Artykuł metodologiczny

Wykrywanie Candidatus Liberibacter asiaticus do stosowania w terenie za pomocą amplifikacji polimerazy rekombinazy w połączeniu z CRISPR-Cas12a

DOI:

10.3791/64070

⸱

23 grudnia 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1China-USA Citrus Huanglongbing Joint Laboratory, National Navel Orange Engineering Research Center, Gannan Normal University, 2Department of Biological Sciences, Gannan Normal University, 3Citrus Research and Education Center, Department of Microbiology and Cell Science, University of Florida - Institute of Food and Agricultural Sciences

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tej pracy opracowano szybką, czułą i przenośną metodę wykrywania Candidatus Liberibacter asiaticus, opartą na amplifikacji polimerazy rekombinazy w połączeniu z CRISPR-Cas12a.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wczesne wykrycie Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas) przez hodowców cytrusów ułatwia wczesną interwencję i zapobiega rozprzestrzenianiu się choroby. Przedstawiono tutaj prostą metodę szybkiej i przenośnej diagnostyki Huanglongbing (HLB), która łączy amplifikację polimerazy rekombinazy i fluorescencyjny reporter wykorzystujący aktywność nukleazy w klastrach, regularnie rozmieszczonych krótkich powtórzeniach palindromicznych/CRISPR-associated 12a (CRISPR-Cas12a). Czułość tej techniki jest znacznie wyższa niż PCR. Co więcej, metoda ta wykazała podobne wyniki do qPCR, gdy użyto próbek liści. W porównaniu z konwencjonalnymi metodami detekcji CLas, przedstawiona tutaj metoda detekcji może być zrealizowana w 90 minut i działa w warunkach izotermicznych, które nie wymagają użycia maszyn PCR. Ponadto wyniki można wizualizować za pomocą ręcznego urządzenia do wykrywania fluorescencyjnego w terenie.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Huanglongbing (HLB) jest jedną z najbardziej problematycznych chorób cytrusów na świecie1. HLB jest wywoływany przez kolonizujące łyko i wybredne bakterie Candidatus Liberibacter spp., w tym Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas), Ca. L. africanus i Ca. L. americanus2. Najbardziej rozpowszechnionym gatunkiem związanym z HLB w Chinach i USA jest CLas, który jest przenoszony przez azjatyckie psyllidy cytrusowe (Diaphorina citri) lub przez szczepienie3. Po zakażeniu CLas, drzewa cytrusowe wykazują spadek wzrostu aż do śmierci2. Typowymi objawami liści cytrusowych zakażonych CLas są plamiste plamistości, zielone wyspy (małe okrągłe ciemnozielone kropki), wypukłe korkowate żyłki na grubszych i skórzastych liściach oraz niejednolite żółknięcie pędów2. Ponadto owoce zakażone CLas wydają się małe i koślawe2.

Ponieważ żadna odmiana cytrusów nie jest odporna na HLB i nie ma terapeutycznego lekarstwa na HLB, zapobieganie HLB wymaga kwarantanny i izolacji drzew cytrusowych z dodatnim wynikiem CLas2,3. Dlatego wczesne wykrycie ma kluczowe znaczenie dla monitorowania i kwarantanny, aby zapobiec rozprzestrzenianiu się CLas i zminimalizować straty ekonomiczne3. Ponadto konieczne jest czułe wykrywanie CLas ze względu na niskie miano CLas u roślin we wczesnym stadium infekcji3. W Chinach wykrywanie CLas jest zwykle przeprowadzane przez niektóre certyfikowane centra testowe. Jednak proces wykrywania trwa zwykle co najmniej 1 tydzień, a opłata za wykrycie jest wysoka. Dlatego, aby pomóc w monitorowaniu częstości występowania HLB

Do diagnozowania HLB4,5,6,7,8,9. Reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR) i ilościowa reakcja PCR (qPCR) są najczęściej używanymi narzędziami do wykrywania CLas ze względu na ich wysoką czułość i swoistość4,5. Technologie te opierają się jednak w dużej mierze na drogich instrumentach i wysoko wykwalifikowanym personelu. Ponadto opracowano kilka metod amplifikacji izotermicznej, takich jak amplifikacja izotermiczna za pośrednictwem pętli (LAMP), jako atrakcyjne alternatywy dla konwencjonalnych metod PCR ze względu na ich prostotę, szybkość i niski koszt8,9,10. Jednak zastosowanie ich do dokładnego wykrywania CLas jest trudne ze względu na niespecyficzne sygnały wzmacniające, które mogą powodować wyniki fałszywie dodatnie.

RNA-guided CRISPR/Cas (clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated) wykrywanie kwasów nukleinowych na bazie endonukleazy zostało opracowane jako technologia diagnostyki molekularnej nowej generacji ze względu na jej wysoką czułość, swoistość i niezawodność11,12,13,14. Te technologie diagnostyczne CRISPR/Cas opierają się na aktywności nukleazy pobocznej białek Cas w celu rozszczepienia jednoniciowego DNA (ssDNA) zmodyfikowanego za pomocą fluorescencyjnego reportera i wygaszacza fluorescencji na każdym końcu oligonukleotydów, a także urządzenia do wykrywania fluorescencji w celu wychwycenia uwolnionego fluorescencyjnego reportera11,12. Aktywność nukleazy kilku efektorów Cas aktywowanych przez docelowy dupleks CRISPR RNA (crRNA) może bezkrytycznie rozszczepiać otaczające niedocelowe ssDNA11. CRISPR-Cas12a (zwany również Cpf 1), system CRISPR/Cas klasy 2 typu V-A, wykazuje kilka zalet w porównaniu z Cas9, takich jak mniejsza tolerancja niedopasowania i większa specyficzność13. System Cas12a/crRNA został zastosowany do czułego i swoistego wykrywania kwasów nukleinowych ludzkich patogenów i fitopatogenów14,15,16,17,18. Dlatego wykorzystanie systemu Cas12a/crRNA powinno umożliwić dokładne i czułe wykrywanie kwasu nukleinowego CLas.

Cas12a sam w sobie nie jest teoretycznie wystarczająco czuły, aby wykryć niskie poziomy kwasów nukleinowych. Dlatego, aby poprawić czułość wykrywania, detekcja CRISPR-Cas12a jest zwykle łączona z krokiem amplifikacji izotermicznej14,15. Amplifikacja polimerazy rekombinazy (RPA) umożliwia czułą i szybką izotermiczną amplifikację DNA w zakresie temperatur od 37 °C do 42 °C19.

Niedawno opracowano platformę detekcyjną o nazwie DETECTR (DNA Endonuclease Targeted CRISPR Trans Reporter), która łączy aktywność DNazy Cas12a z RPA i odczytem fluorescencji12 i wykazano, że wykrywa kwas nukleinowy z większą czułością20. Ponadto sygnał fluorescencyjny emitowany z próbek dodatnich można obserwować za pomocą ręcznego urządzenia do wykrywania fluorescencji w terenie.

Ponieważ amplifikowaliśmy DNA za pomocą RPA, zaprojektowaliśmy crRNA ukierunkowane na pięciokopijny gen nrdB (subjednostka reduktazy rybonukleotydowej β-) specyficzny dla CLas21, i zastosowaliśmy aktywność DNazy białka Cas12a, nazwaliśmy tę metodę wykrywania CLas CLas-DETECTR. W porównaniu z istniejącymi metodami wykrywania CLas, CLas-DETECTR jest szybki, dokładny, czuły i łatwy do wdrożenia.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Budowa CLas-DETECTR

UWAGA: Budowa CLas-DETECTR to czteroetapowy proces: przygotowanie roztworu, całkowita izolacja cytrusowego DNA, izotermiczna amplifikacja DNA i wizualizacja wyników. Schemat testu CLas-DETECTR jest zilustrowany na rysunku Rysunek 1A.

  1. Przygotowanie roztworu
    1. Przygotować bufor A: 20 mM NaOH w 6% PEG 200. Na 100 ml dodać 113 mg NaOH i 6 g PEG 200 do 80 mlH2Ow butelce. Inkubować butelkę w łaźni wodnej w temperaturze 60 °C, aż do rozpuszczenia całego PEG 200. Następnie dodajH2Odo objętości 100 ml.
    2. Przygotować roztwór B: Do każdej reakcji dodać 10 μl buforu RPA, 0,8 μl F-RPA-RNRf, 0,8 μl R-RPA-RNRr i 3,9 μl ddH2O do końcowej objętości 15,5 μL.
      UWAGA: F-RPA-RNRf i R-RPA-RNRr są starterami stosowanymi w teście przeciwko genowi nrdB. Sekwencja znajduje się w tabeli 1.
    3. Przygotować roztwór C: Do każdej reakcji dodać 1 μl reportera ssDNA, 3 μl buforu NEB 3.1, 1 μl crRNA, 4 μl Cas12a i 11 μl ddH2O do końcowej objętości 20 μl.
      UWAGA: Jeśli do wykrycia jest wiele próbek, należy przygotować dużą objętość roztworu B i roztworu C, a następnie podwielokrotnie.
  2. Całkowita izolacja DNA cytrusów
    UWAGA: Aby zaoszczędzić czas i sprawić, by ta metoda była odpowiednia do wykrywania w terenie, zastosowano podejście oparte na alkalicznym glikolu polietylenowym (PEG) w celu uzyskania surowych ekstraktów roślinnych do amplifikacji DNA22,23
    1. W tym protokole użyto liści cytrusowych. Najpierw przebij pięć krążków liściowych z liścia. Następnie umieść krążki liściowe w probówce do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml i dodaj 200 μl buforu A.
      UWAGA: Na polu najpierw wyczyść liście, jeśli pokrywa je kurz. Krążki liściowe można przypiąć za pomocą pokrywy tubki o pojemności 1,5 ml, aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego. Inne tkanki cytrusowe, takie jak korzenie, łodygi, owoce i kwiaty, mogą być również używane w tym protokole.
    2. Zmiel krążki liściowe ręcznie, aż będą gładkie za pomocą plastikowego pręta.
    3. Pozostaw rurkę w spokoju na 10 minut. Następnie użyj supernatantu do amplifikacji DNA.
      UWAGA: W tym miejscu test można wstrzymać, a surowe ekstrakty roślinne, które zostały wyekstrahowane metodą alkaliczną-PEG, można przechowywać w temperaturze -20 °C przez co najmniej 1 rok. Drzewa słodkiej pomarańczy Newhall (Citrus sinensis Osbeck var. Newhall) pokazane na filmie były uprawiane w doniczce wypełnionej mieszanką gleby torfowej 9/3/1 (v/v/v) / wermikulitu / perlitu i utrzymywane w szklarni znajdującej się na terenie kampusu Gannan Normal University w Jiangxi w Chinach. Drzewa zainfekowane HLB zaszczepiono przez szczepienie CLas-dodatnimi pąkami Newhall. Drzewa zakażone i niezakażone HLB zostały potwierdzone metodą PCR. CLas wykryto przy użyciu pary starterów (F-RPA-RNRf/R-RPA-RNRr) ukierunkowanej na gen markera specyficzny dla CLas, nrdB. Z drugiej strony, charakterystyczne objawy HLB, plamiste plamistości i żółknięcie liści można znaleźć na drzewach CLas-dodatnich, ale nie na drzewach CLas-ujemnych.
  3. Izotermiczna amplifikacja DNA
    1. Dodać 1 μl supernatantu z kroku 1.2.3 i 1 μl MgOAc (14 mM stężenie końcowe) do roztworu B i dobrze wymieszać.
    2. W laboratorium inkubować je w prostym inkubatorze w temperaturze 37 °C przez 15 min.
      UWAGA: W terenie trzymaj probówki w ręku przez 15 minut. Zaleca się również inkubację probówek w prostym inkubatorze w temperaturze 37 °C przez 15 minut, jeśli pozwalają na to warunki.
  4. Wizualizacja wyników
    1. Dodać 10 μl mieszaniny z kroku 1.3.2 do roztworu C i dobrze wymieszać.
    2. Inkubować je w inkubatorze w temperaturze 37 °C przez 60 minut.
    3. Załóż gogle i obserwuj zielony sygnał fluorescencyjny uwalniany z reportera ssDNA znakowanego 5' 6-fluoresceiną na 5' i wygaszaczem fluorescencji na 3' przez ręczne urządzenie do wykrywania fluorescencji (długość fali wzbudzenia: 440 nm, długość fali emisji: 500 nm).
      UWAGA: zielony sygnał fluorescencji może trwać kilka dni, lepiej
      UWAGA: Światło emitowane przez urządzenie do wykrywania fluorescencji jest szkodliwe dla oczu. Upewnij się, że założyłeś okulary ochronne przed obserwacją wyników.

2. Test specyficzności

UWAGA: Aby przetestować specyficzność CLas-DETECTR, bakterie ryzosfery Agrobacterium tumefaciens GV3101, Xanthomonas citri subsp. citri (Xcc) i Burkholderia stabilis szczep 1440 wyizolowane w lab24 zostały poddane testowi CLas-DETECTR.

UWAGA: Candidatus Liberibacter (CLas) nie może być hodowany. DNA CLas można uzyskać tylko z ekstrakcji genomowego DNA z tkanek cytrusowych zakażonych CLas. Xcc jest czynnikiem sprawczym innej ważnej choroby cytrusów, raka cytrusów. Burkholderia stabilis szczep 1440 to bakteria anty-Xcc wyizolowana w laboratorium. W związku z tym użyto czystych szczepów dla wszystkich tych trzech bakterii

  1. Wyodrębnij bakteryjne genomowe DNA (gDNA) za pomocą zestawu do ekstrakcji bakteryjnego genomowego DNA zgodnie z protokołem producenta. Użyj wody jako kontroli negatywnej.
  2. Przeprowadzić PCR przy użyciu 0,2 ml pasków probówki PCR z nasadkami optycznymi w 25 μl mieszaniny reakcyjnej zawierającej 1 μl F-RPA-RNRf, 1 μl R-RPA-RNRr, 12,5 μl Ex Taq wersja 2.0 plus barwnik, 1 μl matrycy DNA i 9,5 μlH2O.
    1. Stosować następujące warunki reakcji z cyklami termicznymi: 1 min w temperaturze 98 °C, następnie 35 cykli po 10 s w temperaturze 98 °C, 30 s w temperaturze 55 °C, 15 s w temperaturze 72 °C, następnie 10 min w temperaturze 72 °C i utrzymywać w temperaturze 16 °C.
    2. Uruchom produkty PCR na 1% żelu agarozowym przy napięciu 120 V przez 15 minut.
  3. Wykonać qPCR w 20 μL mieszaninie reakcyjnej zawierającej 0,8 μL F-RPA-RNRf, 0,8 μL R-RPA-RNRr, 10 μL 2x TB Green Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus), 1 μL matrycy DNA i 7,4 μLH2O.
    1. Stosować następujące warunki reakcji z cyklicznymi zmianami termicznymi: 30 s w temperaturze 95 °C, następnie 45 cykli po 5 s w temperaturze 95 °C i 32 s w temperaturze 60 °C, a następnie etap krzywej topnienia trwający 15 s w temperaturze 95 °C, 1 min w temperaturze 60 °C i 15 s w temperaturze 95 °C.
    2. W każdym powtórzeniu należy uwzględnić trzy powtórzenia techniczne.
  4. Wykonaj metodę CLas-DETECTR, wykonując kroki 1.1–1.4.

3. Porównanie czułości

  1. Aby przetestować czułość CLas DETECTR, wykryj serię rozcieńczeń fragmentów DNA CLas za pomocą PCR, CLas-DETECTR i qPCR, jak opisano powyżej.
  2. Amplifikować segment DNA o długości 1,060 pz od nrdB przy użyciu zestawu starterów F-RNR i R-RNR w 100 μl mieszaninie reakcyjnej zawierającej 4 μl F-RNR, 4 μl R-RNR, 50 μl PrimeSTAR Max Premix, 2 μl matrycy DNA i 40 μlH2O, zgodnie z warunkami reakcji z cyklami termicznymi (30 s w temperaturze 98 °C, następnie 35 cykli po 10 s w temperaturze 98 °C, 15 s w temperaturze 55 °C, 30 s w temperaturze 72 °C, następnie 10 minut w temperaturze 72 °C, a następnie utrzymywanie w temperaturze 16 °C).
    UWAGA: Gen nrdB (podjednostka reduktazy rybonukleotydowej β-) jest specyficzny dla CLas21. Amplikon nrdB można łatwo uzyskać z CLas-dodatniego gDNA cytrusowego za pomocą zestawu starterów F-RNR i R-RNR. Zestaw starterów F-RNR i R-RNR amplifikuje fragment nrdB o wartości 1,060 pz, podczas gdy zestaw starterów F-RPA-RNR i R-RPA-RNR amplifikuje fragment genu nrdB o wartości 104 pz, który jest częścią fragmentu nrdB o pz.
  3. Oczyść produkty PCR za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu DNA zgodnie z instrukcją producenta.
  4. Rozcieńczyć produkty PCR zawierające amplikony nrdB wysterylizowanym ddH2O.
  5. Oblicz liczbę kopii genu nrdB, korzystając z dostępnego na rynku internetowego kalkulatora liczby kopii DNA i rozcieńczenia.
  6. Przygotować rozcieńczenia DNA zawierające 2,01 × 106 kopii/μL, 2,01 × 105 kopii/μL, 2,01 × 104 kopii/μL, 2,01 × 103 kopii/μL, 2,01 × 102 kopii/μL, 2,01 × 101 kopii/μL, 2,01 × 100 kopii/μL i 2,01 × 10−1 kopii/μL fragmentu DNA CLas.

4. Wykrywanie próbki

UWAGA: Po teście specyficzności i czułości, metoda CLas-DETECTR została użyta do wykrycia obecności CLas w próbkach liści polowych pobranych z drzew słodkiej pomarańczy Newhall uprawianych w szkółce zasobów plazmy zarodkowej na kampusie Gannan Normal University, Jiangxi, Chiny. W celu weryfikacji wyników wykonano qPCR.

  1. Przetestuj w sumie 15 drzew. Użyj wody jako kontroli negatywnej.
  2. Wykonaj metody CLas-DETECTR i qPCR zgodnie z powyższym opisem.
    UWAGA: Ze względu na nierównomierną charakterystykę rozmieszczenia CLas w cytrusach, liście wykazujące objawy HLB zostały zebrane jako priorytet. Jeśli drzewo wyglądało zdrowo, liście zostały zebrane losowoCLas-DETECTR system działa poprawnie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj opisaliśmy przenośną platformę, CLas-DETECTR, która łączy systemy RPA i CRISPR-Cas12a w celu diagnozowania HLB w terenie. Schemat CLas-DETECTR jest zilustrowany w Rysunek 1A.

Gdy próbki liści z drzew Newhall zakażonych HLB i niezakażonych HLB (Rysunek 1B), dla których obecność CLas została potwierdzona przez PCR (Rysunek 1C), zostały poddane testowi CLas-DETECTR, zaobserwowano zielony sygnał fluorescencyjny w...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W niniejszej pracy przedstawiono szybką i przenośną metodę wykrywania CLas o nazwie CLas-DETECTR, która łączy w sobie systemy RPA i CRISPR-Cas12a. Przepływ pracy jest zilustrowany na rysunku 1. CLas-DETECTR wykrywa CLas ze swoistością i czułością (Rysunek 2 i Rysunek 3). Ponadto, korzystając z próbek liści Newhall, CLas-DETECTR wykrywa CLas z taką samą czułością jak qPCR (ryc. 4). Warto...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają sprzecznych interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była finansowana przez Narodowy Kluczowy Program Badawczo-Rozwojowy Chin (2021YFD1400805), Główny Program Badawczo-Rozwojowy Nauki i Technologii Prowincji Jiangxi (20194ABC28007), Projekty Departamentu Edukacji Jiangxi (GJJ201449) oraz Wspólne Innowacje Nowoczesnych Badań Naukowych w Rolnictwie w Prowincji Jiangxi (JXXTCX2015002(3+2)-003).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Zestaw do ekstrakcji żelu DNA AxyPrepCorning09319KE1Chiny
Zestaw do ekstrakcji bakteryjnego genomowego DNASolarbioD1600Chiny
EnGen LbCas12a TOLOBIO32104-01Chiny
Ex Taq wersja 2.0 plus barwnikTaKaRaRR902AChiny
Ręczne urządzenie do wykrywania fluorescencyjnego LUYOR3415RG
Chiny Dziurkacz Deli114Chiny
Octan magnezu, MgOAcTwistDxTABAS03KITUK
NaOHSCR10019718Chiny
Bufor NEB 3.1 NEBB7203USA
Probówki paskowe PCRLABSELECTPST-0208-FT-CChiny
PEG 200 SigmaP3015USA
PrimeSTAR Max DNA PolymerasTaKaRaR045AChiny
Szybkie ładowanie Fioletowy 1 kb Plus Drabinka DNA New England BiolabsN0550SUSA
TB Green Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus)TaKaRaRR820BChiny
TwistAmp BasicTwistDxTABAS03KITWielka Brytania

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ma, W. X., et al. Citrus Huanglongbing is a pathogen-triggered immune disease that can be mitigated with antioxidants and gibberellin. Nature Communications. 13 (1), 529(2022).
  2. Bové, J. M. Huanglongbing: A destructive, newly-emerging, century-old disease of citrus. Journal of Plant Pathology. 88 (1), 7-37 (2006).
  3. Wang, N., et al. The Candidatus Liberibacter-host interface: Insights into pathogenesis mechanisms and disease control. Annual Review of Phytopathology. 55, 451-482 (2017).
  4. Kim, J. S., Wang, N. Characterization of copy numbers of 16S rDNA and 16S rRNA of Candidatus Liberibacter asiaticus and the implication in detection in planta using quantitative PCR. BMC Research Notes. 2, 37(2009).
  5. Maheshwari, Y., Selvaraj, V., Godfrey, K., Hajeri, S., Yokomi, R. Multiplex detection of "Candidatus Liberibacter asiaticus" and Spiroplasma citri by qPCR and droplet digital PCR. PLoS One. 16 (3), e0242392(2021).
  6. Deng, X., Zhou, G., Li, H., Chen, J., Civerolo, E. L. Nested-PCR detection and sequence confirmation of 'Candidatus Liberibacter asiaticus' from Murraya paniculata in Guandong, China. Plant Disease. 91 (8), 1051(2007).
  7. Ding, F., Duan, Y., Yuan, Q., Shao, J., Hartung, J. S. Serological detection of 'Candidatus Liberibacter asiaticus' in citrus, and identification by GeLC-MS/MS of a chaperone protein responding to cellular pathogens. Scientific Reports. 6, 29272(2016).
  8. Choi, C. W., Hyun, J. W., Hwang, R. Y., Powell, C. A. Loop-mediated isothermal amplification assay for detection of Candidatus Liberibacter asiaticus, a causal agent of citrus Huanglongbing. The Plant Pathology Journal. 34 (6), 499-505 (2018).
  9. Ghosh, D. K., et al. Development of a recombinase polymerase based isothermal amplification combined with lateral flow assay (HLB-RPA-LFA) for rapid detection of "Candidatus Liberibacter asiaticus". PLoS One. 13 (12), e0208530(2018).
  10. Ravindran, A., Levy, J., Pierson, E., Gross, D. C. Development of a loop-mediated isothermal amplification procedure as a sensitive and rapid method for detection of 'Candidatus Liberibacter solanacearum' in potatoes and psyllids. Phytopathology. 102 (9), 899-907 (2012).
  11. Chertow, D. S. Next-generation diagnostics with CRISPR. Science. 360 (6387), 381-382 (2018).
  12. Chen, J. S., et al. CRISPR-Cas12a target binding unleashes indiscriminate single-stranded DNase activity. Science. 360 (6387), 436-439 (2018).
  13. Zetsche, B., et al. Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system. Cell. 163 (3), 759-771 (2015).
  14. Gootenberg, J. S., et al. Multiplexed and portable nucleic acid detection platform with Cas13, Cas12a, and Csm6. Science. 360 (6387), 439-444 (2018).
  15. Ding, X., et al. Ultrasensitive and visual detection of SARS-CoV-2 using all-in-one dual CRISPR-Cas12a assay. Nature Communications. 11 (1), 4711(2020).
  16. Qian, W., et al. Visual detection of human metapneumovirus using CRISPR-Cas12a diagnostics. Virus Research. 305, 198568(2021).
  17. Marques, M. C., et al. Diagnostics of infections produced by the plant viruses TMV, TEV, and PVX with CRISPR-Cas12 and CRISPR-Cas13. ACS Synthetic Biology. 11 (7), 2384-2393 (2022).
  18. Lu, X., et al. A rapid, equipment-free method for detecting Phytophthora infestans in the field using a lateral flow strip-based recombinase polymerase amplification assay. Plant Disease. 104 (11), 2774-2778 (2020).
  19. Lobato, I. M., O'Sullivan, C. K. Recombinase polymerase amplification: Basics, applications and recent advances. Trends in Analytical Chemistry. 98, 19-35 (2018).
  20. Liang, M., et al. A CRISPR-Cas12a-derived biosensing platform for the highly sensitive detection of diverse small molecules. Nature Communications. 10 (1), 3672(2019).
  21. Zheng, Z., et al. Unusual five copies and dual forms of nrdB in "Candidatus Liberibacter asiaticus": Biological implications and PCR detection application. Scientific Reports. 6, 39020(2016).
  22. Chomczynski, P., Rymaszewski, M. Alkaline polyethylene glycol-based method for direct PCR from bacteria, eukaryotic tissue samples, and whole blood. BioTechniques. 40 (4), 454-458 (2006).
  23. Yang, Y. G., Kim, J. Y., Soh, M. S., Kim, D. S. A simple and rapid gene amplification from Arabidopsis leaves using Any Direct system. Journal of Biochemistry and Molecular Biology. 40 (3), 444-447 (2007).
  24. Long, Y., et al. A fluorescent reporter-based evaluation assay for antibacterial components against Xanthomonas citri subsp. citri. Frontiers in Microbiology. 13, 864963(2022).
  25. Wheatley, M. S., Duan, Y. P., Yang, Y. Highly sensitive and rapid detection of citrus Huanglongbing pathogen ('Candidatus Liberibacter asiaticus') using Cas12a-based methods. Phytopathology. 111 (12), 2375-2382 (2021).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Huanglongbing DetectionField DiagnosticsIsothermal DNA AmplificationCitrus Leaf TestingFluorescent DetectionqPCR ComparisonDNA Extraction

Powiązane artykuły