Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Nieniszcząca ocena regionalnej gęstości komórek w agregatach nowotworowych po leczeniu farmakologicznym

1.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/64030

⸱

21 czerwca 2022

 ,  ,  , 
1Rensselaer Polytechnic Institute, 2Albany Medical College

W tym artykule

Podsumowanie

Obecny protokół rozwija technikę opartą na obrazie do szybkiego, nieniszczącego i bezznacznikowego regionalnego pomiaru gęstości komórek i żywotności w agregatach 3D guza. Wyniki ujawniły gradient gęstości komórek, z większą gęstością komórek w regionach rdzenia niż w warstwach zewnętrznych w rozwijających się agregatach i głównie śmiercią komórek obwodowych w agregatach HER2+ leczonych trastuzumabem.

Streszczenie

Modele wielokomórkowych sferoidów nowotworów (MCTSs) wykazały coraz większą użyteczność w badaniach in vitro progresji raka i odkrywaniu leków. Te stosunkowo proste, beznaczyniowe konstrukty naśladują kluczowe aspekty nowotworów in vivo, takie jak struktura 3D i gradienty patofizjologiczne. Modele MCTS mogą dostarczyć informacji na temat zachowania komórek nowotworowych podczas rozwoju sferoidów i w odpowiedzi na leki; Jednak ich wymagany rozmiar drastycznie ogranicza narzędzia używane do oceny nieniszczącej. Obrazowanie strukturalne optycznej koherentnej tomografii i oprogramowanie do analizy 3D Imaris są badane w celu szybkiego, nieniszczącego i bezznacznikowego pomiaru regionalnej gęstości komórek w MCTS. Podejście to jest wykorzystywane do oceny MCTS w 4-dniowym okresie dojrzewania i podczas przedłużonej 5-dniowej kuracji trastuzumabem, klinicznie istotnym lekiem anty-HER2. Krótko mówiąc, MCTS AU565 HER2 + raka piersi stworzono za pomocą płynnej nakładki z dodatkiem lub bez dodatku Matrigelu (macierzy błony podstawnej) w celu zbadania agregatów o różnych morfologiach (odpowiednio grubsze, przypominające dysk agregaty 2,5D lub płaskie agregaty 2D). Gęstość komórek w regionie zewnętrznym, regionie przejściowym i wewnętrznym rdzeniu scharakteryzowano w dojrzałych MCTS, ujawniając gradient gęstości komórek z wyższą gęstością komórek w regionach rdzenia w porównaniu z warstwami zewnętrznymi. Dodanie matrycy spowodowało redystrybucję gęstości komórek i zwiększenie tego gradientu, zmniejszając gęstość strefy zewnętrznej i zwiększając zagęszczenie komórek w rdzeniach. Gęstość komórek określono ilościowo po leczeniu farmakologicznym (0 godzin, 24 godziny, 5 dni) w stopniowo głębszych strefach 100 μm w celu oceny potencjalnych regionalnych różnic w odpowiedzi na lek. W końcowym punkcie czasowym prawie cała śmierć komórek wydawała się być ograniczona do zewnętrznych 200 μm każdego agregatu, podczas gdy komórki znajdujące się głębiej w agregacji wydawały się w dużej mierze nienaruszone, co ilustruje regionalne różnice w odpowiedzi na lek, prawdopodobnie z powodu ograniczeń w penetracji leku. Obecny protokół zapewnia unikalną technikę nieniszczącego ilościowego określania regionalnej gęstości komórek w gęstych tkankach komórkowych i pomiaru jej wzdłużnie.

Wprowadzenie

Badacze w dużej mierze zwrócili się do laboratoryjnych systemów hodowli 3D in vitro, aby zbadać niektóre z kluczowych cech progresji nowotworu. Wiele z tych badań zostało przeprowadzonych przez ponowne pojawienie się wielokomórkowych sferoidów nowotworowych (MCTS) i bardziej złożonych organoidów1,2. Chociaż modele te są unaczynione, stanowią potężne narzędzie do rekapitulacji procesów fizjologicznych i patologicznych zachodzących in vivo3,4,5. W szczególności średniej wielkości modele (średnica 300-500 μm) mogą naśladować kluczowe cechy guza, takie jak struktura 3D, gradienty patofizjologiczne i sygnalizacja przerzutowa spowodowana niedotlenieniem w rdzeniu. Jest dobrze udokumentowane, że modele te wykazują charakterystyczne koncentryczne warstwy widoczne w unaczynionych guzach in vivo, a mianowicie zewnętrzną warstwę komórek proliferacyjnych, warstwę przejściową komórek starczych/spoczynkowych oraz komórki doświadczające niedotlenienia w rdzeniu3,6,7,8,9. Unikalne informacje można uzyskać dzięki tym modelom, charakteryzując zachowanie komórek w tych warstwach, podczas opracowywania i w odpowiedzi na lek. Jednak wymagany rozmiar MCTS, niezbędny do opracowania gradientów, które czynią je tak potężnymi modelami in vitro, drastycznie ogranicza narzędzia używane do oceny nieniszczącej. Rzeczywiście, jednym z największych wyzwań związanych z nieniszczącą analizą MTCS jest ilościowe określenie szczegółów w skali komórki. Mikroskopia jasnego pola i kontrastu fazowego jest rutynowo wykorzystywana do nieniszczącej oceny wzrostu i rozwoju MCTS 3D. Jednak te modalności są ograniczone do projekcji 2D, nie mając możliwości wizualizacji kluczowej struktury 3D tych modeli10,11,12,13. Informacje na temat cytotoksyczności i proliferacji komórek są zwykle zbierane za pomocą obrazowania fluorescencyjnego (tj. mikroskopii świetlnej, mikroskopii konfokalnej) lub barwienia immunohistologicznego ex vivo14,15,16. Chociaż podejścia te dostarczają cennych informacji o wysokiej rozdzielczości na temat struktury tkanki, gęstości komórkowej i funkcji komórek, często wymagają przygotowania próbki, takiego jak oczyszczanie optyczne, utrwalanie/barwienie lub osadzanie, co zapobiega analizom podłużnym.

Optyczna tomografia koherentna (OCT) to nieniszcząca metoda obrazowania strukturalnego, która ma potencjał, aby przezwyciężyć niektóre z wyżej wymienionych wyzwań. Charakteryzuje się rozdzielczością komórkową i wystarczająco szerokim polem widzenia (do 10 mm x 10 mm), zdolnym do wizualizacji całych agregatów wielokomórkowych17,18,19. Co ważne, ze względu na widzialny charakter użytego światła, technika ta jest całkowicie nieniszcząca i wolna od etykiet17. Ponadto próbki mogą być obrazowane in situ bez konieczności przygotowania próbki, dzięki czemu próbki można pobrać bezpośrednio z inkubatora, szybko zeskanować za pomocą OCT (czas trwania skanowania ~5-10 min), a następnie wrócić do inkubatora, co umożliwia charakterystykę podłużną. Ostatnio pojawiło się wiele badań mających na celu wykorzystanie OCT do analizy zachowania sferoidów guza. W jednej z najbardziej ekscytujących demonstracji Huang i in. wykorzystali OCT do nieniszczącego wykrywania nekrotycznych rdzeni w dużych modelach sferoidalnych guza, zauważając, że żywe i martwe regiony komórkowe mają dostrzegalne różnice w tłumieniu optycznym, które można wykorzystać do monitorowania żywotności bez znaczników20. Podobnie Hari i wsp. przeprowadzili pomiary indeksu refrakcji (RI) sferoidów ludzkiego raka jelita grubego (HCT116) zobrazowanych za pomocą OCT, aby zbadać obecność niedotlenienia w próbkach21. Ich pomiary nie były wystarczające do bezpośrednich wniosków, chociaż zaobserwowali niższe RI w lokalizacjach, które korelowały z miejscem, choć nie rozmiarem, martwiczych rdzeni, później zidentyfikowanych za pomocą mikroskopii konfokalnej. Abd El-Sadek i wsp. wykorzystali OCT do wizualizacji i ilościowego określenia regionalnej żywotności tkanek modeli nowotworów raka piersi22. Opisali oni dwie metody wizualizacji dynamiki tkanek oparte na OCT i wykazali umiarkowaną korelację między różnicami w tych wskaźnikach a zidentyfikowanymi pod mikroskopią regionami żywych/martwych komórek.

Nasza opublikowana praca z użyciem OCT opierała się na tej wcześniejszej literaturze, aby ustalić ilościowe, nieniszczące podejście do pomiaru morfologii 3D i liczby komórek w modelach raka piersi MCTS podczas rozwoju10,23. Korzystając z oprogramowania do analizy obrazów renderowania 3D Imaris w celu zliczenia liczby obiektów wielkości komórki (tj. plamek) zobrazowanych w skanach woluminów OCT, liczba komórek została niedestrukcyjnie zmierzona w MCTS, które były statystycznie podobne do tych określonych za pomocą hemocytometru po zagregowanej dysocjacji. Jednak ze względu na strukturalny charakter OCT, błony komórkowe nadal obecne po śmierci komórki w wyniku martwicy mogą być błędnie liczone jako żywe komórki. Co więcej, charakterystyka ta została rozszerzona w celu nieniszczącego śledzenia żywotności komórek w poszczególnych agregatach poddanych schematowi leczenia lekami z obiecującym sukcesem10. Co ważne, zauważono, że podobną żywotność komórek zgłoszono przy użyciu naszego podejścia OCT-Imaris z tym, co zostało porównane w tych próbkach po dysocjacji. To nieniszczące i wolne od znaczników podejście do komórek umożliwia liczenie komórek w konstrukcjach 3D i zagęszczenie agregatów wzdłużnie bez poświęcania struktury konstruktu/agregacji.

Obecna praca przedstawia ulepszone podejście do bezpośredniego ilościowego określania regionalnej gęstości komórek w gęstych agregatach, wykorzystując zdolność OCT-Imaris do pomiaru zarówno morfologii zagregowanej 3D, jak i liczby komórek. Ten postęp metodologiczny zapewnia bardziej szczegółowy obraz przestrzennego rozmieszczenia i proliferacji komórek w charakterystycznych koncentrycznych warstwach modeli MCTS. Zamiast po prostu obliczać ogólną średnią zagregowaną gęstość komórek, takie lokalne pomiary gęstości mogą ujawnić gradienty gęstości komórek, takie jak te związane z zagęszczeniem. Ta ocena regionalna jest również stosowana do agregatów traktowanych chemioterapeutykiem w celu oceny regionalnej odpowiedzi na lek, mierzonej zmianami w lokalnej gęstości komórek. To połączenie OCT i zaawansowanych metod analizy obrazowania zapewnia ilościowe określenie regionalnej żywotności komórek, które można wykorzystać do zbadania penetracji leków w oparciu o to, które regiony doświadczają spadku gęstości komórek. Jest to pierwszy raport, który w sposób nieniszczący określa ilościowo regionalną gęstość i żywotność komórek w odpowiedzi na lek w gęstych tkankach komórkowych i mierzy je wzdłużnie. Taka charakterystyka trójwymiarowej gęstości komórek i rozkładu przestrzennego w całych MCTS może pomóc w optymalizacji dostarczania leków w leczeniu raka i poprawić zrozumienie progresji modelu raka.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

W niniejszym badaniu wykorzystano linie komórkowe raka piersi AU565 (HER2+) oraz MDA-MB-231 (patrz Tabela materiałów).

1. Przygotowanie agregatów nowotworowych

  1. Przygotować podłoże do hodowli komórek raka piersi AU565 (HER2+), używając podstawowego podłoża Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 (+) z L-glutaminą, uzupełnionego o 10% (v/v) płodowej surowicy bydlęcej oraz 1% penicyliny/streptomycyny (patrz Tabela materiałów).
  2. Przygotuj pożywkę do hodowli komórek raka piersi potrójnie ujemnego MDA-MB-231, wykorzystując modyfikowane podłoże Eagle'a Dulbecco (DMEM) uzupełnione o 10% (v/v) płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 10 U/mL penicyliny/streptomycyny oraz 2 mM L-glutaminy (patrz Tabela materiałów).
  3. Przygotuj hodowle obu linii komórkowych o stopniu konfluencji od 70% do 90% (~3-4 dni przygotowania) w warunkach standardowych (37 °C, 5% CO22, 95% wilgotności względnej). Odizolować monowarstwy komórek z kolb hodowlanych, stosując standardową metodę trypsynizacji.
    UWAGA: Należy zapobiegać zbyt długiej ekspozycji komórek na trypsynę, co wpływa na ich żywotność.
    1. W przypadku komórek AU565 odessać pożywkę z kolby za pomocą pipety (lub, jeśli jest dostępna, za pomocą pompy próżniowej podłączonej poprzez (przewód do autoklawowanej szklanej końcówki pipety) i zastąpić go 2 ml Trypsyny-EDTA. Pozostawić kolbę na 3 min w temperaturze pokojowej, a następnie przenieść do inkubatora na kolejne 4 minuty. Następnie do kolby dodać 6 ml pożywki wzrostowej w celu neutralizacji trypsyny.
    2. W przypadku komórek MDA-MB-231 odessać pożywkę z kolby w ten sam sposób, jak wykonano to w kroku 1.3.1, a następnie zastąpić ją 1,5 ml Trypsyny-EDTA. Po 7 minutach inkubacji dodać do kolby 8,5 ml pożywki wzrostowej, aby zneutralizować trypsynę.
  4. Dodaj 10 µL zawiesiny komórkowej do komory countingowej (hemocytometru) w celu oznaczenia liczby komórek w zawiesinie24Resuspendować komórki w medium do pożądanego stężenia 2,5. × 105 komórek/ml
  5. Odmiarzyć 50 µL zawiesiny komórkowej do każdej studzienki okrągłodنnej, nieprzylepnej płytki 96-dołkowej. W przypadku zawiesin przygotowanych bez Matrigelu (macierz błony podstawnej, patrz Tabela materiałów), dodać 50 µL pożywki wzrostowej do każdej studzienki.
    1. W przypadku zawiesin przygotowanych z macierzy błony podstawnej, należy wyjąć fiolkę z macierzą z -20 °C przechowywanie i umieść go w lodówce w celu rozmrożenia przez noc. Przygotuj pojemnik z pożywką wzrostową i chłodź go w lodówce przez 10 min.
    2. Za pomocą zamrożonego końcówki do pipety dodać macierz do schłodzonego medium w taki sposób, aby stężenie końcowe roztworu wynosiło 5%. Dodać 50 µL tego medium do każdej studzienki, tak aby końcowe stężenie macierzy w tych studzienkach wynosiło 2,5%3.
      UWAGA: Wcześniej oceniano morfologię agregatów dla tych linii komórkowych10,25i stwierdzono, że agregaty MDA-MB-231 tworzą sferoidy po dodaniu macierzy błonowej, podczas gdy hodowle MDA-MB-231 bez macierzy oraz AU565 +/- macierz tworzą agregaty o kształcie dysku. Ilościowo określona sferyczność >Wartość 0,8 w skali od 0 (płaszczyzna) do 1,0 (idealna sfera) posłużyła do zidentyfikowania agregatów wystarczająco sferycznych, a tym samym uznanych za posiadające wymagany stosunek powierzchni do objętości dla in vivozachowanie przypominające26,27.
  6. Wiruj płytki z prędkością 123 x g g przez 10 min w temperaturze pokojowej bezpośrednio po wysianiu, aby zapewnić utworzenie osadu komórkowego na dnie każdej studni.
    UWAGA: Ten etap musi zostać wykonany jak najszybciej po wysiewaniu. Autorzy zaobserwowali, że zbyt długi odstęp czasu między tymi krokami pozwala komórkom osiąść na dnie i ściankach każdej studni, co hamuje ich zdolność do gromadzenia się i agregacji na dnie studni.
  7. Inkubować płytki przez 4 dni; po tym czasie agregaty komórkowe uznaje się za dojrzałe.
    UWAGA: Agregaty AU565 przygotowane z macierzy błony podstawnej wymagają dodatkowych 5 dni hodowli w celu przeprowadzenia badania odpowiedzi na lek (łącznie 9 dni, ze zmianą pożywki w 4. dniu).

2. Podawanie trastuzumabu (TZM) do agregatów komórkowych AU565

  1. Przygotować roztwór TZM o stężeniu 50 µg/mL (patrz Tabela materiałów) w pożywce wzrostowej AU565. W 4. dniu dodać 10 µL tego roztworu do każdej studzienki, tak aby końcowe stężenie w każdej studzience wynosiło 50 µg/mL.
  2. Kultywować agregaty przez kolejne 5 dni po dodaniu TZM i przeprowadzać oceny w kluczowych punktach czasowych.
    ​UWAGA: W niniejszym badaniu do analizy działania leku wykorzystano punkty czasowe 0 h (bezpośrednio przed podaniem leku), 24 h oraz 120 h po podaniu leku.

3. Obrazowanie metodą optycznej koherentnej tomografii

UWAGA: Próbki w niniejszym badaniu były obrazowane za pomocą optycznej koherentnej tomografii (OCT) każdego dnia dojrzewania (1-4), a następnie ponownie w dniu 5. (24 h po dodaniu leku) i w dniu 9. (120 h po dodaniu leku) dla wybranych agregatów poddanych działaniu leku. Do obrazowania OCT w obecnym badaniu wykorzystano komercyjny system optycznej koherentnej tomografii w dziedzinie widmowej (SDOCT, patrz Tabela materiałów). Choć podejście to jest możliwe do zastosowania w niemal każdym systemie OCT, a procedura będzie w dużym stopniu podobna w różnych systemach, niektóre z poniższych szczegółowych kroków są specyficzne dla zastosowanego sprzętu.

  1. Do obrazowania strukturalnego należy wykorzystać system OCT. Aby uzyskać obrazy o wysokiej rozdzielczości, ustaw częstotliwość skanowania A (A-scan rate) na 5,5 kHz. Dla próbek w medium ciekłym ustaw współczynnik załamania światła na 1,3. Rozmiar woksela ustaw na 1,10 x 1,10 x 2,58 µm3.
  2. W oknie Image Parameters po prawej stronie ekranu ustaw pole widzenia (FOV), wprowadzając wartości X, Y i Z (w mm) w taki sposób, aby próbka znajdowała się w obrębie tego obszaru zainteresowania.
    UWAGA: W badaniach tych pole widzenia (FOV) było zazwyczaj ustawione na 1,5 x 1,5 x 0,5 mm3. Aby upewnić się, że próbka mieści się w tym obszarze, należy zmieniać wartość parametru „Angle” między 0 a 90 stopni i przeprowadzać potwierdzenie wizualne.
  3. Kliknij 3D Acquisition Mode, a następnie kliknij Record, aby przeprowadzić trójwymiarowe skanowanie objętościowe próbki.

4. Analiza obrazu

  1. Wyeksportuj plik OCT do formatu obsługiwanego przez oprogramowanie (Imaris, patrz Tabela materiałów).
    1. Otwórz plik OCT w zestawie narzędzi programistycznych (SDK). Kliknij w Eksportustaw typ pliku na .jpg i wyeksportuj obrazy do pustego folderu.
    2. Uruchom oprogramowanie do przetwarzania obrazów (FIJI, patrz Tabela materiałów) i zaimportuj sekwencję obrazów z folderu, w którym zapisano wyeksportowane pliki JPEG. Użyj oprogramowania do połączenia sekwencji obrazów, a następnie zapisz tak powstały plik jako obraz TIFF.
  2. Wykonaj rekonstrukcję objętościową zgodnie z poniższymi krokami.
    1. Otwórz program Imaris i przejdź do przekonwertowanego pliku TIFF w obrębie Areny. Przejdź do Edytuj > Właściwości obrazu i wprowadź rozmiar woksela (w µm) z obrazu OCT do odpowiadających im pól XYZ. Następnie kliknij w Proszę o dostarczenie tekstu źródłowego do tłumaczenia..
      UWAGA: W drzewie obiektów próbki po lewej stronie ekranu odznacz Objętość zakładka zapobiegająca opóźnieniom w działaniu oprogramowania.
    2. Kliknij w Dodaj nowe powierzchnie powyżej drzewa obiektów. W menu poniżej drzewa kliknij Pomiń automatyczne tworzenie i edytować ręcznie. W obrębie Regulacja wyświetlacza okno, ręcznie przesuń czerwone i czarne strzałki, aby zwiększyć kontrast między próbką a tłem i poprawić wizualizację próbki.
    3. Ustaw „Pozycję przekroju” (Slice position) na przekroju znajdującym się na krawędzi próbki, tj. tam, gdzie po raz pierwszy pojawia się sygnał z próbki. Użyj klawisza Escape, aby zmienić tryb pracy myszy z trybu Nawigacji (Navigation mode) na tryb Wyboru (Select mode), a następnie kliknij w RysujRęcznie obrysuj kontur obszaru wykazującego sygnał.
    4. Przesuń pozycję przekroju, wprowadzając kolejną pozycję w polu wprowadzania. Kolejna pozycja musi znajdować się nie więcej niż 10 przekrojów głębiej w próbce niż poprzednia. Ręcznie obrysuj obszar wykazujący sygnał.
    5. Powtórz krok 4.2.4 przez całą grubość próbki, aż do osiągnięcia przeciwległej krawędzi próbki. Następnie kliknij w Tworzenie powierzchni w lewym menu, aby połączyć te warstwy i zakończyć rekonstrukcję wolumetryczną.
    6. Kliknij w Edytuja następnie kliknij Wybór maskiTworzy to nowy kanał w oknie regulacji obrazu (Display Adjustment), zawierający wyłącznie wyizolowaną próbkę. Charakterystyka morfologiczna próbki może teraz zostać odnaleziona w Statystyka > Szczegółowy tab.
      UWAGA: Podejście to zastosowano w celu wyznaczenia sferyczności i objętości przedstawionych w niniejszym badaniu.
  3. Należy wyznaczyć całkowitą gęstość komórek w próbce, postępując zgodnie z poniższymi krokami.
    1. Nad drzewem obiektów wybierz Dodaj nowe plamkiW w ramach Ustawienia algorytmu menu, odznacz wszystkie pola. Kliknij w Niebieska strzałka aby przejść do ekranu Kanału Źródłowego.
      1. Z menu rozwijanego, które się pojawi, należy wybrać zamaskowany kanał utworzony w kroku 5.2.8, zazwyczaj nazwany Channel 2. W polu XY diameter należy wpisać średnicę średnią komórek dla danej próbki. Należy upewnić się, że Odliczanie tła zostało sprawdzone.
        UWAGA: W przypadku pracy z komórkami AU565 i MDA-MB-231 średnicę ustawiono na 10 µmWybór ten opiera się na wielkości komórek (wyjaśnione w sekcji Dyskusja).
    2. Kliknij w Niebieska strzałka przenieść do Klasyfikacja plamek ekranu. Na wykresie znajdującym się na dole menu kliknij i przeciągnij lewą krawędź żółtego progu do lewej krawędzi wykresu, tak aby wszystkie obiekty znalazły się w obszarze żółtego zacienionego progu. Następnie kliknij w Zielona strzałka aby zakończyć tworzenie plamek.
    3. Uzyskaj liczbę zidentyfikowanych obiektów (tzn. liczbę komórek w próbce), klikając w Statystyka > Ogólny widok > Całkowita liczba plam.
    4. Aby wyznaczyć średnią gęstość komórek w agregacie, należy podzielić liczbę komórek w agregacie (pomierzoną w kroku 4.3.3) przez objętość agregatu (wyznaczoną w kroku 4.2.6).
  4. Ocena gęstości regionalnej w koncentrycznych warstwach agregatów sferycznych (Rysunek 1A).
    1. Po przeprowadzeniu analizy morfologicznej i gęstości komórek należy ocenić gęstość regionalną. Kliknij powierzchnię utworzoną w kroku 4.2.5, a następnie przejdź do Styl/jakość powierzchni tab. Zmień zaznaczenie na Punkt centralny oraz zmień szerokość piksela na ≤20, aby uzyskać najlepszą widoczność. Przejdź do Statystyka > Szczegółowy > Położenie i zanotuj położenie środkowego punktu.
    2. Wybierz Dodaj nowy układ odniesienia z menu powyżej drzewa obiektów. Sprawdź Widoczny i Utwierdź pola obok opcji XY w menu. Kliknij i przeciągnij ikonę układu odniesienia tak, aby znajdowała się w jednej linii z punktem centralnym. Odznacz opcję XY Widoczny i Naprawić ramki i zaznaczyć je do obrazowania XZ.
      1. Ponownie kliknij i przeciągnij środek ikony układu odniesienia tak, aby znalazł się w jednej linii z punktem centralnym. Na koniec powtórz tę czynność dla płaszczyzny YZ, przełączając się między tymi trzema płaszczyznami stałymi do momentu, aż układ odniesienia zostanie idealnie wyrównany z punktem centralnym. Kliknij dwukrotnie układ odniesienia w drzewie obiektów i zmień jego nazwę. Centrum lub Podobne.
    3. Kliknij plamy utworzone w kroku 4.3 i przejdź do Statystyka > Szczegółowy > Układ odniesienia pozycjiKliknij w Układ odniesienia pozycji X aż do posortowania od najwyższej do najniższej wartości. Zapisz najwyższą wartość – wskazuje ona najbardziej oddalony brzeg próbki, tj. promień próbki.
      UWAGA: Ponieważ próbki użyte w tym przypadku mają kształt okrągły w płaszczyźnie XY, obliczenia można przeprowadzić wzdłuż osi X lub Y, uzyskując podobne wyniki. W przypadku próbek, które nie wykazują symetrii X-Y (asymetryczne, elipsoidalne, o nieregularnej geometrii itp.), zaleca się przeprowadzenie tych analiz wzdłuż wielu osi.
    4. Przejdź do sekcji Statystyki. W prawym dolnym rogu menu kliknij Eksportuj wszystkie statystyki do pliku i zapisz dane w arkuszu kalkulacyjnym.
    5. Wykonaj obliczenia ręczne w celu zidentyfikowania warstw koncentrycznych wzdłuż osi X.
      UWAGA: Próbki wykorzystane w niniejszym badaniu były w przybliżeniu 500 µm średnicy; w związku z tym znajdują się dwie zewnętrzne 200 µm grube strefy koncentryczne i jedna wewnętrzna 100 µm gruba strefa centralna. Zaleca się utrzymywanie stref, które są 200 µm grube, ponieważ przewiduje się, że charakterystyka dyfuzji ulegnie zmianie na tym dystansie7,28,29,30Zgodnie z tym rozumowaniem zaleca się również stosowanie większej liczby stref koncentrycznych dla większych próbek i odwrotnie w przypadku próbek mniejszych.
    6. Zestaw a 200 µm region warstwy zewnętrznej poprzez odjęcie 200 µm od promienia zewnętrznego wyznaczonego w kroku 4.4.3. W związku z tym obszar zewnętrzny będzie obejmował plamki o pozycjach X między Xpromień oraz Xzewnętrzna, wewnętrzna krawędź (Rycina 1A, pomarańczowy obszar).
    7. Wyznacz obszar przejściowy poprzez odjęcie 200 µm z Xzewnętrzna, wewnętrzna krawędźRegion przejściowy będzie obejmował plamki o pozycjach X między Xzewnętrzna, wewnętrzna krawędź, oraz Xprzejściowy, wewnętrzna krawędź (Rycina 1A, obszar różowy).
    8. Wyznacz centralny obszar rdzenia obejmujący pozostałe plamki pomiędzy centrum próbki a Xprzejściowy, wewnętrzna krawędź (Rysunek 1A, niebieski obszar).
    9. Otwórz zapisany plik arkusza kalkulacyjnego utworzony w kroku 4.4.4. Przejdź do karty Distance from Origin Reference Frame.
    10. Oblicz liczbę plamek w obszarze rdzenia, używając funkcji COUNTIF (KolumnaProszę podać tekst źródłowy do przetłumaczenia., "< Xprzejściowy, wewnętrzna krawędź"), gdzie kolumnaProszę podać tekst źródłowy do przetłumaczenia. jest kolumna „Distance from Origin Reference Frame”. Wynikiem jest liczba komórek w tym obszarze. Wartość tę należy podzielić przez objętość obszaru, aby uzyskać gęstość komórek.
    11. W podobny sposób oblicz liczbę komórek w obszarze przejściowym, używając funkcji 'COUNTIF (KolumnaProszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia., "< Xzewnętrzna, wewnętrzna krawędź") - LICZ.JEŻELI(KolumnaWprowadź tekst do przetłumaczenia., "> Xprzejściowy, wewnętrzna krawędź").
    12. Oblicz liczbę komórek w obszarze zewnętrznym, korzystając z funkcji „COUNTIF (KolumnaProszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia.,"> Xprzejściowy, wewnętrzna krawędź").
  5. Ocena regionalnej gęstości komórek w próbkach niesferycznych poprzez „Korki regionalne” (Rycina 1B).
    UWAGA: W przypadku próbek niesferycznych, które nie posiadają koncentrycznych warstw, opracowano metodę „wycinania regionalnego” (Regional Plug) w celu pobrania próbek lokalnej gęstości komórek na różnych głębokościach promieniowych w obrębie agregatu.
    1. Powtórz kroki 4.4.1–4.4.3, aby ustawić centralny układ odniesienia (Rycina 1B, centralny żółty okrąg) i wyznaczyć całkowity promień próbki.
    2. Wykonaj obliczenia ręczne w celu wyznaczenia położenia ramek referencyjnych w obszarach przejściowych i zewnętrznych, tak aby umożliwić ocenę gęstości komórek w próbce w tych lokalizacjach.
      1. Aby obliczyć położenie zewnętrzne, należy odjąć 50 µm z wartości promienia próbki z kroku 4.5.1 i wykorzystaj tę wartość jako pozycję X.
        UWAGA: Dla wszystkich korków w obrębie danej próbki należy użyć tych samych wartości pozycji Y i Z, które zostały zapisane w kroku 4.5.1, aby zmierzyć gęstość komórek wzdłuż osi X próbki (Rycina 1B, najlewiejsze żółte koło).
      2. Nad drzewem obiektów kliknij Dodaj nowe plamy i kliknij w Pomiń automatyczne tworzenie, edytuj ręczniePrzy ustawionym kursorze w trybie „select” (wybierz), przytrzymaj klawisz shift i kliknij, aby umieścić punkt na ekranie. W menu po lewej stronie wprowadź obliczone wcześniej wartości pozycji XYZ. Dostosuj średnice XY oraz Z do wartości ≤20, aby zapewnić optymalną widoczność.
      3. Powtórz krok 4.4.2, aby dodać układ odniesienia w tym punkcie. Zmień nazwę tego układu odniesienia w drzewie obiektów na „outer” lub podobną.
      4. Aby obliczyć położenie przejściowe (punkt środkowy), należy wyznaczyć średnią z Xcentrum wartość położenia i Xzewnętrzny wartości pozycji. Wartość tę należy przyjąć jako pozycję X dla przejściowego układu odniesienia. Podobnie jak powyżej, dla wszystkich wkładek w obrębie danej próbki należy zastosować te same wartości Y i Z odnotowane w kroku 4.5.1, aby zmierzyć gęstość komórek wzdłuż osi X próbki (Rysunek 1B, środkowy żółty okrąg).
      5. Powtórz krok 4.4.2, aby umieścić środkową ramkę odniesienia w tym miejscu, a po jej utworzeniu zmień jej nazwę na „transitional” lub podobną.
    3. Kliknij plamki utworzone w kroku 4.3 i przejdź do StatystykaW prawym dolnym rogu menu kliknij Eksport wszystkich statystyk do pliku oraz zapisz dane w arkuszu kalkulacyjnym.
    4. Otwórz arkusz kalkulacyjny. Przejdź do karty Distance from Origin Reference Frame. Odległość każdego obiektu od ram odniesienia jest przedstawiona w kolumnie A, a grupowanie ram odniesienia dla każdego obiektu znajduje się w kolumnie G. Użyj funkcji „MOD”, aby numerycznie przypisać każdą odległość do odpowiadającej jej ramy odniesienia, gdzie 0 to rama centralna, 1 to przejściowa, a 2 to zewnętrzna.
    5. Przefiltruj wartości w tej kolumnie, aby pracować z odległościami w każdym układzie odniesienia. Dla każdego z układów odniesienia oblicz liczbę obiektów znajdujących się w odległości do 50 mikrometrów od układu, korzystając z funkcji 'COUNTIF (KolumnaProszę podać tekst źródłowy do przetłumaczenia., "≤50"), gdzie KolumnaPrześlij proszę tekst źródłowy do tłumaczenia. kolumną „Odległość od układu odniesienia początku układu współrzędnych” (Distance from Origin Reference Frame) dla każdej grupy. Otrzymana wartość odpowiada liczbie komórek w tym regionalnym wycinku. Wartość tę należy podzielić przez objętość 10-μm podłączyć w celu wyznaczenia gęstości komórkowej.
  6. Wykonaj metodę Spatially-Refined Regional Plug (Rysunek 1C).
    UWAGA: Podejście to zostało zastosowane w celu oceny regionalnej żywotności komórek w odpowiedzi na zastosowanie leku. Uwzględnienie większej liczby klatek referencyjnych poprawia rozdzielczość obliczeń gęstości komórek w całej grubości modelu.
    1. Powtórz kroki 4.4.1–4.4.3, aby ustawić środkową ramkę odniesienia (Rysunek 1C, centralne żółte koło) i wyznaczyć promień próbki.
    2. Wykonaj obliczenia ręcznie, aby wyznaczyć dodatkowe obszary zainteresowania. W tym celu dodaj 100 µm do Xcentrum wartość, a następnie użyj wartości Y i Z punktu środkowego, aby zdefiniować pierwszą lokalizację wzdłuż osi środkowej. Dodaj układ współrzędnych w tej pozycji, zgodnie z opisem w kroku 4.4.2 (Rysunek 1C, żółte koło sąsiednie z kołem środkowym).
      UWAGA: Dodaj mniej µm na tym etapie, w przypadku dążenia do uzyskania wyższej rozdzielczości śledzenia gęstości.
    3. Powtórzyć kroki 4.6.2, dodając 100 µm (lub pożądana liczba µm) do każdej kolejnej lokalizacji w osi X, aby utworzyć oś równomiernie rozmieszczonych próbników w całej grubości próbki. Umieść ostatnią ramkę referencyjną ≤50 µm oddalając się od promienia zewnętrznego próbki (Rycina 1C, żółte kółka).
    4. Powtórz kroki 4.5.3–4.5.5, aby uzyskać liczbę komórek w każdej 100 µm średnica wycinka. Wartości te należy podzielić przez objętość każdego odpowiadającego im wycinka, aby uzyskać lokalną gęstość komórek.
    5. Powtórz wszystkie etapy w tej sekcji dla danych OCT zebranych w każdym punkcie czasowym badania nad lekiem. Porównanie liczby komórek w każdym miejscu w czasie trwania leczenia powinno ujawnić, gdzie gęstość komórek spada (tj. w obszarach dochodzących do śmierci komórkowej) i w konsekwencji, na jaką głębokość przenika lek (tj. w których warstwach następuje spadek gęstości komórek). kontra(te, które utrzymują lub wykazują wzrost poziomu gęstości komórek).

figure-protocol-1
Rycina 1: Ilustracja schematyczna. (A) Metoda koncentrycznych warstw (powłok) służąca do oceny regionalnej gęstości komórek w agregatach sferycznych. (B) Metoda regionalnych wtyczek opracowana w celu oceny lokalnej gęstości komórek w agregatach niesferycznych, w której małe sferyczne wtyczki (o średnicy 10 µm, zaznaczone na żółto) są wykorzystywane jako wskaźniki gęstości w każdej strefie/grubości. (C) Przestrzennie doprecyzowana metoda regionalnych wtyczek stosowana w badaniach nad penetracją leków. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Wcześniejszej publikacji opracowano metodę nieniszczącego pomiaru globalnej gęstości komórek w obrębie agregatów komórkowych z wykorzystaniem OCT.10W niniejszej pracy technika ta została rozszerzona w celu oceny regionalnej gęstości komórek w rozwijających się agregatach komórkowych. Rycina 1 przedstawia schemat tego rozszerzenia, w którym gęstość komórek można ocenić w koncentrycznych warstwach sferoidu lub bardziej lokalnie, analizując zamiast tego niewielkie (100 &...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Znaczenie
Wielokomórkowe sferoidy nowotworowe (MCTS) to potężne modele 3D in vitro do badania progresji guza i badań przesiewowych leków 1,2,3. Zwiększenie użyteczności tych stosunkowo prostych modeli zagregowanych zależy w dużej mierze od scharakteryzowania ich kluczowych cech, takich jak morfologia i gęstość komórek, o których wiadomo, że wpływają zarówno na progresję modelu nowotworu, jak i odpo...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

To badanie było wspierane przez NIH R01 BRG CA207725 (MB/DTC) i NIH R01 CA233188 (MB). Chcielibyśmy podziękować AMC Pharmacy za Trastuzumab dostarczony do tych eksperymentów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Płytki 96-dołkoweGreiner Bio-One 650970Powierzchnia odstraszająca komórki CellStar, https://shop.gbo.com/en/usa/products/bioscience/cell-culture-products/cellstar-cell-repellent-surface/
0,25% trypsyna, 2,21 mM EDTACorning25-053-CI
AU565 komórki raka piersiATCC
Zmodyfikowany Dulbecco's Eagle's MediumCorning10-013-CV
Płodowa surowica bydlęcaATCC30-2020
FIJI oprogramowanieopen-source(Fidżi to sprawiedliwe) ImageJ v2.1 / 1.5.3jPobrane z https://imagej.net/software/fiji/
HemocytometrFisher Scientific0267151B
Oprogramowanie do analizy obrazu ImarisBitplaneAktualna wersja 9.8
L-glutaminaLonza17-605E
MatrigelCorning354263
MDA-MB-231 komórki raka piersiATCC
ZeissZ1 AxioVision
Penicilin streptomycynaCorning30-0002CI
Wirówka płytkowaEppendorf
RPMI medium 1640Gibco11875-085
Domena spektralna Optyczna tomografia koherentnaThorLabsTEL220C1
Kolby do hodowli komórkowych T75Greiner Bio-One 
Pozostałości trastuzumabuPróbki kliniczne trastuzumabu, hojnie podarowane przez Albany Medical College Pharmacy. 
Mikroskop Wtym badaniu wykorzystano 658175

Bibliografia

  1. Sutherland, R., JA, M., Inch, W. Growth of multicell spheroids in tissue culture as a model of nodular carcinomas. Journal of the National Cancer Institute. 46 (1), 113-120 (1971).
  2. Sachs, N., et al. A living biobank of breast cancer organoids captures disease heterogeneity. Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).
  3. Nagelkerke, A., Bussink, J., Sweep, F. C. G. J., Span, P. N. Generation of multicellular tumor spheroids of breast cancer cells: How to go three-dimensional. Analytical Biochemistry. 437 (1), 17-19 (2013).
  4. Kunz-Schughart, L. A., Freyer, J. P., Hofstaedter, F., Ebner, R. The use of 3-D cultures for high-throughput screening: The multicellular spheroid model. Journal of Biomolecular Screening. 9 (4), 273-285 (2004).
  5. Hirschhaeuser, F., et al. Multicellular tumor spheroids: An underestimated tool is catching up again. Journal of Biotechnology. 148 (1), 3-15 (2010).
  6. Jiang, Y., Pjesivac-Grbovic, J., Cantrell, C., Freyer, J. P. A multiscale model for avascular tumor growth. Biophysical Journal. 89 (6), 3884-3894 (2005).
  7. Freyei, J. P., Sutherland, R. M. Regulation of growth saturation and development of necrosisin EMT6/R0 multicellular spheroids by the glucose and oxygen supply. Cancer Research. 46 (7), 3504-3512 (1986).
  8. Desoize, B., Jardillier, J. C. Multicellular resistance: a paradigm for clinical resistance. Critical Reviews in Oncology Hematology. 36 (2-3), 193-207 (2000).
  9. Mellor, H. R., Ferguson, D. J. P., Callaghan, R. A model of quiescent tumour microregions for evaluating multicellular resistance to chemotherapeutic drugs. British Journal of Cancer. 93 (3), 302-309 (2005).
  10. Roberge, C. L., et al. Non-destructive tumor aggregate morphology and viability quantification at cellular resolution, during development and in response to drug. Acta Biomaterialia. 117, 322-334 (2020).
  11. Piccinini, F., Tesei, A., Bevilacqua, A. Single-image based methods used for non-invasive volume estimation of cancer spheroids a practical assessing approach based on entry-level equipment. Computer Methods and Programs in Biomedicine. 135, 51-60 (2016).
  12. Imamura, Y., et al. Comparison of 2D- and 3D-culture models as drug-testing platforms in breast cancer. Oncology Reports. 33 (4), 1837-1843 (2015).
  13. Song, Y., et al. Patient-derived multicellular tumor spheroids towards optimized treatment for patients with hepatocellular carcinoma. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research. 37 (1), 1-13 (2018).
  14. LaBarbera, D. V., Reid, B. G., Yoo, B. H. The multicellular tumor spheroid model for high-throughput cancer drug discovery. Expert Opinion on Drug Discovery. 7 (9), 819-830 (2012).
  15. Hakanson, M., Textor, M., Charnley, M. Engineered 3D environments to elucidate the effect of environmental parameters on drug response in cancer. Integrative Biology. 3 (1), 31-38 (2011).
  16. Pickl, M., Ries, C. H. Comparison of 3D and 2D tumor models reveals enhanced HER2 activation in 3D associated with an increased response to trastuzumab. Oncogene. 28 (3), 461-468 (2009).
  17. Huang, D., et al. Optical coherence tomography HHS public access. Science. 254 (5035), 1178-1181 (1991).
  18. Zhong, H. Q., et al. Enhancement of permeability of glycerol with ultrasound in human normal and cancer breast tissues in vitro using optical coherence tomography. Laser Physics Letters. 7 (5), 388-395 (2010).
  19. Fujimoto, J., Swanson, E. The development, commercialization, and impact of optical coherence tomography. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 57 (9), (2016).
  20. Huang, Y., et al. Optical coherence tomography detects necrotic regions and volumetrically quantifies multicellular tumor spheroids. Cancer Research. 77 (21), 6011-6020 (2017).
  21. Hari, N., Patel, P., Ross, J., Hicks, K., Vanholsbeeck, F. Optical coherence tomography complements confocal microscopy for investigation of multicellular tumour spheroids. Scientific Reports. 9 (1), 1-11 (2019).
  22. El-Sadek, I. A., et al. Three-dimensional dynamics optical coherence tomography for tumor spheroid evaluation. Biomedical Optics Express. 12 (11), 6844(2021).
  23. Kingsley, D. M., et al. Laser-based 3D bioprinting for spatial and size control of tumor spheroids and embryoid bodies. Acta Biomateralia. 95, 357-370 (2019).
  24. Absher, M. Hemocytometer counting. Tissue Culture. , 395-397 (1973).
  25. Roberge, C. L., Rudkouskaya, A., Barroso, M., Corr, D. T. Longitudinal, label-free assessment of cell density and viability in multicellular tumor spheroids via optical coherence tomography. Summer Biomechanics, Bioengineering, and Biotransport Conference. , (2020).
  26. Bellotti, C., Duchi, S., Bevilacqua, A., Lucarelli, E., Piccinini, F. Long term morphological characterization of mesenchymal stromal cells 3D spheroids built with a rapid method based on entry-level equipment. Cytotechnology. 68 (6), 2479-2490 (2016).
  27. Noto, A., et al. Stearoyl-CoA desaturase-1 is a key factor for lung cancer-initiating cells. Cell Death & Disease. 4 (12), 947(2013).
  28. Riffle, S., Hegde, R. S. Modeling tumor cell adaptations to hypoxia in multicellular tumor spheroids. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research. 36, 102(2017).
  29. Wilson, W. R., Hay, M. P. Targeting hypoxia in cancer therapy. Nature Reviews Cancer. 11, 393-410 (2011).
  30. Grimes, D. R., Kelly, C., Bloch, K., Partridge, M. A method for estimating the oxygen consumption rate in multicellular tumour spheroids. Journal of the Royal Society Interface. 11 (92), 20131124(2014).
  31. Nath, S., Devi, G. R. Three-dimensional culture systems in cancer research: Focus on tumor spheroid model. Pharmacology & Therapeutics. 163, 94-108 (2016).
  32. Pozzi, S., et al. Meet me halfway: Are in vitro 3D cancer models on the way to replace in vivo models for nanomedicine development. Advanced Drug Delivery Reviews. 175, 113760(2021).
  33. Nguyen, E. H., Daly, W. T., Belair, D. G., Le, N. N., Murphy, W. L. High throughput screening format identifies synthetic mimics of matrigel for tubulogenesis screening. , Available from: https://abstracts.biomaterials.org/data/papers/2015/abstracts/547.pdf (2015).
  34. Duchnowska, R., Szczylik, C. Central nervous system metastases in breast cancer patients administered trastuzumab. Cancer Treatment Reviews. 31 (4), 312-318 (2005).
  35. Zazo, S., et al. Generation, characterization, and maintenance of trastuzumab-resistant HER2+ breast cancer cell lines. American Journal of Cancer Research. 6 (11), 2661-2678 (2016).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Modele sferoidów nowotworowychoptyczna tomografia koherentnaobrazowanie strukturalne 3Danaliza 3D w programie Imarispenetracja lekówagregaty raka piersigradient gęstości komórekleczenie trastuzumabem
Nieniszcząca ocena regionalnej gęstości komórek w agregatach nowotworowych po leczeniu farmakologicznym
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.