Method Article

Wizualizacja dynamiki sprzężeń aktyny i mikrotubul in vitro za pomocą mikroskopii fluorescencji całkowitego wewnętrznego odbicia (TIRF)

DOI:

10.3791/64074

⸱

July 20th, 2022

1Department of Biochemistry & Molecular Biology, and Department of Neuroscience & Physiology, State University of New York (SUNY) Upstate Medical University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół jest przewodnikiem do wizualizacji dynamicznych aktyny i mikrotubul za pomocą testu in vitro total internal fluorescence (TIRF)

mikroskopowego.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tradycyjnie, cytoszkielety aktyny i mikrotubul były badane jako oddzielne jednostki, ograniczone do określonych regionów lub procesów komórkowych i regulowane przez różne zestawy białek wiążących, unikalne dla każdego polimeru. Wiele badań pokazuje obecnie, że dynamika obu polimerów cytoszkieletu jest ze sobą spleciona i że ten przesłuch jest wymagany dla większości zachowań komórkowych. Zidentyfikowano już szereg białek biorących udział w interakcjach aktyna-mikrotubule (tj. Tau, MACF, GAS, forminy i inne) i są one dobrze scharakteryzowane w odniesieniu do samej aktyny lub mikrotubul. Jednak stosunkowo niewiele badań wykazało testy koordynacji aktyna-mikrotubula z dynamicznymi wersjami obu polimerów. Może to zasłaniać pojawiające się mechanizmy łączące aktynę z mikrotubulami. W tym przypadku technika rekonstytucji in vitro oparta na mikroskopii całkowitego wewnętrznego odbicia (TIRF) pozwala na wizualizację dynamiki zarówno aktyny, jak i mikrotubul z jednej reakcji biochemicznej. Technika ta zachowuje dynamikę polimeryzacji filamentu aktynowego lub mikrotubul pojedynczo lub w obecności drugiego polimeru. Dostępne na rynku białko Tau służy do pokazania, jak zmieniają się zachowania aktyny-mikrotubul w obecności klasycznego białka sieciującego cytoszkielet. Metoda ta może dostarczyć wiarygodnych funkcjonalnych i mechanistycznych informacji na temat tego, w jaki sposób poszczególne białka regulatorowe koordynują dynamikę aktyny-mikrotubul z rozdzielczością pojedynczych włókien lub kompleksów wyższego rzędu.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Historycznie rzecz biorąc, aktyna i mikrotubule były postrzegane jako odrębne jednostki, każda z własnym zestawem białek regulatorowych, dynamicznymi zachowaniami i odrębnymi lokalizacjami komórkowymi. Liczne dowody wskazują na to, że polimery aktyny i mikrotubul angażują się w funkcjonalne mechanizmy przesłuchów, które są niezbędne do przeprowadzenia wielu procesów komórkowych, w tym migracji, pozycjonowania wrzeciona mitotycznego, transportu wewnątrzkomórkowego i morfologii komórek1,2,3,4. Różnorodne skoordynowane zachowania, które leżą u podstaw tych przykładów, zależą od skomplikowanej równowagi czynników sprzęgających, sygnałów i właściwości fizycznych. Jednak szczegóły molekularne, które leżą u podstaw tych mechanizmów, są nadal w dużej mierze nieznane, ponieważ większość badań koncentruje się na pojedynczym polimerze cytoszkieletu na raz1,2,5.

aktyna i mikrotubule nie oddziałują bezpośrednio6,7,8. Skoordynowana dynamika aktyny i mikrotubul obserwowana w komórkach jest pośredniczona przez dodatkowe czynniki. Zidentyfikowano wiele białek, o których uważa się, że regulują przesłuchy aktyna-mikrotubule, a ich aktywność jest dobrze scharakteryzowana w odniesieniu do samego polimeru cytoszkieletu1,2. Coraz więcej dowodów sugeruje, że to podejście oparte na pojedynczym polimerze ukryło podwójne funkcje niektórych białek/kompleksów, które umożliwiają sprzężenie aktyna-mikrotubula7,8,9,10,11,12,13. Eksperymenty, w których oba polimery są obecne, są rzadkie i często definiują mechanizmy z pojedynczym dynamicznym polimerem i stabilizowaną statycznie wersją drugiego6,8,9,10,11,14,15,16,17,18. W związku z tym potrzebne są metody do badania pojawiających się właściwości białek koordynujących aktynę i mikrotubule, które mogą być w pełni zrozumiane tylko w systemach eksperymentalnych wykorzystujących oba dynamiczne polimery.

Kombinacja metod bezpośredniego znakowania białek, genetycznie kodowanych znaczników powinowactwa i mikroskopii całkowitej fluorescencji wewnętrznego odbicia (TIRF) została zastosowana z dużym powodzeniem w systemach rekonstytucji biomimetycznej19,20,21,22,23. Wiele schematów oddolnych nie zawiera wszystkich czynników regulujących białka w komórkach. Jednak technologia "biochemii na szkle nakrywkowym" udoskonaliła wiele mechanizmów dynamiki aktyny i mikrotubul w wysokich skalach przestrzennych i czasowych, w tym składniki wymagane do montażu lub demontażu polimeru oraz ruch białek motorycznych5,12,23,24,25,26,27. W tym miejscu opisano podejście oparte na pojedynczym włóknie minimalnym składniku do badania sprzężenia aktyna-mikrotubula in vitro. Protokół ten może być stosowany z dostępnymi na rynku lub wysoce czystymi oczyszczonymi białkami, białkami znakowanymi fluorescencyjnie, komorami perfuzyjnymi i rozszerzony na bardziej skomplikowane schematy zawierające ekstrakty komórkowe lub systemy syntetyczne. W tym przypadku dostępne na rynku białko Tau jest wykorzystywane do pokazania, jak zmienia się dynamika cytoszkieletu w obecności białka sprzęgającego aktyna-mikrotubula, ale można je zastąpić innymi przypuszczalnymi czynnikami koordynującymi aktynę-mikrotubule. Główną przewagą tego systemu nad innymi podejściami jest możliwość jednoczesnego monitorowania dynamiki wielu polimerów cytoszkieletu w jednej reakcji. Protokół ten zapewnia również użytkownikom przykłady i proste narzędzia do ilościowego określania zmian w polimerach cytoszkieletu. W ten sposób użytkownicy protokołu będą generować wiarygodne, ilościowe dane o rozdzielczości pojedynczego włókna, aby opisać mechanizmy leżące u podstaw tego, jak różne białka regulatorowe koordynują dynamikę aktyny i mikrotubul.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Mycie szkiełek nakrywkowych

UWAGA: Wash (24 mm x 60 mm, #1.5) szkiełka nakrywkowe według Smith et al., 201328.

  1. Ułóż szkiełka nakrywkowe w plastikowym pojemniku na pocztę pocztową.
  2. Zanurz kolejno szkiełka nakrywkowe w następujących roztworach i poddaj sonikacji przez 30-60 minut, spłukując ddH2O 10 razy pomiędzy każdym roztworem: ddH2O jedną kroplą płynu do naczyń; 0,1 M KOH. Szkiełka nakrywkowe należy przechowywać w 100% etanolu przez okres do 6 miesięcy.
    UWAGA: Nie dotykaj szklanych powierzchni palcami bez rękawiczek. Zamiast tego użyj kleszczy.

2. Powłoka oczyszczona (24 mm x 60 mm, #1.5) szkiełka nakrywkowe z mPEG- i biotyny-PEG-silanu

UWAGA: Ten protokół wykorzystuje system biotyna-streptawidyna do pozycjonowania aktyny i mikrotubul w płaszczyźnie obrazowania TIRF. Można stosować inne powłoki i systemy (np. przeciwciała, poli-L-lizynę, miozynę NEM itp.).

  1. Rozmrozić porcje proszków PEG-silan i biotyna-PEG-silan.
  2. Rozpuść proszki PEG w 80% etanolu (pH 2,0), aby wytworzyć roztwory podstawowe powłoki 10 mg/ml mPEG-silanu i 2-4 mg/ml biotyny-PEG-silanu, tuż przed użyciem.
    UWAGA: Proszki PEG często wydają się rozpuszczone, ale mogą nie być na poziomie mikroskopowym. Prawidłowe wymieszanie trwa ~1-2 minuty przy ciągłym pipetowaniu. Zachęca się użytkowników do odpipetowania dodatkowych 10 razy po pojawieniu się rozpuszczenia proszku.
    UWAGA: Nosić rękawice, aby chronić skórę przed stężonym HCl podczas wytwarzania 80% etanolu (pH 2,0).
  3. Usuń czyste (24 mm x 60 mm, #1.5) szkiełko nakrywkowe z magazynu etanolu za pomocą kleszczy. Osuszyć azotem gazowym i przechowywać na czystej szalce Petriego.
  4. Szkiełka nakrywkowe pokryć 100 μl roztworu powlekającego: mieszaniną 2 mg/ml mPEG-silanu (MW 2 000) i 0,04 mg/ml biotyny-PEG-silanu (MW 3 400) w 80% etanolu (pH 2,0).
    UWAGA: Do rzadkiego powlekania (zalecane) należy użyć 2 mg/ml mPEG-silanu i 0,04 mg/ml biotyny-PEG-silanu. Do gęstego powlekania użyj 2 mg/ml mPEG-silanu, 4 mg/ml biotyny-PEG-silanu.
  5. Szkiełka nakrywkowe inkubować w temperaturze 70 °C przez co najmniej 18 godzin lub do momentu użycia.
    UWAGA: Powlekane szkiełka nakrywkowe ulegają degradacji, jeśli są przechowywane w temperaturze 70 °C przez ponad 2 tygodnie.

3. Montaż komór przepływowych do obrazowania

  1. Wytnij 12 pasków dwustronnej taśmy z podwójnym podkładem na długość 24 mm. Usuń jedną stronę podkładu taśmy i przymocuj kawałki taśmy przylegające do sześciu rowków znajdujących się w czystej komorze obrazowania.
    UWAGA: Taśma musi być płaska w celu prawidłowego montażu, w przeciwnym razie komory obrazowania będą przeciekać. Ostrożnie usuń podkład taśmy, aby uniknąć uderzeń. Zaleca się przesuwanie zaklejonych taśmą komór po czystej powierzchni w celu wygładzenia styków taśmy.
  2. Usuń drugi kawałek podkładu taśmy, aby odsłonić lepką stronę taśmy wzdłuż każdego rowka komory. Umieść taśmę komory stroną do góry na czystej powierzchni.
  3. Wymieszaj roztwory żywicy epoksydowej i utwardzacza w stosunku 1:1 (lub zgodnie z instrukcjami producenta) w małej łódce do ważenia.
  4. Użyj końcówki P1000, aby umieścić kroplę zmieszanej żywicy epoksydowej między paskami taśmy na końcu każdego rowka komory obrazowania (czerwona strzałka; Rysunek 1A). Umieść taśmę komorową/stronę epoksydową do góry na czystej powierzchni.
  5. Usunąć powlekane szkiełko nakrywkowe z inkubatora w temperaturze 70 °C. Pokryte i niepowlekane powierzchnie szkiełek nakrywkowych przepłukać sześciokrotnie ddH2O, osuszyć przefiltrowanym gazowym azotem, a następnie przymocować do komory obrazowania stroną z powłoką szkiełka nakrywkowego w kierunku taśmy.
  6. Użyj końcówki do pipety P200 lub P1000, aby wywrzeć nacisk na powierzchnię taśmy-szkło, aby zapewnić dobre uszczelnienie między taśmą a szkiełkiem nakrywkowym.
    UWAGA: Przy odpowiednim uszczelnieniu taśma dwustronna staje się półprzezroczysta. Komory obrazowania bez wystarczających styków taśma-komora będą przeciekać.
  7. Zmontowane komory należy inkubować w temperaturze pokojowej przez co najmniej 5-10 minut, aby żywica epoksydowa mogła w pełni uszczelnić studzienki komory przed użyciem. Komory perfuzyjne tracą ważność w ciągu 12-18 godzin od montażu.
    UWAGA: W zależności od ułożenia taśmy i grubości użytej taśmy dwustronnej, zmontowana komora będzie miała końcową objętość 20-50 μL.

4. Kondycjonowanie komór perfuzyjnych

  1. Za pomocą pompy perfuzyjnej (szybkość ustawiona na 500 μl/min) sekwencyjnie wymieniać roztwory kondycjonujące w komorze perfuzyjnej w następujący sposób:
    1. Przepływ 50 μL 1% BSA w celu zalania komory obrazowania. Usuń nadmiar bufora ze zbiornika złączki Luer lock.
    2. Przepływ 50 μl 0,005 mg/ml streptawidyny. Inkubować przez 1-2 minuty w temperaturze pokojowej. Usunąć nadmiar bufora ze zbiornika.
    3. Przelej 50 μl 1% BSA, aby zablokować niespecyficzne wiązanie. Inkubować przez 10-30 s. Usunąć nadmiar bufora ze zbiornika.
    4. Przepływ 50 μL ciepłej (37 °C) 1x bufor TIRF (1x BRB80, 50 mM KCl, 10 mM DTT, 40 mM glukozy, 0,25% (v/v) metyloceluloza (4,000 cp)).
      UWAGA: Nie usuwaj nadmiaru bufora ze zbiornika. Zapobiega to wysychaniu komory, co może wprowadzić pęcherzyki powietrza do systemu.
    5. Opcjonalnie: Przepływ 50 μL stabilizowanego29 i 50% biotynylowanych nasion mikrotubul rozcieńczonych w 1x buforze TIRF.
      UWAGA: Właściwe rozcieńczenie musi być określone empirycznie i uwzględniać zmienność między partiami. Jako punkty wyjścia zalecane są protokoły z27,29. Rozcieńczenie dające 10-30 nasion na pole widzenia dobrze sprawdza się w tej konfiguracji.

5. Przygotowanie mikroskopu

UWAGA: Reakcje biochemiczne zawierające dynamiczne filamenty aktynowe i mikrotubule są wizualizowane/przeprowadzane za pomocą mikroskopu TIRF (Inverted Total Internal Reflection Fluorescence) wyposażonego w lasery na ciele stałym o mocy 120-150 mW, obiektyw TIRF z korekcją temperatury 63x i kamerę EMCCD. Białka w tym przykładzie są wizualizowane na następujących długościach fal: 488 nm (mikrotubule) i 647 nm (aktyna).

  1. Ustaw stage/obiektywowe urządzenie grzewcze tak, aby utrzymywało temperaturę 35-37 °C co najmniej 30 minut przed obrazowaniem pierwszej reakcji biochemicznej.
  2. Ustaw parametry akwizycji obrazu w następujący sposób:
    1. Ustaw interwał akwizycji co 5 s na 15-20 min.
    2. Ustaw ekspozycję lasera 488 i 647 na 50-100 ms przy mocy 5%-10%. Ustaw odpowiedni kąt TIRF dla mikroskopu.
      UWAGA: Niezależnie od konfiguracji mikroskopu, najprostszym sposobem ustawienia mocy lasera, ekspozycji i kąta TIRF jest dokonanie regulacji na obrazach dowolnego polimeru osobno (patrz 5.2.2.1 i 5.2.2.2 poniżej). Zdecydowanie zaleca się użytkownikom korzystanie z najniższych ustawień mocy lasera i ekspozycji, które nadal pozwalają na wykrycie.
      1. Dostosuj reakcję polimeryzacji (Rysunek 1C), aby zainicjować montaż filamentu aktynowego i uzyskać obrazy przy długości fali 647 nm. Dokonaj odpowiednich korekt.
      2. Dostosuj reakcję polimeryzacji w drugim studzience perfuzyjnej kondycjonowanej, aby zainicjować składanie mikrotubul (Rysunek 1C) i wizualizuj przy 488 nm. Dokonaj odpowiednich korekt.

6. Przygotowanie mieszanin reakcji białkowych

  1. Przygotować roztwór podstawowy tubuliny znakowanej fluorescencyjnie.
    1. Oznaczyć stężenie domowej roboty nieznakowanej tubuliny za pomocą spektrofotometrii przy Abs280, w następujący sposób:
      1. Ślepy spektrofotometr z 1xBRB80 bez GTP.
      2. Obliczyć stężenie tubuliny, korzystając z wyznaczonego współczynnika ekstynkcji 115 000 M-1 cm-1 i następującego wzoru:
        figure-protocol-1
    2. Zawiesić komercyjnie wytwarzaną liofilizowaną 488-tubulinę znakowaną lizyną do 10 μM (1 mg / ml; 100% znacznik) z 20 μl 1x BRB80 bez GTP.
    3. Rozmrozić 7,2 μl podwielokrotności 100 μM nieoznakowanej tubuliny z recyklingu 29 na lodzie.
      UWAGA: Tubulina z recyklingu ma kluczowe znaczenie dla udanego montażu mikrotubul in vitro, ponieważ usuwa niekompetentne dimery polimeryzacji powstałe w zamrożonych zapasach białkowych29,30.
    4. Połączyć 3 μl 10 μM 488-tubuliny z 7,2 μl podwielokrotności 100 μM nieznakowanej tubuliny, nie później niż 15 minut przed użyciem.
  2. Przygotować roztwór podstawowy znakowanej fluorescencyjnie aktyny.
    1. W przypadku białek domowej roboty należy określić stężenie i znacznik procentowy aktyny za pomocą spektrofotometrii Abs290 i Abs650 w następujący sposób:
      1. Ślepa próba spektrofotometru z buforem G.
      2. Obliczyć stężenie nieznakowanej aktyny, korzystając z wyznaczonego współczynnika ekstynkcji 25,974 M-1 cm-1 i następującego wzoru:
        figure-protocol-2
      3. Oblicz stężenie znakowanej lizyną Alexa-647-aktyny, korzystając ze współczynnika ekstynkcji nieznakowanej aktyny, współczynnika korekcji fluoru 0,03 i następującego wzoru:
        [Alexa-647 aktyna], μM = (Abs290 - figure-protocol-3
      4. Oblicz etykietę procentową Alexa-647-aktyny, korzystając z wyznaczonej ε dla Alexa-647 wynoszącej 239 000 M-1 cm-1, w następujący sposób:
        % etykieta Alexa-647-aktyny = (Abs290 - (figure-protocol-4
    2. Rozmrozić jedną 2 μl podwielokrotności 3 μM znakowanej w 100% biotyny-aktyny (oznaczonej na resztach lizyny). Rozcieńczyć 10-krotnie, dodając 18 μl buforu G.
    3. Połączyć 3 μl rozcieńczonej biotynylowanej aktyny, odpowiednie objętości nieznakowanej i znakowanej aktyny (powyżej) tak, aby końcowa mieszanina wynosiła 12,5 μM całkowitej aktyny z 10%-30% znacznikiem fluorescencyjnym.
      UWAGA: Więcej niż 30% procent fluorescencyjnych monomerów aktyny (ostateczna) może pogorszyć rozdzielczość obrazowania, ponieważ włókna stają się trudne do odróżnienia od tła.
  3. Przygotuj mieszaniny reakcyjne (Rysunek 1C).
    1. Przygotować mieszaninę cytoszkieletu (probówka A), łącząc 2 μl 12,5 μM mieszanki aktynowej (6.2.3) z mieszanką tubuliny (6.1.4), nie później niż 15 minut przed obrazowaniem. Przechowywać na lodzie do czasu użycia.
    2. Przygotuj białkową mieszankę reakcyjną (tuba B), łącząc wszystkie inne eksperymentalne składniki i białka, w tym: 2x bufor TIRF, anty-wybielacz, nukleotydy, i białka pomocnicze. Przykład jest pokazany w Rysunek 1C.
      UWAGA: W wyniku końcowego rozcieńczenia powstaje 1x bufor TIRF, który zawiera ATP, GTP i siłę jonową w szacowanym zakresie fizjologicznym.
  4. Probówkę A i probówkę B inkubować oddzielnie w temperaturze 37 °C przez 30-60 s. Aby rozpocząć reakcję, wymieszać i dodać zawartość probówki B do probówki A (poniżej).

7. Obraz aktyny i dynamika mikrotubul

  1. Dobrze kondycjonuj perfuzję (Rysunek 1B; krok 4, powyżej).
  2. Zainicjuj jednocześnie składanie aktyny i mikrotubul, dodając zawartość probówki B (mieszanina reakcyjna) do probówki A (mieszanina cytoszkieletu) (Rysunek 1C).
  3. Przepływ 50 μL reakcji zawierającej 1x bufor TIRF uzupełniony 15 μM wolną tubuliną, 1 mM GTP i 0,5 μM monomerami aktyny oraz odpowiednie objętości kontrolnych.
  4. Nagraj film poklatkowy za pomocą oprogramowania mikroskopu, aby rejestrować co 5 s przez 15-20 min.
    UWAGA: Inicjacja dynamiki aktyny i mikrotubul następuje w ciągu 2-5 minut (Rysunek 2). Dłuższe opóźnienia wskazują na problemy z kontrolą temperatury lub problemy związane ze stężeniem białek w mieszaninie reakcyjnej.
  5. Kondycjonuj nową studzienkę perfuzyjną (krok 4) i zastąp objętość buforu białkiem regulatorowym (białkami) regulatorowym (tj. Tau) i kontrolami buforu (Rysunek 1C). Zdobądź zgodnie z opisem w kroku 7 (powyżej), aby ocenić białka regulatorowe dla pojawiających się funkcji aktyno-mikrotubul
    6. .

8. Przetwarzanie i analiza obrazów za pomocą oprogramowania FIJI31

  1. Otwórz zapisane filmy TIRF i wyświetl je jako kompozyt.
  2. Przeanalizuj dynamikę mikrotubul (Rysunek 3A), w następujący sposób:
    1. Wygeneruj maksymalną projekcję Z w oparciu o czas z menu stosów obrazów.
    2. Zsynchronizuj okno projekcji Z z oryginalnym filmem TIRF z menu Analizuj> Narzędzia> Synchronizuj system Windows.
    3. Narysuj linię za pomocą narzędzia linii prostej wzdłuż interesującej mikrotubuli na obrazie wyświetlanym w czasie.
      1. Otwórz menedżera obszaru zainteresowania (ROI) z menu analizy (Analizuj> Narzędzia> Menedżer ROI).
      2. Zapisz poszczególne lokalizacje mikrotubul, naciskając "t". Powtórz tę czynność dla wszystkich interesujących nas mikrotubul.
    4. Narysuj kimografy wybranych linii za pomocą "/" lub uruchom makro multi-kymo, które generuje wideo i kimograf dla każdej mikrotubuli w menedżerze ROI31.
      1. Dodaj do kimografów paski skali długości (μm), jak i czasu (min) z menu Analizuj> Narzędzia> Paski skali.
    5. Zmierz prędkość wzrostu mikrotubul na podstawie zboczy kimograficznych (Rysunek 3A, 1-2; nachylenie czarnych linii).
    6. Policz dynamiczne zdarzenia mikrotubul (katastrofa lub odrost) z wygenerowanego kimografu lub za pomocą dostępnych makr analitycznych5,8,18,25. Czerwone przerywane linie w Rysunek 3A, 1-2 reprezentują katastrofę/gwałtowny demontaż.
  3. Przeanalizuj dynamikę aktyny (Rysunek 3B), w następujący sposób:
    1. Zmierz zarodkowanie aktyny w następujący sposób:
      1. Policz liczbę włókien aktynowych obecnych w polu widzenia 100 s po rozpoczęciu reakcji i wyraź przez powierzchnię (włókna na μm2).
      2. Rejestruj i zapisuj dane w menedżerze ROI, jak w kroku 8.2.3.1 powyżej.
    2. Zmierz szybkość wydłużania włókien aktynowych (Rysunek 3B), w następujący sposób:
      1. Narysuj linię wzdłuż interesującego Cię filamentu aktyny za pomocą narzędzia do tworzenia linii segmentowych.
      2. Dodaj linię do menedżera ROI, jak w kroku 8.2.3.1 powyżej.
      3. Powtórz czynności zgodnie z linią (dodając każdy pomiar do menedżera ROI) dla co najmniej czterech klatek filmu.
        UWAGA: Zaleca się pomiar od siedmiu do ośmiu kolejnych klatek, jednak w niektórych warunkach polimeryzacja aktyny jest powolna poniżej wykrywalnego limitu, który można rozwiązać za pomocą obiektywu/mikroskopu. W takim przypadku pomiary mogą być wykonywane w regularnych odstępach czasu w nienastępujących po sobie klatkach (np. co pięć klatek).
      4. Wykreśl zmierzone wartości długości w czasie, który upłynął. Nachylenie wygenerowanej linii to szybkość wydłużania aktyny w mikronach/s.
      5. Przekaż końcowe obliczone stawki jako podjednostki s-1 μM-1 przy użyciu współczynnika korekcyjnego 370 podjednostek, aby uwzględnić liczbę monomerów aktyny w mikronie filamentu32.
  4. Przeprowadź analizę korelacyjną dla regionów równoległej asocjacji aktyna-mikrotubula (Rysunek 3C), w następujący sposób:
    1. Narysuj linię wzdłuż interesującej nas mikrotubuli w określonym punkcie czasowym (tj. 300 s po rozpoczęciu reakcji) za pomocą narzędzia do linii prostej.
      1. Dodaj linię do menedżera ROI, jak w kroku 8.2.3.1 powyżej.
    2. Wykreślić intensywność fluorescencji wzdłuż linii w każdym kanale.
      1. Wybierz każdy kanał za pomocą suwaka obrazu i wykreśl intensywność wzdłuż linii za pomocą "polecenia k".
      2. Zapisz lub wyeksportuj wartości, klikając przycisk "lista" w oknie danych wyjściowych.
    3. Wyraź zdarzenia sprzężenia aktyna-mikrotubula jako stosunek (aktyna nakładająca się na mikrotubule) od pojedynczych zdarzeń lub jako liczbę zdarzeń w danym polu widzenia w stałym punkcie czasowym (Rysunek 3C).
    4. Alternatywnie: Użyj oprogramowania, aby określić procentowe nakładanie się obu kanałów5,12.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przy warunkach opisanych powyżej (Rysunek 1), polimery aktyny i mikrotubul powinny być widoczne (i dynamiczne) w ciągu 2 minut od uzyskania obrazu (Rysunek 2). Podobnie jak w przypadku każdego protokołu opartego na biochemii, optymalizacja może być wymagana dla różnych białek regulatorowych lub partii białka. Z tych powodów kąt TIRF i ekspozycja obrazu są ustawiane w pierwszej kolejności w reakcjach zawierających każdy pojedynczy polimer. Potwierdza to, że przechowywane białka są funkcjonalne i obecna jest wystarczająca ilość znakowanego białka do wykrycia. Chociaż nie zawsze jest to konieczne (i nie jest wykonywane w tym przypadku), przetwarzanie końcowe filmów (tj. odejmowanie tła, uśrednianie lub transformacje Fouriera) może być wykorzystane do zwiększenia kontrastu obrazu (szczególnie mikrotubul)5,25,33. Bezpośrednia wizualizacja pojedynczych filamentów aktynowych i mikrotubul zapewniona przez ten test wspiera ilościowe określenie kilku dynamicznych miar dla każdego składnika cytoszkieletu pojedynczo lub razem, w tym parametrów polimeryzacji (tj. szybkości zarodkowania lub wydłużenia), parametrów demontażu (tj. szybkości skurczu lub katastrof) oraz współosiowania/nakładania się polimerów (Rysunek 3). Co więcej, miary te mogą być wykorzystane jako punkt wyjścia do rozszyfrowania wiązania lub wpływu ligandów regulatorowych, takich jak Tau (Rysunek 3). Wiele pomiarów pojedynczych filamentów aktynowych lub mikrotubul można wykonać z jednego filmu TIRF. Jednak ze względu na różnice w powlekaniu szkiełek nakrywkowych, pipetowaniu i innych czynnikach, wiarygodne pomiary powinny również obejmować wiele technicznych powtórzeń reakcji/filmów.

Na podstawie przykładowych kymogramów można określić wiele aspektów dynamiki mikrotubul, w tym szybkość wydłużania mikrotubul, a także częstotliwość katastrof i zdarzeń ratunkowych (Rysunek 3A). Użycie kymografów do pomiaru dynamiki aktyny w tym systemie nie jest tak proste, ponieważ włókna aktynowe są bardziej zawiłe niż mikrotubule. W konsekwencji parametry dynamiki filamentu aktynowego mierzone są ręcznie, co jest czasochłonne i pracochłonne. Liczba zarodków jest mierzona jako liczba filamentów aktyny obecnych w stałym punkcie czasowym dla wszystkich warunków. Liczby te różnią się znacznie w różnych dziedzinach obrazowania TIRF, ale mogą być używane z wieloma powtórzeniami lub jako uzupełnienie obserwacji z innych testów polimeryzacji. Liczba zarodków może być również stosowana dla mikrotubul, jeśli warunki próbne nie mają ustabilizowanych nasion mikrotubul. Szybkość wydłużania filamentu aktynowego jest mierzona jako długość filamentu w czasie z co najmniej czterech klatek filmu. Wartości szybkości są przenoszone na mikromolową aktynę ze współczynnikiem korekcyjnym wynoszącym 370 podjednostek, aby uwzględnić liczbę monomerów aktyny w mikronie filamentu (Rysunek 3B) < sup class = "xref">32. Pomiary mające na celu zdefiniowanie skoordynowanych zachowań między aktyną a mikrotubulami są mniej dobrze zdefiniowane. Jednak do pomiaru koincydencji obu polimerów zastosowano analizy korelacyjne, w tym skany liniowe (Rysunek 3C) lub nakładanie się oprogramowania5,11,34.

Dostępność danych:
Wszystkie zestawy danych związane z tą pracą zostały zdeponowane w Zenodo i są dostępne na uzasadnione żądanie pod adresem: 10.5281/zenodo.6368327.

figure-results-1
Rysunek 1. Schematy eksperymentalne: montaż komory przepływowej do akwizycji obrazu. (A) Zespół komory obrazowania. Od góry do dołu: komory obrazowania IBIDI są przyklejone taśmą wzdłuż studzienek perfuzyjnych (oznaczonych strzałką); druga (biała) warstwa podkładu taśmy (pozostawiona na obrazie pokazanym, aby lepiej zorientować użytkowników) jest usuwana, a żywica epoksydowa jest nakładana na krawędź komory perfuzyjnej (strzałka). Uwaga: Aby ułatwić użytkownikom orientację, gdzie umieścić żywicę epoksydową, biały podkład pozostał włączony na tym obrazie. Oczyszczone i pokryte szkiełko nakrywkowe mocuje się do komory obrazowania stroną z powłoką skierowaną do wnętrza studzienki perfuzyjnej. (B) Schemat blokowy ilustrujący etapy kondycjonowania komór obrazowania dla wiązań biotyna-streptawidyna. (C) Przykłady reakcji stosowanych do pozyskiwania filmów TIRF dynamicznych mikrotubul i włókien aktynowych. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2. Sekwencje obrazów rosnących włókien aktynowych i mikrotubul pod nieobecność lub w obecności Tau. Montaż obrazu poklatkowego z testów TIRF zawierających 0,5 μM aktyny (10% Alexa-647-aktyny i 0,09% biotyny-aktyny) i 15 μM wolnej tubuliny (4% znakowanej HiLyte-488) pod nieobecność (A) lub obecności (B) 250 nM Tau. Pokazany jest czas, jaki upłynął od rozpoczęcia reakcji (zmieszania probówki A i probówki B). Podziałka skali, 25 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3. Przykładowe pomiary mikrotubul i dynamiki filamentów aktynowych. (A) Projekcja średniego czasu kanału tubuliny skutecznie wizualizuje całkowite długości mikrotubul dla skanów liniowych używanych do generowania wykresów kimograficznych. Czarne przerywane linie odpowiadają dwóm przykładowym kymogramom dynamicznych mikrotubul pokazanym po prawej stronie. Fazy wzrostu (ciągłe czarne linie) i demontażu (kropkowane różowe linie; dwie oznaczone różowymi strzałkami) mikrotubul są pokazane na każdym kimografie. Podziałka czasowa, 3 min. Podziałka długości, 10 μm. Reakcja zawiera 0,5 μM aktyny (10% znakowana 647) i 15 μM wolnej tubuliny (4% znakowana 488-HiLyte). Pokazany jest tylko kanał tubuliny. (B) Dwa przykładowe montaże zdjęć poklatkowych przedstawiające aktywnie polimeryzujące filamenty pojedynczej aktyny. Współczynniki wydłużenia oblicza się jako nachylenie wykresów długości włókien aktyny w czasie na aktynę mikromolową. W związku z tym do reakcji aktyny 0,5 μM należy zastosować współczynnik korygujący dwa w celu porównania dla szybkości zwykle określanych przy stężeniu aktyny 1 μM. Przykłady z pięciu filamentów są pokazane po prawej stronie. Podziałka liniowa, 10 μm. Reakcja zawiera 0,5 μM aktyny (10% znakowana 647) i 15 μM wolnej tubuliny (4% znakowana 488-HiLyte). Pokazany jest tylko kanał aktyny. (C) Obrazy TIRF dynamicznych mikrotubul (MT) (zielony) i włókien aktynowych (fioletowy) polimeryzujących pod nieobecność (po lewej) lub w obecności 250 nM Tau (w środku). Niebieskie przerywane linie i strzałki oznaczają miejsce, w którym została narysowana linia dla wykresów skanowania linii odpowiadających każdemu warunkowi (poniżej każdego obrazu). Nakładanie się mikrotubul i regionów aktyny (pokazanych na czarno) można ocenić w określonym punkcie czasowym na obszar (po prawej). Podziałka liniowa, 25 μm. Reakcje zawierają 0,5 μM aktyny (10% znaku 647) i 15 μM wolnej tubuliny (4% znakowania 488-HiLyte) z lub bez 250 nM Tau. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zastosowanie mikroskopii fluorescencji całkowitego wewnętrznego odbicia (TIRF) do wizualizacji oczyszczonych białek było owocnym i przekonującym podejściem do analizy unikalnych mechanizmów regulacji cytoszkieletu 5,23,24,25,26,27,35. W porównaniu z tradycyjnymi testami biochemicznymi, reakcje TIRF wymagają bardzo małych objętości (50-100 μl), a ilościowe pomiary dynamiki cytoszkieletu można uzyskać z pojedynczego testu. Większość badań dynamiki cytoszkieletu koncentruje się na pojedynczym układzie polimerowym (tj. Filamentach aktynowych lub mikrotubulach), dlatego szczegółowe pomiary przesłuchów lub pojawiających się zachowań między filamentami aktyny a mikrotubulami, zwykle obserwowanych w komórkach, pozostały nieuchwytne i trudne do podsumowania w probówce. Aby rozwiązać ten problem, w protokole opisano jednowłóknowy system mikroskopowy TIRF, który umożliwia bezpośrednią wizualizację dynamicznych polimerów aktyny i mikrotubul w tej samej reakcji biochemicznej. W związku z tym metoda ta wykracza poza tradycyjne testy, które podsumowują dynamiczne zachowanie samych filamentów aktynowych lub mikrotubul. Technikę tę przeprowadzono również z Tau jako przykładem tego, jak zmienia się kilka właściwości dynamicznych w obecności czynnika sprzęgającego cytoszkieletu. Protokół ten może być stosowany z dodatkowymi białkami, o których wiadomo lub podejrzewa się, że koordynują dynamikę aktyny lub mikrotubul, w tym (ale nie wyłącznie) MACF, GAS, forminy i inne. Wreszcie, podane przykładowe analizy mogą być wykorzystane jako przewodnik do ilościowego określenia danych uzyskanych za pomocą tego protokołu.

"Zobaczyć znaczy uwierzyć" to przekonujący powód, dla którego warto wykonywać testy oparte na mikroskopii. Należy jednak zachować ostrożność przy wykonywaniu i interpretacji eksperymentów mikroskopowych TIRF. Jednym z głównych wyzwań związanych z testami współskładania cytoszkieletu jest to, że wiele powszechnie stosowanych warunków obrazowania nie jest kompatybilnych z każdym polimerem. Mikrotubule i aktyna zazwyczaj mają różne wymagania dotyczące bufora, temperatury, soli, nukleotydów i stężenia do polimeryzacji. Aktyna, tubulina, białka regulatorowe będące przedmiotem zainteresowania i wykorzystywane w tym protokole są wrażliwe na cykle zamrażania i rozmrażania. Dlatego ostrożne obchodzenie się z białkami i jest konieczne, aby pomyślnie wykonać ten protokół. Aby złagodzić wiele z tych problemów, zdecydowanie zaleca się stosowanie świeżo przetworzonej tubuliny (zamrożonej na <6 tygodnia) oraz wstępne usuwanie zamrożonych/ponownie zawieszonych aktyn za pomocą ultrawirowania. Rozważania te odnoszą się również do niezliczonych białek regulatorowych, które mają być oceniane za pomocą tej procedury, a które mogą być wrażliwe na cykle zamrażania i rozmrażania lub stężenie soli buforowych 5,11,36.

Niestety, nie ma jednego uniwersalnego bufora bez eksperymentalnych kompromisów. Aby zapewnić większą objętość białkom o niższym stężeniu, ATP i GTP mogą być zawarte w 2x roztworze buforowym TIRF (ryc. 1C). Ponieważ jednak nukleotydy te są niezwykle wrażliwe na cykle zamrażania i rozmrażania, nie jest to zalecane. Zastosowane tutaj związki wychwytujące tlen (tj. Katalaza i oksydaza glukozowa) są niezbędne do wizualizacji białek przez długi czas (od minut do godzin), ale wiadomo, że ograniczają polimeryzację mikrotubul przy wysokich stężeniach5. W związku z tymi rozważaniami dotyczącymi bufora, ograniczeniem tego protokołu jest to, że niektóre kanoniczne białka regulatorowe związane z mikrotubulami mogą wymagać mniej lub więcej soli do podsumowania funkcji znalezionych w komórkach lub testów przy użyciu samych mikrotubul (bez aktyny). Zmiana charakteru lub stężenia soli w celu rozwiązania tych problemów prawdopodobnie wpłynie na szybkość polimeryzacji włókien aktynowych i/lub parametry dynamiki mikrotubul. Pomiary wielu parametrów opisowych (minimalnie, zarodkowanie, szybkość wydłużania i stabilność) (ryc. 3) są wymagane w celu potwierdzenia sukcesu protokołu lub jawnego udokumentowania wpływu określonych lub białek regulatorowych. Na przykład zbyt duża polimeryzacja filamentu aktynowego może w ciągu kilku sekund przesłonić zdarzenia sprzężenia aktyny-mikrotubul. W związku z tym dostrojenie warunków eksperymentalnych poprzez obniżenie ogólnego stężenia aktyny lub włączenie dodatkowych białek w celu zahamowania zarodkowania aktyny (tj. profiliny) wydłuży ogólny okres, w którym można wyraźnie zobaczyć skoordynowane działania aktyny-mikrotubul. Kontrolki spełniające te wymagania wstępne i repliki techniczne (poza wieloma polami widzenia) mają kluczowe znaczenie dla użytkowników w celu generowania wiarygodnych i odtwarzalnych wyników.

Badania komórkowe dają ograniczoną możliwość obserwacji bezpośrednich zależności białko-białko lub działania kompleksów regulatorowych. W przeciwieństwie do tego, niektóre mechanizmy uzyskane z testów in vitro nie zawsze odzwierciedlają dokładne zachowania białek obserwowanych w komórkach. Ten klasyczny dylemat biochemika może zostać rozwiązany w przyszłych zastosowaniach tej techniki z określonymi modyfikacjami. Na przykład dodanie funkcjonalnych białek sprzęgających znakowanych fluorescencyjnie rozszerza tę metodę z badań pojedynczych włókien do badań pojedynczych cząsteczek. Testy mogą być dalej modyfikowane w celu wykorzystania ekstraktów komórkowych, które mogą dodać "brakujące" nieznane kluczowe czynniki wymagane do podsumowania zjawisk podobnych do komórek. Na przykład testy oparte na TIRF z wykorzystaniem ekstraktów drożdżowych lub Xenopus odtworzyły kurczliwe pierścienie aktomiozyny37, wrzeciona mitotyczne26,38, składniki aktyny lub zespołu mikrotubul39,40, a nawet dynamikę w centrosomie i kinetochorach 36,41,42,43. Co więcej, takie systemy mogą utorować drogę do sztucznych systemów komórkowych, w których obecne są lipidy lub czynniki sygnałowe 44,45,46.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie ma żadnych konfliktów interesów, które można by ujawnić.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jestem wdzięczny Marcowi Ridilli (Repair Biotechnologies) i Brianowi Haarerowi (SUNY Upstate) za pomocne komentarze na temat tego protokołu. Prace te były wspierane przez Narodowe Instytuty Zdrowia (GM133485).

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1% BSA (w/v)Fisher ScientificBP1600-100W tym celu (blokowanie komór TIRF), BSA jest ponownie zawieszany w ddH20 i filtrowany przez 0,22 &mikro; m filtr.
1 i razy; BRB80Domowerury 80 mM, 1 mM MgCl2, 1 mM EGTA, pH 6,8 z KOH
10 mg/mL (1000 U) oksydaza glukozowaSigma Aldrich Inc, St. Louis, MOG2133-50KUW połączeniu z katalazą, porcją i przechowywać w temperaturze -80 oC do użycia
100 &mikro; M tubulinaCytoskeleton Inc, Denver, COT240Domowe tubuliny powinny być poddane recyklingowi przed użyciem w celu usunięcia tubuliny niekompetentnej do polimeryzacji (Hyman i in. (1992)29; Li i Moore (2020)30). Dostępne na rynku tubuliny są często zbyt rozcieńczone, aby można je było poddać recyklingowi, ale działają dobrze, jeśli są ponownie zawieszone zgodnie z zaleceniami producenta s instrukcje i wstępnie oczyszczone przez ultrawirowanie (278 000 &razy; g) przez 60 minut, przed użyciem.
100 mM ATPGold Biotechnology Inc, Olivette, MOA-081Zawieszony w ddH20 (pH 7,5) i wysterylizowany filtrem.
100 mM GTPFisher Scientific AC226250010ponownie zawieszony w 1 i razy; BRB80 (pH 6,8) i sterylizowany filtrem.
Lasery na ciele stałym 120-150 mWLeica Microsystems11889151; 11889148
2 mg/mL katalazaSigma Aldrich Inc, St. Louis, MOC40-100W połączeniu z oksydazą glukozową, podwielokrotność i przechowywać w temperaturze -80 oC do użycia
2 razy; Bufor TIRFDomowej roboty2 razy; BRB80, 100 mM KCl, 20 mM DTT, 80 mM glukozy, 0,5% (v/v) metylocelulozy (4,000 cp); Uwaga: 1 &mikro; L 0,1 mln GTP i 1 &mikro; L 0,1 M ATP dodawany oddzielnie do reakcji TIRF, aby uniknąć powtarzających się cykli zamrażania i rozmrażania.
24 &razy; 60 mm, #1.5 szkło nakrywkoweFisher Scientific, Waltham, MA22-266882Szkło nakrywkowe należy dokładnie umyć przed użyciem (Smith i in. (2014)22)
37 oC blok
37 oC łaźnia
5 mg/ml Streptawidyny (600x stock)Avantor, Filadelfia, PARLS000-01Zawieszony w Tris-HCl (pH 8,8); rozcieńczyć podwielokrotność do 1&razy; w buforze HEK w dniu użycia
5 min Żywica epoksydowa i utwardzaczLoctite, Rocky Hill, CT1365736Połączenie żywicy i utwardzacza może trwać do 30 minut.
50% biotynylowane-GpCpp nasiona mikrotubulCytoskeleton Inc; Domowestabilizowane T333P(opcjonalnie) GppCpp lub Taxol mogą bardziej efektywnie pośredniczyć w polimeryzacji mikrotubul. Taksol i GppCpp stabilizują mikrotubule na różne sposoby, które mogą wpływać na strukturę siatki mikrotubul i zdolność niektórych białek regulatorowych do wiązania się ze stabilizowaną częścią mikrotubul. Metoda wytwarzania różnych rodzajów nasion mikrotubul została opisana w Hyman et al. (1992).
70 oC inkubator
Mieszanka aktynowaDomowej roboty; ten protokółA 12,5 i mikro; Mieszanina aktyn M składająca się ze znakowanej (fluorescencyjnej i biotynylowanej) i nieznakowanej aktyny dla maksymalnie sześciu reakcji. 2 i mikro; L zapasu jest używany w końcowej reakcji TIRF. Końcowe stężenie aktyny użytej w każdej reakcji wynosi 0,5 &mikro; M (10% Alexa-647; 0,09% znakowane biotyną).
Odpowiednie kontrole buforoweDomowej robotyKombinacja ze wszystkich ocenianych białek
Biotyna-PEG-silan (MW 3,400)Laysan Bio Incbiotyna-PEG-SIL-3400Dozowanie do podwielokrotności 2-5 mg, wypełnienie azotem, parafilmowanie zamknięte i przechowywane w temperaturze -20 oC ze środkiem osuszającym do czasu użycia
Biotynylowanyaktyna Cytoskeleton Inc; DomowaAB07Biotyna-aktyna jest wytwarzana przez znakowanie na resztach lizyny, a zatem zakłada się, że jest co najmniej w 100% znakowana, ale różni się w zależności od różnych partii/preparatów. Optymalne stężenia biotynylowanych aktyn muszą być empirycznie określone dla poszczególnych zastosowań/projektów eksperymentalnych. Wyższe stężenia pozwalają na bardziej efektywne śledzenie, ale mogą utrudniać polimeryzację lub interakcje z białkami regulatorowymi. W tym przypadku niewielki procent (0,09% lub 900 pM) biotynylowanej aktyny jest obecny w końcowej reakcji TIRF.
Mydło do naczyńDawn, Procter and Gamble, Cincinnati, OHZ nieznanych przyczyn niebieska wersja czyści szkiełka nakrywkowe skuteczniej niż inne dostępne kolory.
do suchego lodu
www.https://imagej.net/software/fiji/downloadsSchneider i in. (2012)31.
Znakowany fluorescencyjnie aktynowycytoszkielet Inc; DomowaAR05Domowa aktyna znakowana fluorescencyjnie jest przechowywana w buforze G uzupełnionym 50% glicerolem w temperaturze -20 oC (Spudich i in. (1971)47; Liu i in. (2022)48). Znakowana fluorescencyjnie aktyna jest dializowana z buforem G i wstępnie oczyszczana przez ultrawirowanie przez 60 minut w 278 000 &; g przed użyciem.
Fluorescencyjnie znakowany cytoszkielet tubulinowyIncTL488M, TLA590M, TL670Mzawieszony w 20 i mikro; L 1 i razy; BRB80 (10 i mikro; M końcowe stężenie) i wstępnie oczyszczone przez ultrawirowanie (278 000 i razy; g) przez 60 minut, przed użyciem.
G-bufferDomowy3 mM Tris-HCl (pH 8,0), 0,2 mM CaCl2, 0,5 mM DTT, 0,2 mM ATP
HEK BuforDomowy20 mM HEPES (pH 7,5), 1 mM EDTA (pH 8,0), 50 mM KCl
Lód
Wiadro
Komory obrazowaniaIBIDI, Fitchburg, WI80666Zamów komory bez dna, aby wykorzystać różne powłoki szkieł nakrywkowych
Kamera iXon Life 897 EMCCDAndor, Belfast, Irlandia Północna8114137
Oprogramowanie mikroskopowe LASX PremiumLeica Microsystems11640611
Metyloceluloza (4,000 cp)Sigma Aldrich IncM0512
Podstawa mikroskopu wyposażona w moduł TIRFLeica Microsystems, Wetzlar, Niemcy
mPEG-silan (MW 2,000)Laysan Bio Inc, Arab, ALmPEG-SIL-2000Dozowany do podwielokrotności 10-15 mg, wypełniony azotem, sparafilmowany zamknięty i przechowywany w temperaturze -20 oC ze środkiem osuszającym do czasu użycia
Podgrzewacz obiektywu i podgrzewana wkładka scenicznaOKO labs, Pozzioli, Włochy8113569Ustaw regulator temperatury na 35-37 oC. Skorzystaj z sugestii producenta, aby uzyskać dokładną kalibrację.
Pompa perfuzyjnaHarvard Apparatus, Holliston, MA704504Można zastąpić strzykawkę i rurkę.
Szalka Petriego, 100 x 15 mmGenesee Scientific, San Diego, CA32-107
Plastikowy pojemnik na koperty przesuwneFisher ScientificHS15986
SA-S-1L-SecureSeal o grubości 0,12 mmGrace Biolabs, Bend, OR620001Zdecydowanie zaleca się dwustronną taśmę o precyzyjnych wymiarach.
Mały pojemnik styropianowyAbcam, Cambridge, Wielka BrytaniaPonownie wykorzystany z wysyłki
Mała łódź wagowaFisher Scientific02-202-100
Spektrofotometr
TauCytoszkielet IncTA01W dostępnym na rynku preparacie Tau obecne są trzy izoformy Tau. Stężenie w tym protokole oznaczono z najwyższego pasma masy cząsteczkowej (14,3 &mikro; M, po ponownym zawieszeniu zgodnie z zaleceniami producenta s rekomendacje z 50 &mikro; L z ddH20).
Temperatura skorygowana 63 razy; Plan Apo 1.47 N.A. Zanurzeniowy obiektyw TIRFLeica Microsystems11506319
Tubulinadomowej roboty; ten protokółZapas tubuliny składający się z 7,2 i mikro; L z recyklingu 100 &mikro; M nieznakowana tubulina i 3 &mikro; L z 10 i mikro; M ponownie zawieszona w handlu tubulina znakowana fluorescencyjnie. Na każdą reakcję stosuje się jeden bulion tubulinowy, który rozmraża się/przechowuje na lodzie. Końcowe stężenie wolnej tubuliny w każdej reakcji wynosi 15 &mikro; M (4% oznakowane). Więcej niż 15 &mikro; M tubulina będzie skutkowała hiperstabilizacją (nie dynamicznymi) mikrotubulami, podczas gdy stężenia poniżej 7,5 & mikro; Tubulina wolna M nie polimeryzuje dobrze. Wymagane jest staranne określenie stężenia białka i obchodzenia się z nim.
Nieznakowana aktyna (ciemna)Cytoskeleton Inc; DomoweAKL99są prawie zawsze obecne w dostępnych na rynku (liofilizowanych) lub mrożonych aktynach i przyczyniają się do zmienności pomiarów ilościowych (Spudich i in. (1971)47; Liu i in. (2022)48). Aktyna z mięśni królika jest przechowywana w buforze G w temperaturze -80 oC i wstępnie oczyszczana przez ultrawirowanie przez 60 minut w temperaturze 278 000 i razy; g przed użyciem. W ciągu dnia przygotowuje się kilka roztworów podstawowych aktyny (co nie wystarcza na sześć reakcji jednocześnie  jest zdecydowanie zalecane).
grzewczywodna nasiona mikrotubul Oprogramowanie FIJI na lód11889146 jądra aktyny

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pimm, M. L., Henty-Ridilla, J. L. New twists in actin-microtubule interactions. Molecular Biology of the Cell. 32 (3), 211-217 (2021).
  2. Dogterom, M., Koenderink, G. H. Actin-microtubule crosstalk in cell biology. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 20 (1), 38-54 (2019).
  3. Etienne-Manneville, S. Actin and microtubules in cell motility: which one is in control. Traffic. 5 (7), 470-477 (2004).
  4. Rodriguez, O. C., et al. Conserved microtubule-actin interactions in cell movement and morphogenesis. Nature Cell Biology. 5 (7), 599-609 (2003).
  5. Prezel, E., et al. TIRF assays for real-time observation of microtubules and actin coassembly: Deciphering tau effects on microtubule/actin interplay. Methods in Cell Biology. 141, 199-214 (2017).
  6. Griffith, L. M., Pollard, T. D. The interaction of actin filaments with microtubules and microtubule-associated proteins. The Journal of Biological Chemistry. 257 (15), 9143-9151 (1982).
  7. Henty-Ridilla, J. L., Rankova, A., Eskin, J. A., Kenny, K., Goode, B. L. Accelerated actin filament polymerization from microtubule plus ends. Science. 352 (6288), 1004(2016).
  8. Elie, A., et al. Tau co-organizes dynamic microtubule and actin networks. Scientific Reports. 5 (1), 1-10 (2015).
  9. Preciado López, M., et al. Actin-microtubule coordination at growing microtubule ends. Nature Communications. 5 (1), 1-9 (2014).
  10. Oberhofer, A., et al. Molecular underpinnings of cytoskeletal cross-talk. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (8), 3944-3952 (2020).
  11. Nakos, K., et al. Septins mediate a microtubule-actin crosstalk that enables actin growth on microtubules. bioRxiv. , (2022).
  12. Kučera, O., Gaillard, J., Guérin, C., Théry, M., Blanchoin, L. Actin-microtubule dynamic composite forms responsive active matter with memory. bioRxiv. , (2022).
  13. Kundu, T., Dutta, P., Nagar, D., Maiti, S., Ghose, A. Coupling of dynamic microtubules to F-actin by Fmn2 regulates chemotaxis of neuronal growth cones. Journal of Cell Science. 134 (13), 252916(2021).
  14. Roth-Johnson, E. A., Vizcarra, C. L., Bois, J. S., Quinlan, M. E. Interaction between microtubules and the Drosophila formin Cappuccino and its effect on actin assembly. The Journal of Biological Chemistry. 289 (7), 4395-4404 (2014).
  15. Gaillard, J., et al. Differential interactions of the formins INF2, mDia1, and mDia2 with microtubules. Molecular Biology of the Cell. 22 (23), 4575-4587 (2011).
  16. Bartolini, F., et al. The formin mDia2 stabilizes microtubules independently of its actin nucleation activity. The Journal of Cell Biology. 181 (3), 523-536 (2008).
  17. Sider, J. R., et al. Direct observation of microtubule-F-actin interaction in cell free lysates. Journal of Cell Science. 112 (12), 1947-1956 (1999).
  18. Alkemade, C., et al. Cross-linkers at growing microtubule ends generate forces that drive actin transport. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 119 (11), 2112799119(2022).
  19. Axelrod, D. Total internal reflection fluorescence microscopy in cell biology. Methods in Enzymology. 361, 1-33 (2003).
  20. Amann, K. J., Pollard, T. D. Direct real-time observation of actin filament branching mediated by Arp2/3 complex using total internal reflection fluorescence microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (26), 15009-15013 (2001).
  21. Al-Bassam, J. Reconstituting dynamic microtubule polymerization regulation by TOG domain proteins. Methods in Enzymology. 540, 131-148 (2014).
  22. Smith, B. A., Gelles, J., Goode, B. L. Single-molecule studies of actin assembly and disassembly factors. Methods in Enzymology. 540, 95-117 (2014).
  23. Wioland, H., Jégou, A., Romet-Lemonne, G. Celebrating 20 years of live single-actin-filament studies with five golden rules. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 119 (3), 2109506119(2022).
  24. Ganzinger, K. A., Schwille, P. More from less - bottom-up reconstitution of cell biology. Journal of Cell Science. 132 (4), (2019).
  25. Mahamdeh, M., Howard, J. Implementation of interference reflection microscopy for label-free, high-speed imaging of microtubules. Journal of Visualized Experiments. (150), e59520(2019).
  26. King, M. R., Petry, S. Phase separation of TPX2 enhances and spatially coordinates microtubule nucleation. Nature Communications. 11 (1), 270(2020).
  27. Ramirez-Rios, S., et al. A TIRF microscopy assay to decode how tau regulates EB's tracking at microtubule ends. Methods in Cell Biology. 141, 179-197 (2017).
  28. Smith, B. A., et al. Three-color single molecule imaging shows WASP detachment from Arp2/3 complex triggers actin filament branch formation. eLife. 2, 01008(2013).
  29. Hyman, A. A., Salser, S., Drechsel, D. N., Unwin, N., Mitchison, T. J. Role of GTP hydrolysis in microtubule dynamics: information from a slowly hydrolyzable analogue GMPCPP. Molecular Biology of the Cell. 3 (10), 1155-1167 (1992).
  30. Li, G., Moore, J. K. Microtubule dynamics at low temperature: evidence that tubulin recycling limits assembly. Molecular Biology of the Cell. 31 (11), 1154-1166 (2020).
  31. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  32. Pollard, T. D., Blanchoin, L., Mullins, R. D. Molecular mechanisms controlling actin filament dynamics in nonmuscle cells. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 29, 545-576 (2000).
  33. Kapoor, V., Hirst, W. G., Hentschel, C., Preibisch, S., Reber, S. MTrack: Automated detection, tracking, and analysis of dynamic microtubules. Scientific Reports. 9 (1), 3794(2019).
  34. Willige, D., et al. Cytolinker Gas2L1 regulates axon morphology through microtubule-modulated actin stabilization. EMBO reports. 20 (11), (2019).
  35. Hirst, W. G., Kiefer, C., Abdosamadi, M. K., Schäffer, E., Reber, S. In vitro reconstitution and imaging of microtubule dynamics by fluorescence and label-free microscopy. STAR Protocols. 1 (3), 100177(2020).
  36. Farina, F., et al. The centrosome is an actin-organizing centre. Nature Cell Biology. 18 (1), 65-75 (2016).
  37. Mishra, M., et al. In vitro contraction of cytokinetic ring depends on myosin II but not on actin dynamics. Nature Cell Biology. 15 (7), 853-859 (2013).
  38. Groen, A. C., Ngyuen, P. A., Field, C. M., Ishihara, K., Mitchison, T. J. Glycogen-supplemented mitotic cytosol for analyzing Xenopus egg microtubule organization. Methods in Enzymology. 540, 417-433 (2014).
  39. Pollard, L. W., Garabedian, M. V., Alioto, S. L., Shekhar, S., Goode, B. L. Genetically inspired in vitro reconstitution of Saccharomyces cerevisiae actin cables from seven purified proteins. Molecular Biology of the Cell. 31 (5), 335-347 (2020).
  40. Bergman, Z. J., Wong, J., Drubin, D. G., Barnes, G. Microtubule dynamics regulation reconstituted in budding yeast lysates. Journal of Cell Science. 132 (4), 219386(2018).
  41. Inoue, D., et al. Actin filaments regulate microtubule growth at the centrosome. The EMBO Journal. 38 (11), (2019).
  42. Colin, A., Singaravelu, P., Théry, M., Blanchoin, L., Gueroui, Z. Actin-network architecture regulates microtubule dynamics. Current Biology. 28 (16), 2647-2656 (2018).
  43. Torvi, J. R., et al. Reconstitution of kinetochore and microtubule dynamics reveals a role for a kinesin-8 in establishing end-on attachments. bioRxiv. , (2022).
  44. Nguyen, P. A., et al. Spatial organization of cytokinesis signaling reconstituted in a cell-free system. Science. 346 (6206), 244-247 (2014).
  45. Abu Shah, E., Keren, K. Symmetry breaking in reconstituted actin cortices. eLife. 3, 01433(2014).
  46. Vendel, K. J. A., Alkemade, C., Andrea, N., Koenderink, G. H., Dogterom, M. In vitro reconstitution of dynamic co-organization of microtubules and actin filaments in emulsion droplets. Cytoskeleton Dynamics. 2101, 53-75 (2020).
  47. Spudich, J. A., Watt, S. The regulation of rabbit skeletal muscle contraction. Biochemical studies of the interaction of the tropomyosin-troponin complex with actin and the proteolytic fragments of myosin. The Journal of Biological Chemistry. 246 (15), 4866-4871 (1971).
  48. Liu, X., Pimm, M. L., Haarer, B., Brawner, A. T., Henty-Ridilla, J. L. Biochemical characterization of actin assembly mechanisms with ALS-associated profilin variants. European Journal of Cell Biology. 101 (2), 151212(2022).
  49. Pimm, M. L., Liu, X., Tuli, F., Lojko, A., Henty-Ridilla, J. L. Visualizing functional human profilin in cells and in vitro applications. bioRxiv. , (2021).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Actin Microtubule DynamicsTIRF MicroscopyCytoskeletal CrosstalkIn Vitro ReconstitutionActin Filament PolymerizationMicrotubule AssemblyCytoskeletal Regulatory ProteinsTau ProteinPerfusion ChamberKymograph Analysis

Related Articles