Method Article

Wykrywanie Candidatus Liberibacter asiaticus do stosowania w terenie za pomocą amplifikacji polimerazy rekombinazy w połączeniu z CRISPR-Cas12a

DOI:

10.3791/64070

⸱

December 23rd, 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1China-USA Citrus Huanglongbing Joint Laboratory, National Navel Orange Engineering Research Center, Gannan Normal University, 2Department of Biological Sciences, Gannan Normal University, 3Citrus Research and Education Center, Department of Microbiology and Cell Science, University of Florida - Institute of Food and Agricultural Sciences

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tej pracy opracowano szybką, czułą i przenośną metodę wykrywania Candidatus Liberibacter asiaticus, opartą na amplifikacji polimerazy rekombinazy w połączeniu z CRISPR-Cas12a.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wczesne wykrycie Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas) przez hodowców cytrusów ułatwia wczesną interwencję i zapobiega rozprzestrzenianiu się choroby. Przedstawiono tutaj prostą metodę szybkiej i przenośnej diagnostyki Huanglongbing (HLB), która łączy amplifikację polimerazy rekombinazy i fluorescencyjny reporter wykorzystujący aktywność nukleazy w klastrach, regularnie rozmieszczonych krótkich powtórzeniach palindromicznych/CRISPR-associated 12a (CRISPR-Cas12a). Czułość tej techniki jest znacznie wyższa niż PCR. Co więcej, metoda ta wykazała podobne wyniki do qPCR, gdy użyto próbek liści. W porównaniu z konwencjonalnymi metodami detekcji CLas, przedstawiona tutaj metoda detekcji może być zrealizowana w 90 minut i działa w warunkach izotermicznych, które nie wymagają użycia maszyn PCR. Ponadto wyniki można wizualizować za pomocą ręcznego urządzenia do wykrywania fluorescencyjnego w terenie.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Huanglongbing (HLB) jest jedną z najbardziej problematycznych chorób cytrusów na świecie1. HLB jest wywoływany przez kolonizujące łyko i wybredne bakterie Candidatus Liberibacter spp., w tym Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas), Ca. L. africanus i Ca. L. americanus2. Najbardziej rozpowszechnionym gatunkiem związanym z HLB w Chinach i USA jest CLas, który jest przenoszony przez azjatyckie psyllidy cytrusowe (Diaphorina citri) lub przez szczepienie3. Po zakażeniu CLas, drzewa cytrusowe wykazują spadek wzrostu aż do śmierci2. Ty....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Budowa CLas-DETECTR

UWAGA: Budowa CLas-DETECTR to czteroetapowy proces: przygotowanie roztworu, całkowita izolacja cytrusowego DNA, izotermiczna amplifikacja DNA i wizualizacja wyników. Schemat testu CLas-DETECTR jest zilustrowany na rysunku Rysunek 1A.

  1. Przygotowanie roztworu
    1. Przygotować bufor A: 20 mM NaOH w 6% PEG 200. Na 100 ml dodać 113 mg NaOH i 6 g PEG 200 do 80 mlH2Ow butelce. Inkubować butelkę w łaźni wodnej w temperaturze 60 °C, aż do rozpuszczenia całego PEG 200. Następnie dodajH2Odo objętości 100 ml.
    2. Przygotować roztwór B: Do każdej reakcji ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj opisaliśmy przenośną platformę, CLas-DETECTR, która łączy systemy RPA i CRISPR-Cas12a w celu diagnozowania HLB w terenie. Schemat CLas-DETECTR jest zilustrowany w Rysunek 1A.

Gdy próbki liści z drzew Newhall zakażonych HLB i niezakażonych HLB (Rysunek 1B), dla których obecność CLas została potwierdzona przez PCR (Rysunek 1C), zostały poddane testowi CLas-DETECTR, zaobserwowano zielony sygnał fluorescencyjny w.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W niniejszej pracy przedstawiono szybką i przenośną metodę wykrywania CLas o nazwie CLas-DETECTR, która łączy w sobie systemy RPA i CRISPR-Cas12a. Przepływ pracy jest zilustrowany na rysunku 1. CLas-DETECTR wykrywa CLas ze swoistością i czułością (Rysunek 2 i Rysunek 3). Ponadto, korzystając z próbek liści Newhall, CLas-DETECTR wykrywa CLas z taką samą czułością jak qPCR (ryc. 4). Warto.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają sprzecznych interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była finansowana przez Narodowy Kluczowy Program Badawczo-Rozwojowy Chin (2021YFD1400805), Główny Program Badawczo-Rozwojowy Nauki i Technologii Prowincji Jiangxi (20194ABC28007), Projekty Departamentu Edukacji Jiangxi (GJJ201449) oraz Wspólne Innowacje Nowoczesnych Badań Naukowych w Rolnictwie w Prowincji Jiangxi (JXXTCX2015002(3+2)-003).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Zestaw do ekstrakcji żelu DNA AxyPrepCorning09319KE1Chiny
Zestaw do ekstrakcji bakteryjnego genomowego DNASolarbioD1600Chiny
EnGen LbCas12a TOLOBIO32104-01Chiny
Ex Taq wersja 2.0 plus barwnikTaKaRaRR902AChiny
Ręczne urządzenie do wykrywania fluorescencyjnego LUYOR3415RG
Chiny Dziurkacz Deli114Chiny
Octan magnezu, MgOAcTwistDxTABAS03KITUK
NaOHSCR10019718Chiny
Bufor NEB 3.1 NEBB7203USA
Probówki paskowe PCRLABSELECTPST-0208-FT-CChiny
PEG 200 SigmaP3015USA
PrimeSTAR Max DNA PolymerasTaKaRaR045AChiny
Szybkie ładowanie Fioletowy 1 kb Plus Drabinka DNA New England BiolabsN0550SUSA
TB Green Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus)TaKaRaRR820BChiny
TwistAmp BasicTwistDxTABAS03KITWielka Brytania

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ma, W. X., et al. Citrus Huanglongbing is a pathogen-triggered immune disease that can be mitigated with antioxidants and gibberellin. Nature Communications. 13 (1), 529(2022).
  2. Bové, J. M. ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Candidatus Liberibacter AsiaticusHuanglongbing DetectionRecombinase Polymerase AmplificationCRISPR Cas12aField DiagnosticsIsothermal DNA AmplificationCitrus Leaf TestingFluorescent DetectionqPCR ComparisonDNA Extraction

Related Articles