Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Pobieranie i perfuzja-decelularyzacja unaczynionych płatów świń w niestandardowym bioreaktorze perfuzyjnym

2.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/64068

⸱

1 sierpnia 2022

 ,  ,  , 
1Latner Thoracic Surgery Research Laboratories, Toronto General Hospital Research Institute, University Health Network, 2Institute of Laboratory Medicine and Pathobiology, University of Toronto, 3Division of Thoracic Surgery, Department of Surgery, University of Toronto, 4Division of Plastic and Reconstructive Surgery, Department of Surgery, University of Toronto

W tym artykule

Podsumowanie

Protokół opisuje chirurgiczne pobieranie i późniejszą decelularyzację unaczynionych płatów świńskich poprzez perfuzję detergentu z dodecylosiarczanu sodu przez unaczynienie płata w dostosowanym bioreaktorze perfuzyjnym.

Streszczenie

Duże ubytki tkanek miękkich prowadzą do deficytów funkcjonalnych i mogą znacznie wpłynąć na jakość życia pacjenta. Chociaż rekonstrukcję chirurgiczną można wykonać za pomocą autologicznego transferu wolnego płata lub unaczynionej allotransplantacji kompozytowej (VCA), takie metody mają również wady. Problemy takie jak zachorowalność w miejscu dawczym i dostępność tkanek ograniczają autologiczny transfer wolnego płata, podczas gdy immunosupresja jest znaczącym ograniczeniem VCA. Modyfikowane tkanki w chirurgii rekonstrukcyjnej z wykorzystaniem metod decelularyzacji/recelularyzacji stanowią możliwe rozwiązanie. Tkanki pozbawione komórek są generowane przy użyciu metod, które usuwają natywny materiał komórkowy przy jednoczesnym zachowaniu podstawowej mikroarchitektury macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM). Te bezkomórkowe rusztowania mogą być następnie rekomórkowane komórkami specyficznymi dla biorcy.

Ten protokół szczegółowo opisuje metody pozyskiwania i decelularyzacji używane do uzyskania bezkomórkowych rusztowań w modelu świni. Ponadto zawiera również opis projektu i konfiguracji bioreaktora perfuzyjnego. Płaty obejmują sieć świni, tensor powięzi szerokiej i promieniowe przedramię. Decelularyzacja odbywa się poprzez perfuzję ex vivo detergentu z dodecylosiarczanu sodu (SDS), a następnie obróbkę enzymatyczną DNazy i sterylizację kwasem nadoctowym w dostosowanym bioreaktorze perfuzyjnym.

Udana decelularyzacja tkanek charakteryzuje się biało-nieprzezroczystym wyglądem płatów makroskopowo. Płaty bezkomórkowe wykazują brak jąder na barwieniu histologicznym i znaczne zmniejszenie zawartości DNA. Protokół ten może być efektywnie wykorzystywany do generowania bezkomórkowych rusztowań tkanek miękkich z zachowaną ECM i mikroarchitekturą naczyniową. Takie rusztowania mogą być wykorzystywane w późniejszych badaniach nad recelularyzacją i mają potencjał do zastosowania klinicznego w chirurgii rekonstrukcyjnej.

Wprowadzenie

Uraz i usunięcie guza mogą prowadzić do dużych i skomplikowanych wad tkanek miękkich. Wady te mogą pogarszać jakość życia pacjenta, powodować utratę funkcji i prowadzić do trwałej niepełnosprawności. Chociaż techniki takie jak autologiczny transfer płata tkankowego są powszechnie praktykowane, problemy z dostępnością płata i chorobowością miejsca pobrania są głównymi ograniczeniami1,2,3. Unaczyniona allotransplantacja kompozytowa (VCA) jest obiecującą alternatywą, która przenosi tkanki złożone, np. mięśnie, skórę, naczynia krwionośne, jako pojedynczą jednostkę do biorców. Jednak VCA wymaga długotrwałej immunosupresji, co prowadzi do toksyczności leków, infekcji oportunistycznych i nowotworów złośliwych4,5,6.

Bezkomórkowe rusztowania inżynierii tkankowej są potencjalnym rozwiązaniem tych ograniczeń7. Bezkomórkowe rusztowania tkankowe można uzyskać za pomocą metod decelularyzacji, które usuwają materiał komórkowy z tkanek natywnych, zachowując jednocześnie podstawową mikroarchitekturę macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM). W przeciwieństwie do zastosowania materiałów syntetycznych w inżynierii tkankowej, zastosowanie rusztowań pochodzenia biologicznego oferuje biomimetyczny substrat ECM, który umożliwia biokompatybilność i potencjał translacji klinicznej8. Po decelularyzacji, późniejsza recelularyzacja rusztowań z komórkami specyficznymi dla biorcy może następnie wytworzyć funkcjonalne, unaczynione tkanki o niewielkiej lub zerowej immunogenności9,10,11. Opracowując skuteczny protokół uzyskiwania tkanek bezkomórkowych przy użyciu technik decelularyzacji perfuzyjnej, można zaprojektować szeroki zakres typów tkanek. Z kolei oparcie się na tej technice pozwala na zastosowanie do bardziej złożonych tkanek. Do tej pory decelularyzacja perfuzyjna unaczynionych tkanek miękkich była badana przy użyciu prostych unaczynionych tkanek, takich jak płat powięziowo-skórny o pełnej grubości u gryzoni12, porcine13 i modele ludzkie14, a także mięśnie szkieletowe mięśnia prostego brzucha świni15. Dodatkowo, złożone unaczynione tkanki zostały również zdecellaryzowane perfuzjowo, jak wykazano w przypadku świń i ludzkich ucho16,17 modeli i ludzkich modeli przeszczepów całej twarzy18.

Tutaj protokół opisuje decelularyzację unaczynionych wolnych płatów za pomocą biologicznie pochodnych rusztowań ECM. Przedstawiamy decelularyzację trzech klinicznie istotnych płatów: 1) sieci komórkowej, 2) tensora powięzi szerokiej i 3) promieniowego przedramienia, z których wszystkie są reprezentatywne dla płatów koni roboczych stosowanych rutynowo w chirurgii rekonstrukcyjnej i nie były wcześniej badane w badaniach na zwierzętach w kontekście decelularyzacji tkanek. Te bioinżynieryjne płaty stanowią wszechstronną i łatwo dostępną platformę, która ma potencjał do zastosowań klinicznych w dziedzinie naprawy i rekonstrukcji dużych ubytków tkanek miękkich.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie procedury z udziałem zwierząt zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt (IACUC) University Health Network i są wykonywane zgodnie z protokołami i procedurami Animal Resource Centre University Health Network oraz wytycznymi Kanadyjskiej Rady ds. Opieki nad Zwierzętami (Canadian Council on Animal Care). Do wszystkich eksperymentów wykorzystano pięć świń rasy Yorkshire (35-50 kg; wiek około 12 tygodni).

1. Konstrukcja bioreaktora perfuzyjnego

  1. Wszystkie elementy wykorzystane w bioreaktorze perfuzyjnym przedstawiono na Rysunku 1. Do wykonania komory tkankowej należy użyć dostępnych w sprzedaży polipropylenowych pojemników z zatrzaskowym zamknięciem i wodoszczelnymi oraz powietrznoszczelnymi pokrywkami z uszczelką silikonową. Należy upewnić się, że pojemniki nadają się do autoklawowania.
  2. Należy nawiercić dwa otwory o średnicy 1/4 cala po bokach pojemnika i przeciągnąć przez nie krótkie odcinki silikonowych rurek L/S-16 powlekanych platyną. Jedna rurka będzie służyć do dopływu perfuzatu, a druga do odpływu.
  3. Do rurki dopływowej, w części wewnętrznej, należy przymocować męski konektor Luer, który posłuży do połączenia z kaniulą tkankową. Na zewnętrznym końcu rurki dopływowej należy przymocować żeński konektor Luer, który posłuży do połączenia z trójdrożnym kurkiem.
  4. W pokrywie komory należy nawiercić jeden otwór o średnicy 1/4 cala i przeciągnąć przez niego kolejny krótki odcinek silikonowej rurki L/S-16 powlekanej platyną. Rurka ta będzie pełnić funkcję odpowietrznika.
  5. Rurki dopływowe i odpływowe przygotowuje się, odmierzając około 50 cm silikonowej rurki L/S-16 powlekanej platyną. Jeden koniec należy połączyć z żółtą rurką pompy z trzema zatrzymaniami, a drugi koniec ze sterylną pipetą serologiczną o pojemności 2 mL, aby transportować perfuzat z rezerwuarów z detergentem do komory bioreaktora.
  6. Wszystkie elementy (komorę i rurki) należy autoklawować w oddzielnych, sterylnych opakowaniach.

Schemat systemu dynamiki płynów; układ przepływu wody z rurkami i pojemnikami do badania stanu równowagi.
Rycina 1: Budowa bioreaktora perfuzyjnego. Bioreaktor perfuzyjny składa się z (A) plastikowej polipropylenowej komory tkankowej (B) z wywierconymi otworami bocznymi przeznaczonymi do rurek perfuzyjnych oraz szczelnej pokrywy zapobiegającej przedostawaniu się powietrza i wody. (C) Do rurek przymocowano kurki, umożliwiając podłączenie układu perfuzyjnego, który transportuje środki do decelularyzacji z zbiornika z detergentem do odpadów w systemie jednoprzepływowym. (D) Kompatybilne kasety pompy służą do podłączenia trójstopniowych rurek do pompy perystaltycznej. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

2. Przygotowanie roztworów do decelularyzacji

  1. Przygotować heparynowany roztwór soli fizjologicznej (15 IU/mL) poprzez rozcieńczenie 1,5 mL roztwoku zapasu heparyny o stężeniu 1000 I.U./mL w 100 mL soli fizjologicznej.
  2. Przygotować 0,05% (m/v) roztwór dodecylosiarczanu sodu (SDS), powoli dodając 9 g proszku SDS do 18 L autoklawowanej wody destylowanej i dejonizowanej. Do roztworu SDS użyć polipropylenowego (PP) kanistra o dużej pojemności. Roztwór jest gotowy do użycia po całkowitym rozpuszczeniu. Przechowywać w temperaturze pokojowej.
  3. Przygotować roztwór roboczy DNase I. Najpierw zrekonstytuować liofilizat DNase I do stężenia zapasu 10 mg/mL w 5 mM CaCl2 w sterylnej dH2O. Zrekonstytuowany roztwór zapasu DNase I przechowywać w alikwotach w zamrażarce w temperaturze −20 °C do momentu użycia. W dniu użycia rozcieńczyć zapas DNase I w stosunku 1:100 z Mg++(1,29 mM) i Ca++(1,98 mM) w sterylnej dH2O do stężenia końcowego 0,1 mg/mL.
    UWAGA: Aktywność DNase ulega degradacji, jeśli nie jest przechowywana w zamrożeniu. Do enzymatycznego trawienia DNA w temperaturze pokojowej należy używać wyłącznie świeżego roztworu roboczego DNase.
  4. Przygotować roztwór 1x PBS poprzez rozcieńczenie zapasu 10x PBS w stosunku 1:10 sterylną wodą autoklawowaną do objętości końcowej 5 L w kanistrze PP. Przechowywać w temperaturze pokojowej.
  5. Przygotować 1% roztwór antybiotyków/antymykotyków (A/A) w PBS. Rozcieńczyć 100x antybiotyki/antymykotyki w stosunku 1:100 sterylnym roztworem 1x PBS do objętości końcowej 1 L. Przechowywać w temperaturze pokojowej.
  6. Przygotować 0,1% (v/v) kwas nadoctowy (PAA)/4% (v/v) etanol (EtOH), dodając 3,13 mL PAA + 40 mL 100% etanolu + 956 mL sterylnej dH2O. Doprowadzić do objętości końcowej 1 000 mL i przechowywać w temperaturze pokojowej.

3. Pozyskiwanie płatów świńskich

UWAGA: Jest to procedura terminalna. Do pobrania wszystkich trzech płatów wykorzystano jedną świnię. Po pobraniu wszystkich płatów zwierzę należy humanitarnie uśmiercić.

  1. Opieka przedoperacyjna
    1. Poddać świnie postowi przez co najmniej 12 h przed operacją. Zastosować sedację u zwierząt przy użyciu ketaminy (20 mg/kg domięśniowo, IM), atropiny (0,04 mg/kg IM) i midazolamu (0,3 mg/kg IM).
    2. Wprowadzić w stan znieczulenia poprzez inhalację 5% izofluranu przez maskę przy przepływie 22-44 mL/kg/min w celu założenia wkłucia obwodowego i intubacji. Podtrzymywać znieczulenie za pomocą 0,5%-2% izofluranu przy 22-44 mL/kg/min. Zapewnić odpowiednią głębokość znieczulenia, sprawdzając stabilność hemodynamiczną oraz stwierdzając brak odruchów mrugania/wycofywania kończyny lub napięcia mięśni żuchwy, co wskazuje na odpowiedni poziom podanego środka znieczulającego. W trakcie operacji podawać dożylnie remifentanyl w ciągłym wlewie (10-20 µg/kg/h) w celu zapewnienia analgezji.
    3. Zintubować świnię za pomocą odpowiedniej rurki endotrachealnej (7-8 mm) i podłączyć rurkę do respiratora z ustawioną objętością oddechową 8 mL/kg, PEEP 5 cm H20, FiO2 0,5 oraz częstością oddechów 14.
    4. Wprowadzić kaniulę angiokatetera 22 G do żyły usznej. Po uzyskaniu dostępu dożylnego (IV) przetaczać ciepłą 0,9% sól fizjologiczną z prędkością 5-10 mL/kg/h przez cały czas trwania procedury, aby utrzymać średnie ciśnienie tętnicze między 60 mmHg a 90 mmHg.
    5. stale monitorować częstotliwość akcji serca, pulsoksymetrię oraz końcowe stężenie CO2. Co 5 min oceniać ciśnienie tętnicze i temperaturę ciała.
    6. Zastosować maść do oczu, aby zapobiec wysychaniu rogówki podczas znieczulenia. Przygotować całe pole operacyjne za pomocą povidone-iodine. Obłożyć pole operacyjne sterylnymi ręcznikami.
  2. fragments sieci omentalne (flap omentalny)
    1. Ułożyć świnię w pozycji na plecach i przeprowadzić laparotomię w linii od wyrostka mieczykowatego do pępka.
    2. Po wejściu do jamy brzusznej przemieścić żołądek w kierunku głowy, aby uwidocznić sieci większą. Ostrożnie umieścić sieci w polu operacyjnym i zidentyfikować naczynia żołądkowo-opsoniczne biegnące wzdłuż większej krzywizny żołądkową (Rycina 2A).
    3. Zacząć od lewej strony większej krzywizny, gdzie lewa tętnica żołądkowo-opsoniczna łączy się z tętnicą śledzionową. Używając prostych nożyc do tenotomii Stevensa, wyszpikować zarówno lewą tętnicę, jak i żyłę żołądkowo-opsoniczną. Przewiązać, a następnie oddzielnie przeciąć obie za pomocą nici chirurgicznych lub klipsów.
    4. Przesuwać się wzdłuż większej krzywizny żołądkowej od lewej do prawej strony. Przewiązać i przeciąć krótkie odgałęzienia naczyniowe odchodzące od sieci i zaopatrujące większą krzywiznę żołądkową. Należy uważać, aby podczas tego kroku nie uszkodzić głównego pieńka naczyniowego sieci.
    5. Kontynuować mobilizację sieci większej aż do momentu napotkania połączenia prawych naczyń żołądkowo-opsonicznych z tętnicą żołądkowo-dwunastniczą. Za pomocą klipsów lub nici przewiązać, a następnie oddzielnie przeciąć prawą tętnicę i żyły żołądkowo-opsoniczne, aby uwolnić płat sieci.
    6. Po uwolnieniu sieci można ją podzielić wzdłuż na dwie połowy, z których każda posiada odpowiednią tętnicę i żyłę żołądkowo-opsoniczną. Pozwala to na pobranie dwóch wolnych płatów sieci z jednego zwierzęcia. Pojedynczo zakaniulować naczynia żołądkowo-opsoniczne kaniulą 20-22 G, a następnie zabezpieczyć jedwabnymi nićmi 3-0.
    7. Przepłukać kaniulę tętnicy żołądkowo-opsonicznej heparynizowaną solą fizjologiczną (15 I.U./mL) aż do zaobserwowania przejrzystego odpływu żylnego.
  3. Płat powięzi szerokiej uda (tensor fascia lata)
    UWAGA: Protokół oparto na wcześniejszym opisie płata powięzi szerokiej uda u świń autorstwa Haughey i wsp.19. Wprowadzono modyfikację w celu wyizolowania wyłącznie części powięziowej płata powięzi szerokiej uda.
    1. Ułożyć świnię w pozycji bocznej i ogolić całą górną część kończyny tylnej obustronnie. Przygotować i obłożyć pole operacyjne zgodnie ze standardowymi procedurami sterylnymi.
    2. Wyznaczyć przednią granicę płata linią biegnącą od kolca przedniego górnego kości biodrowej (ASIS) w kierunku bocznej strony rzepki. Położenie pieńka znajduje się w odległości około 6-8 cm od ASIS wzdłuż tej linii.
    3. Wyznaczyć równoległą linię tylną w odległości około 8 cm do 10 cm od cięcia przedniego wzdłuż osi kości udowej, aby wyznaczyć szerokość płata. Wyznaczyć krawędź dystalną płata na bocznej stronie rzepki.
    4. Rozpocząć dyssekcję na marginesie dystalnym przy rzepce, wykonując ostre cięcie skóry skalpelem. Pogłębić cięcie skóry za pomocą kauteryzacji przez tkankę podskórną, aż do napotkania powięzi pokrywającej mięsień prosty uda.
    5. Kontynuować cięcia skóry w kierunku ASIS wzdłuż wyznaczonych granic przedniej i tylnej opisanych powyżej. Aby wyizolować sam płat powięziowy, usunąć nadrzędny komponent skórny z leżącej pod nim warstwy powięziowej. Przewiązać lub wypalić wszelkie małe naczynia perforujące skórę.
    6. Powrócić do krawędzi dystalnej płata i naciąć powięź głęboką, aby umożliwić mobilizację leżącego pod nią mięśnia obszernobocznego. Mobilizować powięź w kierunku ASIS.
    7. Podczas mobilizacji zidentyfikować pień naczyniowy wyłaniający się pomiędzy mięśniem obszernobocznym a prostym uda (Rycina 2B). Należy uważać, aby nie stosować nadmiernej trakcji, aby nie uszkodzić naczyń pieńka.
    8. Przeprowadzić dyssekcję proksymalnej części od ASIS, chroniąc pień naczyniowy. Dyssekować do momentu, aż płat zostanie dostatecznie zmobilizowany wokół swojego pieńka.
    9. Śledzić pień w kierunku głębokich naczyń udowych. Wyszpikować zarówno boczną tętnicę okrężną uda, jak i żyłę zaopatrującą płat powięziowy. Przewiązać, a następnie przeciąć oba naczynia proksymalnie w miejscu ich połączenia z głębokimi naczyniami udowymi.
    10. Zakaniulować naczynia pieńka oddzielnie angiokateterami 20 G do 24 G, zabezpieczając je jedwabnymi nićmi 3-0. Przepłukać kaniulę tętniczą płata heparynizowaną solą fizjologiczną (15 I.U./mL) aż do zaobserwowania przejrzystego odpływu żylnego.
  4. Płat przedramienia promieniowy
    UWAGA: Poniższy protokół oparto na opublikowanym opisie modelu płata przedramienia promieniowego u świń autorstwa Khachatryan i wsp.20.
    1. Ułożyć świnię na stole operacyjnym w pozycji bocznej. Umieścić kończynę przednią znajdującą się na dole w polu operacyjnym.
    2. Wyznaczyć kwadratowy płat skórny o wymiarach około 3 cm x 3 cm na przedramieniu od strony promieniowej. Narysować linię między środkiem proksymalnego brzegu płata a dołem łokciowym, aby wyznaczyć przybliżony przebieg pieńka tętnicy promieniowej. Potwierdzić przebieg tętnicy poprzez palpację.
      UWAGA: W modelu świńskim naczynia promieniowe znajdują się stosunkowo głębiej niż u ludzi. Ich położenie przypada pomiędzy mięśniem zginaczem promieniowym nadgarstka a mięśniem ramienno-promieniowym.
    3. Naciąć skórę skalpelem w części dystalnej na głębokość do powięzi przedramienia. Wykonać dyssekcję tępą nożyczkami do tenotomii, aż do napotkania dystalnej tętnicy promieniowej i dwóch towarzyszących jej żył (venae comitantes). Przewiązać tętnicę i żyły oddzielnie za pomocą nici chirurgicznych i przeciąć.
    4. Kontynuować cięcia skóry na marginesach promieniowym i łokciowym wyznaczonego kwadratu skórnego. Odseparować płat od leżącej pod nim kości promieniowej za pomocą skalpela, przesuwając się z kierunku promieniowego do łokciowego, jednocześnie unosząc płat skórny proksymalnie w stronę dołu łokciowego.
      UWAGA: Należy zachować podpowięziową płaszczyznę dyssekcji, aby upewnić się, że pień tętnicy promieniowej pozostaje powiązany z nadkładającą się warstwą skórną.
    5. Na marginesie proksymalnym rozsunąć przestrzeń między mięśniem ramienno-promieniowym a zginaczem promieniowym nadgarstka za pomocą rozwieraka samotrzymającego, aby odsłonić proksymalną tętnicę promieniową i jej żyły towarzyszące (Rycina 2C).
    6. Używając nożyczek do tenotomii, wyszpikować proksymalnie w dole łokciowym tętnicę promieniową i żyły towarzyszące w miejscu, gdzie łączą się one odpowiednio z tętnicą i żyłami ramiennymi. Oddzielić naczynia od otaczających tkanek włóknisto-tłuszczowych, aby uzyskać wystarczającą długość pieńka, około 5-6 cm. Przewiązać i oddzielnie przeciąć tętnicę i żyły, aby uwolnić płat przedramienia promieniowego.
    7. Zakaniulować naczynia pieńka angiokateterami 20 G do 24 G, zabezpieczając je jedwabnymi nićmi 3-0. Przepłukać kaniulę tętniczą płata heparynizowaną solą fizjologiczną (15 IU/mL) aż do zaobserwowania przejrzystego odpływu żylnego.
    8. Po pobraniu płatów przechowywać je w zimnej soli fizjologicznej w temperaturze 4 °C aż do momentu rozpoczęcia decelularyzacji. W głębokiej znieczuleniu izofluranem uśmiercić zwierzęta poprzez dożylny wtrysk chlorku potasu (100 mg/kg IV). Potwierdzić zgon brakiem oznak życiowych.

Schemat anatomiczny zabiegu, opisane tkanki i struktury w układzie sekcji zwierzęcej.
Rysunek 2: Pozyskanie trzech unaczynionych płatów świńskich. (A) Sieć większa. Prawa (i) i lewa (ii) tętnica żołądkowo-większa zostały kaniulowane w płacie sieci (iii). (B) Rozcięgno powięzi szerokiej uda. Szypułką płata (iv) jest gałąź wstępująca bocznej tętnicy okalającej udo (v). (C) Płat przedramienia z tętnicą promieniową. Pozyskanie płata przedramienia (vi) oparto na tętnicy promieniowej i żyłach towarzyszących (vii) jako szypułce naczyniowej (UWAGA: Dla celów demonstracyjnych pominięto draperie). Paski skali: 3 cm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

4. Konfiguracja systemu decelularyzacji

  1. Zmontować komorę tkankową z płatami w warunkach sterylnych w laminarnej komorze bezpieczeństwa biologicznego.
  2. Przymocować kurek trójdrożny do portów wlotowego i wylotowego bioreaktora. Do portu odpowietrzającego w pokrywie komory tkankowej przymocować filtr 0,2 µm. Wypłukać przewody wlotowe sterylną solą fizjologiczną z heparyną, aby usunąć pęcherzyki powietrza.
  3. Umieścić płaty w komorze. Za pomocą sterylnych kleszczyków hemostatycznych połączyć płaty z przewodami wlotowymi, używając męskiego złącza Luer. Przykręcić odpowiednią kaniulę tętniczą każdego płata do złącza Luer, zapewniając szczelne połączenie.
  4. Przepłukać układ solą fizjologiczną z heparyną przez kurek, aby sprawdzić szczelność połączenia Luer oraz upewnić się, że płaty są perfundowane, co potwierdzi odpływ żylny. Zamknąć pokrywę komory tkankowej.
  5. Połączyć przewody wlotowe za pomocą żółtego przewodu pompy trójstopniowej z kurkiem wlotowym komory tkankowej. Do wlotowego kurka trójdrożnego przymocować również przelotowy przetwornik ciśnienia w celu monitorowania ciśnienia perfuzji.
  6. Włączyć perystaltyczną pompę wlotową. Na ekranie głównym przejść do trzeciej karty za pomocą klawisza strzałki i ustawić średnicę wewnętrzną przewodów (ID) na 1,85 mm. Następnie przejść do drugiej karty, aby ustawić szybkość perfuzji. Wybrać tryb dostarczania „rate” i ustawić wartość na 2 mL/min. Upewnić się, że kierunek przepływu wyświetlany na ekranie jest prawidłowy. Załadować przewód pompy trójstopniowej do pompy perystaltycznej przy użyciu odpowiedniej kasety.
  7. Powtórzyć procedurę dla perystaltycznej pompy wylotowej w sposób analogiczny do powyższego. Ustawić szybkość pompy wylotowej na 4 mL/min. Połączyć przewody wylotowe za pomocą żółtego przewodu pompy trójstopniowej z kurkiem wylotowym komory tkankowej. Załadować przewód pompy trójstopniowej do pompy perystaltycznej przy użyciu odpowiedniej kasety. Uruchomić przepływ w obu pompach, naciskając przycisk Power.
    UWAGA: Wyższa szybkość pompy wylotowej jest kluczowym środkiem bezpieczeństwa zapobiegającym przepełnieniu komory tkankowej, zapewniając, że odpływ z komory zawsze przekracza dopływ podczas procesu decelularyzacji. Cały zmontowany zestaw do decelularyzacji przedstawiono na Rysunku 3.

Schemat i konfiguracja systemu pompy perystaltycznej do regulacji przepływu płynów w komorze tkankowej i monitorowania ciśnienia.
Rysunek 3: Zmontowany system perfuzyjnej decelularyzacji. (A) Schemat systemu perfuzyjnej decelularyzacji. Przewód doprowadzający transportuje perfuzat z zbiornika z detergentem do komory tkankowej w systemie jednoprzepływowym z monitorowaniem za pomocą czujnika ciśnienia. Przewód odpływowy aktywnie usuwa perfuzat z komory tkankowej do pojemnika na odpady. Czarne strzałki oznaczają kierunek przepływu perfuzji. Do sterowania dopływem wykorzystywana jest lewa pompa perystaltyczna. Odpływ jest aktywnie usuwany za pomocą drugiej pompy perystaltycznej poprzez odpowiedni przewód. Rysunek stworzony za pomocą BioRender.com. (B) Fotografia systemu perfuzyjnej decelularyzacji zmontowanego na blacie roboczym z pompą perystaltyczną doprowadzającą (i) podłączoną do komór tkankowych (ii), a następnie do pompy perystaltycznej odpływowej (iii). Ciśnienie perfuzatu dopływającego jest monitorowane za pomocą liniowego czujnika ciśnienia (iv) przed wejściem do komory tkankowej. Tutaj w sposób równoległy decelularyzowane są trzy płaty. Zarówno zbiornik z detergentem, jak i pojemnik na odpady znajdują się pod blatem i nie zostały sfotografowane. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

5. Decelularyzacja płatów świńskich

  1. Wszystkie poniższe etapy decelularyzacji perfuzyjnej należy przeprowadzać w temperaturze pokojowej. Podsumowanie szybkości i czasu trwania perfuzji znajduje się w Tabeli 1. Rozpocząć perfuzję soli fizjologicznej z heparyną z prędkością 2 mL/min przy użyciu pompy perystaltycznej i perfundować płaty solą fizjologiczną z heparyną w komorze tkankowej przez 15 min w celu usunięcia wszelkich pozostałych skrzepów krwi.
  2. Po zakończeniu perfuzji soli fizjologicznej z heparyną odessać pozostałą sól z komory tkankowej. Wypełnić komorę tkankową około 500 mL roztworu decelularyzującego SDS, aby całkowicie zanurzyć płat.
  3. Przenieść rurkę doprowadzającą do roztworu decelularyzującego SDS i perfundować tkankę z prędkością 2 mL/min. Czas trwania perfuzji zależy od rodzaju płata; perfundować SDS przez 2 dni w przypadku sieci większej, 3 dni w przypadku powięzi napinaczowej oraz 5 dni w przypadku płata powięziowo-skórnego przedramienia promieniowego.
  4. Po zakończeniu decelularyzacji SDS odessać obecny perfuzat SDS z komory tkankowej. Przenieść rurkę doprowadzającą do roztworu 1x PBS i perfundować płaty przez 1 dzień z prędkością 2 mL/min.
  5. Usunąć poprzedni roztwór PBS i przenieść rurkę doprowadzającą do roboczego roztworu DNazy. Perfundować przez 2 h z prędkością 2 mL/min. Usunąć roztwór DNazy z komory tkankowej i umieścić rurkę doprowadzającą w roztworze 1x PBS. Zanurzyć tkanki w roztworze 1x PBS w komorze i perfundować roztworem 1x PBS przez 1 dzień z prędkością 2 mL/min.
  6. Zsterylizować płaty roztworem PAA/EtOH. Przenieść rurkę doprowadzającą do roztworu PAA/EtOH w dH2O i zanurzyć tkanki w tym samym roztworze. Perfundować PAA/EtOH z prędkością 2 mL/min przez 3 h. Po zakończeniu sterylizacji PAA/EtOH odłączyć rurki od trójdrożnych kraników.
  7. Wyjąć płaty stosując technikę aseptyczną i umieścić sterylne narzędzia w PBS zawierającym 1% antybiotyków/antybiotyków przeciwgrzybiczych (A/A). Zanurzyć płaty w PBS + 1% A/A na 15 min w dwóch oddzielnych cyklach płukania, aby w pełni zneutralizować pozostały kwas. Przechowywać płaty w PBS + 1% A/A w temperaturze 4 °C do momentu rozpoczęcia recelularyzacji.
  8. Zweryfikować sterylność rusztowań, wykonując posiew wymazów na płytkach z agarem i sprawdzając pod kątem wzrostu drobnoustrojów. Zaszczepić płytki z agarem wymazami pobranymi z powierzchni każdego płata. Inkubować płytki z agarem w temperaturze 37 °C do 2 tygodni. Sterylność potwierdza brak wzrostu kolonii drobnoustrojów.

Tabela 1: Podsumowanie parametrów protokołu perfuzyjnej decelularyzacji. Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać tę tabelę.

6. Ocena decelularyzacji

  1. Za pomocą biopsji wycinającej pobierz z płatów próbki o grubości od 3 mm do 10 mm.
  2. W celu wykonania badania histologicznego utrwal biopsjaty w kasetkach histologicznych w standardowej buforowanej formalinie przez 24 h w temperaturze pokojowej.
  3. Przemyj kasetki z biopsjatami w wodzie lub PBS przez 15 min, a następnie umieść je w 70% etanolu do momentu rozpoczęcia obróbki tkanek. Przetraktuj kasetki w procesorze do tkanek zgodnie ze standardowymi protokołami.
  4. Zatop biopsjaty w parafinie, pozwalając woskowi zastygnąć przez 10-15 min na płytce chłodzącej. Wykonaj skrawki z bloków parafinowych na mikrotomie o grubości 5 µm. Zabarw preparaty hematoksyliną i eozyną (H&E) zgodnie ze standardowymi protokołami. Wykonaj obrazowanie preparatów tkankowych za pomocą mikroskopii świetlnej.
  5. W celu ilościowego oznaczenia zawartości DNA wyznacz masę suchą biopsjatu tkankowego po całonocnym suszeniu tkanek w piecu w temperaturze 60 °C. Przeprowadź trawienie próbek w buforze ekstrakcyjnym z papainą w temperaturze 65 °C przez noc. Odwiruj strawione próbki przy 10 000 x g i przenieś nadsącz do nowej probówki do mikrocentryfugi. Oznacz zawartość DNA za pomocą komercyjnego zestawu do ekstrakcji DNA zgodnie z instrukcją producenta.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Niniejszy protokół decelularyzacji unaczynionych płatów świńskich opiera się na perfuzji detergentu jonowego, SDS, poprzez naczynia krwionośne płata w dostosowanym bioreaktorze perfuzyjnym. Przed decelularyzacją pobrano trzy unaczynione płaty w modelu świńskim i kanulowano je zgodnie z głównymi naczyniami doprowadzającymi. Bezpośrednio po pobraniu płaty zostały przepłukane w celu utrzymania drożnego, perfuzyjnego układu naczyniowego, co umożliwia skuteczną decelularyzację. Wykorzystując szczelne pojemniki z zatrzaskową p...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Proponowany protokół wykorzystuje perfuzję SDS o niskim stężeniu do decelularizacji szeregu płatów pochodzących od świń. Dzięki tej procedurze sieć bezkomórkowa, tensor fascia lata i promieniowe płaty przedramienia mogą być z powodzeniem decellularizowane przy użyciu protokołu, który sprzyja SDS o niskim stężeniu. Wstępne eksperymenty optymalizacyjne wykazały, że SDS w niskim stężeniu (0,05%) między 2 dniami a 5 dniami jest zdolny do usunięcia materiału komórkowego dla sieci komórkowej, tensora powięzi szerokiej i promie...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,2 &mikro; Filtr m pore Acrodisk VWRCA28143-310
0,9% roztwór chlorku sodu (sól fizjologiczna)BaxterJF7123
20 L Polipropylenowy gąsiorCole-ParmerRK-62507-20
3-0 Niewchłanialny krawat chirurgiczny z tworzywa sztucznegoCovidien  LS639
3-drogowy kranCole-ParmerUZ-30600-04
Kleszcze AdsonFine Science Tools11027-12
Roztwór antybiotykowo-przeciwgrzybiczy, 100XŻubr450-115-EL
Siarczan atropiny 15 mg/30mlKrokwia 8 Produkty238481
BD Angiocath 20-GaugeVWRBD381134
BD Angiocath 22-GaugeVWRBD381123
BD Angiocath 24-GaugeVWRBD381112
Chlorek wapniaSigma-AldrichC4901Kofaktor DNAzy
DNaza I z trzustki bydłaSigma-AldrichDN25
(zestaw do oznaczania Quant-iT PicoGreen dsDNA)InvitrogenP7589
DPBS, 10XŻubr311-415-CL  bez Ca++/Mg++
Halsted-Mosquito HemostatFine Science Tools13008-12
Heparyna, 1000 I.U./mLLeo Pharma A/S453811
Chlorowodorek ketaminy  5000 mg/50 mlBimeda-MTC Animal Health Inc.
Pompa Ismatec Tygon 3-stopowa rurkaCole-ParmerRK-96450-40Średnica wewnętrzna:  1,85 mm
Ismatec REGLO 4-kanałowa pompaCole-Parmer78001-78
Ismatec Kasety do rurekCole-ParmerRK-78016-98
Izofluran 99,9%, 250 mlPharmaceutical Partners of Canada Inc.
LB Agar LennoxBioshop CanadaLBL406.500Płytki agarowe do testowania sterylności
Siarczan magnezuSigma-AldrichM7506Kofaktor DNAzy
Masterflex L/S 16 RurkaCole-ParmerRK-96410-16
Midazolam 50 mg/10 mlPharmaceutical Partners of Canada Inc.
Monopolar Cautery PencilValleylabE2100
Normalna buforowana formalina, 10%Sigma-AldrichHT501128
N° 11 ostrzy skalpelaSwann Morton303
Papaina z lateksu papaiSigma-AldrichP3125
Kwas nadoctowySigma-Aldrich269336
Plastikowe złącze kolczaste do rurki 1/4 "do 1/8" IDMcMaster-Carr5117K61
Plastikowa rura kolczasta 90° Złącza kolankoweMcMaster-Carr5117K76
Plastikowe szybkoobrotowe zaślepki do rurMcMaster-Carr51525K143Męskie
plastikowe szybkoobrotowe gniazda ruroweLuer McMaster-Carr51525K293Żeńskie
narzędzie do biopsjiIntegra Miltex3332
Chlorek potasu 40 mEq/20 mlHospira Healthcare Corporation37869
Powidon-jod, 10%Rougier833133
Pipet serologiczny, 2 mlFisher Science13-678-27D
Hermetyczne pojemniki z zatrzaskową pokrywkąSnapLock142-3941-4
Dodecylosiarczan sodu w proszkuSigma-AldrichL4509
Chirurgiczne metalowe klipsy do podwiązywania, małyTeleflex001200
Nożyczki do tenotomii Stevens, 115 mm, prosteB. BraunBC004R
Zestaw do monitorowania ciśnienia TruWaveEdwards LifesciencesPX260
Test DNA 61231622319292242905 Luer Punch

Bibliografia

  1. Richardson, D., Fisher, S. E., Vaughan, D. E., Brown, J. S. Radial Forearm Flap Donor-Site Complications and Morbidity: A Prospective Study. Plastic and Reconstructive Surgery. 99 (1), 109-115 (1997).
  2. Edsander-Nord, Å, Jurell, G., Wickman, M. Donor-site morbidity after pedicled or free TRAM flap surgery: A prospective and objective study. Plastic and Reconstructive Surgery. 102 (5), 1508-1516 (1998).
  3. Qian, Y., et al. A systematic review and meta-analysis of free-style flaps: Risk analysis of complications. Plastic and Reconstructive Surgery. Global Open. 6 (2), 1651(2018).
  4. Issa, F. Vascularized composite allograft-specific characteristics of immune responses. Transplant International. 29 (6), 672-681 (2016).
  5. Kueckelhaus, M., et al. Vascularized composite allotransplantation: Current standards and novel approaches to prevent acute rejection and chronic allograft deterioration. Transplant International. 29 (6), 655-662 (2016).
  6. Iske, J., et al. Composite tissue allotransplantation: Opportunities and challenges. Cellular and Molecular Immunology. 16 (4), 343-349 (2019).
  7. Londono, R., Gorantla, V. S., Badylak, S. F. Emerging implications for extracellular matrix-based technologies in vascularized composite allotransplantation. Stem Cells International. 2016, 1541823(2016).
  8. Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
  9. Hussey, G. S., Dziki, J. L., Badylak, S. F. Extracellular matrix-based materials for regenerative medicine. Nature Reviews Materials. 3, 159-173 (2018).
  10. Colazo, J. M., et al. Applied bioengineering in tissue reconstruction, replacement, and regeneration. Tissue Engineering. Part B Reviews. 25 (4), 259-290 (2019).
  11. Rouwkema, J., Rivron, N. C., van Blitterswijk, C. A. Vascularization in tissue engineering. Trends in Biotechnology. 26 (8), 434-441 (2008).
  12. Zhang, Q., et al. Decellularized skin/adipose tissue flap matrix for engineering vascularized composite soft tissue flaps. Acta Biomaterialia. 35, 166-184 (2016).
  13. Jank, B. J., et al. Creation of a bioengineered skin flap scaffold with a perfusable vascular pedicle. Tissue Engineering - Part A. 23 (13-14), 696-707 (2017).
  14. Giatsidis, G., Guyette, J. P., Ott, H. C., Orgill, D. P. Development of a large-volume human-derived adipose acellular allogenic flap by perfusion decellularization. Wound Repair and Regeneration. 26 (2), 245-250 (2018).
  15. Zhang, J., et al. Perfusion-decellularized skeletal muscle as a three-dimensional scaffold with a vascular network template. Biomaterials. 89, 114-126 (2016).
  16. Duisit, J., et al. Decellularization of the porcine ear generates a biocompatible, nonimmunogenic extracellular matrix platform for face subunit bioengineering. Annals of Surgery. 267 (6), 1191-1201 (2018).
  17. Duisit, J., et al. Perfusion-decellularization of human ear grafts enables ECM-based scaffolds for auricular vascularized composite tissue engineering. Acta Biomaterialia. 73, 339-354 (2018).
  18. Duisit, J., et al. Bioengineering a human face graft: The matrix of identity. Annals of Surgery. 266 (5), 754-764 (2017).
  19. Haughey, B. H., Panje, W. R. A porcine model for multiple musculocutaneous flaps. The Laryngoscope. 99 (2), 204-212 (1989).
  20. Khachatryan, A., et al. Radial Forearm Flap. Microsurgery Manual for Medical Students and Residents: A Step-by-Step Approach. , Springer. Denmark. 177-181 (2021).
  21. Hammouda, B. Temperature effect on the nanostructure of SDS micelles in water. Journal of Research of the National Institute of Standards and Technology. 118, 151-167 (2013).
  22. Qu, J., Van Hogezand, R. M., Zhao, C., Kuo, B. J., Carlsen, B. T. Decellularization of a fasciocutaneous flap for use as a perfusable scaffold. Annals of Plastic Surgery. 75 (1), 112-116 (2015).
  23. Keane, T. J., Swinehart, I. T., Badylak, S. F. Methods of tissue decellularization used for preparation of biologic scaffolds and in vivo relevance. Methods. 84, 25-34 (2015).
  24. Mendibil, U., et al. Tissue-specific decellularization methods: Rationale and strategies to achieve regenerative compounds. International Journal of Molecular Sciences. 21 (15), 5447(2020).
  25. Lupon, E., et al. Engineering vascularized composite allografts using natural scaffolds: A systematic review. Tissue Engineering. Part B Reviews. 28 (3), 677-693 (2022).
  26. Duisit, J., Maistriaux, L., Bertheuil, N., Lellouch, A. G. Engineering vascularized composite tissues by perfusion decellularization/recellularization: Review. Current Transplantation Reports. 8, 44-56 (2021).
  27. Adil, A., Xu, M., Haykal, S. Recellularization of bioengineered scaffolds for vascular composite allotransplantation. Frontiers in Surgery. 9, 843677(2022).
  28. Phelps, E. A., García, A. J. Engineering more than a cell: Vascularization strategies in tissue engineering. Current Opinion in Biotechnology. 21 (5), 704-709 (2010).
  29. Pozzo, V., et al. A reliable porcine fascio-cutaneous flap model for vascularized composite allografts bioengineering studies. Journal of Visualized Experiments. (181), e63557(2022).
  30. Uygun, B. E., et al. Decellularization and recellularization of whole livers. Journal of Visualized Experiments. (48), e2394(2011).
  31. Uzarski, J. S., et al. Epithelial cell repopulation and preparation of rodent extracellular matrix scaffolds for renal tissue development. Journal of Visualized Experiments. (102), e53271(2015).
  32. Sullivan, D. C., et al. Decellularization methods of porcine kidneys for whole organ engineering using a high-throughput system. Biomaterials. 33 (31), 7756-7764 (2012).
  33. Choudhury, D., Yee, M., Sheng, Z. L. J., Amirul, A., Naing, M. W. Decellularization systems and devices: State-of-the-art. Acta Biomaterialia. 115, 51-59 (2020).
  34. Schilling, B. K., et al. Design and fabrication of an automatable, 3D printed perfusion device for tissue infusion and perfusion engineering. Tissue Engineering. Part A. 26 (5-6), 253-264 (2020).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Inżynieria tkankowarusztowania decelularyzowanemacierz zewnątrzkomórkowarekonstrukcja tkanek miękkichpłat sieciowydodecylosiarczan sodumetody recelularyzacji
Pobieranie i perfuzja-decelularyzacja unaczynionych płatów świń w niestandardowym bioreaktorze perfuzyjnym
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.