Protokół ratowania zarodka dla hybrydyzacji międzygatunkowej w squashu

Cucurbita (2n = 40) to bardzo różnorodny rodzaj w rodzinie Cucurbitaceae, który obejmuje 27 różnych gatunków, z których pięć jest udomowionych¹. Wśród nich Cucurbita moschata, C. pepo i C. maxima mają największe znaczenie gospodarcze na świecie. W Stanach Zjednoczonych C. moschata i C. pepo to dwa najważniejsze gatunki w produkcji rolnej. C. pepo składa się z czterech podgatunków (ovifera, pepo, fraternal i gumala), które zawierają zarówno letnie, jak i zimowe grupy odmian dyni: krzywej szyjki, prostej szyi, żołędzi, przegrzebków, kokosa, szpiku warzywnego, cukinii i dyni^2,3,4,5. C. moschata składa się głównie z zimowych rodzajów rynku squasha, w tym butternut, Dickinson i cheese group¹. Te dwa gatunki są zróżnicowane morfologicznie i fenotypowo, przy czym C. pepo jest ceniony za plon, wczesność, pokrój krzewów i różnorodne cechy owoców, w tym kształt owoców, wielkość owoców, kolor miąższu i wzór skórki. Z drugiej strony C. moschata jest ceniona za przystosowanie do ciepła i wilgotności, a także odporność na choroby i szkodniki^6,7. Hybrydyzacja międzygatunkowa między C. moschata i C. pepo jest nie tylko ważną strategią wprowadzania pożądanych cech między tymi dwoma gatunkami, ale także pozwala na poszerzenie bazy genetycznej w programach hodowlanych^7,8.

Wczesne krzyżówki między C. moschata i C. pepo zostały wykonane w celu określenia ich kompatybilności i/lub barier taksonomicznych9^,10,11, podczas gdy późniejsze badania skupiały się głównie na przenoszeniu pożądanych cech^12,13,14. Międzygatunkowa hybrydyzacja między tymi dwoma gatunkami miała na celu przeniesienie nowych cech, takich jak pokrój wzrostu krzewów lub półkrzewów oraz poprawa plonów C. pepo, a także odporność na choroby, zdolność adaptacji do stresu abiotycznego i zwiększony wigor C. moschata^14,15,16. Na przykład, specyficzne krzyżówki między C. pepo (P₅) i C. moschata (MO₃) zaowocowały wyższym plonem owoców¹³, podczas gdy akcesje C. moschata (Nigerian Local i Menina) były szeroko stosowane jako główne źródło odporności na potywirusy w uprawianych odmianach C. pepo^17,18.

Poprzednie badania wykazały, że hybrydyzacja między C. moschata i C. pepo jest możliwa, ale trudna^8,15. Krzyżówki międzygatunkowe mogą skutkować brakiem zawiązywania owoców (aborcja), owocami partenokarpicznymi pozbawionymi żywotnych nasion (pustymi nasionami), owocami bez pestek, w których niedojrzałe zarodki nie rozwijają się (stenospermokarpia) lub owocami z niewielką liczbą niedojrzałych zarodków, które można uratować w dojrzałe rośliny poprzez ratowanie zarodków^15,16. Na przykład, żadne żywotne nasiona nie zostały uzyskane przez skrzyżowanie C. pepo (królowa stołu, matczyna) z C. moschata (duży ser, ojcowski), jednak odwrotna krzyżówka dała 57 żywotnych nasion ze 134 zapyleń⁹. Hayase uzyskała żywotne nasiona z krzyżówek C. moschata i C. pepo tylko wtedy, gdy krzyżówki zostały wykonane o godzinie 04:00 przy użyciu pyłku przechowywanego w temperaturze 10 °C przez noc¹⁹. Baggett skrzyżował osiem różnych odmian C. moschata z C. pepo (delicata) i poinformował, że spośród 103 wszystkich zapyleń uzyskano 83 owoce, które wyglądały normalnie, ale żaden z nich nie zawierał żywotnych nasion⁸. W krzyżówce C. pepo (S179) i C. moschata (NK), Zhang i in. uzyskali 15 owoców z 2994 nasionami, ale tylko 12 z tych nasion było zdolnych do życia, podczas gdy pozostałe wykazywały tylko szczątkowy rozwój. Badania te sugerują, że nawet jeśli krzyżowanie międzygatunkowe między C. moschata i C. pepo jest bardzo korzystne, uzyskanie owoców z żywotnymi nasionami z krzyżówek jest wymagające¹⁶.

Ratowanie zarodków zostało zasugerowane jako odpowiednia metoda przezwyciężania problemów wynikających z wczesnej aborcji lub słabo rozwiniętych embrionów i jest jedną z najwcześniejszych i najbardziej skutecznych technik hodowli in vitro do regeneracji niedojrzałych zarodków^16,20. Ratowanie zarodków polega na hodowli in vitro słabo rozwiniętych/niedojrzałych zarodków, a następnie przeniesieniu do sterylnej pożywki w celu ułatwienia odzyskania sadzonek i ostatecznie dojrzałych roślin²¹. Chociaż ratowanie zarodków jest powszechnie stosowane w hodowli kabaczków, brakuje szczegółowego opisu odpowiedniej metodologii, która pozwoliłaby na jej rutynowe stosowanie. Zastosowanie techniki ratowania zarodków w celu pokonania międzygatunkowych barier hybrydyzacyjnych u gatunków Cucurbita zostało zgłoszone już w 1954 roku²². Jednak sukces ratowania zarodków we wczesnych badaniach był albo nieopisany, albo bardzo niski. Metwally i in. podali 10% wskaźnik sukcesu (regeneracji do dojrzałych roślin) wśród 100 międzygatunkowych zarodków hybrydowych uratowanych ze skrzyżowania C. pepo i C. martinezii²³. Sisko i wsp. podali zmienny wskaźnik powodzenia regeneracji zarodków wśród zarodków uzyskanych z różnych kombinacji krzyżowych: wskaźnik regeneracji mieszańców uzyskanych przez skrzyżowanie C. maxima (Bos. Max) i C. pepo (Gold Rush) wynosił 15,5%, dla C. pepo (cukinia) i C. moschata (Hokaido) wynosił 20%, podczas gdy dla C. pepo (Gold Rush) i C. moschata (Dolga) wynosił 37,5%²⁴. Oprócz genotypu, pożywki i warunki hodowli in vitro są ważnymi czynnikami sukcesu techniki^25,26. W obecnym badaniu przetestowano różne kombinacje krzyżowe między C. moschata i C. pepo i opracowano prostą metodologię wykorzystania techniki ratowania zarodków w squasha. Opracowanie prostej i łatwej do odtworzenia techniki ratowania zarodków ułatwi hybrydyzację międzygatunkową i wzmocnienie plazmy zarodkowej w programach hodowli squasha.

1. Sadzenie i zapylanie

UWAGA: Ważne jest, aby zidentyfikować kompatybilne genotypy, których hybrydyzacja doprowadziłaby do zawiązania owoców i produkcji zdolnych do życia zarodków.

1. Warunki sadzenia i pielęgnacja
   1. Uzyskać nasiona genotypów dyni (odmiany/akcesje) do hybrydyzacji (Tabela 1).
   2. Wypełnij 50 komór (25 cm szerokości x 50 cm długości) podłożem doniczkowym wzbogaconym kompletnym nawozem NPK zawierającym 1,38 g/kg N, 1,38 g/kg P i 1,38 g/kg K.
   3. Wysiewaj nasiona na głębokość równą ich długości i przykryj podłożem doniczkowym. Podlewaj mieszkania bez tworzenia stojącej wody. Następnie utrzymuj podłoże wilgotne, podlewając je ręcznie raz dziennie.
   4. W drugim etapie prawdziwych liści sadzonki należy przesadzić do doniczek o średnicy od 25 cm do 30 cm, wzbogaconych kompletnym nawozem NPK w ilości 3 łyżek stołowych na doniczkę. Rośliny nawozić raz w tygodniu 500 ml / doniczkę płynnego nawozu zawierającego NPK 20:20:20 dodanego w stężeniu 1 g na galon wody.
   5. Utrzymuj rośliny w szklarni w temperaturze między 22-28 °C w warunkach naturalnego oświetlenia. W przypadku genotypów winorośli należy zapewnić kratę nośną w szklarni (Rysunek 1).
2. Wykonywanie zapyleń
   1. Zazwyczaj kwitnienie dyni rozpoczyna się po 6 do 8 tygodniach od wysiewu, w zależności od odmiany (Rysunek 2A,B). Rozpocznij kontrolowaną hybrydyzację (krzyżówki), gdy tylko rośliny zaczną kwitnąć. W warunkach szklarniowych zapylanie można odbywać przez cały rok.
   2. Zidentyfikuj kwiaty męskie i żeńskie odmian C. pepo i C. moschata, które będą gotowe do zapylenia następnego dnia. Aby zidentyfikować takie kwiaty, sprawdź, czy nie ma kwiatów, których płatki mają żółty odcień, ale nie są otwarte. Delikatnie przyklej kwiaty taśmą u góry za pomocą taśmy maskującej, aby zapobiec przypadkowemu zapyleniu przez owady (Rysunek 2C, D).
   3. Rankiem następnego dnia kwiaty są gotowe do zapylenia. Przeprowadź zapylanie przed godziną 10:00, aby poprawić wskaźnik powodzenia hybrydyzacji²⁷.
   4. Otwórz kwiaty żeńskie i męskie, delikatnie usuwając zaklejoną taśmą górną część płatków. Usuń płatki z męskiego kwiatu i przenieś pyłek, delikatnie pocierając pylnik o znamię żeńskiego kwiatu (Rysunek 3A).
   5. Po zapyleniu natychmiast zamknij zapylony żeński kwiat taśmą maskującą. Użyj znacznika, aby zapisać datę zapylenia i wskazać rodziców ze strony ojca i matki użytych w krzyżówce (Rysunek 3B).
   6. O udanej krzyżówce świadczy rozszerzony jajnik, który szybko tworzy mały owoc w ciągu 1 tygodnia (Ryc. 4A). Roślina jest wtedy gotowa do zbioru 45-55 dni po zapyleniu²⁸ (Rysunek 4B).

2. Technika ratowania zarodków

1. Przygotowanie podłoża
   1. Przygotuj zapasy antybiotyków: W przypadku cefotaksymu (soli sodowej) rozpuść antybiotyk w 4 ml wody dejonizowanej lub destylowanej, przefiltruj przez sterylny filtr strzykawkowy 0,22 μm i przygotuj 0,5 ml porcji. Przechowywać w temperaturze -20 °C. Otrzymany roztwór podstawowy będzie miał stężenie 250 mg/ml.
   2. W przypadku ampicyliny (soli sodowej) rozpuścić proszek w 10 ml wody, przefiltrować przez sterylny filtr strzykawkowy 0,22 μm i podwielokrotność w 1 ml bulionu o końcowym stężeniu 100 mg/ml. Przechowywać w temperaturze -20 °C.
   3. Przygotować pożywkę Murashige and Skoog (MS), rozpuszczając 2,45 g pożywki (stężenie 4,91 g/l) w 500 ml wody destylowanej w butelce o pojemności 1 l. Dodać 1,5 g gumy gellan i sterylizować w autoklawie w temperaturze 121 °C przez 20 min. Guma gellan całkowicie rozpuszcza się podczas autoklawowania.
   4. Po sterylizacji w autoklawie schłodzić pożywkę, umieszczając butelkę w łaźni wodnej o temperaturze 50 °C. Wyjmij zapasy antybiotyków z zamrażarki i rozmroź je w komorze laminarnej.
   5. Przenieś pożywkę do okapu z przepływem laminarnym. Dodać 0,6 ml roztworu podstawowego cefotaksymu (250 mg/ml) i 0,25 ml bulionu ampicyliny (100 mg/ml) do pożywki i dobrze wymieszać. Wlać około 7 ml pożywki na sterylną szalkę Petriego (60 mm x 15 mm).
   6. Pozwól pożywce zastygnąć na szalkach Petriego przez około 15-20 minut. Zamknij szalki Petriego folią uszczelniającą i umieść je w pudełku do przechowywania. Przechowywać w temperaturze pokojowej.
2. Ratowanie zarodków
   1. Przed rozpoczęciem wyczyść i wysterylizuj komorę laminarnego przepływu powietrza 70% alkoholem etylowym.
   2. Zbierz owoc dyni, łamiąc / odcinając go od głównej winorośli i zdezynfekuj powierzchnię owocu, myjąc go płynnym detergentem (np. 0,3% chloroksylenolu) w zlewie laboratoryjnym, aż cały luźny brud zostanie usunięty (Rysunek 5A).
   3. Spłucz dużą ilością wody z kranu. Osusz owoce czystymi ręcznikami papierowymi. Przenieś owoce do komory laminarnego przepływu powietrza (Rysunek 5B).
   4. Sterylizuj powierzchnię owoców, rozpylając 70% etanolu na owoce w sterylnej komorze laminarnej z przepływem powietrza. Przetnij owoc na pół sterylnym nożem (Rysunek 5C) i wyekstrahuj nasiona.
   5. Użyj sterylnych kleszczy, aby aseptycznie otworzyć okrywę nasienną i odsłonić niedojrzałe zarodki (Rysunek 6). Ostrożnie umieść niedojrzałe zarodki na szalce Petriego zawierającej pożywkę MS uzupełnioną cefotaksymem i ampicyliną (Ryc. 7A). Zamknąć szalkę Petriego i zamknąć folią do owijania.
      UWAGA: W zależności od wielkości zarodka możliwe jest zmieszczenie pięciu lub sześciu zarodków na szalce Petriego.
   6. Umieścić zapieczętowane szalki Petriego z zarodkami w komorze wzrostowej w świetle 16-godzinnego fotoperiodu w temperaturze 25 °C i wilgotności względnej 70%. Jeśli dojdzie do zakażenia, należy niezwłocznie przeprowadzić subkulturę nieskażonych zarodków na nową płytkę z tym samym podłożem.
   7. Liścienie zaczną się rozszerzać po 4 dniach i zmienią kolor na zielony w ciągu 10 dni (Rysunek 7B). W tym momencie, jeśli to konieczne, wykonaj subkulturację na nowe płytki zawierające to samo podłoże, aby umożliwić ekspansję tkanki. Korzenie zaczną pojawiać się po 14 dniach (Rysunek 7C), a po 21 dniach sadzonki będą miały wydłużone korzenie i liścienie (Rysunek 7D).
      UWAGA: Pożywka zastosowana w protokole jest odpowiednia do różnicowania na pędy i korzenie bez dodatkowych regulatorów wzrostu.
   8. Na tym etapie usuń sadzonki z szalek Petriego i delikatnie zmyj podłoże z korzeni wodą z kranu (Rysunek 8). Umieść sadzonki w plastikowym pojemniku (14 cm x 9 cm x 4 cm) i przykryj korzenie mokrymi ręcznikami papierowymi (Rysunek 9A). Przykryj pojemnik i w razie potrzeby zwilż ręczniki papierowe.
   9. Przechowywać pojemniki w temperaturze pokojowej (25-28 °C) i z 16-godzinnym fotoperiodem. Ten krok zaaklimatyzuje sadzonki. Po aklimatyzacji przez 7-10 dni w pojemniku sadzonki będą miały około 3-4 długości włosów. W tym okresie w razie potrzeby ponownie zwilż ręczniki papierowe.
   10. Przenieś sadzonki do 50 początkowych komór (25 cm szerokości x 50 cm długości) uzupełnionych nawozem zgodnie z wcześniejszym opisem i przenieś je do szklarni (Rysunek 9B). Nie podlewaj nadmiernie sadzonek, aby uniknąć gnicia; w razie potrzeby dodaj około 10-20 ml na komórkę.
   11. W drugiej do trzeciej fazie prawdziwych liści przesadzaj sadzonki do doniczek o średnicy 30 cm wypełnionych podłożem doniczkowym wzbogaconym nawozem, jak opisano wcześniej (Rysunek 10A). Zapewnij podparcie kratowe dla roślin winorośli i przeprowadź kontrolowaną hybrydyzację, gdy rośliny zaczną kwitnąć, jak opisano wcześniej (Rysunek 10B).
   12. Utrzymuj rośliny w szklarni w temperaturze między 22-28 °C w naturalnym oświetleniu. Oceń rośliny pod kątem cech owoców i nasion.

Żywotność owoców i nasion
Przeprowadzono wstępny test w celu określenia zawiązywania owoców i żywotności nasion w różnych kombinacjach krzyżowych. W sumie wybrano 15 genotypów dyni, cztery C. pepo i 11 C. moschata (tab. 1). Spośród 24 prób krzyżowania międzygatunkowego, zestaw owoców uzyskano dla 22 (Tabela 2), co stanowi ogólny sukces >92% w zestawie owoców. Nie uzyskano dojrzałych owoców przez krzyżowanie O i M oraz E i J, natomiast największą liczbę owoców (n = 6) uzyskano przez krzyżowanie F i J (tab. 2). Liczba kwiatów zapylonych w różnych kombinacjach krzyżowych wahała się od jednego do 11, a wskaźnik sukcesu zapylenia wahał się od 0% do 100%. Liczba kwiatów zapylanych w różnych kombinacjach krzyżowych różniła się w zależności od liczby zestawów kwiatowych i synchronizacji kwitnienia wśród kwiatów męskich i żeńskich. Mimo, że owoce uzyskano ze wszystkich krzyżówek z wyjątkiem dwóch, ocena owoców po ich pokrojeniu wykazała, że większość owoców miała poronione zarodki bez zdolnych do życia nasion. Owoce z większości krzyżówek wyglądały normalnie, ale były pozbawione pestek lub składały się z nasion z prymitywnymi zarodkami. Ze wszystkich kombinacji krzyżówek wyprodukowano w sumie 44 owoce, z których tylko jeden, powstały przez skrzyżowanie C i J, miał słabo rozwinięte zarodki, które można było odzyskać za pomocą techniki ratowania zarodków.

Ratowanie zarodków i dalszy rozwój
Hybryda międzygatunkowa F1 opracowana przez skrzyżowanie C i J miała w sumie 44 nasiona, ale tylko 10 z nich miało zarodki, które można było uratować w celu rozwoju pokolenia. Pozostałe nasiona nie miały zarodków. Wszystkie 10 zarodków wyhodowano w pożywce ratunkowej dla zarodków i codziennie sprawdzano ich wzrost i rozwój. Wielkość 10 niedojrzałych zarodków wahała się od 3,51 mm do 8,26 mm. Wskaźnik powodzenia ratowania zarodków wynosił 80%. Mieszańce międzygatunkowe F1 (linie pomostowe) powstałe ze skrzyżowania C. moschata i C. pepo (C i J) zawierały genomy obu gatunków w stosunku 1:1 (50% każdy). Rośliny te zostały wykorzystane jako linie pomostowe do introgresji ważnych gospodarczo cech między tymi dwoma gatunkami. Na przykład przekroczenie tych linii mostowych z C. moschata skutkowałoby hybrydami o pochodzeniu genetycznym odpowiednio 75% C. moschata i 25% C. pepo. Owoce uzyskane z tych linii mostowych zawierały mieszaninę niezdolnych do życia nasion i nasion z niedojrzałymi zarodkami, które następnie wymagały hodowli tkankowej w celu regeneracji. Na przykład, jeden z owoców miał w sumie 54 nasiona, z których 14 miało niedojrzałe zarodki, które zostały uratowane za pomocą opisanego tutaj protokołu.

Rysunek 1: Krata podtrzymująca do pionowo rosnących roślin dyni w szklarni. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Ilustracja otwartych i przyklejonych kwiatów. Otwórz (A) męski i (B) żeński kwiat dyni w szklarni. (C) Oklejony taśmą kwiat męski od rodzica Cucurbita moschata ze strony ojca. (D) Oklejony taśmą żeński kwiat od matki Cucurbita pepo. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Ilustracja zapylania. (A) Przenieś pyłek z kwiatu męskiego, delikatnie pocierając pylnik o znamię kwiatu żeńskiego. (B) Po zapyleniu przyklej żeński kwiat taśmą i użyj znacznika, aby zapisać datę zapylenia oraz rodziców ze strony ojca i matki użytych w krzyżówce. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Zestaw owoców. (A) Po zapyleniu, jajnik szybko się rozrasta, tworząc mały owoc w ciągu 1 tygodnia. (B) Owoc jest gotowy do zbioru po 45 dniach od zapylenia. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5: Przygotowanie owoców. (A) Umyj owoce detergentem. Zbierz i zdezynfekuj powierzchnię owocu, myjąc ją płynnym detergentem w zlewie laboratoryjnym. (B) Opłucz i osusz owoce. Osusz owoce czystymi ręcznikami papierowymi, a następnie spłucz dużą ilością wody z kranu i przenieś je do szafki z laminarnym przepływem powietrza. (C) Przeciąć owoc na pół sterylnym nożem. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 6: Ekstrakcja zarodka z nasion. Użyj sterylnych kleszczy, aby aseptycznie otworzyć okrywę nasienną i odsłonić niedojrzały zarodek. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 7: Regeneracja zarodków w pożywce MS. (A) Ostrożnie umieść niedojrzałe zarodki na szalce Petriego zawierającej pożywkę MS. (B) Liścienie rozszerzą się i staną się zielone w ciągu 10 dni. (C) Korzenie zaczną pojawiać się po 14 dniach. (D) Po 21 dniach sadzonki będą miały przedłużone korzenie i liścienie, które są gotowe do przeniesienia do plastikowego pojemnika w celu aklimatyzacji. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 8: Umyj korzenie. Usuń sadzonki z szalek Petriego i delikatnie zmyj podłoże z korzeni wodą z kranu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 9: Zaaklimatyzuj sadzonki. (A) Umieść sadzonki w plastikowym pojemniku i przykryj korzenie mokrym ręcznikiem papierowym na 5 dni, aby je zaaklimatyzować. (B) Przenieść sadzonki do tacek komórkowych zawierających dostępną w handlu mieszankę doniczkową wzbogaconą kompletnym nawozem NPK. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 10: Przesadzaj sadzonki do doniczek. (A) Na drugim do trzecim etapie prawdziwych liści, przesadź sadzonki do doniczek o średnicy 30 cm wypełnionych podłożem doniczkowym wzbogaconym nawozem. (B) Zapewnij podparcie kratowe dla roślin winorośli i dokonaj kontrolowanej hybrydyzacji, gdy rośliny zaczną kwitnąć. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Tabela 1: W badaniu wykorzystano łącznie 15 genotypów dyni, cztery C. pepo i 11 C. moschata, dla krzyżówek międzygatunkowych.

Tabela 2: Próby krzyżowania z 15 genotypami dyni i odpowiadającym im zestawem owoców, liczba poronionych nasion, niedojrzałe zarodki i udane uratowanie zarodków.

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.