Artykuł metodologiczny

Pobieranie i perfuzja-decelularyzacja unaczynionych płatów świń w niestandardowym bioreaktorze perfuzyjnym

DOI:

10.3791/64068

⸱

1 sierpnia 2022

 ,  ,  , 
1Latner Thoracic Surgery Research Laboratories, Toronto General Hospital Research Institute, University Health Network, 2Institute of Laboratory Medicine and Pathobiology, University of Toronto, 3Division of Thoracic Surgery, Department of Surgery, University of Toronto, 4Division of Plastic and Reconstructive Surgery, Department of Surgery, University of Toronto

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół opisuje chirurgiczne pobieranie i późniejszą decelularyzację unaczynionych płatów świńskich poprzez perfuzję detergentu z dodecylosiarczanu sodu przez unaczynienie płata w dostosowanym bioreaktorze perfuzyjnym.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Duże ubytki tkanek miękkich prowadzą do deficytów funkcjonalnych i mogą znacznie wpłynąć na jakość życia pacjenta. Chociaż rekonstrukcję chirurgiczną można wykonać za pomocą autologicznego transferu wolnego płata lub unaczynionej allotransplantacji kompozytowej (VCA), takie metody mają również wady. Problemy takie jak zachorowalność w miejscu dawczym i dostępność tkanek ograniczają autologiczny transfer wolnego płata, podczas gdy immunosupresja jest znaczącym ograniczeniem VCA. Modyfikowane tkanki w chirurgii rekonstrukcyjnej z wykorzystaniem metod decelularyzacji/recelularyzacji stanowią możliwe rozwiązanie. Tkanki pozbawione komórek są generowane przy użyciu metod, które usuwają natywny materiał komórkowy przy jednoczesnym zachowaniu podstawowej mikroarchitektury macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM). Te bezkomórkowe rusztowania mogą być następnie rekomórkowane komórkami specyficznymi dla biorcy.

Ten protokół szczegółowo opisuje metody pozyskiwania i decelularyzacji używane do uzyskania bezkomórkowych rusztowań w modelu świni. Ponadto zawiera również opis projektu i konfiguracji bioreaktora perfuzyjnego. Płaty obejmują sieć świni, tensor powięzi szerokiej i promieniowe przedramię. Decelularyzacja odbywa się poprzez perfuzję ex vivo detergentu z dodecylosiarczanu sodu (SDS), a następnie obróbkę enzymatyczną DNazy i sterylizację kwasem nadoctowym w dostosowanym bioreaktorze perfuzyjnym.

Udana decelularyzacja tkanek charakteryzuje się biało-nieprzezroczystym wyglądem płatów makroskopowo. Płaty bezkomórkowe wykazują brak jąder na barwieniu histologicznym i znaczne zmniejszenie zawartości DNA. Protokół ten może być efektywnie wykorzystywany do generowania bezkomórkowych rusztowań tkanek miękkich z zachowaną ECM i mikroarchitekturą naczyniową. Takie rusztowania mogą być wykorzystywane w późniejszych badaniach nad recelularyzacją i mają potencjał do zastosowania klinicznego w chirurgii rekonstrukcyjnej.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Uraz i usunięcie guza mogą prowadzić do dużych i skomplikowanych wad tkanek miękkich. Wady te mogą pogarszać jakość życia pacjenta, powodować utratę funkcji i prowadzić do trwałej niepełnosprawności. Chociaż techniki takie jak autologiczny transfer płata tkankowego są powszechnie praktykowane, problemy z dostępnością płata i chorobowością miejsca pobrania są głównymi ograniczeniami1,2,3. Unaczyniona allotransplantacja kompozytowa (VCA) jest obiecującą alternatywą, która przenosi tkanki złożone, np. mięśnie, skórę, naczynia krwionośne, jako pojedynczą jednostkę do biorców. Jednak VCA wymaga długotrwałej immunosupresji, co prowadzi do toksyczności leków, infekcji oportunistycznych i nowotworów złośliwych4,5,6.

Bezkomórkowe rusztowania inżynierii tkankowej są potencjalnym rozwiązaniem tych ograniczeń7. Bezkomórkowe rusztowania tkankowe można uzyskać za pomocą metod decelularyzacji, które usuwają materiał komórkowy z tkanek natywnych, zachowując jednocześnie podstawową mikroarchitekturę macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM). W przeciwieństwie do zastosowania materiałów syntetycznych w inżynierii tkankowej, zastosowanie rusztowań pochodzenia biologicznego oferuje biomimetyczny substrat ECM, który umożliwia biokompatybilność i potencjał translacji klinicznej8. Po decelularyzacji, późniejsza recelularyzacja rusztowań z komórkami specyficznymi dla biorcy może następnie wytworzyć funkcjonalne, unaczynione tkanki o niewielkiej lub zerowej immunogenności9,10,11. Opracowując skuteczny protokół uzyskiwania tkanek bezkomórkowych przy użyciu technik decelularyzacji perfuzyjnej, można zaprojektować szeroki zakres typów tkanek. Z kolei oparcie się na tej technice pozwala na zastosowanie do bardziej złożonych tkanek. Do tej pory decelularyzacja perfuzyjna unaczynionych tkanek miękkich była badana przy użyciu prostych unaczynionych tkanek, takich jak płat powięziowo-skórny o pełnej grubości u gryzoni12, porcine13 i modele ludzkie14, a także mięśnie szkieletowe mięśnia prostego brzucha świni15. Dodatkowo, złożone unaczynione tkanki zostały również zdecellaryzowane perfuzjowo, jak wykazano w przypadku świń i ludzkich ucho16,17 modeli i ludzkich modeli przeszczepów całej twarzy18.

Tutaj protokół opisuje decelularyzację unaczynionych wolnych płatów za pomocą biologicznie pochodnych rusztowań ECM. Przedstawiamy decelularyzację trzech klinicznie istotnych płatów: 1) sieci komórkowej, 2) tensora powięzi szerokiej i 3) promieniowego przedramienia, z których wszystkie są reprezentatywne dla płatów koni roboczych stosowanych rutynowo w chirurgii rekonstrukcyjnej i nie były wcześniej badane w badaniach na zwierzętach w kontekście decelularyzacji tkanek. Te bioinżynieryjne płaty stanowią wszechstronną i łatwo dostępną platformę, która ma potencjał do zastosowań klinicznych w dziedzinie naprawy i rekonstrukcji dużych ubytków tkanek miękkich.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie procedury z udziałem zwierząt zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Wykorzystania Zwierząt (IACUC) Uniwersyteckiej Sieci Zdrowia i są wykonywane zgodnie z protokołem i procedurami Centrum Zasobów Zwierzęcych Uniwersyteckiej Sieci Zdrowia oraz wytycznymi Kanadyjskiej Rady ds. Opieki nad Zwierzętami. Do wszystkich eksperymentów wykorzystano pięć świń rasy Yorkshire (35-50 kg; wiek około 12 tygodni).

1. Produkcja bioreaktora perfuzyjnego

  1. Zobacz Rysunek 1 dla wszystkich komponentów użytych w bioreaktorze perfuzyjnym. Do wykonania komory na chusteczki należy użyć dostępnych w handlu polipropylenowych pojemników typu snap-lock z wodoszczelnymi i hermetycznymi pokrywkami zawierającymi silikonową wyściółkę uszczelniającą. Upewnij się, że pojemniki są kompatybilne z autoklawem.
  2. Wywierć dwa otwory 1/4 cala wzdłuż boków pojemnika i nawlecz krótki odcinek silikonowej rurki L / S-16 pokrytej platyną. Jedna rurka będzie przenosić perfuzat dopływowy, a druga służy do odpływu.
  3. W przypadku rurki dopływowej przymocuj męskie złącze Luer w wewnętrznej części, która będzie używana do połączenia z kaniulą tkankową. Podłącz żeńskie złącze Luer na zewnętrznym końcu rurki dopływowej, która będzie używana do podłączenia do trójdrogowego kranu odcinającego.
  4. Wywierć pojedynczy otwór o średnicy 1/4 cala w pokrywie komory i nawlecz kolejny krótki odcinek silikonowej rurki L/S-16 pokrytej platyną. Ta rurka będzie służyć jako odpowietrznik.
  5. Wykonaj rurkę doprowadzającą i odpływową, mierząc około 50 cm silikonowej rurki L/S-16 pokrytej platyną. Podłącz jeden koniec do żółtej rurki pompy z trzema ogranicznikami, a drugi koniec do sterylnej pipety serologicznej o pojemności 2 ml, aby przenieść perfuzat ze zbiorników detergentu do komory bioreaktora.
  6. Wszystkie elementy (komora i rurki) należy sterylizować w autoklawie w pojedynczo zapakowanym sterylnym opakowaniu.

figure-protocol-1
Rysunek 1: Produkcja bioreaktora perfuzyjnego. Bioreaktor perfuzyjny składa się z (A) plastikowej komory na tkanki polipropylenowe (B) z bocznymi otworami wywierconymi w celu umieszczenia rurki perfuzyjnej z pokrywą szczelną dla powietrza i wody. (C) Krany są przymocowane do przewodów, aby umożliwić podłączenie rurki perfuzyjnej, która przenosi środki decelularyzacyjne ze zbiornika detergentu do odpadów w sposób jednoprzebiegowy. (D) Kompatybilne kasety pompowe służą do podłączenia rurki trójstopniowej do pompy perystaltycznej. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

2. Przygotowanie roztworów decelularyzacyjnych

  1. Przygotować heparynizowany roztwór soli fizjologicznej (15 j.m./ml), rozcieńczając 1,5 ml 1000 j.m./ml roztworu podstawowego heparyny w 100 ml soli fizjologicznej.
  2. Przygotować 0,05% w/v roztwór dodecylosiarczanu sodu (SDS), powoli dodając 9 g proszku SDS do 18 l autoklawowanej destylowanej wody dejonizowanej. Użyj gąsiora polipropylenowego (PP) o dużej objętości, aby pomieścić roztwór SDS. Roztwór jest gotowy do użycia po całkowitym rozpuszczeniu. Przechowywać w temperaturze pokojowej.
  3. Przygotuj roztwór roboczy DNazy I. Najpierw rozpuść liofilizowaną DNazę I do stężenia podstawowego 10 mg/ml z 5 mM CaCl2 w sterylnym dH2O. Odtworzony roztwór podstawowy DNazy I należy przechowywać w postaci podwielokrotności w zamrażarce o temperaturze -20 °C do czasu przygotowania do użycia. W dniu użycia rozcieńczyć zapas DNazy I w stosunku 1:100 z Mg++(1,29 mM) i Ca++(1,98 mM) w sterylnym dH2O do końcowego stężenia 0,1 mg/mL.
    UWAGA: Aktywność DNazy ulegnie degradacji, chyba że będzie przechowywana w stanie zamrożonym. Do enzymatycznego trawienia DNA w temperaturze pokojowej należy używać wyłącznie świeżego roboczego roztworu DNazy.
  4. Przygotować 1x roztwór PBS, rozcieńczając 10x PBS bulionu 1:10 sterylną wodą sterylizowaną w autoklawie w końcowej objętości 5 l w balonie PP. Przechowywać w temperaturze pokojowej.
  5. Przygotuj 1% antybiotyki/leki przeciwgrzybicze (A/A) w PBS. Rozcieńczyć 100x antybiotyki/leki przeciwgrzybicze w stosunku 1:100 sterylnym roztworem 1x PBS do końcowej objętości 1 l. Przechowywać w temperaturze pokojowej.
  6. Przygotować 0,1% (v/v) kwas nadoctowy (PAA)/4% (v/v) etanol (EtOH), dodając 3,13 ml PAA + 40 ml 100 % etanolu + 956 ml sterylnego dH2O. Doprowadzić ostateczną objętość do 1 000 ml i przechowywać w temperaturze pokojowej.

3. Zakup klap dla świń

UWAGA: To jest procedura terminalna. Jedna świnia została użyta do zdobycia wszystkich trzech klap. Humanitarna eutanazja zwierzęcia po pobraniu wszystkich klap.

  1. Opieka przedoperacyjna
    1. Szybkie świnie co najmniej 12 godzin przed zabiegiem. Uspokoić zwierzęta ketaminą (20 mg/kg domięśniowo, domięśniowo), atropiną (0,04 mg/kg domięśniowo) i midazolamem (0,3 mg/kg domięśniowo).
    2. Wywołać znieczulenie przez wdychanie 5% izofluranu przez maskę o szybkości przepływu 22-44 ml / kg / min w celu wprowadzenia linii obwodowej i intubacji. Utrzymuj znieczulenie za pomocą 0,5%-2% izofluranu w stężeniu 22-44 ml/kg/min. Zapewnić odpowiednią głębokość znieczulenia, sprawdzając stabilność hemodynamiczną i zwracając uwagę na brak odruchów odruchu palpebral/pedałowania lub napięcia mięśni żuchwy, aby określić odpowiedni poziom podawanego środka znieczulającego. Podawać dożylnie remifentanyl (10-20 μg/kg/h) infuzję o ciągłej szybkości podczas operacji w celu znieczulenia.
    3. Zaintubuj świnię odpowiednią rurką dotchawiczą (7-8 mm) i podłącz rurkę do respiratora ustawionego na objętość oddechową 8 ml / kg, PEEP 5 cm H20, FiO2 0 i częstość oddechów 14.
    4. Wprowadzić cewnik angiocewny 22 G do żyły usznej. Po uzyskaniu dostępu dożylnego (IV) należy podawać ciepłą 0,9% normalną sól fizjologiczną w ilości 5-10 ml / kg / h przez cały zabieg, aby utrzymać średnie ciśnienie tętnicze między 60 mmHg a 90 mmHg.
    5. Stale monitoruj tętno, pulsoksymetrię i CO2 w kierunku końca oddechu. Oceniaj ciśnienie krwi i temperaturę ciała co 5 minut.
    6. Zastosuj maść do oczu, aby zapobiec suchości oka podczas znieczulenia. Przygotuj całe pole operacyjne za pomocą jodu powidonu. Ułóż pole operacyjne sterylnymi ręcznikami.
  2. Klapa omentalna
    1. Ułóż świnię w pozycji leżącej na plecach i wykonaj laparotomię ksylofopowinową.
    2. Po wejściu do jamy brzusznej zmobilizuj głowę żołądka, aby uwidocznić większą sieć słoniową. Ostrożnie umieść sieć w polu operacyjnym i zidentyfikuj naczynia żołądkowo-epiploiczne biegnące wzdłuż większej krzywizny żołądka (Ryc. 2A).
    3. Zacznij od lewej strony większej krzywizny, gdzie lewa tętnica żołądkowo-epiploiczna łączy się z tętnicą śledzionową. Używając prostych nożyczek do tenotomii Stevensa, zeszkieletuj zarówno lewą tętnicę żołądkowo-epiploidalną, jak i żyłę. Następnie Ligate dzieli je osobno za pomocą opasek chirurgicznych lub klipsów.
    4. Idź wzdłuż większej krzywizny brzucha od lewej do prawej. Podwiązaj i podziel krótkie gałęzie naczyniowe powstające z sieci zasilającej, zapewniając większą krzywiznę żołądka. Na tym etapie należy uważać, aby nie uszkodzić głównej szypułki żołądkowo-epiploidalnej sieci komórkowej.
    5. Kontynuuj mobilizację sieci większej, aż do napotkania połączenia prawych naczyń żołądkowo-epiploicznych i tętnicy żołądkowo-dwunastniczej. Za pomocą klipsów lub opasek podwiązaj, a następnie oddzielnie podziel prawą tętnicę żołądkowo-epiploiczną i żyły, aby uwolnić płat omentalny.
    6. Po uwolnieniu sieć można podzielić wzdłuż środka na dwie połowy, przy czym każdej połowie towarzyszy odpowiednia tętnica i żyła żołądkowo-epiploiczna. Pozwala to na zakup dwóch klap wolnych od omental z jednego gospodarstwa na zwierzęciu. Indywidualnie kaniuluj naczynia żołądkowo-epiploiczne za pomocą kaniuli 20-22 G, a następnie zabezpiecz jedwabnymi opaskami 3-0.
    7. Przepłukać heparynizowaną sól fizjologiczną (15 j.m./ml) do gastro-epiploicznej kaniuli tętniczej, aż do zaobserwowania wyraźnego odpływu żylnego.
  3. Tensor fascia lata flap
    UWAGA: Protokół opiera się na poprzednim opisie płata powięzi lata, który został opracowany przez Haugheya i wsp.19. Modyfikacja ma na celu wyizolowanie tylko części powięziowej płata tensora powięzi lata.
    1. Ułóż świnię w bocznej pozycji odleżynowej i obustronnie ogol całą górną kończynę tylną. Przygotuj i udrapuj przy użyciu zwykłych sterylnych procedur.
    2. Zaznacz przednią granicę płata linią biegnącą od przedniego górnego kręgosłupa biodrowego (ASIS) w kierunku bocznej rzepki. Lokalizacja szypułki znajduje się w odległości około 6-8 cm od ASIS wzdłuż tej linii.
    3. Zaznacz równoległą tylną linię w odległości około 8 cm do 10 cm od przedniego nacięcia wzdłuż osi kości udowej, aby uwzględnić szerokość płata. Zaznacz dystalną krawędź płata przy bocznej rzepce.
    4. Rozpocznij rozwarstwienie na dystalnym brzegu rzepki od ostrego nacięcia skóry za pomocą skalpela. Pogłęb nacięcie skóry z kauteryzacją przez tkankę podskórną, aż do napotkania powięzi leżącej nad mięśniem prostym uda.
    5. Kontynuuj nacięcia skóry w kierunku ASIS wzdłuż zaznaczonej przedniej i tylnej granicy opisanej powyżej. Aby odizolować sam płat powięziowy, usuń leżący na nim element skóry z leżącej poniżej warstwy powięziowej. Podwiązuj lub kauteryzuj wszelkie małe naczynia perforacyjne do skóry.
    6. Wróć do dystalnej granicy płata i naciąć powięź głęboką, aby umożliwić mobilizację leżącego pod spodem mięśnia obszernego bocznego. Zmobilizuj powięź w kierunku ASIS.
    7. Podczas mobilizacji zidentyfikuj szypułkę naczyniową wyłaniającą się spomiędzy mięśni obszernych bocznych i prostych kości udowej (Ryc. 2B). Uważaj, aby uniknąć nadmiernej przyczepności, aby nie uszkodzić naczyń naczynioodpornych.
    8. Wypreparuj proksymalny aspekt z ASIS, jednocześnie chroniąc szypułkę naczyniową. Wypreparuj, aż klapa zostanie wystarczająco zmobilizowana wokół szypułki.
    9. Prześledź szypułkę w kierunku głębokich naczyń udowych. Szkieletować zarówno boczną tętnicę udową obwodową, jak i żyłę zaopatrującą płat powięziowy. Następnie podwiązka dzieli oba naczynia proksymalnie w miejscu, w którym łączą się z głębokimi naczyniami udowymi.
    10. Kankaniuj naczynia szypułkowe indywidualnie za pomocą cewników angiocewnikowych o sile od 20 G do 24 G, zabezpieczonych jedwabnymi opaskami 3-0. Przepłukać heparynizowaną sól fizjologiczną (15 j.m./ml) do kaniuli tętniczej płata, aż do zaobserwowania wyraźnego odpływu żylnego.
  4. Klapa radialna przedramienia
    UWAGA: Poniższy protokół oparty jest na opublikowanym opisie modelu promieniowego płata przedramienia świni autorstwa Khachatryan et al.20.
    1. Umieść świnię na stole operacyjnym w bocznej pozycji odleżynowa. Ustaw zależną kończynę przednią w polu operacyjnym
      2. .
    2. Zaznacz przybliżony kwadrat płata skóry o wymiarach 3 cm x 3 cm na promieniowym przedramieniu. Narysuj linię między punktem środkowym bliższego brzegu płata a dołem przedłokciowym, aby oznaczyć przybliżony przebieg szypułki tętnicy promieniowej. Potwierdzić przebieg tętniczy za pomocą badania palpacyjnego.
      UWAGA: W modelu świńskim naczynia promieniowe znajdują się stosunkowo głębiej niż u ludzi. Ich lokalizacja znajduje się między zginaczem nadgarstka promieniowego a ramienno-promieniowym.
    3. Naciąć skórę za pomocą skalpela w dalszej części na głębokości aż do powięzi przedramiennej. Tępo wyciąć nożyczki do tenotomii, aż do napotkania dalszej tętnicy promieniowej i jej dwóch żył komitantów. Podwiązywać tętnice i żyły za pomocą wiązań chirurgicznych indywidualnie i dzielić.
    4. Kontynuuj nacięcia skóry na promieniowym i łokciowym brzegu zaznaczonego kwadratu skóry. Zmobilizuj płat z leżącej poniżej kości promieniowej za pomocą ostrza chirurgicznego biegnącego od kierunku promieniowego do łokciowego, jednocześnie unosząc płat skóry proksymalnie w kierunku dołu przedłokciowego.
      UWAGA: Utrzymuj płaszczyznę rozwarstwienia podpowięziowego, aby upewnić się, że szypułka tętnicy promieniowej pozostaje połączona z leżącą nad nią warstwą skórną.
    5. Na bliższym brzegu cofnij przestrzeń między ramienno-promieniową a zginaczem nadgarstka promieniowego za pomocą samopodtrzymującego się retraktora, aby odsłonić bliższą tętnicę promieniową i jej żyły (Ryc. 2C).
    6. Za pomocą nożyczek do tenotomii zeszkieletuj tętnicę promieniową i żyły krwiste proksymalnie w dole przedłokciowym, gdzie łączą się odpowiednio z tętnicą ramienną i żyłami. Wypreparuj naczynia z otaczających tkanek włóknisto-tłuszczowych, aby uzyskać wystarczającą długość szypułki około 5-6 cm. Podwiązaj i podziel tętnicę i żyły oddzielnie, aby uwolnić promieniowy płat przedramienia.
    7. Kankatuluj naczynia szypułkowe za pomocą cewników angiocewnikowych o sile od 20 G do 24 G, zabezpieczonych jedwabnymi opaskami 3-0. Przepłukać heparynizowaną sól fizjologiczną (15 j.m./ml) do płatowej kaniuli tętniczej, aż do zaobserwowania wyraźnego odpływu żylnego.
    8. Po pobraniu płata należy przechowywać płatki w zimnym roztworze soli fizjologicznej w temperaturze 4 °C, aż będą gotowe do decelularyzacji. W głębokim znieczuleniu izofluranem poddać zwierzęta eutanazji za pomocą dożylnego wstrzyknięcia chlorku potasu (100 mg/kg dożylnie). Potwierdź śmierć przez brak parametrów życiowych.

figure-protocol-2
Rysunek 2: Pobranie trzech płatów unaczynionych u świń. (A) Sieć Prawa (i) i lewa (ii) tętnica żołądkowo-epiploiczna są kaniulowane w płatku omentalnym (iii). (B) Tensor fascia lata. Szypułka płata (iv) jest wstępującą gałęzią bocznej tętnicy okrężnej kości udowej (v). (C) Promieniowa klapa przedramienia. Pobranie płata promieniowego przedramienia (vi) opiera się na tętnicy promieniowej i żyle comitantes (vii) jako szypułce naczyniowej (UWAGA: Zasłony zostały pominięte w celach demonstracyjnych). Podziałka skali: 3 cm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

4. Konfiguracja systemu decelularyzacji

  1. Komorę na chusteczki z klapkami należy zamontować w sterylnych warunkach w komorze bezpieczeństwa biologicznego z przepływem laminarnym.
  2. Podłączyć trójdrogowy kran zarówno do portu dopływowego, jak i odpływowego bioreaktora. Podłącz filtr 0,2 μm do portu wentylacyjnego na pokrywie komory na chusteczki. Zalać rurkę dopływową sterylną heparynizowaną solą fizjologiczną, aby wyeliminować pęcherzyki powietrza.
  3. Umieść klapy w komorze. Za pomocą sterylnych hemostatów podłącz klapki do rurki dopływowej za pomocą męskiego złącza Luer. Przykręć odpowiednią kaniulę tętniczą każdej klapki do męskiego Luera i upewnij się, że jest szczelnie uszczelniona.
  4. Przepłukać heparynizowaną sól fizjologiczną przez zawór odcinający, aby sprawdzić, czy połączenie Luer nie ma wycieków i czy klapki mogą być przekrwione z dowodami odpływu żylnego. Zamknij pokrywę komory na chusteczki.
  5. Podłączyć rurkę dopływową z żółtą rurką pompy z trzema przystankami do kranu dopływu komory tkankowej. Podłącz również wbudowany przetwornik czujnika ciśnienia do trójdrogowego kurka dopływu, aby umożliwić monitorowanie ciśnienia perfuzji.
  6. Włączyć dopływową pompę perystaltyczną. Na ekranie początkowym przejdź do trzeciej zakładki za pomocą strzałki, aby ustawić identyfikator rurki na 1.85 mm. Następnie przejdź do drugiej zakładki, aby ustawić szybkość perfuzji. Szybkość wejściowa jako metoda dostarczania i ustawiona na 2 ml/min. Upewnij się, że kierunek przepływu jest prawidłowy, jak pokazano na ekranie. Załaduj rurkę pompy z trzema ogranicznikami do pompy perystaltycznej za pomocą kompatybilnej kasety.
  7. Powtórz procedurę dla pompy perystaltycznej odpływu podobną do powyższej. Ustawić pompę odpływową na szybkość 4 ml/min. Podłączyć rurkę odpływową z żółtą rurką pompy z trzema przystankami do kurka odpływowego komory na chusteczki. Załaduj rurkę pompy z trzema ogranicznikami do pompy perystaltycznej za pomocą kompatybilnej kasety. Rozpocznij przepływ dla obu pomp, naciskając przycisk zasilania.
    UWAGA: Wyższa szybkość pompy odpływowej jest kluczowym środkiem bezpieczeństwa zapobiegającym przepełnieniu komory tkankowej, zapewniając, że odpływ z komory zawsze przewyższa dopływ w trakcie decelularyzacji. Cała zmontowana konfiguracja decelularyzacji jest przedstawiona w Rysunek 3.

figure-protocol-3
Rysunek 3: Zmontowany system decelularyzacji perfuzyjnej. (A) Schemat systemu decelularyzacji perfuzyjnej. Rurka doprowadzająca przenosi perfuzat ze zbiornika detergentu do komory na chusteczki w jednym przejściu z monitorowaniem czujnika ciśnienia. Rurka odpływowa aktywnie usuwa perfuzat z komory na chusteczki do pojemnika na odpady. Czarne strzałki oznaczają kierunek przepływu perfuzji. Pompa perystaltyczna jest używana z lewą pompą do sterowania dopływem. Odpływ jest aktywnie usuwany za pomocą drugiej pompy perystaltycznej przez odpowiednie rurki. Figura utworzona za pomocą BioRender.com. (B) Fotografia systemu decelularyzacji perfuzyjnej zmontowanego na stole z pompą perystaltyczną dopływową (i) podłączoną do komór tkankowych (ii), a następnie pompą perystaltyczną odpływową (iii). Ciśnienie perfuzatu na dopływie jest monitorowane za pomocą wbudowanego czujnika ciśnienia (iv) przed wejściem do komory na tkanki. W tym przypadku trzy klapy są równolegle decellaryzowane. Zarówno zbiorniki na detergent, jak i odpady znajdują się poniżej blatu i nie są sfotografowane. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

5. Decelularyzacja płatów wieprzowych

  1. Wykonaj wszystkie poniższe kroki decelularyzacji perfuzyjnej w temperaturze pokojowej. Podsumowanie szybkości perfuzji i czasu trwania znajduje się w Tabeli 1. Rozpocząć perfuzję soli fizjologicznej z heparyną z prędkością 2 ml/min za pomocą pompy perystaltycznej i perfuzjować płaty soli fizjologicznej heparynizowanej w komorze tkankowej przez 15 minut, aby usunąć wszelkie zatrzymane skrzepy krwi.
  2. Po zakończeniu perfuzji soli fizjologicznej w heparyniźnie należy odessać resztki soli fizjologicznej do komory tkankowej. Napełnij komorę tkankową około 500 ml roztworu decelularyzacyjnego SDS, aby wystarczająco zanurzyć płatek.
  3. Przenieś rurkę dopływową do roztworu decelularyzacyjnego SDS i perfunduj tkankę z prędkością 2 ml/min. Czas trwania perfuzji różni się w zależności od płatka; perfuzja SDS przez 2 dni w przypadku sieci komórkowej, 3 dni w przypadku rozcięgna napinacza i 5 dni w przypadku promieniowego płata powięziowo-skórnego przedramienia.
  4. Po zakończeniu decelularyzacji SDS należy odessać istniejący perfuzat SDS zawarty w komorze tkankowej. Przenieś rurkę doprowadzającą do 1x roztworu PBS i wykonuj klapki przez 1 dzień w ilości 2 ml / min.
  5. Usuń poprzedni roztwór PBS i przenieś rurkę doprowadzającą do roztworu roboczego DNazy. Utymulować przez 2 h przy 2 ml/min. Usuń roztwór DNazy z komory tkankowej i umieść rurkę dopływową w 1x roztworze PBS. Zanurz tkanki w 1x roztworze PBS w komorze i uroztapiaj 1x roztwór PBS przez 1 dzień w ilości 2 ml / min.
  6. Wysterylizuj klapki roztworem PAA/EtOH. Przenieść rurkę doprowadzającą do PAA/EtOH w roztworze dH2O i zanurzyć tkanki w tym samym roztworze. Perfuzja PAA/EtOH w stężeniu 2 ml/min przez 3 godziny. Po zakończeniu sterylizacji PAA/EtOH odłącz rurkę od trójdrogowych kurków.
  7. Zdjąć klapki z zachowaniem zasad aseptyki i umieścić sterylne narzędzia w PBS zawierającym 1% antybiotyków/leków przeciwgrzybiczych (AA/A). Zanurz klapki z PBS + 1% A/A na 15 minut w dwóch oddzielnych płukaniach, aby całkowicie zneutralizować resztki kwasu. Przechowywać płatki w PBS + 1% A/A w temperaturze 4 °C, aż będą gotowe do recelularyzacji.
  8. Sprawdź sterylność rusztowań, wykonując wymaz na płytkach agarowych i zbadaj rozwój drobnoustrojów. Zaszczepić płytki agarowe wacikami pobranymi z każdej powierzchni płata. Hodować płytki agarowe w temperaturze 37 °C przez okres do 2 tygodni. O sterylności świadczy brak wzrostu kolonii drobnoustrojów.

Tabela 1: Podsumowanie parametrów protokołu perfuzji i decelularyzacji. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

6. Ocena decelularyzacji

  1. Za pomocą biopsji stempla pobierz próbki o grubości od 3 mm do 10 mm z płatów.
  2. W przypadku histologii należy umieścić biopsje w kasetach histologicznych w normalnej buforowanej formalinie przez 24 godziny w temperaturze pokojowej.
  3. Umyj kasety do biopsji w wodzie lub PBS przez 15 minut, a następnie umieść je w 70% etanolu, aż będą gotowe do przetwarzania tkanek. Przetwarzaj kasety w procesorze tkanek zgodnie ze standardowymi protokołami.
  4. Zanurz biopsje w parafinie, pozwalając woskowi zastygnąć przez 10-15 minut na zimnej płytce. Przekrój bloków parafinowych na mikrotomie do grubości 5 μm. Wybarwić szkiełka hematoksyliną i eozyną (H&E) zgodnie ze standardowymi protokołami. Zobrazuj szkiełka tkankowe za pomocą mikroskopii świetlnej.
  5. W celu ilościowego określenia zawartości DNA należy uzyskać suchą masę biopsji tkanek po wysuszeniu tkanek przez noc w piecu w temperaturze 60 °C. Próbki należy roztrawić w buforze do ekstrakcji papainy w temperaturze 65 °C przez noc. Odwirować przefermentowane próbki o masie 10 000 x g i przenieść supernatant do świeżej probówki do mikrowirówki. Oznacz zawartość DNA za pomocą komercyjnego zestawu do ekstrakcji DNA zgodnie z instrukcjami producenta.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół decelularyzacji unaczynionych płatów świńskich opiera się na perfuzji detergentu na bazie jonów, SDS, przez unaczynienie płata w dostosowanym bioreaktorze perfuzyjnym. Przed decelularyzacją pobrano trzy unaczynione płaty w modelu świni i kaniulowano je zgodnie z ich głównymi naczyniami zasilającymi. Płaty zostały przepłukane natychmiast po pobraniu w celu utrzymania opatentowanego, przepuszczalnego układu krwionośnego, co umożliwiło skuteczną decelularyzację. Korzystając z hermetycznych pojemników z pokrywą ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Proponowany protokół wykorzystuje perfuzję SDS o niskim stężeniu do decelularizacji szeregu płatów pochodzących od świń. Dzięki tej procedurze sieć bezkomórkowa, tensor fascia lata i promieniowe płaty przedramienia mogą być z powodzeniem decellularizowane przy użyciu protokołu, który sprzyja SDS o niskim stężeniu. Wstępne eksperymenty optymalizacyjne wykazały, że SDS w niskim stężeniu (0,05%) między 2 dniami a 5 dniami jest zdolny do usunięcia materiału komórkowego dla sieci komórkowej, tensora powięzi szerokiej i promie...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,2 &mikro; Filtr m pore Acrodisk VWRCA28143-310
0,9% roztwór chlorku sodu (sól fizjologiczna)BaxterJF7123
20 L Polipropylenowy gąsiorCole-ParmerRK-62507-20
3-0 Niewchłanialny krawat chirurgiczny z tworzywa sztucznegoCovidien  LS639
3-drogowy kranCole-ParmerUZ-30600-04
Kleszcze AdsonFine Science Tools11027-12
Roztwór antybiotykowo-przeciwgrzybiczy, 100XŻubr450-115-EL
Siarczan atropiny 15 mg/30mlKrokwia 8 Produkty238481
BD Angiocath 20-GaugeVWRBD381134
BD Angiocath 22-GaugeVWRBD381123
BD Angiocath 24-GaugeVWRBD381112
Chlorek wapniaSigma-AldrichC4901Kofaktor DNAzy
DNaza I z trzustki bydłaSigma-AldrichDN25
(zestaw do oznaczania Quant-iT PicoGreen dsDNA)InvitrogenP7589
DPBS, 10XŻubr311-415-CL  bez Ca++/Mg++
Halsted-Mosquito HemostatFine Science Tools13008-12
Heparyna, 1000 I.U./mLLeo Pharma A/S453811
Chlorowodorek ketaminy  5000 mg/50 mlBimeda-MTC Animal Health Inc.
Pompa Ismatec Tygon 3-stopowa rurkaCole-ParmerRK-96450-40Średnica wewnętrzna:  1,85 mm
Ismatec REGLO 4-kanałowa pompaCole-Parmer78001-78
Ismatec Kasety do rurekCole-ParmerRK-78016-98
Izofluran 99,9%, 250 mlPharmaceutical Partners of Canada Inc.
LB Agar LennoxBioshop CanadaLBL406.500Płytki agarowe do testowania sterylności
Siarczan magnezuSigma-AldrichM7506Kofaktor DNAzy
Masterflex L/S 16 RurkaCole-ParmerRK-96410-16
Midazolam 50 mg/10 mlPharmaceutical Partners of Canada Inc.
Monopolar Cautery PencilValleylabE2100
Normalna buforowana formalina, 10%Sigma-AldrichHT501128
N° 11 ostrzy skalpelaSwann Morton303
Papaina z lateksu papaiSigma-AldrichP3125
Kwas nadoctowySigma-Aldrich269336
Plastikowe złącze kolczaste do rurki 1/4 "do 1/8" IDMcMaster-Carr5117K61
Plastikowa rura kolczasta 90° Złącza kolankoweMcMaster-Carr5117K76
Plastikowe szybkoobrotowe zaślepki do rurMcMaster-Carr51525K143Męskie
plastikowe szybkoobrotowe gniazda ruroweLuer McMaster-Carr51525K293Żeńskie
narzędzie do biopsjiIntegra Miltex3332
Chlorek potasu 40 mEq/20 mlHospira Healthcare Corporation37869
Powidon-jod, 10%Rougier833133
Pipet serologiczny, 2 mlFisher Science13-678-27D
Hermetyczne pojemniki z zatrzaskową pokrywkąSnapLock142-3941-4
Dodecylosiarczan sodu w proszkuSigma-AldrichL4509
Chirurgiczne metalowe klipsy do podwiązywania, małyTeleflex001200
Nożyczki do tenotomii Stevens, 115 mm, prosteB. BraunBC004R
Zestaw do monitorowania ciśnienia TruWaveEdwards LifesciencesPX260
Test DNA 61231622319292242905 Luer Punch

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Richardson, D., Fisher, S. E., Vaughan, D. E., Brown, J. S. Radial Forearm Flap Donor-Site Complications and Morbidity: A Prospective Study. Plastic and Reconstructive Surgery. 99 (1), 109-115 (1997).
  2. Edsander-Nord, Å, Jurell, G., Wickman, M. Donor-site morbidity after pedicled or free TRAM flap surgery: A prospective and objective study. Plastic and Reconstructive Surgery. 102 (5), 1508-1516 (1998).
  3. Qian, Y., et al. A systematic review and meta-analysis of free-style flaps: Risk analysis of complications. Plastic and Reconstructive Surgery. Global Open. 6 (2), 1651(2018).
  4. Issa, F. Vascularized composite allograft-specific characteristics of immune responses. Transplant International. 29 (6), 672-681 (2016).
  5. Kueckelhaus, M., et al. Vascularized composite allotransplantation: Current standards and novel approaches to prevent acute rejection and chronic allograft deterioration. Transplant International. 29 (6), 655-662 (2016).
  6. Iske, J., et al. Composite tissue allotransplantation: Opportunities and challenges. Cellular and Molecular Immunology. 16 (4), 343-349 (2019).
  7. Londono, R., Gorantla, V. S., Badylak, S. F. Emerging implications for extracellular matrix-based technologies in vascularized composite allotransplantation. Stem Cells International. 2016, 1541823(2016).
  8. Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
  9. Hussey, G. S., Dziki, J. L., Badylak, S. F. Extracellular matrix-based materials for regenerative medicine. Nature Reviews Materials. 3, 159-173 (2018).
  10. Colazo, J. M., et al. Applied bioengineering in tissue reconstruction, replacement, and regeneration. Tissue Engineering. Part B Reviews. 25 (4), 259-290 (2019).
  11. Rouwkema, J., Rivron, N. C., van Blitterswijk, C. A. Vascularization in tissue engineering. Trends in Biotechnology. 26 (8), 434-441 (2008).
  12. Zhang, Q., et al. Decellularized skin/adipose tissue flap matrix for engineering vascularized composite soft tissue flaps. Acta Biomaterialia. 35, 166-184 (2016).
  13. Jank, B. J., et al. Creation of a bioengineered skin flap scaffold with a perfusable vascular pedicle. Tissue Engineering - Part A. 23 (13-14), 696-707 (2017).
  14. Giatsidis, G., Guyette, J. P., Ott, H. C., Orgill, D. P. Development of a large-volume human-derived adipose acellular allogenic flap by perfusion decellularization. Wound Repair and Regeneration. 26 (2), 245-250 (2018).
  15. Zhang, J., et al. Perfusion-decellularized skeletal muscle as a three-dimensional scaffold with a vascular network template. Biomaterials. 89, 114-126 (2016).
  16. Duisit, J., et al. Decellularization of the porcine ear generates a biocompatible, nonimmunogenic extracellular matrix platform for face subunit bioengineering. Annals of Surgery. 267 (6), 1191-1201 (2018).
  17. Duisit, J., et al. Perfusion-decellularization of human ear grafts enables ECM-based scaffolds for auricular vascularized composite tissue engineering. Acta Biomaterialia. 73, 339-354 (2018).
  18. Duisit, J., et al. Bioengineering a human face graft: The matrix of identity. Annals of Surgery. 266 (5), 754-764 (2017).
  19. Haughey, B. H., Panje, W. R. A porcine model for multiple musculocutaneous flaps. The Laryngoscope. 99 (2), 204-212 (1989).
  20. Khachatryan, A., et al. Radial Forearm Flap. Microsurgery Manual for Medical Students and Residents: A Step-by-Step Approach. , Springer. Denmark. 177-181 (2021).
  21. Hammouda, B. Temperature effect on the nanostructure of SDS micelles in water. Journal of Research of the National Institute of Standards and Technology. 118, 151-167 (2013).
  22. Qu, J., Van Hogezand, R. M., Zhao, C., Kuo, B. J., Carlsen, B. T. Decellularization of a fasciocutaneous flap for use as a perfusable scaffold. Annals of Plastic Surgery. 75 (1), 112-116 (2015).
  23. Keane, T. J., Swinehart, I. T., Badylak, S. F. Methods of tissue decellularization used for preparation of biologic scaffolds and in vivo relevance. Methods. 84, 25-34 (2015).
  24. Mendibil, U., et al. Tissue-specific decellularization methods: Rationale and strategies to achieve regenerative compounds. International Journal of Molecular Sciences. 21 (15), 5447(2020).
  25. Lupon, E., et al. Engineering vascularized composite allografts using natural scaffolds: A systematic review. Tissue Engineering. Part B Reviews. 28 (3), 677-693 (2022).
  26. Duisit, J., Maistriaux, L., Bertheuil, N., Lellouch, A. G. Engineering vascularized composite tissues by perfusion decellularization/recellularization: Review. Current Transplantation Reports. 8, 44-56 (2021).
  27. Adil, A., Xu, M., Haykal, S. Recellularization of bioengineered scaffolds for vascular composite allotransplantation. Frontiers in Surgery. 9, 843677(2022).
  28. Phelps, E. A., García, A. J. Engineering more than a cell: Vascularization strategies in tissue engineering. Current Opinion in Biotechnology. 21 (5), 704-709 (2010).
  29. Pozzo, V., et al. A reliable porcine fascio-cutaneous flap model for vascularized composite allografts bioengineering studies. Journal of Visualized Experiments. (181), e63557(2022).
  30. Uygun, B. E., et al. Decellularization and recellularization of whole livers. Journal of Visualized Experiments. (48), e2394(2011).
  31. Uzarski, J. S., et al. Epithelial cell repopulation and preparation of rodent extracellular matrix scaffolds for renal tissue development. Journal of Visualized Experiments. (102), e53271(2015).
  32. Sullivan, D. C., et al. Decellularization methods of porcine kidneys for whole organ engineering using a high-throughput system. Biomaterials. 33 (31), 7756-7764 (2012).
  33. Choudhury, D., Yee, M., Sheng, Z. L. J., Amirul, A., Naing, M. W. Decellularization systems and devices: State-of-the-art. Acta Biomaterialia. 115, 51-59 (2020).
  34. Schilling, B. K., et al. Design and fabrication of an automatable, 3D printed perfusion device for tissue infusion and perfusion engineering. Tissue Engineering. Part A. 26 (5-6), 253-264 (2020).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Perfusion DecellularizationPorcine Vascularized FlapsTissue EngineeringPerfusion BioreactorDecellularized ScaffoldsExtracellular MatrixSoft Tissue ReconstructionOmental FlapSodium Dodecyl SulfateRecellularization Methods

Powiązane artykuły