Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Izolacja komórek linii monocytów-makrofagów z kości szczurów metodą wtórnej adherencji

3.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/64053

⸱

13 lipca 2022

 ,  ,  ,  , 
1School of Medical Technology and Information Engineering, Zhejiang Chinese Medical University, 2School of Basic Medical Sciences, Fudan University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół izolacji BMM od szczurów SD, zwany metodą wtórnego przylegania.

Streszczenie

Wraz ze spadkiem gęstości mineralnej kości, kości są bardziej podatne na złamania, co negatywnie wpływa na jakość życia pacjenta. Wzrost i rozwój kości są regulowane głównie przez osteoblasty i osteoklasty. Powszechnie przyjmuje się, że osteoklasty pochodzą z komórek monocytów i makrofagów szpiku kostnego (BMM). BMM i inne hematopoetyczne komórki macierzyste znajdują się w jamie szpiku kostnego. Dlatego wyizolowanie pojedynczych stabilnych BMM z różnych i niejednorodnych populacji komórek jest ogromnym wyzwaniem. W tym miejscu przedstawiamy protokół izolacji BMM od szczurów SD, zwany metodą wtórnej adherencji. Pobrano komórki adherentne hodowane przez 24-48 godzin w hodowli pierwotnej. Analiza cytometrii przepływowej wykazała, że około 37,94% komórek było CD11b/c+ (antygen powierzchniowy monocytów-makrofagów). Barwienie kwasową fosfatazą odporną na winian (TRAP) i analiza western blot wykazały, że BMM mogą różnicować się w osteoklasty in vitro. Powyższe wyniki sugerują, że wtórne komórki przylegające można uznać za odpowiedni model komórkowy do badań nad różnicowaniem osteoklastów.

Wprowadzenie

Doniesiono, że komórki linii monocytów-makrofagów istniejące w szpiku kostnym mogą różnicować się w monocyty krwi i makrofagi tkankowe1,2. Powyższe komórki, które mogą różnicować się w osteoklasty, aby zrównoważyć wzrost i rozwój kości, są powszechnie używane jako model komórkowy do indukcji osteoklastów in vivo3,4. Szpik kostny to specjalna tkanka zawierająca kilka różnych typów komórek, które obejmują między innymi mezenchymalne komórki macierzyste szpiku kostnego, komórki monocytów i makrofagów szpiku kostnego (BMM), hematopoetyczne komórki macierzyste, komórki śródbłonka i komórki odpornościowe. W rzeczywistości kilka wcześniejszych badań sugerowało, że przylegające komórki wydostające się z jamy szpiku kostnego kości długiej mogą różnicować się w osteoblasty, osteoklasty, chondrocyty lub adipocyty5,6,7,8. Chociaż do wytworzenia różnych jednorodnych populacji komórek zastosowano różne metody izolacji i hodowli, nadal istnieją duże wyzwania związane z izolacją i hodowlą BMM z różnych typów komórek.

Opracowano kilka metod ekstrakcji jednojądrzastych makrofagów szpiku kostnego (BMSC). Jednak większość tych metod jest złożona9,10,11. Na przykład wirowanie w gradionym spadku gęstości wymaga specjalistycznego zestawu, a operacja jest czasochłonna i uciążliwa. Ta metoda jest odpowiednia do izolacji BMM z próbek krwi o dużej objętości, ale nie z próbek szpiku kostnego9,12,13. Ponadto ekstrakcja próbek tkanek za pomocą trawienia kolagenazy jest złożoną i czasochłonną procedurą; ta metoda nie jest zalecana do izolacji BMM od próbek szpiku kostnego14,15. Ponadto, mimo że separacja przepływowa może prowadzić do powstania wysoce oczyszczonych populacji monocytów/makrofagów, wymaga bardzo dużych rozmiarów próbek oraz wysokich wymagań dotyczących przyrządów i sprzętu10,16. Dodatkowo, metoda wzbogacania mikrogranulkami jest niezwykle kosztowna i niewykonalna w ogólnym laboratorium17.

Dlatego w obecnym badaniu zaproponowano wygodną, szybką i tanią metodę izolacji jednojądrzastych makrofagów ze szpiku kostnego. Komórki szpiku kostnego przylegające do różnych punktów czasowych wykorzystano do wyizolowania BMM przy użyciu metody wtórnej adhezji. BMM wyekstrahowane powyższą metodą mogą indukować powstawanie osteoklastów in vitro, zapewniając w ten sposób prosty i wygodny model komórkowy do przyszłych badań nad osteoporozą in vitro.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie eksperymenty w tym badaniu zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi eksperymentów na zwierzętach Centrum Badań na Zwierzętach Chińskiego Uniwersytetu Medycznego w Zhejiang (nr zgody: IACUC-20181029-11).

1. Ekstrakcja komórek

  1. Szczury Sprague-Dawley (szczury SD, w wieku 1-10 dni, samce lub samice) należy umieścić w klatkach do eutanazji wypełnionych CO2 w zrównoważonej ilości 30%-70% objętości pojemnika na minutę. Po utracie przytomności przez szczury (20-60 min) należy je poddać eutanazji przez zwichnięcie szyjki macicy, aby zapewnić bezbolesną śmierć.
  2. Zanurz szczury w 75% alkoholu na 10 minut w celu dezynfekcji.
  3. Ostrożnie usuń wszystkie kończyny szczura nożyczkami i kleszczami, odessaj PBS za pomocą pipety i spłucz krew przylegającą do kończyn
    4. .
  4. Dodać 5 ml roztworu penicyliny/streptomycyny do 500 ml DMEM i dobrze wymieszać. Weź 50 ml sterylnej probówki wirówkowej, dodaj 5 ml FBS i 45 ml pożywki DMEM i dokładnie wymieszaj, aby uzyskać 10% FBS DMEM zawierający 1% roztwór penicyliny/streptomycyny. Dodać 2 ml powyższej pożywki hodowlanej do probówki o pojemności 5 ml.
  5. Przenieść kości kończyn do probówki o pojemności 5 ml. Za pomocą nożyczek pociąć kości kończyn w probówce na małe kawałki (1-3 mm) i wymieszać homogenat w celu ponownego zawieszenia komórek szpiku kostnego w pożywce hodowlanej. Odstaw na 5 minut, aż fragmenty tkanki osiądą na dnie probówki.
  6. Dodać 10 ml 10% FBS DMEM do naczyń hodowlanej o średnicy 100 mm, a następnie przenieść supernatant do szalki hodowlanej. Podczas zasysania supernatantu należy unikać przenoszenia resztek tkanek do naczynia hodowlanego.
  7. Inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez około 24 godziny. Po tym czasie inkubacji większość mezenchymalnych komórek macierzystych będzie przylegać do ścianki szalki hodowlanej i będzie rosła powoli, podczas gdy większość BMM będzie nadal zawieszona w pożywce hodowlanej.
  8. Przenieść zawiesinę komórek z naczynia hodowlanego o średnicy 100 mm do nowej kolby o średnicy 25cm2 i kontynuować hodowlę komórek w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez dodatkowe 24 godziny. BMM przylegają do ścianki kolby po 24–48 godzinach hodowli. Ostrożnie usunąć starą pożywkę i zastąpić ją nową pożywką po przyklejeniu się BMM do ścianki kolby.
  9. Subhodowla, gdy komórki w kolbie osiągnęły konfluencję 80%-90%.
    UWAGA: Wszystkie komórki hodowano w temperaturze 37 °C i 5% CO2 . Podczas hodowli morfologia komórek była stopniowo ujednolicana. Komórki były duże, o nieregularnym kształcie, rosły promieniście i były połączone z kolbą w formie dysku, w którym można było zaobserwować wiele jąder.

2. Barwienie komórki metodą FACS

  1. Trawienie trypsyny przy użyciu 1-2 ml komercyjnej trypsyny w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 5 minut i liczenie wtórnych komórek przylegających, aby zapewnić końcową liczbę komórek 100 000 / próbkę (policz komórki za pomocą hemocytometru Neubauera).
  2. Podziel komórki na trzy grupy (500 μl PBS zawiera 100 000 komórek): (1) ślepa grupa kontrolna zawierająca niebarwione komórki; 2) grupa kontrolna ISOTYPU; oraz (3) grupa eksperymentalna (barwienie CD11b/c).
  3. Inkubować przeciwciała pierwszorzędowe (brak przeciwciał dla ślepej próby kontrolnej; kontrola izotypu anty-CD11 dla grupy kontrolnej izotypu, 0,6 μl przeciwciała/próbkę, 1 μg/próbkę; anty-CD11b/c dla grupy eksperymentalnej, 1 μl przeciwciała/próbkę, 1 μg/próbkę) na lodzie przez 30 minut.
  4. Wirować przy 300-350 x g przez 5 minut, wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki za pomocą 500 μl PBS. Powtórz powyższą procedurę jeden raz, aby upewnić się, że niezwiązane przeciwciała pierwszorzędowe zostały wypłukane.
  5. Inkubować odpowiednie przeciwciało drugorzędowe (brak przeciwciała dla ślepej próby kontrolnej; kozie przeciwciało anty-królicze IgG dla kontroli izotypu i grup eksperymentalnych, 0,25 μl przeciwciała/próbkę, 1:2,000) na lodzie w ciemności przez 30 minut.
  6. Wirować przy 300-350 x g przez 5 minut, wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki za pomocą 500 μl PBS. Powtórz powyższą procedurę jeden raz, aby upewnić się, że niezwiązane drugie przeciwciała zostały wypłukane.
  7. Wykryj komórki CD11b/c dodatnie za pomocą cytometrii przepływowej (10 000 komórek/próbkę) i przeanalizuj dane za pomocą oprogramowania (np. FlowJo 7.5).
    UWAGA: Aby uzyskać ostateczny procent komórek CD11b/c+, zastosowano następujący wzór: Procent komórek CD11b / c + w grupie eksperymentalnej - procent komórek CD11 + w grupie kontrolnej izotypu.

3. Barwienie Wrighta-Giemsy

  1. Wysiewać przylegające komórki wtórne, które zostały trzykrotnie pasażowane, na arkusze wspinaczkowe komórek o średnicy 35mm2 (1 × 106 komórek/studzienkę) i hodować w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 24 godziny.
  2. Wyrzucić pożywkę hodowlaną i przemyć trzykrotnie PBS.
  3. Dodaj roztwór barwnika Wrighta-Giemsy (0,5 ml-0,8 ml) do arkusza wspinaczkowego komórek na 1 minutę.
  4. Wymieszaj barwnik z wodą destylowaną (0,5 ml-0,8 ml) z bawełnianym wacikiem i odstaw na 10 minut.
  5. Roztwór barwnika przemyć wodą destylowaną, a następnie suszyć przez 1-3 min. Obserwować pod mikroskopem.

4. Barwienie PUŁAPKI

  1. Wysiewać przylegające komórki wtórne, które zostały trzykrotnie pasażowane, na arkusze wspinaczkowe komórek o średnicy 35mm2 (1 × 106 komórek/studzienkę) i hodować w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 24 godziny.
  2. Zastąp starą pożywkę 10% FBS DMEM lub pożywką do indukcji osteoklastów uzupełnioną aktywatorem receptora 50 ng / ml liganda czynnika jądrowego κB (RANKL) i 30 ng / ml czynnika stymulującego tworzenie kolonii makrofagów (M-CSF) i poprowadź hodowlę w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez dodatkowe 7 dni.
  3. Wybarwić komórki za pomocą zestawu do barwienia TRAP zgodnie z protokołem producenta i obserwować pod mikroskopem.
    UWAGA: Komórki TRAP-dodatnie zdefiniowano jako osteoklasty, które pod mikroskopem świetlnym były fioletowe. Liczbę komórek TRAP-dodatnich zmierzono za pomocą oprogramowania ImageJ.

5. Western blot

  1. Wysiewaj przylegające komórki wtórne, które zostały trzykrotnie pasażowane, na 35 mm2 arkuszach wspinaczkowych komórek (1 × 106 komórek/studzienkę) i hoduj przez 24 godziny.
  2. Zastąp starą pożywkę świeżą 10% pożywką FBS DMEM lub pożywką indukcyjną osteoklastów (50 ng/ml RANKL i 30 ng/ml M-CSF) i hoduj przez dodatkowe 7 dni w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
  3. Wyekstrahuj całkowite białka komórkowe za pomocą buforu RIPA, rozdziel 10% SDS-PAGE i przenieś do membran z polifluorku winylidenu18,19.
  4. Blokuj 5% odtłuszczonym mlekiem w proszku (25 ml) przez 2 godziny i myj trzy razy, za każdym razem przez 10 minut, za pomocą TBS-Tween 20 (TBST).
  5. Inkubować przeciwciała pierwszorzędowe w temperaturze 4 °C przez noc (anty-β-aktyna, anty-TRAP i antykatepsyna K; wszystkie przeciwciała pierwszorzędowe rozcieńczono w stosunku 1:1000, 10 ml rozcieńczonego przeciwciała/pasma) i trzykrotnie przemyć TBST.
  6. Inkubować przeciwciało drugorzędowe (kozie przeciwciało anty-królicze IgG, rozcieńczenie 1:2 000, 10 ml rozcieńczonego przeciwciała/pasma) w temperaturze pokojowej przez 2 godziny i przemyć trzykrotnie TBST. Wizualizacja prążków białkowych za pomocą roztworu do wywoływania.
    UWAGA: Poziomy ekspresji powyższych białek zostały znormalizowane do β-aktyny.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Wtórna populacja komórek adherentnych była stabilna i jednorodna. Wraz z ciągłą proliferacją komórek większość z nich stała się większa, przybrała nieregularny kształt i wyrosła w radialny dysk adherentny (Rysunek 2C,D). Cytometria przepływowa wykazała, że odsetek komórek wykazujących ekspresję CD11b/c, markera molekularnego na powierzchni komórek linii monocytarno-makrofagicznej, wynosił około 37,94% (Rysunek 2A...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Osteoklasty są jednym z najważniejszych typów komórek biorących udział w występowaniu i rozwoju chorób kości, a także jednym z głównych obiektów badań nad chorobami kości20. Monocyty/makrofagi mogą różnicować się w osteoklasty. Ponieważ makrofagi jednojądrzaste (komórki RAW264.7) są zbyt drogie do kupienia i łatwo aktywują się podczas hodowli, trudno jest przeprowadzić eksperymenty różnicowania in vitro z wykorzystaniem tej linii komórkowej. Chociaż opracowano kilka metod ekstrakcji monoc...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają sprzecznych interesów.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Fundację Nauk Przyrodniczych Prowincji Zhejiang (grant nr. LY19H060001) oraz Projekt Planu Nauki i Technologii Tradycyjnej Medycyny Chińskiej Zhejiang (nr 2022ZB093).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
35 mm2 plastry do wspinania się po komórkachNEST Biotechnology80102
Antykatepsyna KAbcamab190271:1,000
Kontrola izotypu anty-CD11Abcamab1727301 μ g / test, 1,675 mg / ml
anty-CD11b / cAbsinabs124232  1μ g/test, 1 mg/ml
Anti-TRAPAbcamab1914061:1,000
Anty-β-aktynaBeyotime  AF50031:1,000
Plastry do wspinania się po komórkachNEST Biotechnology80102
Corning naczynia do hodowli komórkowych430167
Kolba do hodowli komórkowychcorning430168
Zmodyfikowane podłoże orła Dulbecco (DMEM)GibcoC11995500BT
Surowica bydlęca płodu (FBS)Gibco10099141C
Koza anty-królik IgGAbcamab150077dla IF, 1:2,000
koza anty-królik IgGAbcamab6721dla WB, 1:2,000
M-CSFPepro tech400-28
PBSBiosharpBL302A
RANKLPepro tech400-30
SD szczurShanghai SLAC Laboratory Animal Co, Ltd1-10 dni
Zestaw do przygotowania żelu SDS-PAGE Zestaw do barwieniaSolarbioP1200
TRAP/ALPWako294-67001
Roztwór trypsyny-EDTABiosharpBL512A
Roztwór Wrighta-GiemsaKeygen BiotechKGA225-1

Bibliografia

  1. Jakubzick, C. V., Randolph, G. J., Henson, P. M. Monocyte differentiation and antigen-presenting functions. Nature Reviews. Immunology. 17 (6), 349-362 (2017).
  2. Locati, M., Curtale, G., Mantovani, A. Diversity, mechanisms, and significance of macrophage plasticity. Annual Review of Pathology. 15 (1), 123-147 (2020).
  3. Boyle, W. J., Simonet, W. S., Lacey, D. L. Osteoclast differentiation and activation. Nature. 423 (6937), 337-342 (2003).
  4. Ono, T., Nakashima, T. Recent advances in osteoclast biology. Histochemistry and Cell Biology. 149 (4), 325-341 (2018).
  5. Zhou, X., et al. Wnt/ß-catenin-mediated p53 suppression is indispensable for osteogenesis of mesenchymal progenitor cells. Cell Death & Disease. 12 (6), 521-534 (2021).
  6. Yu, Q., Zhao, B., He, Q., Zhang, Y., Peng, X. B. microRNA-206 is required for osteoarthritis development through its effect on apoptosis and autophagy of articular chondrocytes via modulating the phosphoinositide 3-kinase/protein kinase B-mTOR pathway by targeting insulin-like growth factor-1. Journal of Cellular Biochemistry. 120 (4), 5287-5303 (2019).
  7. Li, Z., MacDougald, O. A. Preclinical models for investigating how bone marrow adipocytes influence bone and hematopoietic cellularity. Best Practice & Research. Clinical Endocrinology & Metabolism. 35 (4), 101547-101560 (2021).
  8. Horowitz, M. C., et al. marrow adipocytes. Adipocyte. 6 (3), 193-204 (2017).
  9. Maridas, D. E., Rendina-Ruedy, E., Le, P. T., Rosen, C. J. Isolation, culture, and differentiation of bone marrow stromal cells and osteoclast progenitors frommice. Journal of Visualized Experiments. (131), e56750(2018).
  10. Schyns, J., et al. Non-classical tissue monocytes and two functionally distinct populations of interstitial macrophages populate the mouse lung. Nature Communications. 10 (1), 3964-3980 (2019).
  11. Atif, S. M., Gibbings, S. L., Jakubzick, C. V. Isolation and identification of interstitial macrophages from the lungs using different digestion enzymes and staining strategies. Methods in Molecular Biology. 1784, 69-76 (2018).
  12. Scheven, B. A., Milne, J. S., Robins, S. P. A sequential culture approach to study osteoclast differentiation from nonadherent porcine bone marrow cells. In Vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 34 (7), 568-577 (1998).
  13. Bradley, E. W., Oursler, M. J. Osteoclast culture and resorption assays. Methods in Molecular Biology. , 19-35 (2008).
  14. Yu, Y. R., et al. Flow cytometric analysis of myeloid cells in human blood, bronchoalveolar lavage, and lung tissues. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 54 (1), 13-24 (2016).
  15. Gibbings, S. L., Jakubzick, C. V. A consistent method to identify and isolate mononuclear phagocytes from human lung and lymph nodes. Methods in Molecular Biology. 1799, 381-395 (2018).
  16. Jacquin, C., Gran, D. E., Lee, S. K., Lorenzo, J. A., Aguila, H. L. Identification of multiple osteoclast precursor populations in murine bone marrow. Journal of Bone and Mineral Research. 21 (1), 67-77 (2006).
  17. Gibbings, S. L., et al. Three unique interstitial macrophages in the murine lung at steady state. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 57 (1), 66-76 (2017).
  18. Higashi, S. L., et al. Ultra-high-speed western blot using immunoreaction enhancing technology. Journal of Visualized Experiments. (163), e61657(2020).
  19. Gallagher, S., Chakavarti, D. Immunoblot analysis. Journal of Visualized Experiments. 20 (16), 759(2008).
  20. Yin, Z., et al. Glycyrrhizic acid suppresses osteoclast differentiation and postmenopausal osteoporosis by modulating the NF-κB, ERK, and JNK signaling pathways. European Journal of Pharmocology. 859, 172550(2019).
  21. Liu, F., et al. LRRc17 controls BMSC senescence via mitophagy and inhibits the therapeutic effect of BMSCs on ovariectomy-induced bone loss. Redox Biology. , (2021).
  22. Jin, X., et al. Thioacetamide promotes osteoclast transformation of bone marrow macrophages by influencing PI3K/AKT pathways. Journal of Orthopedic Surgery and Research. 17 (1), 53-63 (2022).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

kom rki monocytarno makrofagicznekom rki szpiku kostnegor nicowanie osteoklast wizolacja ko ci szczuracytometria przep ywowabarwienie TRAPWestern blotprekursory osteoklast wmezenchymalne kom rki macierzyste
Izolacja komórek linii monocytów-makrofagów z kości szczurów metodą wtórnej adherencji
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.