Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Rurociąg do badania struktur i szlaków sygnałowych receptorów sfingozyno-fosforanowych

3.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/64054

⸱

8 czerwca 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Nephrology and Kidney Research Institute, State Key Laboratory of Biotherapy and Cancer Center, West China Hospital, Sichuan University, 2Department of Neurosurgery, West China Hospital, Sichuan University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

S1P wywiera swoje różnorodne efekty fizjologiczne poprzez podrodzinę receptorów S1P (S1PRs). W tym miejscu opisano potok w celu wyjaśnienia struktur i funkcji S1PR.

Streszczenie

Lizofosfolipidy (LPL) to bioaktywne lipidy, które zawierają sfingozyno-1-fosforan (S1P), kwas lizofosfatydowy, itp. S1P, produkt metaboliczny sfingolipidów w błonie komórkowej, jest jednym z najlepiej scharakteryzowanych LPL, który reguluje różnorodne reakcje fizjologiczne komórek poprzez szlaki sygnałowe, w których pośredniczą receptory sfingozyno-1-fosforanu (S1PR). Sugeruje to, że system sygnalizacyjny S1P-S1PRs jest niezwykłym potencjalnym celem terapeutycznym dla zaburzeń, w tym stwardnienia rozsianego (SM), zaburzeń autoimmunologicznych, raka, stanów zapalnych, a nawet COVID-19. S1PRs, niewielki podzbiór rodziny receptorów sprzężonych z białkiem G klasy A (GPCR), składa się z pięciu podtypów: S1PR1, S1PR2, S1PR3, S1PR4 i S1PR5. Brak szczegółowych informacji strukturalnych utrudnia jednak odkrywanie leków ukierunkowanych na S1PR. Tutaj zastosowaliśmy metodę mikroskopii krioelektronowej, aby rozwiązać strukturę kompleksu S1P-S1PRs i wyjaśniliśmy mechanizm aktywacji, selektywnego rozpoznawania leków i sprzęgania białka G za pomocą testów funkcjonalnych opartych na komórkach. Inne receptory lizofosfolipidowe (LPLR) i GPCR mogą być również badane przy użyciu tej strategii.

Wprowadzenie

Sfingozyno-1-fosforan (S1P), produkt metaboliczny sfingolipidów w błonie komórkowej, jest wszechobecną lizofosfatydową cząsteczką sygnałową, która obejmuje różne aktywności biologiczne, w tym transport limfocytów, rozwój naczyń krwionośnych, integralność śródbłonka i częstość akcji serca1,2,3. S1P wywiera swoje różnorodne efekty fizjologiczne poprzez pięć podtypów receptora S1P (S1PR 1-5); S1PR znajdują się w różnych tkankach i wykazują unikalne preferencje dla dalszych białek G4,5. S1PR1 jest przede wszystkim sprzężony z białkiem Gi, które następnie hamuje produkcję cAMP; S1PR2 i S1PR3 są sprzężone z Gi, Gq i G12/13, a S1PR4 i S1PR5 transdukują sygnał przez Gi i G12/136.

S1P-S1PR sygnalizacja jest krytycznym celem terapeutycznym dla wielu chorób, w tym chorób autoimmunologicznych7, zapalenia8, cancer9, a nawet COVID-1910. W 2010 roku fingolimod (FTY720) został zarejestrowany jako pierwszy w swojej klasie lek ukierunkowany na S1PR w leczeniu nawrotu stwardnienia rozsianego (SM)11. Jest jednak zdolny do wiązania się ze wszystkimi S1PR z wyjątkiem S1PR2, podczas gdy niespecyficzne wiązanie z S1PR3 powoduje obrzęk kory mózgowej, zwężenie naczyń krwionośnych i oskrzeli oraz przeciek nabłonka płuc12. Jako alternatywną strategię zwiększania selektywności terapeutycznej wyprodukowano ligandy specyficzne dla podtypu receptora. Siponimod (BAF312) został zatwierdzony w 2019 r. do leczenia nawrotu SM13; skutecznie celuje w S1PR1 i S1PR5, podczas gdy nie ma powinowactwa do S1PR3, wykazując mniej skutków ubocznych w praktyce klinicznej14. W 2020 roku amerykańska Agencja ds. Żywności i Leków zatwierdziła ozanimod do terapii stwardnienia rozsianego15. Doniesiono, że ozanimod ma 25-krotnie większą selektywność dla S1PR1 niż dla S1PR516. Warto zauważyć, że w kontekście obecnej pandemii COVID-19 odkryto, że leki agonistyczne ukierunkowane na S1PR mogą być stosowane w leczeniu COVID-19 przy użyciu technik terapii immunomodulującej17. W porównaniu z fingolimodem, ozanimod wykazał przewagę w obniżaniu objawów u pacjentów z COVID-19 i jest obecnie w trakcie badań klinicznych10. Zrozumienie podstaw strukturalnych i funkcji S1PR stanowi istotną podstawę do opracowania leku, który selektywnie celuje w S1PRs18.

Do badania informacji strukturalnych biomakromolekuł używa się wielu technik, w tym krystalografii rentgenowskiej, magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR) i mikroskopii elektronowej (EM). Według stanu na marzec 2022 r. w Protein Databank (PDB) zdeponowano ponad 180 000 struktur, a większość z nich została rozwiązana za pomocą krystalografii rentgenowskiej. Jednak wraz z pierwszą prawie atomową strukturą rozdzielczości TPRV1 (rozdzielczość 3,4 A) opisaną przez Yifan Cheng i Davida Juliusa w 2013 roku19, mikroskopia krioelektronowa (cryo-EM) stała się główną techniką dla struktur białkowych, a całkowita liczba struktur EM PDB wyniosła ponad 10 000. Krytycznymi obszarami przełomu są opracowanie nowych kamer do obrazowania, znanych jako kamery z bezpośrednią detekcją elektronów, oraz nowe algorytmy przetwarzania obrazu. Cryo-EM zrewolucjonizował biologię struktury i odkrywanie leków na podstawie struktury w ciągu ostatniej dekady20. Ponieważ zrozumienie, w jaki sposób kompleksy makromolekularne spełniają swoje skomplikowane role w żywej komórce, jest głównym tematem nauk biologicznych, cryo-EM ma potencjał do ujawnienia konformacji dynamicznych kompleksów molekularnych, szczególnie dla białek transbłonowych21. Receptory sprzężone z białkiem G (GPCR) są największą nadrodziną białek transbłonowych i są celem ponad 30% obecnie sprzedawanych farmaceutyków22. Rozwój cryo-EM przyczynił się do powstania struktur o wysokiej rozdzielczości kompleksów białkowych GPCR-G, umożliwiając określenie strukturalne dla "trudnych" celów, które nadal nie są dostępne do analizy krystalograficznej rentgenowskiej w projektowaniu leków23. W związku z tym aplikacja cryo-EM daje szansę na określenie trójwymiarowej struktury GPCR w warunkach zbliżonych do natywnych w rozdzielczości bliskiej atomowi24. Postępy w dziedzinie cryo-EM umożliwiają wizualizację mechanistycznych podstaw stymulacji lub hamowania GPCR, a także dalsze korzyści w odkrywaniu nowych miejsc wiązania dla tworzenia leków ukierunkowanych na GPCR25.

Opierając się na ogromnych postępach technologii cryo-EM, zidentyfikowaliśmy ostatnio struktury kompleksów sygnalizacyjnych S1PR1-, S1PR3- i S1PR5-Gi26,27. U ludzi S1PR znajdują się w różnych tkankach i wykazują unikalne preferencje dla dalszych białek G4,5. S1PR1 jest przede wszystkim sprzężony z białkiem Gi, które następnie hamuje produkcję 3′,5′-cyklicznego monofosforanu adenozyny (cAMP). S1PR3 i S1PR5 są również zdolne do sprzężenia z Gi6,28. Ponieważ aktywacja receptora sprzężonego z Gi zmniejsza produkcję cAMP29, wprowadzono test cAMP z inhibicją w celu zmierzenia efektów hamowania cAMP w celu wychwycenia zmian funkcjonalnych26,27. Wykorzystując zmutowaną wersję lucyferazy Photinus pyralis, w której wstawiono ugrupowanie białkowe wiążące cAMP, ten test cAMP oferuje prostą i niezawodną metodę monitorowania aktywności GPCR poprzez zmiany wewnątrzkomórkowego stężenia cAMP30. Jest to czuły i nieradioaktywny test funkcjonalny, który może być stosowany do monitorowania sygnalizacji w czasie rzeczywistym szerokiej gamy GPCR do celów odkrywania leków31.

Tutaj znajduje się podsumowanie krytycznych metod rozwiązywania problemów związanych z aktywacją i rozpoznawaniem leków w trybach S1PRs, w tym przede wszystkim manipulacje krio-EM i test cAMP z inhibicją. Niniejszy artykuł ma na celu dostarczenie kompleksowych wskazówek eksperymentalnych dla dalszych badań nad strukturami i funkcjami GPCR.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Oczyszczanie kompleksu białkowego S1PRs-G

  1. Aby oczyścić kompleks białkowy S1PRs-G człowieka, należy sklonować cDNA S1PR1 pozbawionego reszt C-końca 338-382, S1PR3 typu dzikiego, S1PR5 uciętą w pozycji 345-398 na C-końcu oraz Gi1 typu dzikiego do wektora pFastBac1, a cDNA Gβ1 i Gγ2 typu dzikiego do wektora pFastBacdual (Tabela materiałów).
    UWAGA: Wszystkie konstrukty dla S1PRs zawierają również sekwencję sygnałową hemaglutyniny (HA), po której następuje znacznik epitopowy Flag na N-końcu oraz znacznik 10x his na C-końcu. Ponadto, w celu ułatwienia ekspresji i oczyszczania receptorów, do N-końca S1PRs wstawiono syntetyczną sekwencję DNA (Tabela materiałów) kodującą lyzozym T4 (T4L).
  2. Przygotowanie bakulowirusa kodującego S1PRs, Gi1 oraz Gβ1γ2
    1. Dodaj wektory rekombinowane do 50 µL kompetentnych komórek Escherichia coli (E. coli) DH5α przechowywanych w probówce 1,5 mL w temperaturze -80 °C i inkubuj na lodzie przez 30 min.
    2. Przeprowadź szok termiczny komórek w 42 °C przez 90 s, natychmiast przenieś je na lód i chłodź przez 2 min.
    3. Wstrząsaj probówką w 37 °C przez 3-5 h po uzupełnieniu o 300 µL pożywki LB (lysogeny broth). Wysiej 100 µL komórek na płytkę z agarem LB i inkubuj w 37 °C w ciemności przez 48 h.
    4. Zaszczep białą kolonię do 5 mL pożywki LB zawierającej 50 µg/mL kanamycyny, 10 µg/mL tetracykliny i 7 µg/mL gentamycyny, a następnie hoduj w 37 °C przez 16 h.
    5. Wyizoluj rekombinowany bakmid za pomocą zestawu do miniprep plazmidów (Tabela materiałów) zgodnie z instrukcjami producenta, w celu wytworzenia bakulowirusa P0.
      UWAGA: Przed użyciem oczyszczony bakmid przeanalizowano metodą PCR z użyciem starterów pUC/M13 forward i reverse. Parametry PCR: liczba cykli = 30 cykli, temperatura topnienia = 58 °C, czas elongacji = 1 min na 1 Kb.
    6. Przygotuj bakulowirusa P0 zgodnie z opisem w poprzednim protokole32.
      1. Hoduj komórki sf9 (pożywka ESF921) w płytkach sześciodołkowych i zweryfikuj, czy komórki znajdują się w fazie logarytmicznej (1,0-1,5 x 106 komórek/mL).
      2. Rozcieńcz 8 µL odczynnika do transfekcji bakulowirusowej w 100 µL pożywki Grace'a i inkubuj przez 30 min w temperaturze pokojowej. Rozcieńcz 10 µg rekombinowanego bakmidu w 100 µL pożywki Grace'a i delikatnie wymieszaj. Połącz rozcieńczony bakmid z rozcieńczonym odczynnikiem do transfekcji bakulowirusowej, delikatnie wymieszaj i inkubuj przez 30 min w temperaturze pokojowej.
      3. Dodaj mieszaninę (bakmid i odczynnik) do komórek (Krok 1.2.6.1) i inkubuj na płytkach w 27 °C przez 3 h.
      4. Usuń pożywkę Grace'a i zastąp ją 2 mL pożywki do hodowli komórek ESF921. Inkubuj płytki sześciodołkowe w 27 °C i zbierz pożywkę ESF921 5 dni po transfekcji.
      5. Wiruj przy 500 x g w 4 °C przez 10 min, aby usunąć komórki i resztki komórkowe. Przenieś supernatant do probówek 2 mL. Jest to zapas bakulowirusa P0.
    7. Izolacja zapasu wirusa P1
      1. Przenieś 30 mL komórek sf9 do kolby stożkowej, hoduj w 27 °C przy wstrząsaniu z prędkością 270 rpm i zweryfikuj, czy komórki osiągnęły fazę logarytmiczną (1,0-1,5 x 106 komórek/mL).
      2. Dodaj 2 mL zapasu wirusa P0 do kolby i wstrząsaj przy 270 rpm przez 4 dni w 27 °C.
      3. Przenieś komórki do probówki 50 mL, wiruj przy 1 800 x g przez 10 min w 4 °C, aby usunąć komórki i resztki komórkowe, a następnie przenieś supernatant do probówek 50 mL. Jest to zapas bakulowirusa P1.
    8. Amplifikacja zapasu bakulowirusowego
      1. Powtórz krok 1.2.7, używając 50 mL komórek sf9 w fazie logarytmicznej (1,0-1,5 x 106 komórek/mL) i 1 mL zapasu P1.
      2. Przechowuj otrzymany zapas bakulowirusa P2 w 4 °C, chroniąc go przed światłem.
        UWAGA: Nie należy amplifikować bakulowirusa w nieskończoność, ponieważ przy każdym pasażu powstawały szkodliwe mutanty.
  3. Ekspresja kompleksu białkowego S1PRs-G
    1. Hoduj komórki owadzie sf9 do osiągnięcia gęstości 2,5 x 106 komórek/mL, zainfekuj wspólnie bakulowirusami P2 kodującymi S1PRs, Gi1 i Gβ1γ2 w stosunku objętości 1:2:1 i ponownie hoduj w 27 °C przez 48 h.
    2. Zbierz komórki przez wirowanie przy 700 x g w 4 °C przez 15 min, zamroź je w ciekłym azocie i przechowuj w -80 °C do późniejszego użycia.
  4. Oczyszczanie białka
    1. Rozmroź pellet komórkowy otrzymany w kroku 1.3 w temperaturze pokojowej, a następnie resuspenduj go w buforze do lizy (20 mM HEPES pH 7,5, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 5 mM CaCl2) uzupełnionym o 100 µg/mL benzamidyny, 100 µg/mL leupeptyny, 100 µg/mL aprotininy, 25 mU/mL apyrazą i 10 µM agonisty. Mieszaj zawiesinę komórkową w temperaturze pokojowej przez 2 h, aby indukowć tworzenie kompleksu białkowego S1PRs-G.
      UWAGA: Apyraza jest difosfohydrolazą ATP. Katalizuje ona usuwanie fosforanu gamma z ATP i fosforanu beta z ADP.
    2. Przenieś roztwór do probówek, wiruj przy 70 000 x g przez 10 min i ostrożnie usuń supernatant. Resuspenduj pellet w buforze solubilizującym (20 mM HEPES pH 7,5, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 5 mM CaCl2, 0,5% (w/v) LMNG, 0,1% (w/v) CHS, 1% (w/v) loucholanu sodu, 10% (v/v) glicerolu).
    3. Przenieś zawiesinę do szklanego homogenizatora Dounce i w pełni zhomogenizuj pellet. Dodaj do zawiesiny 10 µM agonisty, 4 mg scFv16, 100 µg/mL benzamidyny, 100 µg/mL leupeptyny, 100 µg/mL aprotininy oraz 25 mU/mL apyrazą i mieszaj w 4 °C przez 2 h.
      UWAGA: Kroki homogenizacji pelletów są kluczowe dla wytworzenia kompleksu białkowego GPCR-G.
    4. Przenieś roztwór do probówek i wiruj przy 100 000 x g przez 30 min w 4 °C.
    5. Wprowadź żywicę Flag do stanu równowagi za pomocą buforu płuczącego (20 mM HEPES pH 7,5, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 5 mM CaCl2, 10 µM agonisty, 0,0375% (w/v) LMNG, 0,0125% (w/v) GDN, 0,01% (w/v) CHS).
    6. Przenieś supernatant do probówek i inkubuj z żywicą Flag w 4 °C przez 2 h.
    7. Nałóż powyższą mieszaninę na szklaną kolumnę i przemyj kolumnę 50 mL buforu płuczącego uzupełnionego o 100 µg/mL benzamidyny, 100 µg/mL leupeptyny i 100 µg/mL aprotininy.
    8. Eluuj kolumnę za pomocą 10 mL buforu elucyjnego zawierającego 20 mM HEPES pH 7,5, 100 mM NaCl, 5 mM EDTA, 200 µg/mL peptydu Flag, 10 µM agonisty, 0,0375% (w/v) LMNG, 0,0125% (w/v) GDN, 0,01% (w/v) CHS, 100 µg/mL benzamidyny, 100 µg/mL leupeptyny i 100 µg/mL aprotininy.
    9. Zbierz kompleks białkowy S1PRs-G i skoncentruj do 1 mL za pomocą koncentratora z progiem odcięcia 100 kDa przy 1 300 x g w 4 °C. Przefiltruj przez filtr 0,22 µM i wiruj przy 13 000 x g przez 10 min w 4 °C, aby usunąć agregaty.
    10. Nałóż kompleks białkowy S1PRs-G na kolumnę do chromatografii wykluczania rozmiarów (SEC) uprzednio wyrównaną buforem SEC zawierającym 20 mM HEPES pH 7,5, 100 mM NaCl, 10 µM agonisty, 100 Μm TCEP, 0,00375% (w/v) LMNG, 0,00125% (w/v) GDN i 0,001% (w/v) CHS przy szybkości przepływu 0,5 mL/min w 4 °C.
    11. Zbierz frakcje szczytowe i skoncentruj za pomocą koncentratora z progiem odcięcia 100 kDa przy 1 300 x g w 4 °C do analizy cryo-EM.

2. Mikroskopia elektronowa w celu rozstrzygnięcia struktury S1PRs

  1. Gromadzenie danych
    1. Aby przygotować siatki do krio-EM, należy poddać siatki złote Au R1.2/1.3 o gęstości 300 mesh działaniu próżni przez 10 s i przeprowadzić glow discharge przez 60 s przy natężeniu 15 mA, korzystając z systemu do czyszczenia metodą glow discharge.
    2. Przeprowadź witryfikację próbki zgodnie z opisaną wcześniej procedurą33,34W konsoli do mrożenia wstrzykiwanego (plunge-freezing) ustaw temperaturę na 4 °C oraz wilgotność względna na poziomie 100% dla środowiska pracy komory. Ustaw siłę osuszania (blot force) na 0, czas oczekiwania na 0 s, czas osuszania (blot time) na 2 lub 3 s oraz czas odpływu (drain time) na 0 s. Zazwyczaj wymaga to jedynie 3 µL próbki w stężeniach 5–10 mg/ml do pojedynczej witryfikacji.
    3. Przytnąć i załadować siatki do automatycznego zestawu montażowego (auto grid assembly), załadować automatyczny zestaw montażowy do Nanocab, a następnie załadować Nanocab do mikroskopu za pomocą autoloadera zgodnie z wcześniejszym opisem35Ocena jakości próbek za pomocą oprogramowania EPU234Zazwyczaj dane zebrane w obszarach o odpowiedniej grubości lodu były lepszej jakości.
    4. Należy zebrać dane krio-EM zgodnie z opisem szczegółowym przedstawionym wcześniej35W przypadku receptora S1P ustaw przesunięcie defokusa w zakresie od -1.0 µm i -1.8 µm przy dawce ekspozycyjnej elektronów 50-65 e--/Å2W przypadku kompleksów S1PR1-Gi stosy filmów należy gromadzić automatycznie przy użyciu oprogramowania EPU2 w trybie zliczania (counting mode) z detektorem K2, przy całkowitym czasie ekspozycji 2 s, szybkości rejestracji pięciu surowych klatek na sekundę i całkowitej dawce 56 e.-/Å2 aby uzyskać 35 klatek na stos.
      UWAGA: Zazwyczaj do rekonstrukcji struktury receptora potrzeba więcej niż 5 000 filmów.
  2. Przetwarzanie danych z wykorzystaniem kombinacji oprogramowania RELION36 oraz cryoSPARC37 aby uzyskać optymalną mapę gęstości cryo-EM. Do wstępnego przetwarzania danych należy użyć oprogramowania RELION-3.1_gpu_ompi4, co obejmuje operacje analogiczne do opisanych wcześniej34.
    1. W terminalu systemu Linux przejdź do katalogu nadrzędnego katalogu przechowywania danych.
    2. Wprowadź relion polecenie w terminalu służące do uruchomienia graficznego interfejsu użytkownika (GUI) programu RELION.
      UWAGA: Jeśli jest to pierwsze otwarcie interfejsu graficznego RELION w tym katalogu, pojawi się okno z zapytaniem; należy kliknąć Tak.
    3. Kliknij w Import w pasku funkcji po prawej stronie interfejsu graficznego (GUI) programu RELION, aby zaimportować surowe dane do programu RELION.
      1. W Filmy/mikroskopy opcja, wybierz Tak dla Importować surowe filmy/mikrografie?wprowadź ścieżkę do danych w Surowe pliki wejściowe pole (zaleca się stosowanie znaków wieloznacznych), a następnie wybierz Tak dla Czy są to filmy wieloklatkowe?W polu Pixel size (Angstrom) wprowadź rozmiar piksela filmów, a w polu napięcia pracy mikroskopu (w kV) Napięcie (kV) pole oraz aberracja sferyczna mikroskopu w Aberracja sferyczna (mm) pole. Są to parametry, które odnotowano w momencie gromadzenia danych.
      2. W Przebieg badania opcja, zmodyfikować Nazwa kolejki zależnie od serwera, na którym uruchomiony jest program (inne funkcje również wymagają modyfikacji tego parametru). Pozostałe parametry pozostaw z wartościami domyślnymi ustawionymi przez RELION. Gdy wszystkie parametry zostaną poprawnie wykryte, kliknij BIEGNIJ! aby uruchomić program.
    4. Użyj Korekcja ruchu funkcja wyrównania wszystkich klatek38.
      1. W ramach Wejście/Wyjście opcja, kliknij w Przeglądaj i wybierz wynik z Import funkcja o nazwie filmy.gwiazda jako wejście dla Plik wejściowy STAR dla filmówWprowadź dawkę na klatkę w Dawka na klatkę (e/A)2) pole odpowiadające całkowitej dawce podzielonej przez liczbę klatek. Wybierz Nie dla Zapisać sumę widm mocy?.
      2. W Ruch opcja, wprowadź 250 dla współczynnik B, 5,5 dla Liczba obszarów X,Yi 2 dla Grupowanie klatek (zapewniając dawkę grupy >3). Jeśli dane nie zostały skorygowane względem wzmocnienia (gain-referenced) podczas okresu gromadzenia, wymagany jest obraz referencyjny wzmocnienia, który można uzyskać poprzez obrazowanie pustego obszaru siatki. Wybierz Nie dla Czy użyć własnej implementacji programu RELION? i wprowadź katalog zawierający plik wykonywalny programu MOTIONCOR239 w plik wykonywalny MOTIONCOR2 dziedzina
      3. W Bieganie opcja, należy wybrać odpowiednią liczbę procesów MPI oraz wątków w zależności od mocy obliczeniowej serwera; w tym przypadku zastosowano MPI = 8 oraz threads = 3.
    5. Zastosowanie Szacowanie CTF funkcja modulacji obrazu krio-EM witryfikowanej próbki40W wejście/wyjście opcja, kliknij w Przeglądaj i wybierz wynik z Korekcja ruchu nazwany poprawione mikrografie.star jako wejście dla Plik wejściowy STAR dla filmówW Gctf opcja, wybierz Tak dla użyć zamiast tego Gctf?.
    6. Zastosowanie Wybór podzbioru funkcja do usuwania mikrofotografii o wartości rlnCtfMaxResolutin >4.
      1. W w ramach Wejście/Wyjście opcja, kliknij w Przeglądaj znajdujący się po prawej stronie LUB wybierz z mikrografii.star i wybrać wynik z CtfFind nazwany mikrografie_ctf.star jako sygnał wejściowy. W Podzbiór opcja, wybierz Tak dla Wybierz na podstawie wartości metadanych? i zatwierdź 4 dla Maksymalna wartość metadanych w celu usunięcia błędnych danych.
    7. Ręczny wybór: ręczny wybór niektórych obrazów do wstępnej selekcji i klasyfikacji.
      1. W wejście/wyjście opcja, kliknij w Przeglądaj i wybrać wybrane_mikrografie.star z poprzedniego Wybierz katalog (krok 2.2.6) jako dane wejściowe.
      2. Kliknij w URUCHOM! (pojawia się okno). Kliknij w Plik w lewym górnym rogu nowego okna i kliknij Odwróć zaznaczenie aby odznaczyć wszystkie obrazy. Zaznacz pole wyboru znajdujące się najbardziej po lewej stronie w odpowiednim wierszu każdego wpisu, a następnie kliknij wybierz należy sprawdzić obrazy i wybrać około 500 prawidłowych obrazów. Kliknij w Plik > Zapisz zaznaczenie aby zapisać wybrane obrazy i zamknąć okno.
    8. Automatyczne wybieranie (auto-picking): zautomatyzowane pakiety oprogramowania do wybierania cząstek są użyteczne i wydajne41.
      1. W wejście/wyjście opcja, kliknij w Przeglądaj na prawo od Mikrografie wejściowe do automatycznego wybierania cząstek i wybierz wybrane_mikrografie.star z poprzedniego Ręczny wybór katalog (Krok 2.2.7) jako dane wejściowe. Na początku stosowany jest algorytm Laplasjanu z funkcją Gaussa, dlatego należy wybrać Tak dla LUB: zastosuj operator Laplace’a-Gaussa.
      2. W Laplasjan opcja, zestaw Minimalna średnica dla filtra LoG (A) Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia. 80 i Maks. średnica filtru LoG (A) Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia. 130W ramach Automatyczny dobór kolonii opcja, zestaw Minimalna odległość między cząsteczkami (A) do 65, i wybierz Tak dla Użyj akceleracji GPU czy dostęp do GPU jest możliwy.
    9. Wyodrębnić cząstki do kolejnych etapów.
      1. W wejście/wyjście opcja, kliknij Przeglądaj po prawej stronie plik STAR mikrografu i wybierz wybrane_mikrografie.star z Kroku 2.2.6. Kliknij w Przeglądaj po prawej stronie Współrzędnych wejściowych i wybrać cords_suffix_autopick.star od kroku 2.2.8.
      2. W Ekstrakt opcja, wybierz Tak dla Zmiana skali cząstek i ustawić Przeskalowany rozmiar (piksele) do 128 w celu przyspieszenia późniejszych etapów.
    10. Klasyfikacja 2D do wstępnej klasyfikacji cząstek
      1. W Wejście/Wyjście opcja, kliknij w Przeglądaj po prawej stronie Plik STAR obrazów wejściowych i wybierz cząsteczki.star z kroku 2.2.9. W Optymalizacja opcja, zestaw Liczba klas Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia. 100 i Średnica maski (A) Proszę podać tekst źródłowy do przetłumaczenia. 140.
      2. W Obliczenia opcja, zestaw Liczba połączonych cząsteczek Proszę podać tekst do tłumaczenia. 10wejdź do katalogu znajdującego się na szybkim dysku lokalnym (np. dysku SSD) w Kopiuj cząsteczkę do katalogu tymczasowego (scratch) pole i wybierz Tak dla Użyć akceleracji GPU? dla uzyskania większej szybkości przetwarzania.
    11. Wybór podzbioru w celu wyselekcjonowania reprezentatywnych wyników 2D jako szablonów do wyboru cząstek
      1. W wejście/wyjście opcja, kliknij w Przeglądaj po prawej stronie Wybierz klasy z model.star i wybierz wynik kroku 2.2.10 o nazwie plik run_it025_model.star jako dane wejścioweKliknij w BIEGNIJ!W oknie wyskakującym zaznacz Sortuj obrazy według i Sortowanie odwrócone? i kliknij w Wyświetl!.
      2. Wybierz reprezentatywne wyniki 2D, które posłużą jako punkt odniesienia dla Bibliografia z Automatyczny pobór próbek funkcja
        UWAGA: Wybrane wyniki zostały obramowane na czerwono. Dobre i złe wyniki klasyfikacji 2D zostaną przedstawione w dalszej części.
      3. Kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz Zapisz wybrane klasy.
    12. Użyj szablonu dla drugiej rundy automatycznego pobierania. W Wejście/wyjście opcja, kliknij w Przeglądaj po prawej stronie Mikrografie wejściowe do automatycznego wyboru obszarów (autopick) i wybrać wybrane_mikrografie.star z kroku 2.2.6. Kliknij w Przeglądaj po prawej stronie Referencje 2Dwybierz class_averages.star z kroku 2.2.11 i wybierz Nie dla LUB: zastosuj operator Laplace'a z rozkładem Gaussa (LoG)n.
    13. Ponownie przeprowadź ekstrakcję cząstek, wykorzystując coord_suffix_autopick.star z kroku 2.2.12 i wybrane_mikrografie.star od Kroku 2.2.6.
    14. Ponownie przeprowadź klasyfikację 2D, używając cząsteczki.star od kroku 2.2.13.
    15. Ponownie przeprowadź wybór podzbioru, korzystając z run_it025_optymalizator.star od kroku 2.2.14.
      UWAGA: Należy wybrać wszystkie obrazy 2D o wyraźnych konturach i poprawnych kształtach.
    16. Ekstrakcję cząstek przeprowadza się w następujący sposób. W Wejście/Wyjście opcja, kliknij w Przeglądaj po prawej stronie plik STAR mikrografiiwybrać wybrane_mikrografie.star z kroku 2.2.6, a następnie wybierz Tak dla CZY ponawiać ekstrakcję oczyszczonych cząsteczek?Kliknij w Przeglądaj po prawej stronie Plik STAR z przetworzonymi cząstkami i wybrać cząsteczki.star od Kroku 2.2.15.
    17. Wstępny model 3D i generowanie mapy referencyjnej: W wejścia/wyjścia opcja, kliknij w Przeglądaj po prawej stronie Plik STAR obrazów wejściowych i wybrać cząsteczki.star od Kroku 2.2.16. Ustaw Liczba klas Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia. 1oraz Średnica maski (A) Proszę podać tekst źródłowy w języku angielskim, który ma zostać przetłumaczony. 140 w Optymalizacja opcja
    18. Klasyfikacja 3D i generowanie wstępnej mapy 3D: W ramach Wejście/Wyjście opcja, kliknij w Przeglądaj po prawej stronie Plik STAR obrazów wejściowych i wybierz cząsteczki.star z kroku 2.2.16. Kliknij w Przeglądaj po prawej stronie Mapa referencyjna i wybierz initial_model.mrc od kroku 2.2.17. Ustawić Liczba klas od 4 do 6oraz Średnica maski (A) do 140 w Optymalizacja opcja
    19. Generowanie masek: Wybierz odpowiednią mapę (lub mapy) 3D z kroku 2.2.17 jako dane wejściowe w wejścia/wyjścia opcja. Ustawić Wstępny próg binaryzacji do 0.05 (dostosować na podstawie wyniku), Rozszerz mapę binarną o tę liczbę pikseli do 3, i Dodaj miękką krawędź o tej liczbie pikseli Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia. 8 w Maska opcja
    20. Do dalszej obróbki należy wykorzystać oprogramowanie cryoSPARC.
    21. Utwórz nowy obszar roboczy i kliknij w Kreator zadań do pierwszej czynności.
    22. Aby zaimportować stos cząstek, należy wprowadzić ścieżkę do cząstek (Krok 2.2.16) w Metaścieżka cząstek pole i ścieżka filmu (Krok 2.2.16) w Ścieżka danych cząsteczek dziedzina
      UWAGA: Parametry Napięcie przyspieszające (kV), aberracja sferyczna (mm)i Rozmiar piksela (Angstrom) pozostają takie same jak wcześniej. Kontrast amplitudowy wartość (frakcja) wynosi 0,1.
    23. Zaimportuj wolumeny 3D, wprowadzając ścieżkę do najlepszego wolumenu 3D w kroku 2.2.18 w Ścieżka danych wolumetrycznych oraz wybieranie Mapa dla Typ importowanego wolumenu.
    24. Zaimportuj maskę, wpisując ścieżkę do maski (krok 2.2.19) w Ścieżka danych wolumetrycznych oraz wybieraniu Maska dla Typ importowanej objętości.
    25. Niejednorodna rafinacja: Jako dane wejściowe przyjmij wyniki kroków 2.2.22, 2.2.23 oraz 2.2.24.
      UWAGA: Funkcja ta jest bardzo użyteczna w przypadku białek błonowych.
      1. Przeciągnij wynik kroku 2.2.22 (importowane cząstki) jako dane wejściowe dla funkcji Non-uniform Refinement cząstki (cząstka), wynik kroku 2.2.23 (zaimportowana_objętość_1) jako dane wejściowe dla nieliniowego doprecyzowania (Non-uniform Refinement) objętość (objętość)or wynik kroku 2.2.24 (zaimportowana_maska_1) jako dane wejściowe dla funkcji Non-uniform Refinement maska (maska).
        UWAGA: Czasami lepsze wyniki można osiągnąć bez zastosowania maski.
      2. Kliknij Kolejka rozpocząć przetwarzanie.
    26. Wykonaj kroki 2.2.18–2.2.25, aby uzyskać lepsze wyniki. Dzięki powyższej serii procesów można otrzymać mapę 3D S1PR-Gi o dobrej rozdzielczości.

3. Analiza hamowania cAMP pośredniczona przez kompleksy S1PRs-Gi

UWAGA: Eksperyment hamowania cAMP pośredniczone przez S1PRs-Gi został podzielony na kilka części, a poniżej przedstawiono szczegółowe procedury eksperymentalne. Zasada eksperymentu oraz ogólny przebieg procesu zostały przedstawione w formie schematu blokowego na Rysunku 1.

  1. Konstrukcja plazmidów
    1. Wykonaj subklonowanie cDNA dla typów dzikich S1PR1, S1PR3 i S1PR5 do wektora pcDNA3.1+ z sekwencją sygnałową HA, a następnie znacznikiem Flag na N-końcu (Tabela materiałów).
      UWAGA: Mutacje we wszystkich receptorach zostały wygenerowane przy użyciu zestawu do mutagenezy (Tabela materiałów).
  2. Przygotowanie plazmidu
    1. Dodaj rekombinowane wektory pcDNA3.1+ lub plazmid Sensor (Tabela materiałów) do 50 µL z DH5α kompetentne Escherichia coli (E. coli) przechowywać w probówce 1,5 ml w temperaturze -80 °C osobno, a następnie inkubować w lodzie przez 30 min. Poddać komórki szokowi termicznemu w temperaturze 42 °C przez 90 s, następnie natychmiast przenieść je na lód i chłodzić przez 2 min.
      UWAGA: Plazmid Sensor dostarczony w zestawie do analizy cAMP z inhibicją Gi (Tabela materiałówwyraża zmodyfikowany gen lucyferazy połączony z domeną wiążącą cAMP i wykazuje zwiększoną aktywność luminescencyjną w obecności związanego cAMP.
    2. Wstrząsnąć probówką przy 37 °C przez 1 h po uzupełnieniu o 300 µL pożywki LB (lysogeny broth). Wysiać na płytki 100 µL komórek na płytkę z agarem LB i inkubować w temperaturze 37 °C poprzez inkubację w ciemności przez 48 h. Kolonię o białym kolorze zaszczepić do 5 ml podłoża LB zawierającego 100 µg/mL Ampicylinę i inkubację w 37 °C przez 16 h.
    3. Wyizoluj DNA przy użyciu zestawu do minipreparatyki plazmidów (Tabela materiałów) zgodnie z instrukcją producenta; stężenie plazmidu wynosiło ponad 350 ng/µL z wartością A260/A280 między 1,7 a 1,9.
  3. Hodowla komórkowa
    1. Wysiać komórki CHO-K1 do szalki Petriego o średnicy 10 cm i hodować je w 37 °C inkubator z 5% CO22i zbierać je, gdy monowarstwa osiągnie 80%–90% konfluencji.
    2. Odssać pożywkę hodowlaną z komórek CHO-K1 i dodać 4 ml 0,05% trypsyny-EDTA uprzednio ogrzanej do 37 °C ostrożnie na szalkę Petriego i inkubować przez 15 s. Następnie dodać 4 ml pożywki wzrostowej składającej się z pożywki F12 + 10% FBS.
    3. Oddzielić komórki od powierzchni szalki Petriego, delikatnie kołysząc i opukując bok naczynia. Przenieść zawiesinę komórkową do probówki stożkowej. Mieszać i powoli pipetować, aby delikatnie usunąć aglomeraty komórek.
    4. Wirować komórki z prędkością 250 x g przez 5 min w temperaturze pokojowej, odessać supernatant i resuspender w 3 ml PBS. Powtórzyć ten krok.
    5. Wyznacz liczbę komórek za pomocą hemacytometru, a następnie odwiruj komórki przy 250 x g. g przez 5 min w temperaturze pokojowej.
    6. Odssać bufor PBS i resuspendować komórki CHO-K1 w 3 ml pożywki wzrostowej składającej się z pożywki F12 i 10% FBS.
    7. Do każdego dołka płytki sześciodołkowej dodać 2 ml pożywki wzrostowej składającej się z pożywki F12 i 10% FBS, a następnie zasiać 150 µL zawiesiny komórkowej do każdego dołka, aby utrzymać gęstość komórek na poziomie 1,5 x 105 komórek/ml. Inkubować płytkę sześciodołkową w 37 °C inkubator do hodowli tkankowych z 5% CO22 przez około 24 h.
  4. Transfekcja przejściowa
    1. Rozcieńczyć 2 µg DNA (krok 3.2.3) do 200 µL buforu odczynnika do transfekcji (Tabela materiałów). Wymieszać za pomocą wortexera przez 10 s i krótko odwirować przed użyciem.
      UWAGA: W tym przypadku 2 µg DNA zawiera 0.5 µg wektora receptora (S1PR1, S1PR3 lub S1PR5) i 1.5 µg plazmidu Sensor.
    2. Dodaj 4 µL odczynnika do transfekcji (Tabela materiałów), wierzchołkować przez 10 s i krótko wirować przed użyciem. Inkubować przez 15 min w temperaturze pokojowej.
    3. Powoli dodawać kroplami 200 µL mieszaniny do transfekcji do każdej studni (zawierającej komórki CHO-K1), aby równomiernie ją rozprowadzić. Delikatnie potrząśnij płytką sześciodołkową, aby zapewnić dokładne wymieszanie.
    4. Po 4–6 h należy wymienić medium do transfekcji na medium wzrostowe składające się z medium F12 + 10% FBS i umieścić płytkę sześciodołkową z powrotem w inkubatorze.
    5. Zbiór komórek należy przeprowadzić 24–48 h po transfekcji.
      1. Trawienie komórek CHO-K1 w studzience za pomocą 500 µL 0,05% trypsyny z EDTA (podgrzanej wcześniej do 37 °C) przez 15 s, a następnie dodać 1 ml pożywki wzrostowej składającej się z pożywki F12 + 10% FBS. Odczepić komórki od powierzchni dołka poprzez kołysanie i delikatne opukiwanie ścianki dołka.
      2. Przenieść zawiesinę komórek do probówki stożkowej i wirować z prędkością 250 x g przez 5 min w temperaturze pokojowej. Odlać nadsącz i zebrać transfektowane komórki.
        UWAGA: Przed oznaczeniem sygnału fluorescencyjnego należy sprawdzić poziomy ekspresji receptorów na powierzchni komórek za pomocą metody ELISA, zgodnie z wcześniejszym opisem.26.
  5. Równoważenie z solą potasową D-lucyferyny (Tabela materiałów)
    1. Zebrane komórki (24–48 h po transfekcji) należy niezwłocznie zawiesić w 3 ml buforu do analizy (tj. zrównoważonego roztworu soli Hanksa (HBSS) zawierającego 10 mM HEPES pH 7,4) z dodatkowym rozcieńczeniem 3% v/v soli potasowej D-lucyferyny.
    2. Dodaj 90 µL zawiesiny komórkowej na dołek płytki 96-dołkowej przy użyciu pipety wielokanałowej, a następnie delikatnie wymieszać.
    3. Inkubować przez 40 min w temperaturze pokojowej.
  6. Oznaczanie sygnału fluorescencji
    1. Należy wcześniej przygotować 10 mM roztwory zapasowe siponimodu rozpuszczonego w DMSO, a następnie wykonać rozcieńczenia seryjne przy użyciu buforu HBSS zawierającego 25 µM forskolina przed stymulacją ligandem.
      UWAGA: Z wyjątkiem grupy kontrolnej bez ligandu, pozostałe grupy mają zakres gradientu stężeń wynoszący 10-11-10-5 mol/L.
    2. Stymulować za pomocą 10 µL (na studzienkę) roztworu agonisty o różnych stężeniach przez 30 min.
    3. Odczytaj sygnały luminescencyjne za pomocą czytnika mikropłytek, korzystając z odpowiedniego oprogramowania (Tabela materiałów) parametry w następujący sposób. Wybierz Luminescencja dla Metoda detekcji, punkt końcowy dla Typ odczytu, i Włókno luminescencyjne dla Typ optykiUstaw Wzmocnienie optyczne Proszę podać tekst źródłowy do przetłumaczenia. 255.
      UWAGA: Każdy pomiar powtórzono w co najmniej trzech niezależnych eksperymentach, każdy w trzech powtórzeniach.
    4. Należy odczytać wartości sygnału fluorescencji, zaimportować dane do programu arkusza kalkulacyjnego, a następnie przetworzyć je przy użyciu funkcji regresji nieliniowej (dopasowania krzywej) dla zależności dawka-odpowiedź.

figure-protocol-1
Rycina 1Schematyczny rysunek eksperymentu. Szczegółowy przewodnik krok po kroku dotyczący konfiguracji i przeprowadzenia eksperymentu. W skrócie, receptor i zmodyfikowana lucyferaza były przejściowo koekspresowane w komórkach CHO-K1 poprzez transfekcję komórek plazmidem receptora oraz plazmidem Sensor przy użyciu odczynnika do transfekcji. Komórki zawieszono w roztworze HBSS z solą potasową D-lucyferyny, która jest substratem lucyferazy, a po 24 h wysiano na płytkę 96-dołkową. Aby umożliwić przenikanie do wnętrza komórek, D-lucyferyna musi zostać uprzednio zrównoważona z komórkami. Enzym utleniający lucyferaza przekształca lucyferynę w oksylucyferynę i emituje światło. Zmodyfikowana lucyferaza z kolei generuje światło poprzez reakcja chemiczna zachodzi wyłącznie po związaniu z cAMP, a natężenie światła wykazuje dodatnią korelację z poziomami cAMP w komórkach. Poziomy cAMP były regulowane za pomocą GPCR aktywowanego agonistą. Receptory sprzężone z białkiem Gi obniżały poziomy cAMP, co wymagało dodania forskoliny w celu aktywacji cyklazy adenylowej w eksperymencie dotyczącym hamowania cAMP przez białko Gi. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Przed zamrożeniem próbki kompleksu S1PRs-Gi należy poddać ją rozdziałowi za pomocą chromatografii wykluczania cząsteczkowego (SEC) i przeanalizować metodą chromatografii żelowej. Rycina 2 przedstawia kompleks S1PR3-Gi jako przykład. Frakcja szczytowa jednorodnego kompleksu GPCR-białka G znajdowała się zazwyczaj przy ~10,5 mL w chromatografii wykluczania cząsteczkowego (Rycina 2A). Analiza SDS-PAGE kompleksu S1PR3-Gi (Rycina 2B) wyka...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Protokół ten opisuje podstawowy potok do określania struktur S1PR za pomocą cryo-EM i pomiaru siły aktywacji S1PR za pomocą testu inhibicji cAMP za pośrednictwem Gi. Niektóre kroki są kluczowe dla powodzenia eksperymentu.

Aby oczyścić kompleks S1PRs-Gi, należy zwrócić większą uwagę na jakość wirusa i zdrowie komórek sf9 . Ekspresja receptora jest dramatycznie zmniejszona w słabych komórkach sf9 . Zdrowie komórek sf9 oceniano, mierząc ich średnicę. Zdrowa komórka ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie pozostają w konflikcie interesów.

Podziękowania

Dane kompleksu S1PRs-Gi zostały zebrane w Centrum Krio-EM Zachodniochińskim na Uniwersytecie Sichuan oraz Centrum Krio-EM na Południowym Uniwersytecie Nauki i Technologii (SUSTech) i przetworzone w Centrum Obliczeń Wysokiej Wydajności Duyu na Uniwersytecie Sichuan. Praca ta była wspierana przez Chińską Fundację Nauk Przyrodniczych (32100965 do L.C., 32100988 do W.Y., 31972916 do Z.S.) oraz Fundusz Badań Podoktoranckich Uniwersytetu Syczuańskiego (2021SCU12003 do L.C.)

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,05% trypsyna-EDTAGIBCOCat# 25300054
0,22 i mikro; Filtr MThermo Fisher ScientificCat# 42213-PS
Koncentrator odcinający 100 kDaThermo Fisher ScientificCat# 88533
6-dołkowaCorningCat# 43016
płytka 96-dołkowaCorningCat# 3917
AprotininSigma-AldrichCat# 9087-70-1
ApyraseNEBCat# M0398S
Odczynnik do transfekcji bakulowirusaThermo Fisher ScientificCat# 10362100Do przygotowania bakulowirusa P0
BenzamidineSigma-AldrichCat# B6506
CHO-K1ATCCN/A
CHSSigma-AldrichCat# C6512
CryoSPARCPunjani, A., et al.,2017https://cryosparc.com/
DH5α kompetentny E.coliThermo Fisher ScientificCat# EC0112
D-Lucyferin-Sól potasowaSigma- AldrichCat# 50227
DMSOSigma- AldrichCat# D2438
EDTAThermo Fisher ScientificCat# S311-500
ESF921 pożywka do hodowli komórkowychSystemy ekspresjiCat#  96-001
ExcelMicrosoftN/A
F12 mediumInvitrogenCat# 11765
FBSCell BoxCat# SAG-01U-02
Żywica flagowaSigma- AldrichCat# A4596
ForskolinAPExBIOCat# B1421
GctfZhang, 2016  https://www.mrc-lmb.cam.ac.uk/kzhang/Gctf/
GDNAnatraceCat# GDN101
Żelowa kolumna filtracyjnaGE healthcareCat# 28990944
Gen5 3.11BIO-TEKN/A
GentamycynaSolarbioCat# L1312
GloSensor cAMP zestaw do oznaczaniaPromegaCat# E1291Zestaw do oznaczania przewody pokarmowego cAMP
Plazmid GloSensorPromegaCat# E2301Plazmid czujnika
Grace' s średniGIBCOCat# 11595030
GraphPad Prism 8GraphpadN/A
HBSSThermo Fisher ScientificCat# 88284
HEPESSigma- AldrichCat# H4034
jetPRIME Odczynniktransfekcji Polyplus Cat# 114-15odczynnik do transfekcji
JanamycinSolarbioCat# K1030
LB mediumInvitrogenCat# 12780052
LeupeptinSigma-AldrichCat# L2884
LMNGAnatraceCat# NG310
MotionCor2(Zheng et al., 2017)https://emcore.ucsf.edu/ucsf-software
NanoCabThermo Fisher ScientificCat# 1121822
PBSInvitrogenCat# 14190-144
pcDNA3.1-HA-FLAG-S1PRsGenScriptN/A
pFastBac1-Gα iGenScriptN/A
pFastBac1-HA-FLAG-T4L-S1PRs-His10GenScriptN/A
pFastBacdual-Gβ 1γ 2GenScriptN/A
PureLink HiPure Plasmid Miniprep KitInvitrogenCat# K210003Do przygotowania plazmidów i bakulowirusa P0
Q5 Zestaw do mutagenezy ukierunkowanej na miejsceNEBCat# E0554SDo przygotowania plazmidów
QuantifoilQuantifoilCat# 251448
RELION-3.1(Zivanov i wsp., 2018)
S1PRs cDNAaddgeneN/A
scFv16InvitrogenCat# 703976
Sf9Expression SystemsN/A
SiponimodSelleckCat# S7179
cholan soduSigma-AldrichCat# C1254
Synergy H1 czytnik mikropłytekBIO-TEKN/A
Syntetyczne DNA T4L (sekwencja)N/A/AAacatcttcgagatgctgcgcatcgacgaagg
cctgcgtctcaagatttacaagaataccgaagg
ttattacacgattggcatcggccacctcctgaca
aagagcccatcactcaacgctgccaagtctga
actggacaaagcattgggcaacaccaac
ggtgtcattacaaaggacgagggggagaaac
tcttcaaccaagatgatgcggctgtccgtgg
catcctgcgtaatgccaagggcccgt
gatcaacatggttccaaatgggg
agtggctggttttacgaactccctgcgcatgctcc
agcagaagcgctgggacgagggcagtga
atttggctaaatctcgctggtacaatcagacacc
taaccgtgccaaggcatcatcactaccttccg
tactggaacttgggccttac
TCEPThermo Fisher ScientificCat# 77720
TetracyklinaSolarbioCat# T8180
Vitrobot Mark IVThermo Fisher ScientificN/A
płytka do https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/relion N

Bibliografia

  1. Verstockt, B., et al. Sphingosine 1-phosphate modulation and immune cell trafficking in inflammatory bowel disease. Nature Reviews: Gastroenterology & Hepatology. , 1-16 (2022).
  2. Rosen, H., Stevens, R. C., Hanson, M., Roberts, E., Oldstone, M. B. Sphingosine-1-phosphate and its receptors: structure, signaling, and influence. Annual Review of Biochemistry. 82, 637-662 (2013).
  3. Cartier, A., Hla, T. Sphingosine 1-phosphate: Lipid signaling in pathology and therapy. Science. 366 (6463), 5551(2019).
  4. Jozefczuk, E., Guzik, T. J., Siedlinski, M. Significance of sphingosine-1-phosphate in cardiovascular physiology and pathology. Pharmacological Research. 156, 104793(2020).
  5. Kihara, Y., Maceyka, M., Spiegel, S., Chun, J. Lysophospholipid receptor nomenclature review: IUPHAR Review 8. British Journal of Pharmacology. 171 (15), 3575-3594 (2014).
  6. Bryan, A. M., Del Poeta, M. Sphingosine-1-phosphate receptors and innate immunity. Cellular Microbiology. 20 (5), 12836(2018).
  7. Pelletier, D., Hafler, D. A. Fingolimod for multiple sclerosis. New England Journal of Medicine. 366 (4), 339-347 (2012).
  8. Obinata, H., Hla, T. Sphingosine 1-phosphate and inflammation. International Immunology. 31 (9), 617-625 (2019).
  9. Pyne, N. J., Pyne, S. Sphingosine 1-phosphate and cancer. Nature Reviews: Cancer. 10 (7), 489-503 (2010).
  10. Abu-Farha, M., et al. The role of lipid metabolism in COVID-19 virus infection and as a drug target. International Journal of Molecular Sciences. 21 (10), 3544(2020).
  11. Chun, J., Kihara, Y., Jonnalagadda, D., Blaho, V. A. Fingolimod: lessons learned and new opportunities for treating Multiple Sclerosis and other disorders. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 59, 149-170 (2019).
  12. Murakami, A., et al. Sphingosine 1-phosphate (S1P) regulates vascular contraction via S1P3 receptor: investigation based on a new S1P3 receptor antagonist. Molecular Pharmacology. 77 (4), 704-713 (2010).
  13. Cao, L., et al. Siponimod for multiple sclerosis. Cochrane Database of Systematic Reviews. 11, (2021).
  14. Scott, L. J. Siponimod: a review in secondary progressive Multiple Sclerosis. CNS Drugs. 34 (11), 1191-1200 (2020).
  15. Lamb, Y. N. Ozanimod: first approval. Drugs. 80 (8), 841-848 (2020).
  16. Scott, F. L., et al. Ozanimod (RPC1063) is a potent sphingosine-1-phosphate receptor-1 (S1P1) and receptor-5 (S1P5) agonist with autoimmune disease-modifying activity. British Journal of Pharmacology. 173 (11), 1778-1792 (2016).
  17. McGowan, E. M., Haddadi, N., Nassif, N. T., Lin, Y. Targeting the SphK-S1P-SIPR pathway as a potential therapeutic approach for COVID-19. International Journal of Molecular Sciences. 21 (19), 7189(2020).
  18. O'Sullivan, C., Dev, K. K. The structure and function of the S1P1 receptor. Trends in Pharmacological Sciences. 34 (7), 401-412 (2013).
  19. Liao, M., Cao, E., Julius, D., Cheng, Y. Structure of the TRPV1 ion channel determined by electron cryo-microscopy. Nature. 504 (7478), 107-112 (2013).
  20. Bai, X. C., McMullan, G., Scheres, S. H. How cryo-EM is revolutionizing structural biology. Trends in Biochemical Sciences. 40 (1), 49-57 (2015).
  21. Murata, K., Wolf, M. Cryo-electron microscopy for structural analysis of dynamic biological macromolecules. Biochimica et Biophysica Acta General Subjects. 1862 (2), 324-334 (2018).
  22. Zhang, M., et al. Cryo-EM structure of an activated GPCR-G protein complex in lipid nanodiscs. Nature Structural & Molecular Biology. 28 (3), 258-267 (2021).
  23. Renaud, J. P., et al. Cryo-EM in drug discovery: achievements, limitations and prospects. Nature Reviews: Drug Discovery. 17 (7), 471-492 (2018).
  24. Ishchenko, A., Gati, C., Cherezov, V. Structural biology of G protein-coupled receptors: new opportunities from XFELs and cryoEM. Current Opinion in Structural Biology. 51, 44-52 (2018).
  25. Yang, D., et al. G protein-coupled receptors: structure- and function-based drug discovery. Signal Transduction and Targeted Therapy. 6 (1), 7(2021).
  26. Yuan, Y., et al. Structures of signaling complexes of lipid receptors S1PR1 and S1PR5 reveal mechanisms of activation and drug recognition. Cell Research. 31 (12), 1263-1274 (2021).
  27. Zhao, C., et al. Structural insights into sphingosine-1-phosphate recognition and ligand selectivity of S1PR3-Gi signaling complexes. Cell Research. 32 (2), 218-221 (2022).
  28. Xu, Z., et al. Structural basis of sphingosine-1-phosphate receptor 1 activation and biased agonism. Nature Chemical Biology. 18, 281-288 (2022).
  29. Liu, Y. F., Ghahremani, M. H., Rasenick, M. M., Jakobs, K. H., Albert, P. R. Stimulation of cAMP synthesis by Gi-coupled receptors upon ablation of distinct Galphai protein expression. Gi subtype specificity of the 5-HT1A receptor. Journal of Biological Chemistry. 274 (23), 16444-16450 (1999).
  30. Buccioni, M., et al. Innovative functional cAMP assay for studying G protein-coupled receptors: application to the pharmacological characterization of GPR17. Purinergic Signalling. 7 (4), 463-468 (2011).
  31. Wang, F. I., Ding, G., Ng, G. S., Dixon, S. J., Chidiac, P. Luciferase-based GloSensor cAMP assay: Temperature optimization and application to cell-based kinetic studies. Methods. , (2021).
  32. Audet, M., et al. Small-scale approach for precrystallization screening in GPCR X-ray crystallography. Nature Protocols. 15 (1), 144-160 (2020).
  33. Sgro, G. G., Costa, T. R. D. Cryo-EM grid preparation of membrane protein samples for single particle analysis. Frontiers in Molecular Biosciences. 5, 74(2018).
  34. White, J. B. R., et al. Single particle cryo-electron microscopy: from sample to structure. Journal of Visualized Experiments. (171), e62415(2021).
  35. Thompson, R. F., Iadanza, M. G., Hesketh, E. L., Rawson, S., Ranson, N. A. Collection, pre-processing and on-the-fly analysis of data for high-resolution, single-particle cryo-electron microscopy. Nature Protocols. 14 (1), 100-118 (2019).
  36. Fernandez-Leiro, R., Scheres, S. H. W. A pipeline approach to single-particle processing in RELION. Acta Crystallographica Section D. 73 (6), 496-502 (2017).
  37. Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. cryoSPARC: algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination. Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
  38. Brilot, A. F., et al. Beam-induced motion of vitrified specimen on holey carbon film. Journal of Structural Biology. 177 (3), 630-637 (2012).
  39. Zheng, S. Q., et al. MotionCor2: anisotropic correction of beam-induced motion for improved cryo-electron microscopy. Nature Methods. 14 (4), 331-332 (2017).
  40. Zhang, K. Gctf: Real-time CTF determination and correction. Journal of Structural Biology. 193 (1), 1-12 (2016).
  41. Scheres, S. H. Semi-automated selection of cryo-EM particles in RELION-1.3. Journal of Structural Biology. 189 (2), 114-122 (2015).
  42. Liu, S., et al. Differential activation mechanisms of lipid GPCRs by lysophosphatidic acid and sphingosine 1-phosphate. Nature Communications. 13 (1), 731(2022).
  43. Duan, J., et al. Cryo-EM structure of an activated VIP1 receptor-G protein complex revealed by a NanoBiT tethering strategy. Nature Communications. 11 (1), 4121(2020).
  44. DiIorio, M. C., Kulczyk, A. W. A robust single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) processing workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion. Journal of Visualized Experiments. (179), e63387(2022).
  45. Pradelles, P., Grassi, J., Chabardes, D., Guiso, N. Enzyme immunoassays of adenosine cyclic 3',5'-monophosphate and guanosine cyclic 3',5'-monophosphate using acetylcholinesterase. Analytical Chemistry. 61 (5), 447-453 (1989).
  46. Jiang, L. I., et al. Use of a cAMP BRET sensor to characterize a novel regulation of cAMP by the sphingosine 1-phosphate/G13 pathway. Journal of Biological Chemistry. 282 (14), 10576-10584 (2007).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Receptory S1Preceptory sprz one z bia kiem Gkriomikroskopia elektronowachromatografia elowaanaliza strukturalnatesty funkcjonalneszlaki sygna oweodkrywanie lek wreceptory lizofosfolipid w
Rurociąg do badania struktur i szlaków sygnałowych receptorów sfingozyno-fosforanowych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.