Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Wytwarzanie i stosowanie suchych makroporowatych rusztowań alginianowych do transdukcji wirusowej limfocytów T

3.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/64036

⸱

9 września 2022

 ,  ,  , 
1Joint Department of Biomedical Engineering, University of North Carolina at Chapel Hill and North Carolina State University, 2Comparative Medicine Institute, North Carolina State University, 3Lineberger Comprehensive Cancer Center, University of North Carolina at Chapel Hill

W tym artykule

Podsumowanie

To jest protokół tworzenia suchych makroporowatych rusztowań alginianowych, które pośredniczą w efektywnym transferze genów wirusowych, do wykorzystania w inżynierii genetycznej limfocytów T, w tym limfocytów T do terapii komórkami CAR-T. Wykazano, że rusztowania transdukują aktywowane pierwotne limfocyty T z transdukcją >85%.

Streszczenie

Inżynieria genetyczna limfocytów T do terapii komórkowej CAR-T wysunęła się na pierwszy plan leczenia raka w ciągu ostatnich kilku lat. Limfocyty CAR-T są wytwarzane w wyniku transferu genów wirusa do limfocytów T. Obecny złoty standard transferu genów wirusa polega na spinokulacji płytek pokrytych retronektyną, co jest kosztowne i czasochłonne. Istnieje duże zapotrzebowanie na wydajne i opłacalne metody wytwarzania komórek CAR-T. Opisano tutaj metodę wytwarzania niedrogich, suchych makroporowatych rusztowań alginianowych, znanych jako rusztowania Drydux, które skutecznie promują transdukcję wirusa aktywowanych limfocytów T. Rusztowania są przeznaczone do stosowania zamiast złotego standardu spinokulacji płytek pokrytych retronektyną wysianych wirusem i upraszczają proces transdukcji komórek. Alginian jest sieciowany krzyżowo z D-glukonianem wapnia i zamrażany przez noc w celu stworzenia rusztowań. Zamrożone rusztowania są liofilizowane w liofilizatorze przez 72 godziny, aby zakończyć formowanie suchych rusztowań makroporowatych. Rusztowania pośredniczą w transferze genów wirusa, gdy wirus i aktywowane limfocyty T są wysiewane razem na rusztowaniu w celu wytworzenia genetycznie zmodyfikowanych komórek. Rusztowania wytwarzają >85% pierwotnej transdukcji limfocytów T, co jest porównywalne ze skutecznością transdukcji spinokulacji na płytkach pokrytych retronektyną. Wyniki te pokazują, że suche makroporowate rusztowania alginianowe stanowią tańszą i wygodniejszą alternatywę dla konwencjonalnej metody transdukcji.

Wprowadzenie

Immunoterapia stała się rewolucyjnym paradygmatem leczenia nowotworów ze względu na swoją zdolność do specyficznego celowania w guzy, ograniczania cytotoksyczności poza docelowej oraz zapobiegania nawrotom. W szczególności terapią, która zyskała popularność dzięki sukcesom w leczeniu chłoniaków i białaczek, jest terapia komórkami T z chimerycznym receptorem antygenowym (CAR-T). FDA zatwierdziła pierwszą terapię komórkami CAR-T w 2017 roku, a od tego czasu zatwierdzono kolejne cztery terapie CAR-T1,2,3,4,5. Receptory CAR posiadają domenę rozpoznawania antygenu, składającą się zazwyczaj z jednoczynnikowego fragmentu zmiennego przeciwciała monoklonalnego, który jest specyficzny dla antygenu związanego z nowotworem3,4. Gdy CAR wchodzi w interakcję ze swoim antygenem związanym z nowotworem, komórki CAR-T ulegają aktywacji, co prowadzi do odpowiedzi przeciwnowotworowej obejmującej uwalnianie cytokin, degranulację cytolityczną, ekspresję czynników transkrypcyjnych oraz proliferację limfocytów T. Aby wytworzyć komórki CAR-T, od pacjenta pobiera się krew w celu pozyskania jego limfocytów T. Receptory CAR są wprowadzane do limfocytów T pacjenta metodą genetyczną przy użyciu wirusa. Komórki CAR-T są namnażane in vitro, a następnie infundowane z powrotem do organizmu pacjenta2,3,4,6. O sukcesie generowania komórek CAR-T decyduje wydajność transdukcji, która określa liczbę limfocytów T zmodyfikowanych genetycznie w komórki CAR-T.

Obecnie złotym standardem w generowaniu komórek CAR-T jest spinokulacja aktywowanych limfocytów T i wirusa na płytkach pokrytych retronektyną7,8. Transdukcja rozpoczyna się w momencie, gdy cząsteczki wirusa wiążą się z powierzchnią limfocytów T. Retronektyna sprzyja kolokalizacji wirusa i komórek poprzez zwiększenie wydajności wiązania między cząsteczkami wirusa a komórkami, co nasila transdukcję7,8. Retronektyna nie działa skutecznie samodzielnie i musi być stosowana w połączeniu ze spinokulacją, która usprawnia transfer genów poprzez koncentrację cząsteczek wirusa i zwiększenie przepuszczalności powierzchni limfocytów T, co ułatwia infekcję wirusową8. Pomimo sukcesu spinokulacji na płytkach pokrytych retronektyną, jest to proces złożony, wymagający wielu cykli wirowania i kosztownych odczynników. W związku z tym wysoce pożądane są alternatywne, szybsze i tańsze metody wirusowego transferu genów.

Alginian jest naturalnym anionowym polisacharydem szeroko stosowanym w przemyśle biomedycznym ze względu na niski koszt, dobry profil bezpieczeństwa oraz zdolność do tworzenia hydrożeli po zmieszaniu z kationami dwuwartościowymi9,10,11,12. Alginian jest polimerem zgodnym z zasadami GMP i jest ogólnie uznawany za bezpieczny (GRAS) przez FDA13. Sieciowanie alginianu kationami prowadzi do powstania stabilnych hydrożeli często wykorzystywanych w leczeniu ran, dostarczaniu małocząsteczkowych leków chemicznych i białek oraz w transporcie komórek9,10,11,12,14,15,16. Ze względu na doskonałe właściwości żelujące alginian jest preferowanym materiałem do tworzenia porowatych rusztowań metodą liofilizacji10,17. Te właściwości alginianu sprawiają, że jest on atrakcyjnym kandydatem do produkcji rusztowania, które może pośredniczyć w wirusowym transferze genów do aktywowanych komórek.

Opisano tutaj protokół wytwarzania suchych makroporowatych rusztowań alginianowych, znanych jako rusztowania Drydux, które służą do statycznej transdukcji limfocytów T poprzez wirusowy transfer genów17,18. Proces wytwarzania tych rusztowań przedstawiono na Ryc. 1. Rusztowania te eliminują konieczność spinokulacji na płytkach pokrytych retronektyną. Makroporowate rusztowania alginianowe sprzyjają oddziaływaniu cząsteczek wirusowych i limfocytów T, co umożliwia wydajny transfer genów w jednym kroku, bez wpływu na funkcjonalność i żywotność zmodyfikowanych limfocytów T17. Przy prawidłowym zastosowaniu, makroporowate rusztowania alginianowe wykazują wydajność transdukcji na poziomie co najmniej 80%, co upraszcza i skraca proces transdukcji wirusowej.

Proces produkcji i transdukcji rusztowania Drydux; sieciowanie alginianu wapniem, zastosowanie w hodowli komórkowej.
Rycina 1: Schemat i harmonogram protokołu. (A) Harmonogram wytwarzania suchych makroporowatych rusztowań alginianowych. Alginian jest sieciowany D-glukonianem wapnia i mrożony przez noc. Zamrożone rusztowania są liofilizowane przez 72 h w celu utworzenia rusztowań Drydux. (B) Harmonogram transdukcji wirusowej aktywowanych komórek. Aktywowane komórki i wirus (MOI 2) są wysiewane na wierzch rusztowania i inkubowane w pożywce kompletnej uzupełnionej o IL-7 i IL-15. Rusztowania absorbują mieszaninę i wspomagają wirusowy transfer genów. EDTA jest stosowany do rozpuszczenia rusztowań i izolacji transdukowanych komórek. Po dwukrotnym przemyciu PBS, osad komórkowy może zostać wykorzystany do analizy. Skróty: PBS = fosforanowy bufor solny; PBMCs = mononuklearne komórki krwi obwodowej. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie procedury z udziałem ludzkich komórek pierwotnych i wektorów retrowirusowych zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Bezpieczeństwa Biologicznego Uniwersytetu Stanowego Karoliny Północnej i zatwierdzone przez Biuro ds. Zdrowia i Bezpieczeństwa Środowiskowego. Ludzkie komórki jednojądrzaste krwi obwodowej zakupiono jako kożuchy ze źródeł komercyjnych. Pierwotne komórki ludzkie muszą zostać wyizolowane z frakcji kożuchy ludzkiej i wymagają zezwolenia na poziom bezpieczeństwa biologicznego 2 oraz szczegółowych standardowych procedur operacyjnych i zgody instytucji, w której mają być prowadzone prace. Wektory wirusowe, w tym supernatanty wektorów retrowirusowych używane do transdukcji, przygotowane zgodnie z wcześniejszym opisem19, mogą być klasyfikowane jako poziom bezpieczeństwa biologicznego 1 lub poziom bezpieczeństwa biologicznego 2 w zależności od kodowanego białka i wymagają zatwierdzenia przez odpowiedni instytucjonalny komitet ds. bezpieczeństwa biologicznego.

1. Tworzenie makroporowatych rusztowań alginianowych

  1. Przygotować roztwór podstawowy 0,4% (wagowo na objętość) glukonianu wapnia D, dodając sterylnie przefiltrowaną wodę dejonizowaną do glukonianu wapnia D w zlewce. Mieszać na średnich obrotach, aż glukonian wapnia się rozpuści (~1,5 h), sterylnie przefiltrować i przechowywać w temperaturze pokojowej.
    UWAGA: Nie ma potrzeby sprawdzania pH roztworu.
  2. Przygotować roztwór 2% (wagowo na objętość) alginianu w zakręcanej fiolce lub zlewce. Ostrożnie dodaj ultraczysty alginian do naczynia i dodaj sterylnie przefiltrowaną wodę dejonizowaną do alginianu. Wybierz jak największy mieszadło, które nie będzie utrudniało mieszania i dodaj go do naczynia.
    UWAGA: Informacje na temat rodzaju ultraczystego alginianu użytego w tym protokole można znaleźć w Tabeli Materiałów oraz na stronie internetowej Novamatrix20. Różne alginiany nie zostały zbadane dla tych rusztowań, ponieważ mogą one prowadzić do niepożądanych zmian w porowatości i biokompatybilności rusztowań9,10,11.
  3. Mieszać roztwór na wysokich obrotach, aż alginian się rozpuści (~1 h). Jeśli po bokach naczynia znajdują się duże grudki, przechyl naczynie, aby je usunąć. Niewielkie ilości alginianu po bokach rozpuszczą się podczas mieszania i nie są powodem do niepokoju.
    UWAGA: Nie ma potrzeby sprawdzania pH roztworu.
  4. Gdy alginian się rozpuści, zmniejsz prędkość mieszania, powoli dodaj równą objętość 0,4% glukonianu wapnia D do roztworu alginianu, aby zapobiec tworzeniu się usieciowanych grudek i energicznie mieszaj przez 15 minut.
  5. Przechylić zlewkę lub fiolkę na bok, aby usunąć wszelkie grudki, które mogły się utworzyć.
    UWAGA: Zaleca się stosowanie homogenizatora. Ostateczne rozwiązanie powinno być optycznie jasne.
  6. Odpipetować żądaną objętość roztworu do każdego dołka płytki 48-dołkowej lub 24-dołkowej. Użyj 300 μl/dołek dla płytki 48-dołkowej i 1 ml/dołek dla płytki 24-dołkowej. Rzucaj powoli i często zmieniaj końcówki, ponieważ roztwór będzie lepki i przyklei się do końcówki.
  7. Przykryj talerze pokrywkami i zamroź przez noc w temperaturze -20 °C.
  8. Przygotuj płytkę do liofilizatora, zdejmując pokrywkę i zabezpieczając górę chusteczkami i gumkami. Umieścić płytki w kolbach liofilizatora o pojemności od 750 ml do 2 000 ml i umieścić na liofilizatorze na 72 godziny.
  9. Po 72 godzinach wyjmij płytkę z liofilizatora i załóż pokrywkę. Uszczelnić płytkę i przechowywać w temperaturze 4 °C. W przypadku długotrwałego przechowywania, przed przechowywaniem w temperaturze 4 °C należy zamknąć próżniowo płytkę. Przechowywać w suchym miejscu do czasu, gdy będzie potrzebna.
    UWAGA: Przygotować dodatkowy roztwór alginianu wapnia ze względu na błąd objętości (niektóre przyklejają się do ścianek fiolki, końcówki pipet). Na przykład, aby zrobić cztery rusztowania na 24-dołkowej płytce, wymagane są 4 ml połączonego roztworu (2 ml alginianu + 2 ml glukonianu wapnia D), ale zaleca się przygotowanie 2,5 ml 2% roztworu alginianu i 2,5 ml 0,4% roztworu glukonianu wapnia D.

2. Transdukcja

  1. Zagęszczanie supernatantu wirusowego przy użyciu filtrów 100 kDa
    1. Nawilżaj filtr odśrodkowy przez 2 minuty 1 ml 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). Wyrzuć PBS.
    2. Zagęścić zawiesinę wirusa, dodając 2 ml zawiesiny wirusa (1 × 106 TU/ml) i przepuszczając ją przez filtr odśrodkowy o stężeniu 1 500 × g przez 10 minut w wahadłowym wirniku kubełkowym.
      UWAGA: Potrzeba od jednego do dwustu mikrolitrów skoncentrowanego wirusa na rusztowanie.
    3. Wirować przez kilka dodatkowych minut, jeśli objętość stężonej zawiesiny wirusa jest większa niż 200 μl.
    4. Powtórz kroki 2.1.1-2.1.3 dla każdego rusztowania.
      UWAGA: Dopuszczalne jest również zagęszczenie dużego zapasu wirusa i pobranie 100-200 μl podwielokrotności z zagęszczonego zapasu.
  2. Wysiewaj razem aktywowane komórki i wirusa.
    1. Dla każdego rusztowania należy przygotować podwielokrotność, zawieszając 1 ×10 6 aktywowanych komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC) w 50 μl kompletnej pożywki do hodowli komórkowych (250 ml pożywki Clicka + 250 ml pożywki RPMI 1640 + 50 ml płodowej surowicy bydlęcej + 5 ml substytutu glutaminy + 5 ml penicyliny/streptomycyny).
      UWAGA: Patrz Plik uzupełniający 1, aby zapoznać się z protokołem aktywacji PBMC.
    2. Dodać skoncentrowany supernatant wirusowy (~2 × 106 TU, MOI 2) do zawiesiny komórek. Całkowita objętość zawiesiny wirusa komórkowego nie powinna przekraczać 200 μl dla rusztowania 48-dołkowego lub 350 μl dla rusztowania 24-dołkowego.
    3. Dodaj mieszaninę komórkowo-wirusową kroplami na szczyt suchego rusztowania. Do eksperymentów z kontrolą ujemną należy użyć kompletnych pożywek do hodowli komórkowych zamiast skoncentrowanego wirusa. Dodaj zawiesinę komórkową na szczyt suchego rusztowania.
    4. Powtórz kroki 2.2.1-2.2.3 dla każdego rusztowania.
    5. Inkubować rusztowania w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C przez 45-60 minut. Usunąć rusztowania z inkubatora; w tym czasie rusztowania w pełni wchłoną roztwór.
    6. Aby indukować proliferację, dodać do każdej studzienki kompletne pożywki do hodowli komórkowych uzupełnione IL-15 (5 ng/ml) i IL-7 (10 ng/ml); Można również stosować IL-2. Dodać 500 μl do każdego rusztowania 48-dołkowego lub 1 ml do każdego rusztowania 24-dołkowego.
    7. Inkubować rusztowania w temperaturze 37 °C przez 72 godziny. W miarę namnażania się komórek pożywka zmieni kolor na pomarańczowy.
  3. Odizoluj komórki od rusztowań do analizy.
    1. Rozcieńczyć 0,5 M EDTA do 0,25 M EDTA w 1x PBS.
    2. Usuń nadmiar pożywki z każdej studzienki i zbierz do oddzielnych probówek wirówkowych o pojemności 15 ml.
    3. Aby wyizolować komórki z rusztowania, dodaj 0,25 M EDTA do każdego rusztowania. Dodać 300 μl do rusztowań 48-dołkowych lub 1 ml do rusztowań 24-dołkowych. Pozostaw talerz na 3-4 minuty lub delikatnie mieszaj.
    4. Gdy rusztowanie jest już w większości rozpuszczone, delikatnie wsuwaj i wyjmuj pipetą z wnętrza studzienki. Do całkowitego rozpuszczenia rusztowania może być konieczne wykonanie kilku etapów pipetowania. Jeśli nie rozpuści się w ciągu 10 minut, dodaj kolejne 200 μl 0,25 M EDTA.
    5. Gdy rusztowanie całkowicie się rozpuści, przenieś roztwór do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml.
    6. Powtórz kroki 2.3.4 i 2.3.5 dla każdego rusztowania.
    7. Umyć komórki dwukrotnie, dodając 12 ml PBS do każdej probówki wirówkowej i odwirowując przy 400 × g przez 5 minut. Na dnie każdej probówki utworzy się osad komórkowy. Odessać supernatant i powtórzyć pranie. Należy uważać, aby całkowicie zassać supernatant przy każdym płukaniu, ponieważ bardzo ważne jest usunięcie całego EDTA.
    8. Po drugim przemyciu PBS osad komórkowy jest teraz gotowy do analizy. Postępuj zgodnie z odpowiednim protokołem wymaganym do analizy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Te makroporowate rusztowania alginianowe są łatwe w przygotowaniu i po wyjęciu z liofilizatora powinny mieć postać porowatych, puszystych i białych dysków. Choć nie badano tego w niniejszym eksperymencie, roztwór alginianu wapnia można odlewać do różnych form w celu stworzenia rusztowań o zróżnicowanych kształtach, w zależności od potrzeb użytkownika9,10. Rusztowania wykazują właściwości elektrostatyczne i mogą przylegać do pokrywy płytki wielodołkowej lub do pal...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Terapia komórkowa CAR-T cieszy się coraz większym zainteresowaniem zarówno w zastosowaniach badawczych, jak i komercyjnych. Pomimo sukcesu, jaki terapia komórkowa CAR-T odniosła w leczeniu nowotworów krwi, wysokie koszty procedury ograniczają jej zastosowanie. Przedstawiony tutaj protokół wprowadza nową metodę wirusowego transferu genów limfocytów T bez konieczności spinokulacji płytek pokrytych retronektyną. Produkcja suchych makroporowatych rusztowań alginianowych do pośredniczenia w transdukcji jest stosunkowo prosta ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

P.A. i Y.B. są wynalazcami patentów związanych z wykorzystaniem biomateriałów do wytwarzania terapii komórkowych CAR-T. Y.B. otrzymuje sponsorowany przez przemysł grant badawczy związany z technologią terapii komórkami CAR-T (niezwiązany z tą pracą). Wszyscy pozostali autorzy deklarują, że nie mają sprzecznych interesów.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez National Institutes of Health poprzez przyznanie grantów o numerach R37-CA260223, R21CA246414. Dziękujemy rdzeniowi cytometrii przepływowej NCSU za szkolenie i wskazówki dotyczące analizy cytometrii przepływowej. Schematy zostały stworzone za pomocą Biorender.com

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,5 M EDTAInvitrogen15575-038UltraPure, pH 8,0
1x DPBSGibco14190-144Bez chlorku wapnia lub chlorku magnezu
3% kwas octowy z błękitem metylenowymStemcell Technologies Inc07060
Aktywowane jednojądrzaste komórki krwi obwodowej-świeże lub mrożone
D-glukonian wapniaAlfa AesarA11649
CD28.2 PrzeciwciałoBD5557251 mg / ml
Przeciwciało CD3Miltenyi130-093-387100 μ g/mL
Click's MediaFUJIFILM IRVINE SCIENTIFIC MS9195
DI Woda--
GlutamaxGibco35-050-061
HyClone FBSCytviaSH3039603
HyClone RPMI 1640 MediaCytviaSH3009601
Penicylina-streptomycyna (P/S)Gibco15-140-122
Jednojądrzaste komórki krwi obwodowej-świeże lub mrożone
PRONOVA UP MVGNovaMatrix4200101Alginian sodu
Rekombinowany ludzki IL-15Peprotech200-155 ng / ml
Rekombinowany ludzki IL-7Peprotech200-0710 ng / ml
Retrowirus-1 x 106 TU/ Ml
-

Bibliografia

  1. Prinzing, B. L., Gottschalk, S. M., Krenciute, G. C. A. R. T-cell therapy for glioblastoma: ready for the next round of clinical testing. Expert Review of Anticancer Therapy. 18 (5), 451-461 (2018).
  2. Bagley, S. J., Desai, A. S., Linette, G. P., June, C. H., O'Rourke, D. M. CAR T-cell therapy for glioblastoma: recent clinical advances and future challenges. Neuro-oncology. 20 (11), 1429-1438 (2018).
  3. Nair, R., Westin, J. CAR T cells. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1342, 297-317 (2021).
  4. Jackson, H. J., Rafiq, S., Brentjens, R. J. Driving CAR T-cells forward. Nature Reviews. Clinical Oncology. 13 (6), 370-383 (2016).
  5. Sterner, R. C., Sterner, R. M. CAR-T cell therapy: current limitations and potential strategies. Blood Cancer Journal. 11 (4), 69(2021).
  6. Miliotou, A. N., Papadopoulou, L. C. CAR T-cell therapy: A new era in cancer immunotherapy. Current Pharmaceutical Biotechnology. 19 (1), 5-18 (2018).
  7. Lee, H. -J., et al. Retronectin enhances lentivirus-mediated gene delivery into hematopoietic progenitor cells. Biologicals: Journal of the International Association of Biological Standardization. 37 (4), 203-209 (2009).
  8. Rajabzadeh, A., Hamidieh, A. A., Rahbarizadeh, F. Spinoculation and retronectin highly enhance the gene transduction efficiency of Mucin-1-specific chimeric antigen receptor (CAR) in human primary T cells. BMC Molecular and Cell Biology. 22 (1), 57(2021).
  9. Sun, J., Tan, H. Alginate-based biomaterials for regenerative medicine applications. Materials. 6 (4), 1285-1309 (2013).
  10. Nayak, A. K., Mohanta, B. C., Hasnain, M. S., Hoda, M. N., Tripathi, G. Chapter 14 - Alginate-based scaffolds for drug delivery in tissue engineering. Alginates in Drug Delivery. , 359-386 (2020).
  11. Lee, K. Y., Mooney, D. J. Alginate: properties and biomedical applications. Progress in Polymer Science. 37 (1), 106-126 (2012).
  12. Kuo, C. K., Ma, P. X. Ionically crosslinked alginate hydrogels as scaffolds for tissue engineering: part 1. Structure, gelation rate and mechanical properties. Biomaterials. 22 (6), 511-521 (2001).
  13. Soccol, C., et al. Probiotic nondairy beverages. Handbook of Plant-Based Fermented Food and Beverage Technology, Second Edition. , 707-728 (2012).
  14. Moody, C. T., et al. Restoring carboxylates on highly modified alginates improves gelation, tissue retention and systemic capture. Acta Biomaterialia. 138, 208-217 (2022).
  15. Brudno, Y., et al. Replenishable drug depot to combat post-resection cancer recurrence. Biomaterials. 178, 373-382 (2018).
  16. Moody, C. T., Palvai, S., Brudno, Y. Click cross-linking improves retention and targeting of refillable alginate depots. Acta Biomaterialia. 112, 112-121 (2020).
  17. Agarwalla, P., et al. Scaffold-mediated static transduction of T Cells for CAR-T Cell therapy. Advanced Healthcare Materials. 9 (14), 2000275(2020).
  18. Agarwalla, P., et al. Bioinstructive implantable scaffolds for rapid in vivo manufacture and release of CAR-T cells. Nature Biotechnology. 40 (8), 1250-1258 (2022).
  19. Vera, J., et al. T lymphocytes redirected against the kappa light chain of human immunoglobulin efficiently kill mature B lymphocyte-derived malignant cells. Blood. 108 (12), 3890-3897 (2006).
  20. PRONOVA UP MVG. IFF Nutrition Norge AS. , Available from: https://novamatrix.biz/store/pronova-up-mvg/ (2022).
  21. Zappasodi, R., Budhu, S., Abu-Akeel, M., Merghoub, T. In vitro assays for effector T cell functions and activity of immunomodulatory antibodies. Methods in Enzymology. 631, 43-59 (2020).
  22. Kong, B. S., Lee, C., Cho, Y. M. Protocol for the assessment of human T cell activation by real-time metabolic flux analysis. STAR Protocols. 3 (1), 101084(2022).
  23. Bio-Rad cell activation protocols. Bio-Rad. , Available from: https://www.bio-rad-antibodies.com/cell-activation.html?JSESSIONID_STERLING=D6E538F76818E53C29884D6CC7334F24. ecommerce2&evCntryLang=US-en&cntry= US&thirdPartyCookieEnabled=true (2022).
  24. Lin, H. -R., Yeh, Y. -J. Porous alginate/hydroxyapatite composite scaffolds for bone tissue engineering: Preparation, characterization, andin vitro studies. Journal of Biomedical Materials Research. 71 (1), 52-65 (2004).
  25. Wu, J., Zhao, Q., Sun, J., Zhou, Q. Preparation of poly(ethylene glycol) aligned porous cryogels using a unidirectional freezing technique. Soft Matter. 8 (13), 3620(2012).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

In ynieria limfocyt w Tkom rki CAR Trusztowanie makroporowatetransfer gen walternatywa dla spinokulacjicytometria przep ywowatransdukcja retrowirusowaproliferacja kom rek
Wytwarzanie i stosowanie suchych makroporowatych rusztowań alginianowych do transdukcji wirusowej limfocytów T
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.