Artykuł metodologiczny

Nieniszcząca ocena regionalnej gęstości komórek w agregatach nowotworowych po leczeniu farmakologicznym

DOI:

10.3791/64030

⸱

21 czerwca 2022

 ,  ,  , 
1Rensselaer Polytechnic Institute, 2Albany Medical College

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obecny protokół rozwija technikę opartą na obrazie do szybkiego, nieniszczącego i bezznacznikowego regionalnego pomiaru gęstości komórek i żywotności w agregatach 3D guza. Wyniki ujawniły gradient gęstości komórek, z większą gęstością komórek w regionach rdzenia niż w warstwach zewnętrznych w rozwijających się agregatach i głównie śmiercią komórek obwodowych w agregatach HER2+ leczonych trastuzumabem.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Modele wielokomórkowych sferoidów nowotworów (MCTSs) wykazały coraz większą użyteczność w badaniach in vitro progresji raka i odkrywaniu leków. Te stosunkowo proste, beznaczyniowe konstrukty naśladują kluczowe aspekty nowotworów in vivo, takie jak struktura 3D i gradienty patofizjologiczne. Modele MCTS mogą dostarczyć informacji na temat zachowania komórek nowotworowych podczas rozwoju sferoidów i w odpowiedzi na leki; Jednak ich wymagany rozmiar drastycznie ogranicza narzędzia używane do oceny nieniszczącej. Obrazowanie strukturalne optycznej koherentnej tomografii i oprogramowanie do analizy 3D Imaris są badane w celu szybkiego, nieniszczącego i bezznacznikowego pomiaru regionalnej gęstości komórek w MCTS. Podejście to jest wykorzystywane do oceny MCTS w 4-dniowym okresie dojrzewania i podczas przedłużonej 5-dniowej kuracji trastuzumabem, klinicznie istotnym lekiem anty-HER2. Krótko mówiąc, MCTS AU565 HER2 + raka piersi stworzono za pomocą płynnej nakładki z dodatkiem lub bez dodatku Matrigelu (macierzy błony podstawnej) w celu zbadania agregatów o różnych morfologiach (odpowiednio grubsze, przypominające dysk agregaty 2,5D lub płaskie agregaty 2D). Gęstość komórek w regionie zewnętrznym, regionie przejściowym i wewnętrznym rdzeniu scharakteryzowano w dojrzałych MCTS, ujawniając gradient gęstości komórek z wyższą gęstością komórek w regionach rdzenia w porównaniu z warstwami zewnętrznymi. Dodanie matrycy spowodowało redystrybucję gęstości komórek i zwiększenie tego gradientu, zmniejszając gęstość strefy zewnętrznej i zwiększając zagęszczenie komórek w rdzeniach. Gęstość komórek określono ilościowo po leczeniu farmakologicznym (0 godzin, 24 godziny, 5 dni) w stopniowo głębszych strefach 100 μm w celu oceny potencjalnych regionalnych różnic w odpowiedzi na lek. W końcowym punkcie czasowym prawie cała śmierć komórek wydawała się być ograniczona do zewnętrznych 200 μm każdego agregatu, podczas gdy komórki znajdujące się głębiej w agregacji wydawały się w dużej mierze nienaruszone, co ilustruje regionalne różnice w odpowiedzi na lek, prawdopodobnie z powodu ograniczeń w penetracji leku. Obecny protokół zapewnia unikalną technikę nieniszczącego ilościowego określania regionalnej gęstości komórek w gęstych tkankach komórkowych i pomiaru jej wzdłużnie.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badacze w dużej mierze zwrócili się do laboratoryjnych systemów hodowli 3D in vitro, aby zbadać niektóre z kluczowych cech progresji nowotworu. Wiele z tych badań zostało przeprowadzonych przez ponowne pojawienie się wielokomórkowych sferoidów nowotworowych (MCTS) i bardziej złożonych organoidów1,2. Chociaż modele te są unaczynione, stanowią potężne narzędzie do rekapitulacji procesów fizjologicznych i patologicznych zachodzących in vivo3,4,5. W szczególności średniej wielkości modele (średnica 300-500 μm) mogą naśladować kluczowe cechy guza, takie jak struktura 3D, gradienty patofizjologiczne i sygnalizacja przerzutowa spowodowana niedotlenieniem w rdzeniu. Jest dobrze udokumentowane, że modele te wykazują charakterystyczne koncentryczne warstwy widoczne w unaczynionych guzach in vivo, a mianowicie zewnętrzną warstwę komórek proliferacyjnych, warstwę przejściową komórek starczych/spoczynkowych oraz komórki doświadczające niedotlenienia w rdzeniu3,6,7,8,9. Unikalne informacje można uzyskać dzięki tym modelom, charakteryzując zachowanie komórek w tych warstwach, podczas opracowywania i w odpowiedzi na lek. Jednak wymagany rozmiar MCTS, niezbędny do opracowania gradientów, które czynią je tak potężnymi modelami in vitro, drastycznie ogranicza narzędzia używane do oceny nieniszczącej. Rzeczywiście, jednym z największych wyzwań związanych z nieniszczącą analizą MTCS jest ilościowe określenie szczegółów w skali komórki. Mikroskopia jasnego pola i kontrastu fazowego jest rutynowo wykorzystywana do nieniszczącej oceny wzrostu i rozwoju MCTS 3D. Jednak te modalności są ograniczone do projekcji 2D, nie mając możliwości wizualizacji kluczowej struktury 3D tych modeli10,11,12,13. Informacje na temat cytotoksyczności i proliferacji komórek są zwykle zbierane za pomocą obrazowania fluorescencyjnego (tj. mikroskopii świetlnej, mikroskopii konfokalnej) lub barwienia immunohistologicznego ex vivo14,15,16. Chociaż podejścia te dostarczają cennych informacji o wysokiej rozdzielczości na temat struktury tkanki, gęstości komórkowej i funkcji komórek, często wymagają przygotowania próbki, takiego jak oczyszczanie optyczne, utrwalanie/barwienie lub osadzanie, co zapobiega analizom podłużnym.

Optyczna tomografia koherentna (OCT) to nieniszcząca metoda obrazowania strukturalnego, która ma potencjał, aby przezwyciężyć niektóre z wyżej wymienionych wyzwań. Charakteryzuje się rozdzielczością komórkową i wystarczająco szerokim polem widzenia (do 10 mm x 10 mm), zdolnym do wizualizacji całych agregatów wielokomórkowych17,18,19. Co ważne, ze względu na widzialny charakter użytego światła, technika ta jest całkowicie nieniszcząca i wolna od etykiet17. Ponadto próbki mogą być obrazowane in situ bez konieczności przygotowania próbki, dzięki czemu próbki można pobrać bezpośrednio z inkubatora, szybko zeskanować za pomocą OCT (czas trwania skanowania ~5-10 min), a następnie wrócić do inkubatora, co umożliwia charakterystykę podłużną. Ostatnio pojawiło się wiele badań mających na celu wykorzystanie OCT do analizy zachowania sferoidów guza. W jednej z najbardziej ekscytujących demonstracji Huang i in. wykorzystali OCT do nieniszczącego wykrywania nekrotycznych rdzeni w dużych modelach sferoidalnych guza, zauważając, że żywe i martwe regiony komórkowe mają dostrzegalne różnice w tłumieniu optycznym, które można wykorzystać do monitorowania żywotności bez znaczników20. Podobnie Hari i wsp. przeprowadzili pomiary indeksu refrakcji (RI) sferoidów ludzkiego raka jelita grubego (HCT116) zobrazowanych za pomocą OCT, aby zbadać obecność niedotlenienia w próbkach21. Ich pomiary nie były wystarczające do bezpośrednich wniosków, chociaż zaobserwowali niższe RI w lokalizacjach, które korelowały z miejscem, choć nie rozmiarem, martwiczych rdzeni, później zidentyfikowanych za pomocą mikroskopii konfokalnej. Abd El-Sadek i wsp. wykorzystali OCT do wizualizacji i ilościowego określenia regionalnej żywotności tkanek modeli nowotworów raka piersi22. Opisali oni dwie metody wizualizacji dynamiki tkanek oparte na OCT i wykazali umiarkowaną korelację między różnicami w tych wskaźnikach a zidentyfikowanymi pod mikroskopią regionami żywych/martwych komórek.

Nasza opublikowana praca z użyciem OCT opierała się na tej wcześniejszej literaturze, aby ustalić ilościowe, nieniszczące podejście do pomiaru morfologii 3D i liczby komórek w modelach raka piersi MCTS podczas rozwoju10,23. Korzystając z oprogramowania do analizy obrazów renderowania 3D Imaris w celu zliczenia liczby obiektów wielkości komórki (tj. plamek) zobrazowanych w skanach woluminów OCT, liczba komórek została niedestrukcyjnie zmierzona w MCTS, które były statystycznie podobne do tych określonych za pomocą hemocytometru po zagregowanej dysocjacji. Jednak ze względu na strukturalny charakter OCT, błony komórkowe nadal obecne po śmierci komórki w wyniku martwicy mogą być błędnie liczone jako żywe komórki. Co więcej, charakterystyka ta została rozszerzona w celu nieniszczącego śledzenia żywotności komórek w poszczególnych agregatach poddanych schematowi leczenia lekami z obiecującym sukcesem10. Co ważne, zauważono, że podobną żywotność komórek zgłoszono przy użyciu naszego podejścia OCT-Imaris z tym, co zostało porównane w tych próbkach po dysocjacji. To nieniszczące i wolne od znaczników podejście do komórek umożliwia liczenie komórek w konstrukcjach 3D i zagęszczenie agregatów wzdłużnie bez poświęcania struktury konstruktu/agregacji.

Obecna praca przedstawia ulepszone podejście do bezpośredniego ilościowego określania regionalnej gęstości komórek w gęstych agregatach, wykorzystując zdolność OCT-Imaris do pomiaru zarówno morfologii zagregowanej 3D, jak i liczby komórek. Ten postęp metodologiczny zapewnia bardziej szczegółowy obraz przestrzennego rozmieszczenia i proliferacji komórek w charakterystycznych koncentrycznych warstwach modeli MCTS. Zamiast po prostu obliczać ogólną średnią zagregowaną gęstość komórek, takie lokalne pomiary gęstości mogą ujawnić gradienty gęstości komórek, takie jak te związane z zagęszczeniem. Ta ocena regionalna jest również stosowana do agregatów traktowanych chemioterapeutykiem w celu oceny regionalnej odpowiedzi na lek, mierzonej zmianami w lokalnej gęstości komórek. To połączenie OCT i zaawansowanych metod analizy obrazowania zapewnia ilościowe określenie regionalnej żywotności komórek, które można wykorzystać do zbadania penetracji leków w oparciu o to, które regiony doświadczają spadku gęstości komórek. Jest to pierwszy raport, który w sposób nieniszczący określa ilościowo regionalną gęstość i żywotność komórek w odpowiedzi na lek w gęstych tkankach komórkowych i mierzy je wzdłużnie. Taka charakterystyka trójwymiarowej gęstości komórek i rozkładu przestrzennego w całych MCTS może pomóc w optymalizacji dostarczania leków w leczeniu raka i poprawić zrozumienie progresji modelu raka.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

AU565 (HER2+) i MDA-MB-231 linie komórkowe raka piersi zostały użyte w niniejszym badaniu (patrz Tabela materiałów).

1. Przygotowanie agregatów nowotworowych

  1. Przygotuj pożywkę do wzrostu komórek raka piersi AU565 (HER2 +) przy użyciu podstawowego podłoża (+) Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 w L-glutaminie uzupełnionej 10% (v / v) płodowej surowicy bydlęcej i 1% penicyliny / streptomycyny (patrz tabela materiałów).
  2. Przygotuj potrójnie ujemną pożywkę do wzrostu komórek raka piersi MDA-MB-231 za pomocą zmodyfikowanego podłoża Eagle's Medium (DMEM) firmy Dulbecco uzupełnionego 10% (v/v) płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 100 U/ml penicyliny/streptomycyny i 2 mM L-glutaminy (patrz tabela materiałów).
  3. Przygotuj 70%-90% zlewających się kultur komórkowych obu linii komórkowych (~3-4 dni przygotowania) w standardowych warunkach (37 °C, 5% CO2, 95% wilgotności względnej). Odłączyć monowarstwy komórek od kolb hodowlanych zgodnie ze standardową metodą trypsynizacji.
    UWAGA: Zapobiegaj nadmiernej ekspozycji komórek na trypsynę, wpływając na ich żywotność.
    1. W przypadku komórek AU565 należy odessać pożywkę komórkową z kolby za pomocą pipety (lub, jeśli to możliwe, za pomocą pompy próżniowej podłączonej za pomocą rurki do autoklawizowanej szklanej końcówki pipety) i zastąpić 2 ml trypsyny-EDTA. Pozostawić kolbę na 3 minuty w temperaturze pokojowej, a następnie przenieść do inkubatora na dodatkowe 4 minuty. Następnie dodaj 6 ml pożywki wzrostowej do kolby, aby zneutralizować trypsynę.
    2. W przypadku komórek MDA-MB-231 należy odessać pożywkę komórkową z kolby w taki sam sposób, jak w kroku 1.3.1 i zastąpić 1,5 ml trypsyny-EDTA. Po 7 minutach inkubacji dodać 8,5 ml pożywki wzrostowej do kolby, aby zneutralizować trypsynę.
  4. Dodaj 10 μl zawiesiny komórek do hemocytometru, aby określić liczbę komórek w zawiesinie24. Ponownie zawiesić komórki w pożywce w pożądanym stężeniu 2,5 × 105 komórek/ml.
  5. Dozować 50 μl zawiesiny komórek do każdego dołka okrągłodennej, nieprzylegającej, 96-dołkowej płytki. W przypadku zawiesin przygotowanych bez Matrigelu (matryca błony podstawnej, patrz tabela materiałów), do każdej studzienki dodać 50 μl zwykłej pożywki wzrostowej.
    1. W przypadku zawiesin przygotowanych z matrycą z membraną podstawną, należy wyjąć fiolkę z matrycą z miejsca przechowywania w temperaturze -20 °C i umieścić ją w lodówce do rozmrożenia przez noc. Przygotuj pojemnik z podłożem wzrostowym i wstaw do lodówki na 10 minut do schłodzenia.
    2. Za pomocą zamrożonej końcówki pipety dodać matrycę do schłodzonego podłoża tak, aby końcowe stężenie tego roztworu wynosiło 5%. Dodaj 50 μL tego podłoża do każdej studzienki, tak aby końcowe stężenie matrycy w tych studzienkach wynosiło 2,5%3.
      UWAGA: We wcześniejszych pracach morfologia agregatów została oceniona dla tych linii komórkowych10,25 i stwierdzono, że agregaty MDA-MB-231 tworzą sferoidy z dodatkiem macierzy błonowej, podczas gdy kultury MDA-MB-231 bez matrycy i matrycy AU565 +/- tworzą agregaty w kształcie dysku. Ilościowo określona sferyczność >0,8 w skali od 0 (płaszczyzna) do 1,0 (idealna kula) została wykorzystana do identyfikacji wystarczająco kulistych agregatów, a zatem oczekiwano, że będą miały wymagany stosunek powierzchni do objętości dla zachowania podobnego do in vivo26,27.
  6. Bezpośrednio po wysianiu odwirować płytki o sile 123 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej, aby zapewnić zebranie osadu komórkowego na dnie każdej studzienki.
    UWAGA: Ten krok musi nastąpić jak najszybciej po wysiewie. Autorzy zaobserwowali, że zbyt długi czas między tymi etapami pozwala komórkom osiadać na dnie i bokach każdej studzienki, hamując ich zdolność do gromadzenia się i agregacji na dnie studni.
  7. Inkubować płytki przez 4 dni, po czym agregaty komórkowe uważa się za dojrzałe.
    UWAGA: Agregaty AU565 przygotowane z matrycą błony podstawnej wymagają dodatkowego 5-dniowego okresu posiewu w badaniu odpowiedzi na lek (łącznie 9 dni, zmiana pożywki w 4 dniu).

2. Podawanie trastuzumabu (TZM) do agregatów komórek AU565

  1. Przygotuj 500 μg/ml roztworu TZM (patrz tabela materiałów) w pożywce wzrostowej AU565. W dniu 4 dodać 10 μl tego roztworu do każdego dołka, tak aby końcowe stężenie w każdym dołku wynosiło 50 μg/ml.
  2. Posiew agreguje się przez 5 dodatkowych dni po dodaniu TZM i ocenia w kluczowych punktach czasowych.
    UWAGA: W niniejszym badaniu do analizy leku wykorzystano punkty czasowe 0 godzin (bezpośrednio przed podaniem leku), 24 godziny i 120 godzin po podaniu leku.

3. Obrazowanie metodą optycznej koherentnej tomografii

UWAGA: Próbki w tym dokumencie były obrazowane za pomocą optycznej tomografii koherentnej (OCT) podczas każdego dnia dojrzewania (1-4), a następnie ponownie w dniu 5 (24 godziny po dodaniu leku) i dniu 9 (120 godzin po dodaniu leku) dla wybranych agregatów odurzonych. W niniejszym badaniu wykorzystano komercyjny system optycznej koherentnej tomografii w domenie spektralnej (SDOCT, patrz tabela materiałów) do obrazowania OCT. Chociaż podejście to jest możliwe do zastosowania w prawie każdym systemie OCT, a stosowana procedura będzie zasadniczo podobna w różnych systemach, niektóre z poniższych szczegółowych kroków są specyficzne dla obecnego sprzętu.

  1. Wykorzystaj system OCT do obrazowania strukturalnego. Ustaw częstotliwość skanowania A na 5,5 kHz, aby zbierać obrazy w wysokiej rozdzielczości. Ustaw współczynnik załamania światła na 1,33 dla próbek w ciekłym ośrodku. Ustaw rozmiar woksela na 1,10 x 1,10 x 2,58 μm3.
  2. W oknie Image Parameters (Parametry obrazu) po prawej stronie ekranu ustaw pole widzenia (FOV), wprowadzając wartości X, Y i Z (w mm) tak, aby próbka znajdowała się w tym obszarze zainteresowania.
    UWAGA: Pole widzenia w tych badaniach było zwykle ustawione na 1,5 x 1,5 x 0,5 mm3. Upewnij się, że próbka mieści się w tym obszarze, zmieniając wejście "Kąt" w zakresie od 0 do 90 stopni i wykonując wizualne potwierdzenie.
  3. Kliknij Tryb akwizycji 3D, a następnie kliknij Nagraj, aby pobrać skan objętości 3D próbki.

4. Analiza obrazu

  1. Wyeksportuj plik OCT do formatu oprogramowania (Imaris, patrz Spis materiałów).
    1. Otwórz plik OCT w zestawie narzędzi do tworzenia oprogramowania. Kliknij Eksportuj, ustaw typ pliku na .jpg i wyeksportuj obrazy do pustego folderu.
    2. Otwórz oprogramowanie do przetwarzania obrazów (FIJI, patrz Tabela materiałów) i zaimportuj sekwencję obrazów z folderu, w którym przechowywane są wyeksportowane pliki JPEG. Użyj oprogramowania, aby zszyć sekwencję obrazów, a następnie zapisz ten plik jako obraz TIFF.
  2. Utwórz rekonstrukcję woluminu, wykonując poniższe czynności.
    1. Otwórz Imaris i przejdź do przekonwertowanego pliku TIFF w Arenie. Przejdź do Edytuj > Właściwości obrazu i wprowadź rozmiar woksela (w μm) z obrazu OCT w odpowiednich polach XYZ. Następnie kliknij OK.
      UWAGA: W przykładowym drzewie obiektów po lewej stronie ekranu usuń zaznaczenie karty Głośność, aby zapobiec opóźnieniom oprogramowania.
    2. Kliknij Dodaj nowe powierzchnie nad drzewem obiektów. W menu pod drzewem kliknij Pomiń automatyczne tworzenie i edytuj ręcznie. W oknie Korekta wyświetlania ręcznie przesuń czerwoną i czarną strzałkę, aby zwiększyć kontrast między próbką a tłem i poprawić wizualizację próbki.
    3. Dostosuj 'Pozycję wycinka' do wycinka na jednej krawędzi próbki, tj. w miejscu, w którym sygnał próbki pojawia się po raz pierwszy. Użyj Escape, aby zmienić mysz z trybu nawigacji na tryb wyboru, a następnie kliknij Rysuj. Ręcznie prześledź kontur obszaru, w którym wyświetlany jest sygnał.
    4. Zwiększ pozycję wycinka, wprowadzając następną pozycję w polu wprowadzania. Następna pozycja musi znajdować się ≤100 plasterków dalej w próbce niż poprzednia. Ręcznie prześledź region, w którym wyświetlany jest sygnał.
    5. Powtórzyć krok 4.2.4 przez grubość próbki, aż do osiągnięcia przeciwległej krawędzi próbki. Następnie kliknij Utwórz powierzchnię w menu po lewej stronie, aby zszyć te plasterki i zakończyć rekonstrukcję objętości.
    6. Kliknij Edytuj, a następnie kliknij Wybór maski. Spowoduje to utworzenie nowego kanału w oknie Dopasowanie wyświetlania zawierającego tylko izolowaną próbkę. Charakterystykę morfologiczną próbki można teraz znaleźć w zakładce Statystyki > Szczegółowe.
      UWAGA: Podejście to zastosowano w celu określenia sferyczności i objętości zgłoszonych w tym bieżącym badaniu.
  3. Uzyskaj całkowitą gęstość komórek próbki, wykonując poniższe czynności.
    1. Nad drzewem obiektów wybierz opcję Dodaj nowe miejsca. W menu Ustawienia algorytmu usuń zaznaczenie wszystkich pól. Kliknij niebieską strzałkę, aby przejść do ekranu Kanał źródłowy.
      1. Z wyświetlonego menu rozwijanego wybierz zamaskowany kanał utworzony w kroku 5.2.8, zwykle o nazwie Kanał 2. Wprowadzić średnią średnicę kuwety dla próbki w polu o średnicy XY. Upewnij się, że opcja Odejmowanie tła jest zaznaczona.
        UWAGA: W przypadku tej pracy z ogniwami AU565 i MDA-MB-231 średnica została ustawiona na 10 μm. Ten wybór jest oparty na rozmiarze komórki (wyjaśnionym w sekcji Dyskusja).
    2. Kliknij niebieską strzałkę, aby przejść do ekranu Klasyfikuj miejsca. Na wykresie u dołu menu kliknij i przeciągnij lewą krawędź żółtego progu do lewej krawędzi wykresu, tak aby wszystkie obiekty znalazły się w zacienionym na żółto progu. Następnie kliknij zieloną strzałkę, aby zakończyć tworzenie miejsca.
    3. Uzyskaj liczbę zidentyfikowanych obiektów (tj. liczbę komórek próbki), klikając Statystyki > Ogólna > Łączna liczba plam.
    4. Aby określić średnią zagregowaną gęstość komórek, podziel zagregowaną liczbę komórek (mierzoną w kroku 4.3.3) przez zagregowaną objętość (określoną w kroku 4.2.6).
  4. Oceń gęstość regionalną w koncentrycznych warstwach agregatów sferycznych (Rysunek 1A).
    1. Po analizie morfologicznej i gęstości komórek oceń gęstość regionalną. Kliknij powierzchnię utworzoną w kroku 4.2.5 i przejdź do zakładki Styl/jakość powierzchni. Zmień zaznaczenie na Punkt środkowy i zmień szerokość pikseli na ≤20, aby uzyskać najlepszą widoczność. Przejdź do sekcji Statystyki > Szczegółowa pozycja > i zarejestruj lokalizację środkowego punktu.
    2. Wybierz opcję Dodaj nową ramkę odniesienia z menu znajdującego się nad drzewem obiektów. Zaznacz pola Widoczne i Napraw obok XY w menu. Kliknij i przeciągnij ikonę ramki odniesienia w taki sposób, aby znalazła się w jednej linii z punktem środkowym. Usuń zaznaczenie pól XY Visible i Fix i wybierz je dla XZ.
      1. Ponownie kliknij i przeciągnij środek ikony ramki odniesienia tak, aby znalazła się w jednej linii z punktem środkowym. Na koniec powtórz to dla płaszczyzny YZ, naprzemiennie między tymi trzema stałymi płaszczyznami, aż układ odniesienia idealnie wyrówna się z punktem środkowym. Kliknij dwukrotnie ramkę odniesienia w drzewie obiektów i zmień jej nazwę na Wyśrodkowana lub Podobna.
    3. Kliknij miejsca utworzone w kroku 4.3 i przejdź do sekcji Statystyka > Szczegółowy układ odniesienia pozycji >. Kliknij ramkę odniesienia pozycji X, aż zostanie posortowana od najwyższej do najniższej wartości. Zapisz najwyższą wartość - wskazuje najdalszą krawędź próbki, tj. promień próbki.
      UWAGA: Ponieważ użyte tutaj próbki są kołowe w płaszczyźnie XY, obliczenia można wykonywać wzdłuż osi X lub Y z podobnymi wynikami. W przypadku próbek, które nie wykazują symetrii X-Y (asymetryczna, elipsoidalna, nieregularna geometria itp.), zaleca się wykonywanie tych analiz wzdłuż wielu osi.
    4. Przejdź do sekcji Statystyki. W prawym dolnym rogu menu kliknij Eksportuj wszystkie statystyki do pliku i zapisz dane w arkuszu kalkulacyjnym.
    5. Wykonaj obliczenia ręczne, aby zidentyfikować warstwy koncentryczne wzdłuż osi X.
      UWAGA: Próbki użyte w tym badaniu miały średnicę około 500 μm; W związku z tym istnieją dwie zewnętrzne strefy koncentryczne o grubości 200 μm i jedna wewnętrzna strefa centralna o grubości 100 μm. Zaleca się utrzymywanie stref o grubości 200 μm, ponieważ oczekuje się, że zachowanie dyfuzji zmieni się na tym dystansie7,28,29,30. Zgodnie z tym rozumowaniem zaleca się również stosowanie bardziej koncentrycznych stref dla większych próbek i odwrotnie dla mniejszych próbek.
    6. Ustaw obszar warstwy zewnętrznej o wielkości 200 μm, odejmując 200 μm od promienia zewnętrznego znajdującego się w kroku 4.4.3. W ten sposób obszar zewnętrzny będzie obejmował plamy z pozycjami X międzypromieniem X a Xzewnętrznym, wewnętrzną krawędzią (Rysunek 1A, obszar pomarańczowy).
    7. Ustaw obszar przejściowy, odejmując 200 μm odX zewnętrznej, wewnętrznej krawędzi. Obszar przejściowy będzie obejmował miejsca z pozycjami X między Xzewnętrznym, wewnętrznym krawędzią i Xprzejściową, wewnętrzną krawędzią (Rysunek 1A, różowy obszar).
    8. Ustaw centralny obszar rdzenia obejmujący pozostałe punkty między środkiem próbki aX przejściowym, wewnętrznym krawędzią (Rysunek 1A, niebieski obszar).
    9. Otwórz zapisany plik arkusza kalkulacyjnego utworzony w kroku 4.4.4. Przejdź do zakładki Odległość od układu odniesienia początkowego.
    10. Oblicz liczbę plamek w obszarze rdzenia za pomocą funkcji "LICZ.JEŻELI" (kolumnax, "< Xprzejściowa, krawędź wewnętrzna"), gdzie kolumnax to kolumna "Odległość od układu odniesienia początku". Wynikowa wartość to numer komórki w tym regionie. Podziel tę wartość przez objętość regionu, aby uzyskać gęstość komórek.
    11. W podobny sposób oblicz liczbę komórek w regionie przejściowym za pomocą 'COUNTIF (Kolumnax, "< Xzewnętrzna, krawędź wewnętrzna") - LICZ.JEŻELI(Kolumnax, "> Xkrawędź przejściowa,krawędź wewnętrzna").
    12. Oblicz liczbę komórek w regionie zewnętrznym za pomocą "LICZ.JEŻELI (kolumnax,"> Xprzejściowa,krawędź wewnętrzna").
  5. Oceń regionalne zagęszczenie komórek w próbkach niesferycznych za pomocą "Regionalnych zatyczek" (Rysunek 1B).
    UWAGA: W przypadku próbek niesferycznych, które nie mają koncentrycznych warstw, opracowano metodę "korka regionalnego" w celu pobierania próbek o lokalnej gęstości komórek na różnych głębokościach promieniowych w całym skupisku.
    1. Powtórz kroki 4.4.1-4.4.3, aby ustawić centralny układ odniesienia (Rysunek 1B, środkowe żółte kółko) i uzyskać całkowity promień próbki.
    2. Wykonaj obliczenia ręczne, aby określić rozmieszczenie układów odniesienia w regionach przejściowych i zewnętrznych, tak aby można było ocenić gęstość komórek w próbce w tych miejscach.
      1. Aby obliczyć położenie zewnętrzne, odejmij 50 μm od wartości promienia próbki z kroku 4.5.1 i użyj tej wartości jako pozycji X.
        UWAGA: Użyj tych samych wartości pozycji Y i Z zapisanych w kroku 4.5.1 dla wszystkich wtyczek w danej próbce, aby zmierzyć gęstość komórek wzdłuż osi X próbki (Rysunek 1B, żółte kółko po lewej stronie).
      2. Nad drzewem obiektów kliknij Dodaj nowe miejsca i kliknij Pomiń automatyczne tworzenie, edytuj ręcznie. Gdy wskaźnik jest w trybie "wybierz", przytrzymaj shift+kliknięcie, aby umieścić miejsce na ekranie. W menu po lewej stronie wprowadź obliczone powyżej wartości pozycji XYZ. Dostosuj średnice XY i Z do ≤20, aby uzyskać najlepszą widoczność.
      3. Powtórz krok 4.4.2, aby dodać układ odniesienia w tym miejscu. Zmień nazwę tego układu odniesienia w drzewie obiektów, zewnętrznym lub podobnym.
      4. Aby obliczyć położenie przejściowe (punkt środkowy), znajdź średnią wartości X pozycjiśrodkowej i X wartości pozycjizewnętrznej. Użyj tej wartości jako pozycji X dla przejściowego układu odniesienia. Jak wyżej, użyj tych samych wartości Y i Z zapisanych w kroku 4.5.1 dla wszystkich zatyczek w danej próbce, aby zmierzyć gęstość komórek wzdłuż osi X próbki (Rysunek 1B, środkowe żółte kółko).
      5. Powtórz krok 4.4.2, aby umieścić środkowy układ odniesienia w tym miejscu, zmieniając jego nazwę na "przejściowy" lub podobny po utworzeniu.
    3. Kliknij spoty utworzone w kroku 4.3 i przejdź do sekcji Statystyki. W prawym dolnym rogu menu kliknij Eksportuj wszystkie statystyki do pliku i zapisz dane w arkuszu kalkulacyjnym.
    4. Otwórz arkusz kalkulacyjny. Przejdź do zakładki Odległość od układu odniesienia początkowego. Odległość każdego obiektu od układów odniesienia jest pokazana w kolumnie A, a grupowanie układów odniesienia dla każdego obiektu jest pokazane w kolumnie G. Użyj funkcji "MOD", aby numerycznie przypisać każdą odległość do odpowiadającego jej układu odniesienia, gdzie 0 to ramka środkowa, 1 to ramka przejściowa, a 2 to strona zewnętrzna.
    5. Przefiltruj wartości w tej kolumnie, aby pracować z odległościami w każdym układzie odniesienia. Dla każdego z układów odniesienia należy obliczyć liczbę obiektów w promieniu 50 mikrometrów od układu za pomocą funkcji "LICZ.JEŻELI (kolumnax, "≤50"), gdzie kolumnax jest kolumną "Odległość od układu odniesienia punktu początkowego" dla każdej grupy. Wynikowa wartość odpowiada liczbie komórek w tej wtyczce regionalnej. Podziel tę wartość przez objętość korka 100 μm, aby uzyskać gęstość komórek.
  6. Wykonaj metodę Spatially-Refined Regional Plug (Rysunek 1C).
    UWAGA: Podejście to zastosowano do oceny regionalnej żywotności komórek w odpowiedzi na aplikację leku. Uwzględnienie większej liczby układów odniesienia poprawia rozdzielczość gęstości komórek, które można obliczyć na całej grubości modelu.
    1. Powtórz kroki 4.4.1-4.4.3, aby ustawić środkowy układ odniesienia (Rysunek 1C, środkowe żółte kółko) i uzyskać promień próbki.
    2. Wykonaj obliczenia ręczne, aby określić dodatkowe interesujące lokalizacje. W tym celu należy dodać 100 μm do wartościśrodka X, a następnie użyć wartości Y i Z punktu środkowego, aby zdefiniować pierwsze położenie wzdłuż osi środkowej. Dodaj ramkę odniesienia do tej pozycji, jak w kroku 4.4.2 (Rysunek 1C, żółte kółko przylegające do środkowego koła).
      UWAGA: Na tym etapie dodaj mniej μm, jeśli chcesz śledzić gęstość w wyższej rozdzielczości.
    3. Powtórzyć kroki 4.6.2, dodając 100 μm (lub żądaną liczbę μm) do każdego sekwencyjnego położenia X, aby ustalić oś równomiernie rozmieszczonych zatyczek przez grubość próbki. Umieść ostatni układ odniesienia w odległości ≤50 μm od zewnętrznego promienia próbki (Rysunek 1C, żółte kółka).
    4. Powtórzyć kroki 4.5.3-4.5.5, aby uzyskać liczbę komórek w każdej korku o średnicy 100 μm. Podziel te wartości przez objętość każdej odpowiedniej wtyczki, aby uzyskać lokalną gęstość komórek.
    5. Powtórz wszystkie kroki opisane w tej sekcji dla danych OCT zebranych w każdym punkcie czasowym badania klinicznego. Porównanie liczby komórek w każdym miejscu w czasie leczenia powinno ujawnić, gdzie gęstość komórek zmniejsza się (tj. regiony, w których dochodzi do śmierci komórki), a w konsekwencji, jak głęboko wnika lek (tj. które warstwy odnotowują spadek gęstości komórek, a które utrzymują lub wykazują wzrost poziomu gęstości komórek).

figure-protocol-1
Rysunek 1: Schematyczna ilustracja. (A) Podejście oparte na warstwach koncentrycznych (powłokach) do oceny regionalnej gęstości komórek w sferycznych agregatach. (B) Metoda korków regionalnych została opracowana w celu oceny lokalnej gęstości komórek w agregatach niesferycznych, gdzie małe (średnica 100 μm) kuliste czopki (pokazane na żółto) są używane jako wskaźniki gęstości w każdej strefie/grubości. (C) Do badań penetracji narkotyków stosuje się przestrzennie rafinowaną metodę wtyczki regionalnej. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W poprzedniej publikacji ustalono metodę nieniszczącego pomiaru globalnej gęstości komórek w agregatach komórkowych za pomocą OCT10. W tym przypadku technika ta została rozszerzona w celu oceny regionalnej gęstości komórek rozwijających się agregatów komórkowych. Rysunek 1 pokazuje schemat tego rozszerzenia, gdzie gęstość komórek może być oceniana w koncentrycznych warstwach sferoidy lub bardziej lokalnie, patrząc zamiast tego na małe (100 μm średnicy) kuliste korki, ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Znaczenie
Wielokomórkowe sferoidy nowotworowe (MCTS) to potężne modele 3D in vitro do badania progresji guza i badań przesiewowych leków 1,2,3. Zwiększenie użyteczności tych stosunkowo prostych modeli zagregowanych zależy w dużej mierze od scharakteryzowania ich kluczowych cech, takich jak morfologia i gęstość komórek, o których wiadomo, że wpływają zarówno na progresję modelu nowotworu, jak i odpo...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie było wspierane przez NIH R01 BRG CA207725 (MB/DTC) i NIH R01 CA233188 (MB). Chcielibyśmy podziękować AMC Pharmacy za Trastuzumab dostarczony do tych eksperymentów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Płytki 96-dołkoweGreiner Bio-One 650970Powierzchnia odstraszająca komórki CellStar, https://shop.gbo.com/en/usa/products/bioscience/cell-culture-products/cellstar-cell-repellent-surface/
0,25% trypsyna, 2,21 mM EDTACorning25-053-CI
AU565 komórki raka piersiATCC
Zmodyfikowany Dulbecco's Eagle's MediumCorning10-013-CV
Płodowa surowica bydlęcaATCC30-2020
FIJI oprogramowanieopen-source(Fidżi to sprawiedliwe) ImageJ v2.1 / 1.5.3jPobrane z https://imagej.net/software/fiji/
HemocytometrFisher Scientific0267151B
Oprogramowanie do analizy obrazu ImarisBitplaneAktualna wersja 9.8
L-glutaminaLonza17-605E
MatrigelCorning354263
MDA-MB-231 komórki raka piersiATCC
ZeissZ1 AxioVision
Penicilin streptomycynaCorning30-0002CI
Wirówka płytkowaEppendorf
RPMI medium 1640Gibco11875-085
Domena spektralna Optyczna tomografia koherentnaThorLabsTEL220C1
Kolby do hodowli komórkowych T75Greiner Bio-One 
Pozostałości trastuzumabuPróbki kliniczne trastuzumabu, hojnie podarowane przez Albany Medical College Pharmacy. 
Mikroskop Wtym badaniu wykorzystano 658175

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sutherland, R., JA, M., Inch, W. Growth of multicell spheroids in tissue culture as a model of nodular carcinomas. Journal of the National Cancer Institute. 46 (1), 113-120 (1971).
  2. Sachs, N., et al. A living biobank of breast cancer organoids captures disease heterogeneity. Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).
  3. Nagelkerke, A., Bussink, J., Sweep, F. C. G. J., Span, P. N. Generation of multicellular tumor spheroids of breast cancer cells: How to go three-dimensional. Analytical Biochemistry. 437 (1), 17-19 (2013).
  4. Kunz-Schughart, L. A., Freyer, J. P., Hofstaedter, F., Ebner, R. The use of 3-D cultures for high-throughput screening: The multicellular spheroid model. Journal of Biomolecular Screening. 9 (4), 273-285 (2004).
  5. Hirschhaeuser, F., et al. Multicellular tumor spheroids: An underestimated tool is catching up again. Journal of Biotechnology. 148 (1), 3-15 (2010).
  6. Jiang, Y., Pjesivac-Grbovic, J., Cantrell, C., Freyer, J. P. A multiscale model for avascular tumor growth. Biophysical Journal. 89 (6), 3884-3894 (2005).
  7. Freyei, J. P., Sutherland, R. M. Regulation of growth saturation and development of necrosisin EMT6/R0 multicellular spheroids by the glucose and oxygen supply. Cancer Research. 46 (7), 3504-3512 (1986).
  8. Desoize, B., Jardillier, J. C. Multicellular resistance: a paradigm for clinical resistance. Critical Reviews in Oncology Hematology. 36 (2-3), 193-207 (2000).
  9. Mellor, H. R., Ferguson, D. J. P., Callaghan, R. A model of quiescent tumour microregions for evaluating multicellular resistance to chemotherapeutic drugs. British Journal of Cancer. 93 (3), 302-309 (2005).
  10. Roberge, C. L., et al. Non-destructive tumor aggregate morphology and viability quantification at cellular resolution, during development and in response to drug. Acta Biomaterialia. 117, 322-334 (2020).
  11. Piccinini, F., Tesei, A., Bevilacqua, A. Single-image based methods used for non-invasive volume estimation of cancer spheroids a practical assessing approach based on entry-level equipment. Computer Methods and Programs in Biomedicine. 135, 51-60 (2016).
  12. Imamura, Y., et al. Comparison of 2D- and 3D-culture models as drug-testing platforms in breast cancer. Oncology Reports. 33 (4), 1837-1843 (2015).
  13. Song, Y., et al. Patient-derived multicellular tumor spheroids towards optimized treatment for patients with hepatocellular carcinoma. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research. 37 (1), 1-13 (2018).
  14. LaBarbera, D. V., Reid, B. G., Yoo, B. H. The multicellular tumor spheroid model for high-throughput cancer drug discovery. Expert Opinion on Drug Discovery. 7 (9), 819-830 (2012).
  15. Hakanson, M., Textor, M., Charnley, M. Engineered 3D environments to elucidate the effect of environmental parameters on drug response in cancer. Integrative Biology. 3 (1), 31-38 (2011).
  16. Pickl, M., Ries, C. H. Comparison of 3D and 2D tumor models reveals enhanced HER2 activation in 3D associated with an increased response to trastuzumab. Oncogene. 28 (3), 461-468 (2009).
  17. Huang, D., et al. Optical coherence tomography HHS public access. Science. 254 (5035), 1178-1181 (1991).
  18. Zhong, H. Q., et al. Enhancement of permeability of glycerol with ultrasound in human normal and cancer breast tissues in vitro using optical coherence tomography. Laser Physics Letters. 7 (5), 388-395 (2010).
  19. Fujimoto, J., Swanson, E. The development, commercialization, and impact of optical coherence tomography. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 57 (9), (2016).
  20. Huang, Y., et al. Optical coherence tomography detects necrotic regions and volumetrically quantifies multicellular tumor spheroids. Cancer Research. 77 (21), 6011-6020 (2017).
  21. Hari, N., Patel, P., Ross, J., Hicks, K., Vanholsbeeck, F. Optical coherence tomography complements confocal microscopy for investigation of multicellular tumour spheroids. Scientific Reports. 9 (1), 1-11 (2019).
  22. El-Sadek, I. A., et al. Three-dimensional dynamics optical coherence tomography for tumor spheroid evaluation. Biomedical Optics Express. 12 (11), 6844(2021).
  23. Kingsley, D. M., et al. Laser-based 3D bioprinting for spatial and size control of tumor spheroids and embryoid bodies. Acta Biomateralia. 95, 357-370 (2019).
  24. Absher, M. Hemocytometer counting. Tissue Culture. , 395-397 (1973).
  25. Roberge, C. L., Rudkouskaya, A., Barroso, M., Corr, D. T. Longitudinal, label-free assessment of cell density and viability in multicellular tumor spheroids via optical coherence tomography. Summer Biomechanics, Bioengineering, and Biotransport Conference. , (2020).
  26. Bellotti, C., Duchi, S., Bevilacqua, A., Lucarelli, E., Piccinini, F. Long term morphological characterization of mesenchymal stromal cells 3D spheroids built with a rapid method based on entry-level equipment. Cytotechnology. 68 (6), 2479-2490 (2016).
  27. Noto, A., et al. Stearoyl-CoA desaturase-1 is a key factor for lung cancer-initiating cells. Cell Death & Disease. 4 (12), 947(2013).
  28. Riffle, S., Hegde, R. S. Modeling tumor cell adaptations to hypoxia in multicellular tumor spheroids. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research. 36, 102(2017).
  29. Wilson, W. R., Hay, M. P. Targeting hypoxia in cancer therapy. Nature Reviews Cancer. 11, 393-410 (2011).
  30. Grimes, D. R., Kelly, C., Bloch, K., Partridge, M. A method for estimating the oxygen consumption rate in multicellular tumour spheroids. Journal of the Royal Society Interface. 11 (92), 20131124(2014).
  31. Nath, S., Devi, G. R. Three-dimensional culture systems in cancer research: Focus on tumor spheroid model. Pharmacology & Therapeutics. 163, 94-108 (2016).
  32. Pozzi, S., et al. Meet me halfway: Are in vitro 3D cancer models on the way to replace in vivo models for nanomedicine development. Advanced Drug Delivery Reviews. 175, 113760(2021).
  33. Nguyen, E. H., Daly, W. T., Belair, D. G., Le, N. N., Murphy, W. L. High throughput screening format identifies synthetic mimics of matrigel for tubulogenesis screening. , Available from: https://abstracts.biomaterials.org/data/papers/2015/abstracts/547.pdf (2015).
  34. Duchnowska, R., Szczylik, C. Central nervous system metastases in breast cancer patients administered trastuzumab. Cancer Treatment Reviews. 31 (4), 312-318 (2005).
  35. Zazo, S., et al. Generation, characterization, and maintenance of trastuzumab-resistant HER2+ breast cancer cell lines. American Journal of Cancer Research. 6 (11), 2661-2678 (2016).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Modele sferoid w nowotworowychoptyczna tomografia koherentnaobrazowanie strukturalne 3Danaliza 3D w programie Imarispenetracja lek wagregaty raka piersigradient g sto ci kom rekleczenie trastuzumabem

Powiązane artykuły