Artykuł metodologiczny

Modele kolonizacji pochwy myszy przez bakterie hodowane beztlenowo

5.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/64032

⸱

25 maja 2022

 ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Biology and Biomedical Sciences, Washington University School of Medicine, 2Department of Obstetrics, Gynecology, and Reproductive Sciences, University of California, 3Glycobiology Research and Training Center, UCSD, 4Department of Pediatrics, Washington University School of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

Protokół przedstawia mysi model kolonizacji pochwy za pomocą beztlenowo hodowanych ludzkich bakterii pochwy. Skupiamy się na Gardnerella vaginalis, jednocześnie zamieszczając sugestie dotyczące Prevotella bivia i Fusobacterium nucleatum. Protokół ten może być również stosowany jako przewodnik do inokulacji dopochwowych i realnego odzyskiwania innych bakterii hodowanych beztlenowo.

Streszczenie

Pochwa ssaków może być skolonizowana przez wiele taksonów bakteryjnych. Ludzki mikrobiom pochwy jest często zdominowany przez gatunki Lactobacillus, ale jedna na cztery kobiety doświadcza bakteryjnego zapalenia pochwy, w którym niskiemu poziomowi pałeczek kwasu mlekowego towarzyszy przerost różnych bakterii beztlenowych. Stan ten wiąże się z wieloma komplikacjami zdrowotnymi, w tym zagrożeniami dla zdrowia reprodukcyjnego i seksualnego. Chociaż istnieje coraz więcej dowodów wskazujących na złożoną naturę interakcji mikrobiologicznych w zdrowiu pochwy człowieka, indywidualne role tych różnych bakterii beztlenowych nie są w pełni poznane. Sytuację komplikuje brak odpowiednich modeli do badania bakterii pochwy hodowanych beztlenowo. Modele mysie pozwalają nam badać biologię i zjadliwość tych organizmów in vivo. Inne mysie modele inokulacji bakteryjnej pochwy zostały już wcześniej opisane. W tym miejscu opisujemy metody inokulacji bakterii hodowanych beztlenowo i ich żywotnego odzyskiwania u konwencjonalnie hodowanych myszy C57Bl/6. Opisano również nową, mniej stresującą metodę proceduralną inokulacji i mycia pochwy. Szczegółowo przedstawiono inokulację i realne odzyskiwanie Gardnerella oraz omówiono strategie dla dodatkowych beztlenowców, takich jak Prevotella bivia i Fusobacterium nucleatum.

Wprowadzenie

U ssaków pochwa jest domem dla konsorcjum gatunków bakterii. Ludzki mikrobiom pochwy jest wyjątkowy wśród ssaków ze względu na obfitość członków rodzaju Lactobacillus i odpowiadające mu niskie pH pochwy (3,8-4,5)1,2,3,4. Zakłócenie tej dominacji Lactobacillus wiąże się z różnymi negatywnymi skutkami zdrowotnymi.

W bakteryjnym zapaleniu pochwy (BV) występuje mniej pałeczek kwasu mlekowego i zwiększona obfitość różnorodnych bakterii beztlenowych, takich jak Gardnerella vaginalis i Prevotella bivia5,6. Kobiety z BV są narażone na zwiększone ryzyko infekcji przenoszonych drogą płciową7,8,9, niepłodność10, utrata ciąży11, przedwczesny poród12,13,14, zakażenia wewnątrzmaciczne15, infekcje szyjki macicy16oraz cancer16,17,18. BV wiąże się również z większym prawdopodobieństwem kolonizacji pochwy przez potencjalnie chorobotwórcze bakterie, takie jak Fusobacterium nucleatum1,19,20, powszechny izolat od infekcji płynem owodniowym21.

Ze względu na znaczenie bakterii beztlenowych dla zdrowia pochwy człowieka, istnieje zapotrzebowanie na modele zwierzęce, które mogą być wykorzystane do badania biologii i patogenezy tych organizmów. W tym miejscu opisujemy metody inokulacji dopochwowej i realnego odzyskiwania Gardnerella vaginalis u myszy estrogenizowanych i sugerujemy dodatkowe strategie dla Prevotella bivia i Fusobacterium nucleatum. Inne modele mysiej kolonizacji pochwy zostały wcześniej opisane, ale skupiały się one na inokulacji i odzyskiwaniu fakultatywnych bakterii beztlenowych, takich jak Streptococcus22 i Neisseria gonorrhoeae23, które były hodowane tlenowo. Inokulacja i odzysk obligatoryjnych beztlenowców mogą być z powodzeniem zrealizowane dzięki odpowiednim strategiom eksperymentalnym. Omawiamy podejścia do realnego odtworzenia kilku taksonów bakteryjnych i sugerujemy empiryczną ocenę warunków żywotności dodatkowych gatunków/szczepów będących przedmiotem zainteresowania.

Klasyczną metodą szacowania kolonizacji przez żywe bakterie jest odzyskiwanie jednostek tworzących kolonie (CFU). U myszy hodowanych konwencjonalnie z własną endogenną mikrobiotą wymaga to regeneracji na pożywce agarowej, która selekcjonuje przeciwko członkom endogennej mikrobioty pochwy, jednocześnie umożliwiając wzrost zaszczepionego szczepu bakterii. W tym przypadku używamy opornego na streptomycynę izolatu G. vaginalis24, który można selektywnie odzyskać na pożywce agarowej zawierającej streptomycynę. Aby zapewnić, że pożywka jest wystarczająco selektywna i odwrotnie, że bakterie oporne na streptomycynę nie są obecne w endogennym mikrobiomie, płukanie pochwy pobrane tuż przed inokulacją powinno być posiewane na selektywnym (zawierającym streptomycynę) agarze

.

Najlepsza metoda przygotowania inokulum może się różnić w zależności od gatunku i szczepu bakterii. Przed rozpoczęciem eksperymentów na myszach należy przeprowadzić wstępne prace w celu określenia preferowanych warunków dla pożywki hodowlanej, punktu końcowego wzrostu i przygotowania inokulum, a także wrażliwości na tlen i żywotności w PBS. W przypadku bakterii bardziej wrażliwych na tlen można rozważyć alternatywne preparaty inokulum (np. w pożywce do hodowli beztlenowej z odpowiednią grupą kontrolną nośnika)25,26.

Protokół

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone i przeprowadzone zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi oraz Przewodnikiem po opiece i użytkowaniu zwierząt laboratoryjnych Uniwersytetu Kalifornijskiego w San Diego (UCSD, numer protokołu: S20057, 2020-i nowsze), a wcześniej na Uniwersytecie Waszyngtońskim w St. Louis (Protokół 20110149, do 2020 roku).

UWAGA: Poniższy protokół wykorzystuje tradycyjnie hodowane samice myszy C57Bl/ w wieku 6-11 tygodni w momencie szczepienia. Proszę zwrócić uwagę na informacje o dostawcy i konkretnych przedziałach wiekowych użytych wcześniej w odpowiedniej cytowanej pracy.

1. Przygotowanie i podawanie 17-walerianianu β-estradiolu

UWAGA: 17-walerianian β-estradiolu jest substancją rakotwórczą i reprodukcyjną, która może być wchłaniana przez skórę27,28. Nosić odpowiednie środki ochrony osobistej podczas pracy z proszkiem i płynnym roztworem. Jest to również toksyna wodna29; Zutylizować go w odpowiednio zamkniętym i oznakowanym pojemniku.

  1. Filtr: wysterylizuj do 50 ml oleju sezamowego przez filtr 0,22 μm za pomocą systemu filtrów próżniowych z rurką stożkową o pojemności 50 ml. Otwierać tylko w komorze bezpieczeństwa biologicznego, aby zachować sterylność.
  2. Oblicz objętość roztworu walerianianu β-estradiolu potrzebnego do eksperymentu: 200 μl na mysz plus 2-3 ml dodatkowo, aby uwzględnić utratę próbki podczas napełniania strzykawki (np. eksperyment z udziałem 10 myszy wymaga łącznie 4 ml). Obliczyć ilość walerianianu β-estradiolu potrzebną do przygotowania roztworu o stężeniu 5 mg/ml i zważyć go bezpośrednio w 14 ml probówce okrągłodennej.
  3. Szczelnie zakręć probówkę o pojemności 14 ml i przemieszaj, aby rozbić grudki w proszku (umożliwi to szybsze rozpuszczenie walerianianu β-estradiolu). Dodać sterylnie przefiltrowany olej sezamowy do probówki o pojemności 14 ml tak, aby końcowe stężenie walerianianu β-estradiolu wynosiło 5 mg/ml.
  4. Umieść szczelnie zakorkowaną probówkę o pojemności 14 ml na rotatorze w temperaturze 37 °C na 30-40 minut, aż stały proszek całkowicie się rozpuści. Wizualnie potwierdzić jednorodność roztworu przed wstrzyknięciem myszom. Inkubacja w temperaturze 37 °C zmniejsza lepkość oleju sezamowego, ułatwiając jego wstrzykiwanie.
  5. Pobrać roztwór walerianianu β-estradiolu do strzykawki o pojemności 1 ml (bez igły). Aby to zrobić bez wprowadzania bąbelków, najpierw nabierz trochę roztworu, a następnie delikatnie wydmuchnij, trzymając końcówkę strzykawki w oleju sezamowym. Ponownie powoli nabrać roztwór, nieznacznie przekraczając oznaczenie 100 μl.
  6. Umieścić igłę 25 G x 5/8 cala na strzykawce. Następnie zagruntuj igłę, powoli wypychając roztwór oleju sezamowego, aż zacznie wydostawać się z końcówki igły. Wylać roztwór, aż strzykawka znajdzie się na oznaczeniu 100 μl. Przygotować jedną strzykawkę na mysz.
  7. 17-walerianian β-estradiolu należy podać we wstrzyknięciu dootrzewnowym po 48 godzinach lub 72 godzinach przed inokulacją. Wstrzyknąć każdej myszy 100 μl roztworu walerianianu β-estradiolu o stężeniu 5 mg/ml (0,5 mg walerianianu β-estradiolu/myszy), jak opisano wcześniej22,30. Pozostały roztwór należy przechowywać w temperaturze 4 °C przez 72 godziny, do następnego wstrzyknięcia.
  8. Roztwór walerianianu β-estradiolu należy podać ponownie w dniu inokulacji, bezpośrednio przed inokulacją dopochwową myszy. Usunąć roztwór z temperatury 4 °C i umieścić go na rotatorze w temperaturze 37 °C na 30 minut przed wstrzyknięciem, aby olej sezamowy rozgrzał się i stał się mniej lepki. Wstrzyknięcia należy wykonywać zgodnie z opisem w kroku 1.7.

2. Przygotowanie inokulum

UWAGA: Ta sekcja zawiera ogólne kroki przygotowania inokulacji z odpornej na streptomycynę szczepu Gardnerella vaginalis JCP8151B-SmR24,25,31,32. Wszystkie kroki opisane w tej sekcji należy wykonać w komorze beztlenowej.

  1. Wszelkie odczynniki, w tym przygotowany bulion NYC III, agar i PBS, należy umieścić w komorze beztlenowej w celu zrównoważenia co najmniej 24 godziny przed użyciem.
    UWAGA: W tym przypadku zastosowano winylową komorę beztlenową zrównoważoną 5% mieszanką wodoru gazowego. Wewnętrzne stężenie tlenu zwykle wynosi 0 ppm, chociaż mogą wystąpić przejściowe wzrosty niskiego poziomu (10-25 ppm) podczas cyklicznego wprowadzania materiałów do komory.
  2. Dwa dni przed inokulacją dopochwową rozprowadź Gardnerella z zamrożonego wywaru glicerolowego na płytkę agarową NYC III w komorze beztlenowej. Użyj małego pojemnika (takiego jak puste pudełko na końcówki do pipet) wypełnionego suchym lodem, aby utrzymać zapas glicerolu zamrożony podczas transportu do i z komory.
  3. Na 1 dzień przed inokulacją dopochwową należy użyć 5-10 pojedynczych kolonii Gardnerella z płytki, aby zaszczepić 10 ml bulionu NYC III. Pozostawić płynną kulturę do wzrostu przez noc przez 16 godzin w temperaturze 37 °C. Dodać drugą 1 ml podwielokrotność pożywki, która pozostała niezaszczepiona, i inkubować ją razem z zaszczepioną kulturą, aby potwierdzić, że pożywka nie jest zanieczyszczona.
  4. Przygotować inokulum z płynnej kultury, jak opisano poniżej. Przygotowanie inokulum należy w miarę możliwości przeprowadzić w komorze beztlenowej.
    1. Oznaczyć gęstość optyczną kultury (OD), dodając 200 μl kultury do 800 μl świeżej pożywki w kuwecie o pojemności 1,5 ml (rozcieńczenie 1:5). Użyć spektrofotometru do pomiaru gęstości (OD) rozcieńczonej kultury przy długości fali 600 nm (użyć oddzielnej kuwety z samą świeżą pożywką jako ślepą próbą). Pomnóż odczyt OD przez 5, aby uzyskać rzeczywisty OD600 z 16-godzinnej hodowli.
    2. Oblicz objętość inokulum potrzebną do eksperymentu. Na przykład, aby zarazić 15 myszy inokulum w ilości 20 μl na mysz, potrzeba 15 x 20 μl = 300 μl inokulum. Przygotuj około 25% więcej inokulum niż potrzeba, więc dla 15 myszy przygotuj 300 μL + (0,25 x 300 μL) = 375 μL inokulum.
    3. Korzystając z OD600 oznaczonego w kroku 2.4.1, obliczyć objętość 16-godzinnej hodowli, która musi być odwirowana i ponownie zawieszona, aby uzyskać inokulum OD600 = 5,0 w objętości obliczonej w kroku 2.4.2. Na przykład, jeśli OD600 w kulturze wynosi 1,5, a potrzebna objętość inokulum wynosi 375 μl, to objętość kultury do odwirowania wynosi (375 μL x 5)/1,5 = 1250 μL.
    4. Odpipetować objętość kultury obliczoną w kroku 2.4.3 do sterylnej probówki mikrowirówkowej. Bakterie osadzać przez odwirowanie przy 16 000 x g przez 1-3 minuty.
    5. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w beztlenowym PBS w objętości obliczonej w kroku 2.4.2. Inokulum będzie teraz miało obliczony OD600 równy 5,0. W stosownych przypadkach należy również przygotować probówkę PBS, która posłuży jako nośnik kontrolny dla myszy w niezakażonej grupie kontrolnej.
  5. Przed wyjęciem probówki z inokulum z komory beztlenowej należy przygotować serię seryjnych rozcieńczeń od 1:10 do 1:10 x 106 w PBS. Na płytce punktowej umieścić 5 powtórzeń każdego rozcieńczenia na płytce agarowej za pomocą pipety wielokanałowej w celu określenia CFU inokulum. To jest CFU przed inokulacją.

3. Wstępne płukanie pochwy i inokulacja preparatem Gardnerella

  1. Przygotować probówki do płukania/płukania pochwy w komorze beztlenowej (można to zrobić w tym samym czasie, co przygotowanie inokulum w kroku 2.4.). Pobrać pipetę 70 μl sterylnego, beztlenowego PBS do 1,5 ml probówek wirówkowych o pojemności 1,5 ml oznaczonych numerami myszy. Przygotuj jedną rurkę myjącą na mysz. Szczelnie zamknij rurki i wyjmij je z komory beztlenowej.
  2. Na każdej myszy należy wykonać płukanie dopochwowe za pomocą 50 μl beztlenowego PBS z poszczególnych probówek przygotowanych w kroku 3.1. Te płukanki dopochwowe są płukankami przed inokulacją i mogą być używane do dalszych pomiarów i testów.
    1. Po podaniu drugiego wstrzyknięcia walerianianu β-estradiolu (krok 1.8), umieść każdą mysz na klatce lub czystej, twardej powierzchni, którą może chwycić przednimi łapami. Delikatnie chwyć środkową część ogona i unieś tak, aby kończyny tylne były lekko uniesione, a otwór pochwy odsłonięty.
    2. Za pomocą pipety i końcówki filtra p-200 pobrać 50 μl PBS z rurki myjącej odpowiadającej odpowiedniej myszy. Delikatnie włóż końcówkę pipety do światła pochwy ~2-3 mm i delikatnie odpipetuj objętość 50 μl, 3x-4x.
    3. Przenieś zebrany materiał do mycia (~50 μl) z powrotem do tej samej rurki myjącej, z której pochodzi, pipetując w górę iw dół w probówce do mycia, która nadal zawiera pozostałe 20 μl PBS. Jeśli jest nadmiar śluzu i końcówka zostanie zatkana, użyj czystej końcówki p-200, aby zebrać pozostały materiał i umieścić go w tej samej rurce myjącej.
  3. Dopochwowo podawać 20 μl skoncentrowanej zawiesiny bakteryjnej lub środka do kontroli nośnika do pochwy każdej myszy. Zaszczepić każdą mysz bezpośrednio po płukaniu pochwy dla tej myszy (tj. wykonać płukanie i inokulację w sekwencji dla każdej myszy przed przejściem do następnej). Aby uprościć ten proces, użyj dwóch pipet p200 - jednej ustawionej na 50 μl do płukania, a drugiej na 20 μl do inokulacji.
    1. Unieruchom, jak opisano w kroku 3.2.1. Za pomocą końcówki p-200 odpipetuj 20 μl zawiesiny bakteryjnej do pochwy. W przypadku eksperymentów z jednoczesnym inokulacją przy użyciu dwóch różnych gatunków/szczepów bakterii, należy użyć 10 μl każdej zawiesiny bakteryjnej i unikać mieszania dwóch szczepów przed inokulacją.
      UWAGA: Całkowita objętość inokulacji nie powinna przekraczać 20 μl, aby uniknąć rozlania się z pochwy.
    2. Kontynuuj trzymanie tylnego końca każdej myszy przez 10-20 sekund, aby zapobiec natychmiastowemu gromadzeniu się podanej objętości w introicie pochwy. Następnie umieść mysz w nowej klatce/pojemniku lub z towarzyszami z klatki, którzy zostali już zaszczepieni.
    3. Powtórz kroki 3.2 i 3.3 dla każdej myszy. Nigdy nie umieszczaj myszy z powrotem w klatce ze zwierzętami, które nie zostały jeszcze zaszczepione. Zapobiega to przypadkowemu narażeniu myszy na bakterie oporne na streptomycynę przed inokulacją.
  4. Po zaszczepieniu wszystkich myszy, wprowadź probówkę z inokulum z powrotem do komory beztlenowej. Przygotować i poddać na płytkę kolejne seryjne rozcieńczenie, jak opisano w kroku 2.5. To jest CFU po inokulacji. Porównaj jtk z płytek po inokulacji i przed inokulacją, aby określić, czy żywotność inokulum zmniejszyła się poza komorą beztlenową podczas inokulacji zwierząt.
  5. Płukanki z pochwy pobrane w kroku 3.2 należy umieścić na selektywnym agarze (w tym przypadku 1 mg/ml streptomycyny). Inkubować płytki przez 1-2 dni w komorze beztlenowej w temperaturze 37 °C i badać pod kątem wzrostu.
    UWAGA: Wzrost wskazuje, że endogenni członkowie mikrobiomu są oporni na marker selekcyjny i dlatego mogą zaciemniać liczenie CFU organizmu docelowego.

4. Zbiór płukanek z pochwy w celu określenia żywotnej kolonizacji Gardnerella

  1. Zbierz płyny do płukania pochwy w wybranych punktach czasowych, aby przeanalizować kolonizację pochwy. Zbierz zgodnie z opisem w kroku 3.2.
  2. Natychmiast po pobraniu należy przekierować płukanie pochwy do komory beztlenowej. Użyć 10 μl każdego płukania do przeprowadzenia seryjnego rozcieńczania i posiewu na selektywnym agarze zgodnie z opisem w kroku 2.5. Użyj liczby CFU jako miary kolonizacji pochwy przez Gardnerella (lub inny beztlenowiec będący przedmiotem zainteresowania).

5. Ofiara, sekcja i homogenizacja tkanek

  1. Przygotuj probówkę o pojemności 5 ml dla każdego narządu pobieranego od każdej myszy (na przykład, jeśli pobierana jest pochwa, szyjka macicy i macica, przygotuj trzy probówki na mysz). Napełnij każdą probówkę sterylnym beztlenowym 1x PBS (lub innym medium homogenizacyjnym) w komorze beztlenowej. Użyj 1 ml PBS do probówek używanych do pobierania pochwy i szyjek macicy oraz 750 μl do probówek używanych do pobierania rogów macicy.
  2. Po dodaniu PBS zważ każdą pojedynczą probówkę (jest to masa pobrana przed pobraniem i zostanie wykorzystana do określenia całkowitej masy każdej pobranej tkanki). Jeśli waga nie jest dostępna w komorze beztlenowej, szczelnie zakręć probówki i wyjmij je z komory do ważenia, a następnie włóż je z powrotem do środka.
    UWAGA: Przygotowanie probówki i pobranie wagi można wykonać 1 dzień przed złożeniem ofiary, ale probówki powinny być przechowywane w komorze beztlenowej z szczelnie zamkniętymi nakrętkami, aby zapobiec parowaniu.
  3. Przygotuj zestaw probówek do płukania pochwy zgodnie z opisem w kroku 3.1, aby zebrać ostatnią płukankę w momencie złożenia jej w ofierze. Przygotuj również 50 ml zlewki z wodą dejonizowaną (DI) i drugą 50 ml zlewki z 70%-90% etanolem, aby użyć ich do płukania i sterylizacji standardowych stalowych narzędzi preparacyjnych podczas składania ofiary.
  4. Wyjmij rurki do pobierania narządów wypełnione PBS z komory beztlenowej. Trzymaj probówki szczelnie zamknięte, aż chusteczki będą gotowe do dodania.
  5. Poświęć każdą mysz przy użyciu metod zatwierdzonych przez IACUC. Wykonaj końcowe płukanie zgodnie z opisem w krokach 3.2.2. oraz 3.2.3. albo bezpośrednio przed złożeniem ofiary, albo bezpośrednio po niej.
  6. Rozpocznij sekcję i pobieranie tkanek. Spryskaj brzuch i grzbiet każdej myszy 70% etanolem. Wysterylizuj nożyczki w zlewce z etanolem, pozwól im wyschnąć, a następnie wykonaj pojedyncze pionowe cięcie jamy brzuszno-miednicznej myszy.
  7. Użyj sterylnych kleszczy, aby odciągnąć skórę i delikatnie wypchnąć jelita z jamy ciała na bok otwartego pola, co odsłoni drogi rodne.
    UWAGA: Uważaj, aby nie przekłuwać ani nie przekłuwać jelit, ponieważ mogą one zawierać bakterie oporne na streptomycynę, które mogą zakłócić wyniki eksperymentu.
  8. Aby pobrać maksymalną ilość tkanki pochwy, należy złamać kość łonową podczas sekcji zwłok. Za pomocą sterylnych nożyczek przytnij środek kości łonowej (spojenie łonowe), uważając, aby nie przeciąć pochwy. Używając dwóch zestawów sterylnych kleszczy, chwyć każdą stronę miednicy i rozsuń miednicę na boki, odsłaniając dolną część pochwy pod spodem.
  9. Użyj kleszczy, aby delikatnie chwycić szyjkę macicy (twardsza struktura w porównaniu z otaczającą tkanką). Delikatnie pociągnij szyjkę macicy, aby odsłonić okrężnicę, ukrytą z tyłu i ściśle połączoną z pochwą.
  10. Użyj małych nożyczek, aby uwolnić pochwę z zewnętrznych tkanek łącznych. Ostrożnie oddziel pochwę od okrężnicy i unikaj nakłuwania przewodu pokarmowego. Po całkowitym zwolnieniu opuść pochwę na introitusie nożyczkami i odetnij, aby uwolnić się z ciała myszy.
  11. Delikatnie chwyć szyjkę macicy, jednocześnie lekko podciągając, aby rogi macicy były bardziej widoczne. Drugą ręką przeciąć bezpośrednio pod jajnikami po prawej i lewej stronie, aby uwolnić rogi macicy. Usuń teraz odłączony układ rozrodczy z jamy ciała i umieść go na sterylnej płytce Petriego.
  12. Za pomocą brzytwy oddziel rogi macicy, szyjkę macicy i pochwę. Umieść każdą tkankę w odpowiedniej oznakowanej probówce zbiorczej. Jeśli mają zostać pobrane cytokiny, po dodaniu tkanki umieść probówki na lodzie.
  13. Ponownie zważyć każdą probówkę po dodaniu tkanki. Jest to waga po pobraniu. Odejmij masę przed pobraniem od masy po pobraniu, aby uzyskać całkowitą masę tkanki.
  14. Użyj ręcznego homogenizatora, aby homogenizować narządy w probówkach zbiorczych. W przypadku szczepionki Gardnerella JCP8151B należy wykonać ten krok w komorze bezpieczeństwa biologicznego (tlenowo) lub w komorze beztlenowej.
    1. Przygotować kilka zestawów probówek do mycia i aseptycznego traktowania ręcznego homogenizatora między próbkami. Upewnij się, że każdy zestaw ma trzy stożkowe probówki o pojemności 50 ml: jedną wypełnioną wodą DI, jedną z 70% etanolem, a trzecią z 1x PBS. Przygotuj oddzielny zestaw probówek do płukania dla każdej grupy leczonej myszy.
    2. Aby wyczyścić homogenizator, opuść ostrza do cieczy w każdej rurce myjącej i obróć przyrząd na maksymalną prędkość. Trzymaj homogenizator w każdej z trzech probówek przez około 3 sekundy. Kolejność mycia to woda DI (w celu usunięcia zanieczyszczeń fizycznych), następnie etanol (w celu odkażenia), a na końcu 1x PBS (w celu zneutralizowania). Potrząśnij sondą na ręczniku papierowym lub jednorazowej podkładce stołowej, aby usunąć nadmiar płynu między każdym płukaniem.
    3. Po wstępnym płukaniu należy homogenizować tkanki, opuszczając sondę homogenizatora na dno probówki zbiorczej, zatrzymując tkankę pod spodem. Włącz homogenizator, aby zmielić tkankę, delikatnie przesuwając sondę w górę iw dół około 5 razy, pozostając zanurzonym. Homogenizuj każdy narząd przez około 15-30 s.
    4. Po wyłączeniu i wyjęciu homogenizatora z probówki, należy wzrokowo sprawdzić zawartość, aby upewnić się, że tkanka została całkowicie rozerwana. Jest to szczególnie ważne w przypadku szyjki macicy i pochwy, które czasami nie mogą zostać wychwycone przez sondę.
      UWAGA: Nie ma nic złego w tym, że nadmiar tłuszczu na rogach macicy nie jest w pełni homogenizowany.
    5. Powtórz kroki 5.14.1-5.14.4., myjąc i sterylizując sondę między każdą próbką. Przełącz się na nowy zestaw rurek do mycia dla każdej grupy eksperymentalnej.
  15. Przenieść probówki z homogenizowanymi próbkami do komory beztlenowej. Aby określić obciążenie bakteryjne każdej tkanki, należy przeprowadzić krótkie, delikatne wirowanie próbki do wymieszania, a następnie usunąć 100 μl homogenatu tkankowego do seryjnego rozcieńczania i posiewu na selektywnym agarze do oznaczania CFU (pierwsze rozcieńczenie to 1 x 100). Jeśli wymagana jest dolna granica wykrywalności, należy przeprowadzić posiewanie 200-250 μl nierozcieńczonego homogenatu.

Wyniki

Schematyczny rysunek przykładowego eksperymentu przedstawia niektóre z możliwych sposobów przeprowadzenia opisanego protokołu (Rysunek 1).

Niektóre zwierzęta mogą posiadać w mikrobiomie pochwy endogenne drobnoustroje, które będą rosły na pożywkach nieselektywnych. Metody opisane w niniejszej pracy opierają się na zastosowaniu izolatów badanych szczepów bakteryjnych opornych na streptomycynę oraz selektywnych pożywek zawierających streptomycynę, aby wyeliminować bakterie endogenne (Rycina 2A,B). Ponieważ oporność na streptomycynę może rozwinąć się samoistnie, badanie myszy przed infekcją (płukania w dniu 0.) może pomóc ustalić, czy zjawisko to stanowi problem.

Izolacja żywych bakterii z płukanin pochwy jest realizowana poprzez seryjne rozcieńczanie i wysiew na pożywki agarowe. Standardowa szalka Petri może pomieścić macierz 6 x 6 kropel o objętości 5 µL, co pozwala na oznaczenie miana bakterii z sześciu powtórzeń w sześciu rzędach wielkości dla każdej próbki, przy zastosowaniu dziesięciokrotnych rozcieńczeń seryjnych (Rysunek 3A). Metodę tę można wykorzystać do oznaczania miana bakterii od Gardnerella po Prevotella i Fusobacterium (Rysunek 3B-D).

Wspólnie metody te pozwalają na testowanie hipotez i formułowanie interpretacji dotyczących kolonizacji lub infekcji bakteriami dróg rodnych samicy. Na przykład porównanie mian Gardnerella w płukankach z pochwy i homogenatach tkanek pochwy wykazało zgodność między tymi metodami (Rycina 4A). Podobnie, w modelu współinokulacji pochwy, miana Prevotella w tkance macicy były znacznie wyższe (około 20-krotnie) podczas współinfekcji Gardnerella w porównaniu do monoinfekcji Prevotella (Rycina 4B). Wreszcie, w modelach tych można porównać szczepy bakteryjne typu dzikiego z mutantami, aby określić rolę, jaką poszczególne geny i ich produkty odgrywają w procesach kolonizacji i infekcji dróg rodnych. Na przykład mutant szczepu Fusobacterium, pozbawiony zdolności do transportu i utylizacji węglowodanowego kwasu sialowego, doprowadził do niższego poziomu kolonizacji w 3. dobie po inokulacji (Rycina 4C).

Schemat eksperymentu na myszach C57BL/6 przedstawiający inokulację bakteryjną oraz harmonogram podawania estradiolu.
Rysunek 1: Schemat przykładowego eksperymentu33. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Porównanie testu dyfuzji na płytkach agarowych; analiza oporności na antybiotyki; eksperyment mikrobiologiczny.
Rycina 2: Wzrost endogennych drobnoustrojów pochwy myszy na agarze selektywnym i nieselektywnym. Płukania z pochwy pięciu samic myszy C57Bl/6 (1-5) zostały wysiane na dwie różne płytki z agarem NYC III i inkubowane beztlenowo. (A) Płytka po lewej nie zawiera antybiotyków i umożliwia wzrost endogennych bakterii beztlenowych z dróg rodnych myszy. (B) Płytka po prawej zawiera 1 mg/mL streptomycyny i hamuje wzrost bakterii endogennych. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Tworzenie kolonii bakteryjnych na płytce z agarem i wykresy analizy CFU/ml dla badania wzrostu drobnoustrojów.
Rycina 3: Odzyskanie żywotnych jednostek tworzących kolonie (CFU) G. vaginalis, P. bivia oraz F. nucleatum z płukanin pochwy. (A) CFU inokulum G. vaginalis JCP8151B-SmR, wysiane metodą replikacji w serii rozcieńczeń na agarze NYC III. (B-D) Odzyskanie żywotnych (B) G. vaginalis24, (C) P. bivia25 oraz (D) F. nucleatum26 z płukanin pochwy zwierząt zakażonych pojedynczo. Dla każdego wykresu (B-D) dane zostały połączone z dwóch niezależnych eksperymentów, z udziałem 10-15 myszy na eksperyment24,25,26. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Analiza obciążenia bakteryjnego; wykresy porównują CFU w tkankach; zaznaczono istotność statystyczną.
Rycina 4: Dalsza analiza kolonizacji przez bakterie beztlenowe w mysim modelu inokulacji pochwy. (A) Miana G. vaginalis w płukaniach pochwy korelują z mianami G. vaginalis odzyskanymi z homogenatów tkanki pochwy 24 h i 72 h po inokulacji (połączenie dwóch niezależnych eksperymentów, n = 10 dla każdego. Istotność określono za pomocą testu korelacji rang Spearmana)24. (B) Koinfekcja G. vaginalis prowadzi do zwiększenia mian P. bivia w tkance rogu macicy w porównaniu z zwierzętami zakażonymi pojedynczo P. bivia 48 h po inokulacji (połączenie dwóch niezależnych eksperymentów, każdy z 6-10 myszami na grupę. Istotność określono za pomocą testu U Manna-Whitneya, **p = 0,0017)25. (C) Mutant F. nucleatum z zaburzonym transporterem kwasu sialowego (Ω SiaT) wykazuje obniżone miana w płukaniach pochwy myszy zakażonych pojedynczo w porównaniu do typu dzikiego F. nucleatum 72 h po inokulacji (połączenie dwóch niezależnych eksperymentów, każdy z 10 myszami na grupę. Istotność określono za pomocą testu U Manna-Whitneya, **p < 0,01)26. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Plik uzupełniający 1: Przykłady metod stosowanych dla różnych bakterii pochwy hodowanych w warunkach beztlenowych. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Najbardziej znaczącym sposobem, w jaki opisany tutaj model różni się od wcześniej opublikowanych modeli inokulacji dopochwowej, jest użycie bakterii hodowanych beztlenowo, które wymagają specjalnych względów w celu przygotowania żywotnego inokulum i odzyskania bakterii od myszy. Konkretne kroki w powyższym protokole mogą się nieznacznie różnić w zależności od gatunku/szczepu użytych bakterii, zgodnie z sugestią w pliku uzupełniającym 1. Ponadto manuskrypt ten opisuje nową metodę proceduralną podawania bakterii i płynów do płukania pochwy, która wymaga mniejszego doświadczenia ze strony badacza i mniejszej powściągliwości dla myszy. Jeśli eksperymentator nie czuje się komfortowo z formą powściągliwości opisaną w kroku 3.2. i kroku 3.3., myszy można zamiast tego oczyścić, jak opisanowcześniej 34 , ze znieczuleniem lub bez, zgodnie z projektem eksperymentalnym i wytycznymi instytucjonalnymi IACUC.

Ważnym zastrzeżeniem dotyczącym stosowania bakterii hodowanych beztlenowo w modelach mysich jest to, że pewne kroki (takie jak te z udziałem żywych zwierząt) muszą być wykonywane poza komorą beztlenową. Dlatego najbardziej krytycznymi krokami w tym protokole są te, w których bakterie będące przedmiotem zainteresowania będą narażone na działanie środowiska tlenowego, na przykład podczas inokulacji myszy. Zastosowanie jakiegokolwiek nowego beztlenowca w tym modelu będzie wymagało wstępnych badań nad jego zdolnością do utrzymania żywotności po wystawieniu na działanie tlenu (takich jak porównanie CFU przed i po inokulacji, jak opisano w kroku 2.5 i kroku 3.4). W zależności od stopnia wrażliwości organizmu na tlen i PBS, należy rozważyć różne metody przygotowania inokulum (Plik Uzupełniający 1, krok 2.4.5). W przypadku inokulacji z użyciem G. vaginalis JCP8151B odkryliśmy, że pojedyncza probówka inokulum może być przygotowana w PBS i użyta do zakażenia wszystkich myszy. Jeśli używana jest inna bakteria beztlenowa, która jest bardziej wrażliwa na tlen, inokulum można zamiast tego przygotować w oddzielnych probówkach dla każdej myszy, tak aby nie było wymagane wielokrotne otwieranie/zamykanie probówki. Podobnie, jeśli interesujący nas gatunek bakterii jest bardziej wybredny/mniej zdolny do przetrwania w PBS niż G. vaginalis, inokulację można zamiast tego przygotować w pożywkach hodowlanych. Jeśli zastosowana pożywka zawiera środki redukujące, takie jak pożywka beztlenowa CDC stosowana do hodowli Prevotella bivia (plik uzupełniający 1, krok 2.1. i krok 2.2.), wówczas bakterie będą miały również zwiększoną ochronę przed narażeniem na tlen.

Można również rozważyć alternatywne metody homogenizacji, takie jak ubijanie kulki 22,35, które odbywa się przy zamkniętej nasadce probówki i dlatego może wprowadzać mniej tlenu niż homogenizator ręczny. Ponadto organizmy bardziej wrażliwe na tlen mogą wymagać dłuższego czasu równowagi dla pożywki. Wskaźnik tlenu, taki jak rezazuryna, może być użyty do sprawdzenia, czy zostały osiągnięte warunki beztlenowe (krok 2.1.). Alternatywne metody, takie jak słoiki beztlenowe, mogą wpływać na wyniki i przed użyciem należy je sprawdzić pod kątem żywotności bakterii.

Wrażliwość na tlen i skrupulatność organizmu doświadczalnego może również odgrywać rolę w pomyślnym odzyskaniu żywych bakterii od myszy podczas płukania/homogenizacji (plik uzupełniający 1, krok 3.2 i krok 5.1.). W przypadku organizmów bardzo wrażliwych czas między pobraniem płukania a posiewem może prowadzić do utraty żywotności i powodować sztucznie zaniżoną ocenę bakteryjnej kolonizacji pochwy. Aby złagodzić ten efekt, zebrane płukanie można natychmiast rozcieńczyć na świeże beztlenowe podłoża hodowlane (ze środkiem redukującym). Podobnie, homogenizację narządów można przeprowadzić w świeżych pożywkach hodowlanych, a nie w PBS, aby zwiększyć żywotność bakterii, a także w samej komorze beztlenowej, aby zminimalizować narażenie na tlen.

W zależności od celu danego eksperymentu, eksperymentator musi zwrócić uwagę na grupy kontrolne. Aby przetestować hipotezy, podstawowe pomiary niezakażonych myszy kontrolnych, które są pozorowane samym nośnikiem, pomogą ustalić, czy występuje indukcja chemokin/cytokin lub inne specyficzne wyniki infekcji. Użyty nośnik kontrolny musi być taki sam, jak nośnik używany do inokulacji, więc jeśli bakterie są inokulowane w pożywkach hodowlanych, wówczas jako kontrola należy użyć niezaszczepionych pożywek hodowlanych (plik uzupełniający 1, krok 2.4.5).

Metody opisane w tym protokole mogą być również stosowane do bakterii fakultatywnych zdolnych do wzrostu beztlenowego, ale tradycyjnie badanych w warunkach hodowli tlenowej (takich jak Escherichia coli lub Streptococcus grupy B). Może to być szczególnie istotne w przypadku zakażeń tymi organizmami w miejscach ciała, które uważa się za zawierające niski poziom tlenu, takich jak szyjka macicy. Może się zdarzyć, że organizm fakultatywny skuteczniej infekuje miejsca mniejszą ilością tlenu, gdy inokulum jest przygotowywane beztlenowo niż tlenowo. W takim eksperymencie odzysk żywych bakterii do oznaczania liczby CFU może nie wymagać warunków beztlenowych.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

Dziękujemy Lynne Foster za pomoc techniczną podczas rozwoju tych modeli. Doceniamy fundusze startowe z Zakładu Mikrobiologii Molekularnej i Centrum Badań nad Chorobami Zakaźnymi Kobiet (do AL) oraz March of Dimes (nagroda Basila O'Connora dla AL), które pomogły wesprzeć eksperymenty na wczesnym etapie. Narodowy Instytut Alergii i Chorób Zakaźnych (R01 AI114635) również wspierał rozwój tych modeli.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
β-estradiol 17-walerianianSigmaE1631estrogenizacja myszy
0,22 &mikro; m, 50 ml Filtr próżniowy SteriflipFisher  SCGP00525sterylny filtrujący olej sezamowy
tubka 14 mlFalcon352059estrogenizacji myszy
190-proofetanol Koptec  Rozwarstwienie V1105M, homogenizacja tkanek, pożywki CDC i Columbia
1x PBSFisherMT21040CMpłukanie pochwy, przygotowanie inokulum G. vaginlalis, pobieranie tkanek i homogenizacja
25 G i razy; 5/8 -w igleBD305122estrogenizacja myszy
ml probówkaFalcon352063Pobieranie i homogenizacja tkanek
Komora beztlenowaCoy7200000Wzrost bakterii beztlenowych
Bacto agarFisherDF0140074G. vaginalis, F. nucleatum i P. bivia Płytki agarowe
Bacto peptonFisherDF0118170CDC podłoża beztlenowe do wzrostu P. bivia
Bulion ColumbiaFisherDF0944170Columbia podłoża do wzrostu F. nucleatum
Defibrynowane krew owczaHemostatDSB500CDC pożywka beztlenowa do wzrostu P. bivia
KleszczeNarzędzia do nauki pięknej  11008-13rozwarstwienie myszy/tkanek
GlukozaSigmaG7528NYCIII podłoże do wzrostu G. vaginalis
Ręczny homogenizatorISC Bio3305500Homogenizacja tkanek
HeminSigma51280CDC pożywka anaerobowa do wzrostu P. bivia, pożywka Columbia do wzrostu F. nucleatum
HEPESCellgro25-060-ClNYCIII pożywka dla G. vaginalis wzrost
Surowica koniaHemostatSHS500NYCIII podłoże dla wzrostu G. vaginalis
Mieszanka gazów wodorowych (5% wodoru, 10% CO2, 85% azotu)Gaz Mathesondo komory beztlenowej
IzofluoranVetOne502017znieczulenie myszy w ofierze
L-cysteinaSigmaC1276CDC podłoże beztlenowe do wzrostu P. bivia
L-glutaminianSigmaG1626CDC pożywka beztlenowa do wzrostu P. bivia
Oczyszczacz wody Milli-QMilliporeIQ-7000do wytwarzania pożywek i homogenizacji
Pożywka NaClSigmaS3014NYCIII do wzrostu G. vaginalis
Tabletki NaOHSigmaS5881CDC pożywka anaerobowa do wzrostu P. bivia
Azot gazowy  Gaz powietrzny  Gaz do komory beztlenowej
p-200 końcówki filtrówISC Bio  P-1237-200płukanie pochwy i inokulacje bakteryjne
trawienie kazeiny przez trzustkęSigma70169CDC podłoża beztlenowe do wzrostu P. bivia
Pepton Proteose #3FisherDF-122-17-4NYCIII podłoże do wzrostu G. vaginalis
NożyczkiFine Science Tools  14084-08Analiza myszy/tkanek
Olej sezamowyFisher  ICN15662191estrogenizacja myszy
Chirurgiczne żyletki ze stali węglowej z pojedynczą krawędziąVWR55411-050rozwarstwienie tkanek
Chlorek soduSigmaS3014CDC podłoże beztlenowe do wzrostu P. bivia
SpektrofotometrBioChrom80-3000-45mierzący bakteryjną Streptomycynę OD600
Gibco11860038dodać do podłoża agarowego, aby zrobić płytki selektywne
Końcówka tuberkulinowa Strzykawka 1 mlBD309659estrogenizacji myszy
Vitaim K3SigmaM5625Pożywka Columbia do wzrostu F. nucleatum
Witamina K1Sigma95271CDC pożywka beztlenowa do wzrostu P. bivia
Ekstrakt drożdżowyFisherDF0127-17-9NYCIII podłoże do wzrostu G. vaginalis
5

Bibliografia

  1. Hillier, S. L., Krohn, M. A., Rabe, L. K., Klebanoff, S. J., Eschenbach, D. A. The normal vaginal flora, H2O2-producing lactobacilli, and bacterial vaginosis in pregnant women. Clinical Infectious Diseases. 16, Suppl 4 273-281 (1993).
  2. Ravel, J., et al. Vaginal microbiome of reproductive-age women. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, Supplement_1 4680-4687 (2011).
  3. Hill, G. B., Eschenbach, D. A., Holmes, K. K. Bacteriology of the vagina. Scandinavian Journal of Urology and Nephrology. 86, 23-39 (1984).
  4. van de Wijgert, J. The vaginal microbiome and sexually transmitted infections are interlinked: Consequences for treatment and prevention. PLoS Medicine. 14 (12), 1002478(2017).
  5. Srinivasan, S., et al. Bacterial communities in women with bacterial vaginosis: high resolution phylogenetic analyses reveal relationships of microbiota to clinical criteria. PLoS One. 7 (6), 37818(2012).
  6. Shipitsyna, E., et al. Composition of the vaginal microbiota in women of reproductive age-sensitive and specific molecular diagnosis of bacterial vaginosis is possible. PLoS One. 8 (4), 60670(2013).
  7. Brotman, R. M., et al. Bacterial vaginosis assessed by gram stain and diminished colonization resistance to incident gonococcal, chlamydial, and trichomonal genital infection. The Journal of Infectious Diseases. 202 (12), 1907-1915 (2010).
  8. Peipert, J. F., et al. Bacterial vaginosis, race, and sexually transmitted infections: does race modify the association. Sexually Transmitted Diseases. 35 (4), 363-367 (2008).
  9. Wiesenfeld, H. C., Hillier, S. L., Krohn, M. A., Landers, D. V., Sweet, R. L. Bacterial vaginosis is a strong predictor of Neisseria gonorrhoeae and Chlamydia trachomatis infection. Clinical Infectious Diseases. 36 (5), 663-668 (2003).
  10. Spandorfer, S. D., Neuer, A., Giraldo, P. C., Rosenwaks, Z., Witkin, S. S. Relationship of abnormal vaginal flora, proinflammatory cytokines and idiopathic infertility in women undergoing IVF. The Journal of Reproductive Medicine. 46 (9), 806-810 (2001).
  11. Ralph, S. G., Rutherford, A. J., Wilson, J. D. Influence of bacterial vaginosis on conception and miscarriage in the first trimester: cohort study. BMJ. 319 (7204), 220-223 (1999).
  12. Holst, E., Goffeng, A. R., Andersch, B. Bacterial vaginosis and vaginal microorganisms in idiopathic premature labor and association with pregnancy outcome. Journal of Clinical Microbiology. 32 (1), 176-186 (1994).
  13. DiGiulio, D. B., et al. Microbial prevalence, diversity and abundance in amniotic fluid during preterm labor: a molecular and culture-based investigation. PLoS One. 3 (8), 3056(2008).
  14. Svare, J. A., Schmidt, H., Hansen, B. B., Lose, G. Bacterial vaginosis in a cohort of Danish pregnant women: Prevalence and relationship with preterm delivery, low birthweight and perinatal infections. British Journal of Obstetrics and Gynaecology. 113 (12), 1419-1425 (2006).
  15. Ádám, A., et al. Culture- and PCR-based detection of BV associated microbiological profile of the removed IUDs and correlation with the time period of IUD in place and the presence of the symptoms of genital tract infection. Annals of Clinical Microbiology and Antimicrobials. 17 (1), 40(2018).
  16. Di Paola, M., et al. Characterization of cervico-vaginal microbiota in women developing persistent high-risk Human Papillomavirus infection. Scientific Reports. 7 (1), 10200(2017).
  17. Bullman, S., et al. Analysis of Fusobacterium persistence and antibiotic response in colorectal cancer. Science. 358 (6369), 1443-1448 (2017).
  18. Brennan, C. A., Garrett, W. S. Gut microbiota, inflammation, and colorectal cancer. Annual Review of Microbiology. 70, 395-411 (2016).
  19. Hill, G. B. Preterm birth: associations with genital and possibly oral microflora. Annals of Periodontology. 3 (1), 222-232 (1998).
  20. Hitti, J., et al. Vaginal indicators of amniotic fluid infection in preterm labor. Obstetrics & Gynecology. 97 (2), 211-219 (2001).
  21. DiGiulio, D. B. Diversity of microbes in amniotic fluid. Seminars in Fetal and Neonatal. 17 (1), 2-11 (2012).
  22. Patras, K. A., Doran, K. S. A murine model of Group B Streptococcus vaginal colonization. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (117), e54708(2016).
  23. Jerse, A. E., et al. Estradiol-treated female mice as surrogate hosts for Neisseria gonorrhoeae genital tract infections. Frontiers in Microbiology. 2, 107(2011).
  24. Gilbert, N. M., Lewis, W. G., Lewis, A. L. Clinical features of bacterial vaginosis in a murine model of vaginal infection with Gardnerella vaginalis. PLoS One. 8 (3), 59539(2013).
  25. Gilbert, N. M., et al. Gardnerella vaginalis and Prevotella bivia trigger distinct and overlapping phenotypes in a mouse model of bacterial vaginosis. The Journal of Infectious Diseases. 220 (7), 1099-1108 (2019).
  26. Agarwal, K., et al. Glycan cross-feeding supports mutualism between Fusobacterium and the vaginal microbiota. PLOS Biology. 18 (8), 3000788(2020).
  27. Liehr, J. G. Is estradiol a genotoxic mutagenic carcinogen. Endocrine Reviews. 21 (1), 40-54 (2000).
  28. Yager, J. D., Davidson, N. E. Estrogen carcinogenesis in breast cancer. The New England Journal of Medicine. 354 (3), 270-282 (2006).
  29. Adeel, M., Song, X., Wang, Y., Francis, D., Yang, Y. Environmental impact of estrogens on human, animal and plant life: A critical review. Environment International. 99, 107-119 (2017).
  30. Miner, N. A., Koehler, J., Greenaway, L. Intraperitoneal injection of mice. Journal of Applied Microbiology. 17 (2), 250-251 (1969).
  31. Lewis, W. G., Robinson, L. S., Gilbert, N. M., Perry, J. C., Lewis, A. L. Degradation, foraging, and depletion of mucus sialoglycans by the vagina-adapted Actinobacterium Gardnerella vaginalis. Journal of Biological Chemistry. 288 (17), 12067-12079 (2013).
  32. Robinson, L. S., et al. Genome sequences of 15 Gardnerella vaginalis strains isolated from the vaginas of women with and without bacterial vaginosis. Genome Announcements. 4 (5), 00879(2016).
  33. Adapted from "mouse posterior turn" by BioRender.com. BioRender.com. , Available from: https://app.biorender.com/biorender-templates (2022).
  34. Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (67), e2771(2012).
  35. Verollet, R. A major step towards efficient sample preparation with bead-beating. Biotechniques. 44 (6), 832-833 (2008).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Bakterie beztlenowemikrobiom pochwybakteryczna wagozainokulacja pochwyjednostki tworzące koloniepłukanie pochwyhomogenizacja tkanekGardnerella vaginalismodel mysi
Modele kolonizacji pochwy myszy przez bakterie hodowane beztlenowo
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.