Artykuł metodologiczny

Wizualizacja dynamiki sprzężeń aktyny i mikrotubul in vitro za pomocą mikroskopii fluorescencji całkowitego wewnętrznego odbicia (TIRF)

6.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/64074

⸱

20 lipca 2022

1Department of Biochemistry & Molecular Biology, and Department of Neuroscience & Physiology, State University of New York (SUNY) Upstate Medical University

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół jest przewodnikiem do wizualizacji dynamicznych aktyny i mikrotubul za pomocą testu in vitro total internal fluorescence (TIRF)

mikroskopowego.

Streszczenie

Tradycyjnie, cytoszkielety aktyny i mikrotubul były badane jako oddzielne jednostki, ograniczone do określonych regionów lub procesów komórkowych i regulowane przez różne zestawy białek wiążących, unikalne dla każdego polimeru. Wiele badań pokazuje obecnie, że dynamika obu polimerów cytoszkieletu jest ze sobą spleciona i że ten przesłuch jest wymagany dla większości zachowań komórkowych. Zidentyfikowano już szereg białek biorących udział w interakcjach aktyna-mikrotubule (tj. Tau, MACF, GAS, forminy i inne) i są one dobrze scharakteryzowane w odniesieniu do samej aktyny lub mikrotubul. Jednak stosunkowo niewiele badań wykazało testy koordynacji aktyna-mikrotubula z dynamicznymi wersjami obu polimerów. Może to zasłaniać pojawiające się mechanizmy łączące aktynę z mikrotubulami. W tym przypadku technika rekonstytucji in vitro oparta na mikroskopii całkowitego wewnętrznego odbicia (TIRF) pozwala na wizualizację dynamiki zarówno aktyny, jak i mikrotubul z jednej reakcji biochemicznej. Technika ta zachowuje dynamikę polimeryzacji filamentu aktynowego lub mikrotubul pojedynczo lub w obecności drugiego polimeru. Dostępne na rynku białko Tau służy do pokazania, jak zmieniają się zachowania aktyny-mikrotubul w obecności klasycznego białka sieciującego cytoszkielet. Metoda ta może dostarczyć wiarygodnych funkcjonalnych i mechanistycznych informacji na temat tego, w jaki sposób poszczególne białka regulatorowe koordynują dynamikę aktyny-mikrotubul z rozdzielczością pojedynczych włókien lub kompleksów wyższego rzędu.

Wprowadzenie

Historycznie rzecz biorąc, aktyna i mikrotubule były postrzegane jako odrębne jednostki, każda z własnym zestawem białek regulatorowych, dynamicznymi zachowaniami i odrębnymi lokalizacjami komórkowymi. Liczne dowody wskazują na to, że polimery aktyny i mikrotubul angażują się w funkcjonalne mechanizmy przesłuchów, które są niezbędne do przeprowadzenia wielu procesów komórkowych, w tym migracji, pozycjonowania wrzeciona mitotycznego, transportu wewnątrzkomórkowego i morfologii komórek1,2,3,4. Różnorodne skoordynowane zachowania, które leżą u podstaw tych przykładów, zależą od skomplikowanej równowagi czynników sprzęgających, sygnałów i właściwości fizycznych. Jednak szczegóły molekularne, które leżą u podstaw tych mechanizmów, są nadal w dużej mierze nieznane, ponieważ większość badań koncentruje się na pojedynczym polimerze cytoszkieletu na raz1,2,5.

aktyna i mikrotubule nie oddziałują bezpośrednio6,7,8. Skoordynowana dynamika aktyny i mikrotubul obserwowana w komórkach jest pośredniczona przez dodatkowe czynniki. Zidentyfikowano wiele białek, o których uważa się, że regulują przesłuchy aktyna-mikrotubule, a ich aktywność jest dobrze scharakteryzowana w odniesieniu do samego polimeru cytoszkieletu1,2. Coraz więcej dowodów sugeruje, że to podejście oparte na pojedynczym polimerze ukryło podwójne funkcje niektórych białek/kompleksów, które umożliwiają sprzężenie aktyna-mikrotubula7,8,9,10,11,12,13. Eksperymenty, w których oba polimery są obecne, są rzadkie i często definiują mechanizmy z pojedynczym dynamicznym polimerem i stabilizowaną statycznie wersją drugiego6,8,9,10,11,14,15,16,17,18. W związku z tym potrzebne są metody do badania pojawiających się właściwości białek koordynujących aktynę i mikrotubule, które mogą być w pełni zrozumiane tylko w systemach eksperymentalnych wykorzystujących oba dynamiczne polimery.

Kombinacja metod bezpośredniego znakowania białek, genetycznie kodowanych znaczników powinowactwa i mikroskopii całkowitej fluorescencji wewnętrznego odbicia (TIRF) została zastosowana z dużym powodzeniem w systemach rekonstytucji biomimetycznej19,20,21,22,23. Wiele schematów oddolnych nie zawiera wszystkich czynników regulujących białka w komórkach. Jednak technologia "biochemii na szkle nakrywkowym" udoskonaliła wiele mechanizmów dynamiki aktyny i mikrotubul w wysokich skalach przestrzennych i czasowych, w tym składniki wymagane do montażu lub demontażu polimeru oraz ruch białek motorycznych5,12,23,24,25,26,27. W tym miejscu opisano podejście oparte na pojedynczym włóknie minimalnym składniku do badania sprzężenia aktyna-mikrotubula in vitro. Protokół ten może być stosowany z dostępnymi na rynku lub wysoce czystymi oczyszczonymi białkami, białkami znakowanymi fluorescencyjnie, komorami perfuzyjnymi i rozszerzony na bardziej skomplikowane schematy zawierające ekstrakty komórkowe lub systemy syntetyczne. W tym przypadku dostępne na rynku białko Tau jest wykorzystywane do pokazania, jak zmienia się dynamika cytoszkieletu w obecności białka sprzęgającego aktyna-mikrotubula, ale można je zastąpić innymi przypuszczalnymi czynnikami koordynującymi aktynę-mikrotubule. Główną przewagą tego systemu nad innymi podejściami jest możliwość jednoczesnego monitorowania dynamiki wielu polimerów cytoszkieletu w jednej reakcji. Protokół ten zapewnia również użytkownikom przykłady i proste narzędzia do ilościowego określania zmian w polimerach cytoszkieletu. W ten sposób użytkownicy protokołu będą generować wiarygodne, ilościowe dane o rozdzielczości pojedynczego włókna, aby opisać mechanizmy leżące u podstaw tego, jak różne białka regulatorowe koordynują dynamikę aktyny i mikrotubul.

Protokół

1. Mycie szkiełek nakrywkowych

UWAGA: Przemyć szkiełka nakrywki (24 mm x 60 mm, #1.5) zgodnie z opisem Smith i wsp., 201328.

  1. Umieścić szkiełka nakrywkowe w plastikowym pojemniku do transportu preparatów.
  2. Zanurzać szkiełka nakrywkowe sekwencyjnie w następujących roztworach i poddać sonikacji przez 30-60 min, płucząc 10 razy w ddH2O pomiędzy każdym roztworem: ddH2O z jedną kroplą płynu do mycia naczyń; 0.1 M KOH. Przechowywać szkiełka nakrywkowe w 100% etanolu do 6 miesięcy.
    UWAGA: Nie dotykać szklanych powierzchni nieosłoniętymi palcami. Należy używać pęsety.

2. Powlekanie oczyszczonych szkiełek cover-slip (24 mm x 60 mm, #1.5) silanem mPEG oraz biotiną-PEG-silanem

UWAGA: W niniejszym protokole wykorzystano system biotyna-streptawidyna do pozycjonowania aktyny i mikrotubul w płaszczyźnie obrazowania TIRF. Można zastosować inne powłoki i systemy (np. przeciwciała, poli-L-lizynę, miozynę NEM itp.).

  1. Odmrozić alikwoty proszków PEG-silane oraz biotin-PEG-silane.
  2. Bezpośrednio przed użyciem rozpuścić proszki PEG w 80% etanolu (pH 2,0), aby przygotować roztwory zapasowe do powlekania o stężeniu 10 mg/mL mPEG-silane oraz 2-4 mg/mL biotin-PEG-silane.
    UWAGA: Proszki PEG często wydają się rozpuszczone, lecz w skali mikroskopowej może być inaczej. Prawidłowe resuspensowanie trwa ok. 1-2 min przy ciągłym pipetowaniu. Zaleca się dodatkowe 10-krotne pipetowanie po zauważeniu rozpuszczenia proszku.
    OSTROŻNIE: Podczas przygotowywania 80% etanolu (pH 2,0) należy używać rękawic, aby chronić skórę przed stężonym HCl.
  3. Za pomocą pęsety wyjąć czystą szkiełko zakrywkowe (24 mm x 60 mm, #1.5) z przechowywanego etanolu. Osuszyć strumieniem azotu i umieścić w czystej szalce Petriego.
  4. Powlec szkiełka zakrywkowe 100 µL roztworu do powlekania: mieszaniny 2 mg/mL mPEG-silane (MW 2,000) oraz 0,04 mg/mL biotin-PEG-silane (MW 3,400) w 80% etanolu (pH 2,0).
    UWAGA: W przypadku powlekania rzadkiego (zalecane) należy użyć 2 mg/mL mPEG-silane i 0,04 mg/mL biotin-PEG-silane. W przypadku powlekania gęstego należy użyć 2 mg/mL mPEG-silane oraz 4 mg/mL biotin-PEG-silane.
  5. Inkubować szkiełka zakrywkowe w temperaturze 70 °C przez co najmniej 18 h lub do momentu użycia.
    UWAGA: Powleczone szkiełka zakrywkowe ulegają degradacji, jeśli są przechowywane w 70 °C przez więcej niż 2 tygodnie.

3. Montaż komór przepływowych do obrazowania

  1. Odetnij 12 pasków dwustronnej taśmy o długości 24 mm. Usuń zabezpieczenie z jednej strony taśmy i przytwierdź kawałki taśmy obok sześciu rowków znajdujących się w czystej komorze obrazowania.
    UWAGA: Taśma musi być płasko przyklejona dla prawidłowego montażu, w przeciwnym razie komory obrazowania będą przeciekać. Należy ostrożnie usuwać zabezpieczenie taśmy, aby uniknąć powstania wybrzuszeń. Zaleca się przesunięcie oklejonych komór po czystej powierzchni w celu wygładzenia styków taśmy z komorą.
  2. Usuń drugie zabezpieczenie taśmy, aby odsłonić jej klejącą stronę wzdłuż każdego rowka komory. Połóż komorę stroną z taśmą do góry na czystej powierzchni.
  3. Wymieszaj żywicę epoksydową i utwardzacz w stosunku 1:1 (lub zgodnie z instrukcją producenta) w małej łódzce ważnej.
  4. Używając końcówki do pipety P1000, nanieś kroplę zmieszanej żywicy epoksydowej pomiędzy paskami taśmy na końcu każdego rowka komory obrazowania (czerwona strzałka; Rycina 1A). Połóż komorę stroną z taśmą i żywicą epoksydową do góry na czystej powierzchni.
  5. Wyjmij powleczone szkiełko nakrywkowe z inkubatora w temperaturze 70 °C. Przepłucz powleczone i niepowleczone powierzchnie szkiełek nakrywkowych wodą ddH2O sześć razy, osusz przefiltrowanym azotem, a następnie przymocuj do komory obrazowania stroną powleczoną w stronę taśmy.
  6. Używając końcówki do pipety P200 lub P1000, wywrzyj nacisk na styk taśmy ze szkłem, aby zapewnić szczelne połączenie między taśmą a szkiełkiem nakrywkowym.
    UWAGA: Przy prawidłowym uszczelnieniu taśma dwustronna staje się półprzezroczysta. Komory obrazowania z niewystarczającym kontaktem taśmy z komorą będą przeciekać.
  7. Inkubuj zmontowane komory w temperaturze pokojowej przez co najmniej 5-10 min, aby żywica epoksydowa w pełni uszczelniła wgłębienia komory przed użyciem. Komory perfuzyjne tracą ważność w ciągu 12-18 h od montażu.
    UWAGA: W zależności od rozmieszczenia taśmy i grubości użytej taśmy dwustronnej, zmontowana komora będzie miała objętość końcową 20-50 µL.

4. Kondycjonowanie komór perfuzyjnych

  1. Użyć pompy perfuzyjnej (przepływ ustawiony na 500 µL/min), aby sekwencyjnie wymieniać roztwory kondycjonujące w komorze perfuzyjnej w następujący sposób:
    1. Przepuścić 50 µL 1% BSA w celu przygotowania komory obrazowania. Usunąć nadmiar buforu z rezerwuaru złącza Luer lock.
    2. Przepuścić 50 µL streptawidyny o stężeniu 0,005 mg/mL. Inkubować przez 1-2 min w temperaturze pokojowej. Usunąć nadmiar buforu z rezerwuaru.
    3. Przepuścić 50 µL 1% BSA w celu zablokowania nieswoistego wiązania. Inkubować przez 10-30 s. Usunąć nadmiar buforu z rezerwuaru.
    4. Przepuścić 50 µL ciepłego (37 °C) 1x buforu TIRF (1x BRB80, 50 mM KCl, 10 mM DTT, 40 mM glukozy, 0,25% (v/v) metylocelulozy (4,000 cp)).
      UWAGA: Nie usuwać nadmiaru buforu z rezerwuaru. Zapobiega to wyschnięciu komory, co mogłoby wprowadzić pęcherzyki powietrza do układu.
    5. Opcjonalnie: Przepuścić 50 µL stabilizowanych29 i 50% biotynilowanych zarodków mikrotubul rozcieńczonych w 1x buforze TIRF.
      UWAGA: Odpowiednie rozcieńczenie musi zostać określone empirycznie i może wykazywać zmienność między partiami. Jako punkty wyjścia zaleca się protokoły z27,29. Rozcieńczenie dające 10-30 zarodków na pole widzenia sprawdza się dobrze w tej konfiguracji.

5. Przygotowanie mikroskopu

UWAGA: Reakcje biochemiczne z udziałem dynamicznych filamentów aktynowych i mikrotubul są wizualizowane/przeprowadzane przy użyciu odwróconego mikroskopu TIRF (całkowitego wewnętrznego odbicia fluorescencyjnego) wyposażonego w lasery półprzewodnikowe o mocy 120-150 mW, obiektyw TIRF z imersją olejową 63x z korekcją temperatury oraz kamerę EMCCD. Białka w tym przykładzie są wizualizowane przy następujących długościach fal: 488 nm (mikrotubule) i 647 nm (aktyna).

  1. Ustaw urządzenie grzewcze stolika/obiektywu tak, aby utrzymywało temperaturę 35-37 °C przez co najmniej 30 min przed obrazowaniem pierwszej reakcji biochemicznej.
  2. Ustaw parametry akwizycji obrazu w następujący sposób:
    1. Ustaw interwał akwizycji na co 5 s przez 15-20 min.
    2. Ustaw ekspozycję laserów 488 i 647 na 50-100 ms przy mocy 5%-10%. Ustaw odpowiedni kąt TIRF dla mikroskopu.
      UWAGA: Niezależnie od konfiguracji mikroskopu, najprostszym sposobem ustawienia mocy lasera, ekspozycji i kąta TIRF jest dokonywanie korekt na obrazach pojedynczego polimeru (patrz 5.2.2.1 i 5.2.2.2 poniżej). Użytkownikom zdecydowanie zaleca się stosowanie najniższej mocy lasera i ustawień ekspozycji, które wciąż umożliwiają detekcję.
      1. Dostosuj reakcję polimeryzacji (Rycina 1C), aby zainicjować montaż filamentów aktynowych, i wykonaj akwizycję obrazów przy 647 nm. Wprowadź odpowiednie korekty.
      2. Dostosuj reakcję polimeryzacji w drugiej przygotowanej studni perfuzyjnej, aby zainicjować montaż mikrotubul (Rycina 1C), i wizualizuj przy 488 nm. Wprowadź odpowiednie korekty.

6. Przygotowanie mieszanin reakcyjnych białek

  1. Przygotuj roztwór zapasowy tubuliny znakowanej fluorescencyjnie.
    1. Oznaczenie stężenia domowej, nieznakowanej tubuliny poprzez spektrofotometria przy Abs280w następujący sposób:
      1. Kuweta zerująca spektrofotometru z 1xBRB80 bez dodatku GTP.
      2. Oblicz stężenie tubuliny, korzystając z wyznaczonego współczynnika ekstynkcji wynoszącego 115 000 M⁻¹cm⁻¹-1 cm-1 oraz następujący wzór:
        Wzór na obliczanie stężenia tubuliny; Abs280 podzielone przez współczynnik ekstynkcji; równanie naukowe.
    2. Resuspend komercyjnie dostępną liofilizowaną tubulinę 488 znakowaną lizyną do 10 µM (1 mg/ml; 100% stężenia nominalnego) z 20 µL 1x BRB80 bez GTP.
    3. Rozmrozić 7.2 µL alikwot z 100 µM nieoznaczona odzyskana tubulina29 w lodzie.
      UWAGA: Odzyskana tubulina jest kluczowa dla prawidłowego montażu mikrotubul in vitro ponieważ usuwa niezdolne do polimeryzacji dimery powstające w zamrożonych zapasach białka29,30.
    4. Połączyć 3 µL z 10 µM tubuliny 488 z 7.2 µL alikwot z 100 µM nieznakowana tubulina, nie wcześniej niż 15 min przed użyciem.
  2. Przygotuj roztwór zapasu aktyny znakowanej fluorescencyjnie.
    1. W przypadku białek otrzymanych metodą domową należy wyznaczyć stężenie oraz procentową zawartość aktyny względem całkowitej ilości białka. poprzez spektrofotometria Abs290 oraz Abs650w następujący sposób:
      1. Zeroowanie spektrofotometru z buforem G.
      2. Oblicz stężenie nieznakowanej aktyny, korzystając z wyznaczonego współczynnika ekstynkcji wynoszącego 25 974 M⁻¹cm⁻¹-1 cm-1 oraz następujący wzór:
        Wzór na stężenie aktyny, Abs290/współczynnik ekstynkcji, pomoc obliczeniowa do analizy molekularnej.
      3. Oblicz stężenie aktyny znakowanej Alexa-647 w lizynie, wykorzystując współczynnik ekstynkcji nieznakowanej aktyny, czynnik korekcyjny fluorescencji wynoszący 0,03 oraz poniższy wzór:
        [aktyna znakowana Alexa-647], µM = (Abs290 - Równanie fluorometryczne do korekty absorpcji; wzór wykorzystuje współczynnik ekstynkcji, Abs650.
      4. Oblicz procent znakowania aktyny Alexa-647, używając wyznaczonej wartości ε dla Alexa-647 wynoszącej 239 000 M⁻¹cm⁻¹-1 cm-1w następujący sposób:
        % znakowania aktyny Alexa-647 = (Abs290 - (Wzór na absorbancję dla stężenia białka; równanie znakowania aktyny; analiza biochemiczna.
    2. Rozmrozić jedną 2 µL alikwot 3 µM 100% znakowana biotyną aktyna (znakowanie w resztach lizyny). Rozcieńczyć 10-krotnie poprzez dodanie 18 µL buforu G.
    3. Połączyć 3 µL rozcieńczonej biotynylowanej aktyny, odpowiednie objętości nieznakowanej i znakowanej aktyny (powyżej), tak aby końcowa mieszanina była 12.5 µM aktyna całkowita z 10%–30% znacznikiem fluorescencyjnym.
      UWAGA: Stężenie fluorescencyjnych monomerów aktyny (końcowe) przekraczające 30% może pogorszyć rozdzielczość obrazowania, ponieważ filamenty stają się trudne do odróżnienia od tła.
  3. Przygotuj mieszaniny reakcyjne (Rycina 1C).
    1. Przygotować mieszaninę cytoszkieletu (probówka A), łącząc 2 µL z 12.5 µM wymieszać roztwór aktyny (6.2.3) z roztworem tubuliny (6.1.4) nie wcześniej niż 15 minut przed obrazowaniem. Przechowywać w lodzie do momentu użycia.
    2. Przygotować mieszaninę reakcyjną białek (probówka B), łącząc wszystkie pozostałe komponenty eksperymentalne i białka, w tym: bufor TIRF 2x, środek przeciw wybielaniu, nukleotydy, bufory oraz białka akcesoryjne. Przykład przedstawiono w Rycina 1C.
      UWAGA: Końcowe rozcieńczenie pozwala uzyskać 1x bufor TIRF zawierający ATP, GTP oraz siłę jonową w przybliżonym zakresie fizjologicznym.
  4. Inkubować osobno probówkę A i probówkę B w temperaturze 37 °C przez 30–60 s. Aby rozpocząć reakcję, wymieszać i dodać zawartość probówki B do probówki A (poniżej).

7. Obrazowanie dynamiki aktyny i mikrotubul

  1. Przygotuj dożośnią studnię perfuzyjną (Ryc. 1B; krok 4 powyżej).
  2. Zainicjuj jednoczesny montaż aktyny i mikrotubul, dodając zawartość probówki B (mieszanina reakcyjna) do probówki A (mieszanina cytoszkieletu) (Ryc. 1C).
  3. przepuść 50 µL reakcji zawierającej 1x bufor TIRF uzupełniony o 15 µM wolnej tubuliny, 1 mM GTP i 0,5 µM monomerów aktyny oraz odpowiednie objętości kontroli buforowych.
  4. Nagraj film w trybie time-lapse, używając oprogramowania mikroskopu, wykonując akwizycję co 5 s przez 15-20 min.
    UWAGA: Inicjacja dynamiki aktyny i mikrotubul następuje w ciągu 2-5 min (Ryc. 2). Dłuższe opóźnienia wskazują na problemy z kontrolą temperatury lub problemy z koncentracją białek w mieszaninie reakcyjnej.
  5. Przygotuj nową studnię perfuzyjną (krok 4) i zastąp objętość buforu badanym białkiem (białkami) regulacyjnym (np. Tau) oraz kontrolami buforowymi (Ryc. 1C). Wykonaj akwizycję zgodnie z opisem w kroku 7 (powyżej), aby ocenić białka regulacyjne pod kątem pojawiających się funkcji aktynowo-mikrotubularnych.

8. Przetwarzanie i analiza obrazów za pomocą oprogramowania FIJI31

  1. Otwórz zapisane filmy TIRF i wyświetl je jako obraz kompozytowy.
  2. Analiza dynamiki mikrotubul (Rysunek 3A), w następujący sposób:
    1. Wygeneruj maksymalną projekcję Z w czasie z menu stosów obrazów.
    2. Zsynchronizuj okno projekcji Z z oryginalnym filmem TIRF z Analiza> Narzędzia> Synchronizacja okien menu
    3. Za pomocą narzędzia do rysowania linii prostych narysuj linię wzdłuż wybranego mikrotubuli na obrazie z projekcją czasową.
      1. Otwórz menedżera obszarów zainteresowania (ROI) z menu analizy (Analizuj> Narzędzia> Menedżer ROI).
      2. Zapisz położenia poszczególnych mikrotubul, naciskając klawisz „t”. Powtórz tę czynność dla wszystkich wybranych mikrotubul.
    4. Wykreśl kymografy wybranych linii, używając „/”, lub uruchom makro multi-kymo, które generuje wideo i kymograf dla każdego mikrotubuli w menedżerze ROI31.
      1. Dodaj zarówno długość (µm) oraz paski skali czasu (min) do kymografów z Analizuj> Narzędzia> Skale obrazu menu
    5. Pomiar prędkości wzrostu mikrotubul na podstawie nachyleń kymografów (Rycina 3A, 1-2; nachylenie czarnych linii).
    6. Policz dynamiczne zdarzenia mikrotubularne (katastrofę lub odrost) na podstawie wygenerowanego kymografu lub przy użyciu dostępnych makr analitycznych5,8,18,25Czerwone linie przerywane w Rycina 3A, 1-2 reprezentują zdarzenia katastrofy/szybkiego rozpadu.
  3. Analiza dynamiki aktyny (Rysunek 3B), w następujący sposób:
    1. Pomiar nukleacji aktyny należy przeprowadzić w następujący sposób:
      1. Policz liczbę filamentów aktynowych obecnych w polu widzenia 100 s po rozpoczęciu reakcji i wyraź wynik w przeliczeniu na powierzchnię (liczba filamentów na µm2).
      2. Zarejestruj i zapisz dane w menedżerze ROI (ROI manager), zgodnie z krokiem 8.2.3.1 opisanym powyżej.
    2. Pomiar szybkości elongacji filamentów aktynowych (Rycina 3B), w następujący sposób:
      1. Narysuj linię wzdłuż wybranego filamentu aktynowego, korzystając z narzędzia linii segmentowej.
      2. Dodaj linię do managera ROI, zgodnie z krokiem 8.2.3.1 powyżej.
      3. Powtórz czynność zgodnie z linią (dodając każdy pomiar do menedżera ROI) dla co najmniej czterech klatek filmu.
        UWAGA: Zaleca się pomiar od siedmiu do ośmiu następujących po sobie klatek, jednak w niektórych warunkach polimeryzacja aktyny przebiega zbyt wolno, by była wykrywalna przy zastosowaniu danej konfiguracji obiektywu i mikroskopu. W takim przypadku pomiary można przeprowadzać w regularnych odstępach czasu, pomijając kolejne klatki (np. co piątą klatkę).
      4. Nanieś zmierzone wartości długości na wykres w funkcji czasu. Nachylenie wygenerowanej linii stanowi szybkość elongacji aktyny wyrażoną w mikrometrach na sekundę (µm/s).
      5. Podaj końcowe obliczone szybkości w jednostkach s⁻¹-1 µM-1 stosując współczynnik korekcyjny wynoszący 370 podjednostek, aby uwzględnić liczbę monomerów aktyny w mikrometrze filamentu32.
  4. wykonaj analizę korelacyjną dla obszarów równoległego powiązania aktyny i mikrotubul (Rycina 3C), w następujący sposób:
    1. Za pomocą narzędzia do rysowania linii prostych narysuj linię wzdłuż wybranego mikrotubuli w konkretnym punkcie czasowym (np. 300 s po rozpoczęciu reakcji).
      1. Dodaj linię do menedżera ROI, zgodnie z krokiem 8.2.3.1 powyżej.
    2. Wykreśl intensywność fluorescencji wzdłuż linii w każdym kanale.
      1. Wybierz każdy kanał za pomocą suwaka obrazu i wykreśl intensywności wzdłuż linii, używając polecenia „command k”.
      2. Zapisz lub wyeksportuj wartości, klikając przycisk „list” w oknie wyjściowym.
    3. Wyraź zdarzenia sprzęgania aktyny z mikrotubulami jako stosunek (aktyna nakładająca się na mikrotubule) z poszczególnych zdarzeń lub jako liczbę zdarzeń w danym polu widzenia w określonym punkcie czasowym (Rycina 3C).
    4. Alternatywa: Użycie oprogramowania do wyznaczenia procentowej zakładki obu kanałów5,12.

Wyniki

Przy zastosowaniu opisanych powyżej warunków (Rysunek 1), polimery aktyny i mikrotubul powinny być widoczne (oraz dynamiczne) w ciągu 2 min od rozpoczęcia akwizycji obrazu (Rysunek 2). Jak w przypadku każdego protokołu opartego na biochemii, może być wymagana optymalizacja dla różnych białek regulatorowych lub partii białek. Z tych względów kąt TIRF i czasy naświetlania obrazu są ustawiane w pierwszej kolejności przy użyciu reakcji zawierających każdy polimer z osobna. Potwierdza to, że przechowywane białka są funkcjonalne i że obecna jest wystarczająca ilość znakowanego białka do detekcji. Choć nie zawsze jest to konieczne (i nie wykonano tego w niniejszym przypadku), do poprawy kontrastu obrazu (szczególnie w przypadku mikrotubul) można zastosować postprocessing filmów (np. odejmowanie tła, uśrednianie lub transformacje Fouriera)5,25,33. Bezpośrednia wizualizacja pojedynczych filamentów aktynowych i mikrotubul umożliwiana przez ten test wspiera ilościowe określenie kilku parametrów dynamicznych dla każdego z komponentów cytoszkieletu osobno lub razem, w tym parametrów polimeryzacji (np. szybkości nukleacji lub elongacji), parametrów depolimeryzacji (np. szybkości kurczenia się lub zdarzeń katastrofy) oraz współliniowości/nakładania się polimerów (Rysunek 3). Ponadto pomiary te mogą służyć jako punkt wyjścia do analizy wiązania lub wpływu ligandów regulatorowych, takich jak białko Tau (Rysunek 3). Z jednego filmu TIRF można wykonać wiele pomiarów pojedynczych filamentów aktynowych lub mikrotubul. Jednak ze względu na różnice w powłoce szkiełka podstawowego, pipetowaniu i inne czynniki, wiarygodne pomiary powinny obejmować również wiele technicznych powtórzeń reakcji/filmów.

Wiele aspektów dynamiki mikrotubul można określić na podstawie przykładowych kymografów, w tym szybkość elongacji mikrotubul, a także częstotliwość zdarzeń katastrofy i ratunku (Rysunek 3A). Wykorzystanie kymografów do pomiaru dynamiki aktyny w tym systemie nie jest tak proste, ponieważ filamenty aktynowe są bardziej poskręcane niż mikrotubule. W konsekwencji parametry dynamiki filamentów aktynowych są mierzone ręcznie, co jest czasochłonne i pracochłonne. Liczba nukleacji jest mierzona jako liczba filamentów aktynowych obecnych w tym samym punkcie czasowym dla wszystkich warunków. Liczby te znacznie różnią się w zależności od pola obrazowania TIRF, ale mogą być stosowane przy wielu powtórzeniach lub jako uzupełnienie obserwacji z innych testów polimeryzacji. Liczbę nukleacji można również zastosować dla mikrotubul, jeśli w warunkach doświadczalnych brakuje stabilizowanych zarodków mikrotubul. Szybkości elongacji filamentów aktynowych są mierzone jako długość filamentu w czasie na podstawie co najmniej czterech klatek filmu. Wartości szybkości są podawane na mikromolarny poziom aktyny z czynnikiem korekcyjnym wynoszącym 370 podjednostek, aby uwzględnić liczbę monomerów aktyny w jednym mikronie filamentu (Rysunek 3B)32. Pomiary definiujące skoordynowane zachowania aktyny i mikrotubul są mniej jednoznaczne. Niemniej jednak do pomiaru zbieżności obu polimerów zastosowano analizy korelacyjne, w tym skany liniowe (Rysunek 3C) lub oprogramowanie do analizy nakładania się obrazów5,11,34.

Dostępność danych:
Wszystkie zestawy danych powiązane z niniejszą pracą zostały zdeponowane w Zenodo i są dostępne na uzasadnioną prośbę pod adresem: 10.5281/zenodo.6368327.

Układ mikroskopii TIRF: panel A przedstawia montaż komory perfuzyjnej; panel B opisuje proces oświetlania; panel C szczegółowo przedstawia składniki roztworów do obrazowania.
Rycina 1. Schematy eksperymentalne: od montażu komory przepływowej do akwizycji obrazów.(A) Montaż komory obrazowania. Od góry do dołu: komory obrazowania IBIDI są przyklejane taśmą wzdłuż otworów perfuzyjnych (oznaczone strzałką); druga (biała) warstwa podkładu taśmy (pozostawiona na obrazie w celu lepszego zorientowania użytkownika) zostaje usunięta, a na krawędzi komory perfuzyjnej nakłada się żywicę epoksydową (strzałka). Uwaga: Aby ułatwić orientację w miejscu nakładania żywicy epoksydowej, na tym obrazie pozostawiono biały podkład. Oczyszczone i powlekane szkiełko podstawowe jest mocowane do komory obrazowania stroną powleczoną w stronę wnętrza otworu perfuzyjnego. (B) Schemat blokowy ilustrujący etapy przygotowania komór obrazowania do tworzenia wiązań biotyna-streptawidyna. (C) Przykłady reakcji wykorzystywanych do rejestracji filmów TIRF dynamicznych mikrotubul i filamentów aktynowych. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Mikroskopia polimeryzacji tubuliny i aktyny, schemat time-lapse, pokazujący efekt białka Tau, skala 25μm.
Rysunek 2. Sekwencje obrazów rosnących filamentów aktynowych i mikrotubul w obecności lub przy braku Tau. Montaż obrazów time-lapse z analiz TIRF zawierających 0,5 µM aktyny (10% Alexa-647-actin i 0,09% biotin-actin) oraz 15 µM wolnej tubuliny (4% HiLyte-488) przy braku (A) lub w obecności (B) 250 nM Tau. Przedstawiono czas upływający od rozpoczęcia reakcji (wymieszania probówki A i probówki B). Paski skali, 25 µm. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Dynamika tubuliny i aktyny; schematy mikroskopii fluorescencyjnej; kymografy; analiza elongacji aktyny.
Rycina 3Przykładowe pomiary dynamiki mikrotubul i filamentów aktynowych. (A) Średnia projekcja czasowa kanału tubuliny pozwala na efektywną wizualizację całkowitej długości mikrotubul dla skanów liniowych użytych do wygenerowania wykresów kymograficznych. Czarne linie przerywane odpowiadają dwóm przykładowym kymografom dynamicznych mikrotubul przedstawionym po prawej stronie. Na każdym kymografie zaznaczono fazy wzrostu (ciągłe czarne linie) i rozpadu (różowe linie przerywane; dwie wskazane różowymi strzałkami) mikrotubul. Pasek skali czasu, 3 min. Pasek skali długości, 10 µmReakcja zawiera 0.5 µM aktyna (10% znakowanie 647) i 15 µM wolna tubulina (znakowanie 4% 488-HiLyte). Przedstawiono wyłącznie kanał tubuliny.(B) Dwa przykładowe montaże obrazów time-lapse przedstawiające aktywnie polimeryzujące pojedyncze filamenty aktyny. Szybkość elongacji oblicza się jako nachylenie wykresów długości filamentów aktyny w czasie na mikromol aktyny. W związku z tym należy zastosować współczynnik korekcyjny wynoszący dwa do 0.5 µM reakcje aktyny do porównania szybkości, zazwyczaj określanych w 1 µM stężenie aktyny. Przykłady z pięciu filamentów przedstawiono po prawej stronie. Paski skali, 10 µmReakcja zawiera 0.5 µM aktyna (10% znakowania 647) i 15 µM wolna tubulina (oznaczenie 4% 488-HiLyte). Przedstawiono tylko kanał aktyny. (C) obrazy TIRF dynamicznych mikrotubul (MT) (zielone) i filamentów aktynowych (fioletowe) polimeryzujących w obecności (środek) lub przy braku (lewo) 250 nM białka Tau. Niebieskie linie przerywane i strzałki wskazują miejsca wyznaczenia linii dla wykresów skanowania liniowego odpowiadających każdemu z warunków (poniżej każdego obrazu). Nakładanie się obszarów mikrotubul i aktyny (wykazane jako kolor czarny) może być oceniane w określonym punkcie czasowym na jednostkę powierzchni (prawo). Paski skali, 25 µmReakcje zawierają 0.5 µM aktyna (10% znakowana 647) i 15 µM wolna tubulina (znakowana 4% 488-HiLyte) z dodatkiem lub bez dodatku 250 nM Tau. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dyskusja

Zastosowanie mikroskopii fluorescencji całkowitego wewnętrznego odbicia (TIRF) do wizualizacji oczyszczonych białek było owocnym i przekonującym podejściem do analizy unikalnych mechanizmów regulacji cytoszkieletu 5,23,24,25,26,27,35. W porównaniu z tradycyjnymi testami biochemicznymi, reakcje TIRF wymagają bardzo małych objętości (50-100 μl), a ilościowe pomiary dynamiki cytoszkieletu można uzyskać z pojedynczego testu. Większość badań dynamiki cytoszkieletu koncentruje się na pojedynczym układzie polimerowym (tj. Filamentach aktynowych lub mikrotubulach), dlatego szczegółowe pomiary przesłuchów lub pojawiających się zachowań między filamentami aktyny a mikrotubulami, zwykle obserwowanych w komórkach, pozostały nieuchwytne i trudne do podsumowania w probówce. Aby rozwiązać ten problem, w protokole opisano jednowłóknowy system mikroskopowy TIRF, który umożliwia bezpośrednią wizualizację dynamicznych polimerów aktyny i mikrotubul w tej samej reakcji biochemicznej. W związku z tym metoda ta wykracza poza tradycyjne testy, które podsumowują dynamiczne zachowanie samych filamentów aktynowych lub mikrotubul. Technikę tę przeprowadzono również z Tau jako przykładem tego, jak zmienia się kilka właściwości dynamicznych w obecności czynnika sprzęgającego cytoszkieletu. Protokół ten może być stosowany z dodatkowymi białkami, o których wiadomo lub podejrzewa się, że koordynują dynamikę aktyny lub mikrotubul, w tym (ale nie wyłącznie) MACF, GAS, forminy i inne. Wreszcie, podane przykładowe analizy mogą być wykorzystane jako przewodnik do ilościowego określenia danych uzyskanych za pomocą tego protokołu.

"Zobaczyć znaczy uwierzyć" to przekonujący powód, dla którego warto wykonywać testy oparte na mikroskopii. Należy jednak zachować ostrożność przy wykonywaniu i interpretacji eksperymentów mikroskopowych TIRF. Jednym z głównych wyzwań związanych z testami współskładania cytoszkieletu jest to, że wiele powszechnie stosowanych warunków obrazowania nie jest kompatybilnych z każdym polimerem. Mikrotubule i aktyna zazwyczaj mają różne wymagania dotyczące bufora, temperatury, soli, nukleotydów i stężenia do polimeryzacji. Aktyna, tubulina, białka regulatorowe będące przedmiotem zainteresowania i wykorzystywane w tym protokole są wrażliwe na cykle zamrażania i rozmrażania. Dlatego ostrożne obchodzenie się z białkami i jest konieczne, aby pomyślnie wykonać ten protokół. Aby złagodzić wiele z tych problemów, zdecydowanie zaleca się stosowanie świeżo przetworzonej tubuliny (zamrożonej na <6 tygodnia) oraz wstępne usuwanie zamrożonych/ponownie zawieszonych aktyn za pomocą ultrawirowania. Rozważania te odnoszą się również do niezliczonych białek regulatorowych, które mają być oceniane za pomocą tej procedury, a które mogą być wrażliwe na cykle zamrażania i rozmrażania lub stężenie soli buforowych 5,11,36.

Niestety, nie ma jednego uniwersalnego bufora bez eksperymentalnych kompromisów. Aby zapewnić większą objętość białkom o niższym stężeniu, ATP i GTP mogą być zawarte w 2x roztworze buforowym TIRF (ryc. 1C). Ponieważ jednak nukleotydy te są niezwykle wrażliwe na cykle zamrażania i rozmrażania, nie jest to zalecane. Zastosowane tutaj związki wychwytujące tlen (tj. Katalaza i oksydaza glukozowa) są niezbędne do wizualizacji białek przez długi czas (od minut do godzin), ale wiadomo, że ograniczają polimeryzację mikrotubul przy wysokich stężeniach5. W związku z tymi rozważaniami dotyczącymi bufora, ograniczeniem tego protokołu jest to, że niektóre kanoniczne białka regulatorowe związane z mikrotubulami mogą wymagać mniej lub więcej soli do podsumowania funkcji znalezionych w komórkach lub testów przy użyciu samych mikrotubul (bez aktyny). Zmiana charakteru lub stężenia soli w celu rozwiązania tych problemów prawdopodobnie wpłynie na szybkość polimeryzacji włókien aktynowych i/lub parametry dynamiki mikrotubul. Pomiary wielu parametrów opisowych (minimalnie, zarodkowanie, szybkość wydłużania i stabilność) (ryc. 3) są wymagane w celu potwierdzenia sukcesu protokołu lub jawnego udokumentowania wpływu określonych lub białek regulatorowych. Na przykład zbyt duża polimeryzacja filamentu aktynowego może w ciągu kilku sekund przesłonić zdarzenia sprzężenia aktyny-mikrotubul. W związku z tym dostrojenie warunków eksperymentalnych poprzez obniżenie ogólnego stężenia aktyny lub włączenie dodatkowych białek w celu zahamowania zarodkowania aktyny (tj. profiliny) wydłuży ogólny okres, w którym można wyraźnie zobaczyć skoordynowane działania aktyny-mikrotubul. Kontrolki spełniające te wymagania wstępne i repliki techniczne (poza wieloma polami widzenia) mają kluczowe znaczenie dla użytkowników w celu generowania wiarygodnych i odtwarzalnych wyników.

Badania komórkowe dają ograniczoną możliwość obserwacji bezpośrednich zależności białko-białko lub działania kompleksów regulatorowych. W przeciwieństwie do tego, niektóre mechanizmy uzyskane z testów in vitro nie zawsze odzwierciedlają dokładne zachowania białek obserwowanych w komórkach. Ten klasyczny dylemat biochemika może zostać rozwiązany w przyszłych zastosowaniach tej techniki z określonymi modyfikacjami. Na przykład dodanie funkcjonalnych białek sprzęgających znakowanych fluorescencyjnie rozszerza tę metodę z badań pojedynczych włókien do badań pojedynczych cząsteczek. Testy mogą być dalej modyfikowane w celu wykorzystania ekstraktów komórkowych, które mogą dodać "brakujące" nieznane kluczowe czynniki wymagane do podsumowania zjawisk podobnych do komórek. Na przykład testy oparte na TIRF z wykorzystaniem ekstraktów drożdżowych lub Xenopus odtworzyły kurczliwe pierścienie aktomiozyny37, wrzeciona mitotyczne26,38, składniki aktyny lub zespołu mikrotubul39,40, a nawet dynamikę w centrosomie i kinetochorach 36,41,42,43. Co więcej, takie systemy mogą utorować drogę do sztucznych systemów komórkowych, w których obecne są lipidy lub czynniki sygnałowe 44,45,46.

Oświadczenia

Nie ma żadnych konfliktów interesów, które można by ujawnić.

Podziękowania

Jestem wdzięczny Marcowi Ridilli (Repair Biotechnologies) i Brianowi Haarerowi (SUNY Upstate) za pomocne komentarze na temat tego protokołu. Prace te były wspierane przez Narodowe Instytuty Zdrowia (GM133485).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1% BSA (w/v)Fisher ScientificBP1600-100W tym celu (blokowanie komór TIRF), BSA jest ponownie zawieszany w ddH20 i filtrowany przez 0,22 &mikro; m filtr.
1 i razy; BRB80Domowerury 80 mM, 1 mM MgCl2, 1 mM EGTA, pH 6,8 z KOH
10 mg/mL (1000 U) oksydaza glukozowaSigma Aldrich Inc, St. Louis, MOG2133-50KUW połączeniu z katalazą, porcją i przechowywać w temperaturze -80 oC do użycia
100 &mikro; M tubulinaCytoskeleton Inc, Denver, COT240Domowe tubuliny powinny być poddane recyklingowi przed użyciem w celu usunięcia tubuliny niekompetentnej do polimeryzacji (Hyman i in. (1992)29; Li i Moore (2020)30). Dostępne na rynku tubuliny są często zbyt rozcieńczone, aby można je było poddać recyklingowi, ale działają dobrze, jeśli są ponownie zawieszone zgodnie z zaleceniami producenta s instrukcje i wstępnie oczyszczone przez ultrawirowanie (278 000 &razy; g) przez 60 minut, przed użyciem.
100 mM ATPGold Biotechnology Inc, Olivette, MOA-081Zawieszony w ddH20 (pH 7,5) i wysterylizowany filtrem.
100 mM GTPFisher Scientific AC226250010ponownie zawieszony w 1 i razy; BRB80 (pH 6,8) i sterylizowany filtrem.
Lasery na ciele stałym 120-150 mWLeica Microsystems11889151; 11889148
2 mg/mL katalazaSigma Aldrich Inc, St. Louis, MOC40-100W połączeniu z oksydazą glukozową, podwielokrotność i przechowywać w temperaturze -80 oC do użycia
2 razy; Bufor TIRFDomowej roboty2 razy; BRB80, 100 mM KCl, 20 mM DTT, 80 mM glukozy, 0,5% (v/v) metylocelulozy (4,000 cp); Uwaga: 1 &mikro; L 0,1 mln GTP i 1 &mikro; L 0,1 M ATP dodawany oddzielnie do reakcji TIRF, aby uniknąć powtarzających się cykli zamrażania i rozmrażania.
24 &razy; 60 mm, #1.5 szkło nakrywkoweFisher Scientific, Waltham, MA22-266882Szkło nakrywkowe należy dokładnie umyć przed użyciem (Smith i in. (2014)22)
37 oC blok
37 oC łaźnia
5 mg/ml Streptawidyny (600x stock)Avantor, Filadelfia, PARLS000-01Zawieszony w Tris-HCl (pH 8,8); rozcieńczyć podwielokrotność do 1&razy; w buforze HEK w dniu użycia
5 min Żywica epoksydowa i utwardzaczLoctite, Rocky Hill, CT1365736Połączenie żywicy i utwardzacza może trwać do 30 minut.
50% biotynylowane-GpCpp nasiona mikrotubulCytoskeleton Inc; Domowestabilizowane T333P(opcjonalnie) GppCpp lub Taxol mogą bardziej efektywnie pośredniczyć w polimeryzacji mikrotubul. Taksol i GppCpp stabilizują mikrotubule na różne sposoby, które mogą wpływać na strukturę siatki mikrotubul i zdolność niektórych białek regulatorowych do wiązania się ze stabilizowaną częścią mikrotubul. Metoda wytwarzania różnych rodzajów nasion mikrotubul została opisana w Hyman et al. (1992).
70 oC inkubator
Mieszanka aktynowaDomowej roboty; ten protokółA 12,5 i mikro; Mieszanina aktyn M składająca się ze znakowanej (fluorescencyjnej i biotynylowanej) i nieznakowanej aktyny dla maksymalnie sześciu reakcji. 2 i mikro; L zapasu jest używany w końcowej reakcji TIRF. Końcowe stężenie aktyny użytej w każdej reakcji wynosi 0,5 &mikro; M (10% Alexa-647; 0,09% znakowane biotyną).
Odpowiednie kontrole buforoweDomowej robotyKombinacja ze wszystkich ocenianych białek
Biotyna-PEG-silan (MW 3,400)Laysan Bio Incbiotyna-PEG-SIL-3400Dozowanie do podwielokrotności 2-5 mg, wypełnienie azotem, parafilmowanie zamknięte i przechowywane w temperaturze -20 oC ze środkiem osuszającym do czasu użycia
Biotynylowanyaktyna Cytoskeleton Inc; DomowaAB07Biotyna-aktyna jest wytwarzana przez znakowanie na resztach lizyny, a zatem zakłada się, że jest co najmniej w 100% znakowana, ale różni się w zależności od różnych partii/preparatów. Optymalne stężenia biotynylowanych aktyn muszą być empirycznie określone dla poszczególnych zastosowań/projektów eksperymentalnych. Wyższe stężenia pozwalają na bardziej efektywne śledzenie, ale mogą utrudniać polimeryzację lub interakcje z białkami regulatorowymi. W tym przypadku niewielki procent (0,09% lub 900 pM) biotynylowanej aktyny jest obecny w końcowej reakcji TIRF.
Mydło do naczyńDawn, Procter and Gamble, Cincinnati, OHZ nieznanych przyczyn niebieska wersja czyści szkiełka nakrywkowe skuteczniej niż inne dostępne kolory.
do suchego lodu
www.https://imagej.net/software/fiji/downloadsSchneider i in. (2012)31.
Znakowany fluorescencyjnie aktynowycytoszkielet Inc; DomowaAR05Domowa aktyna znakowana fluorescencyjnie jest przechowywana w buforze G uzupełnionym 50% glicerolem w temperaturze -20 oC (Spudich i in. (1971)47; Liu i in. (2022)48). Znakowana fluorescencyjnie aktyna jest dializowana z buforem G i wstępnie oczyszczana przez ultrawirowanie przez 60 minut w 278 000 &; g przed użyciem.
Fluorescencyjnie znakowany cytoszkielet tubulinowyIncTL488M, TLA590M, TL670Mzawieszony w 20 i mikro; L 1 i razy; BRB80 (10 i mikro; M końcowe stężenie) i wstępnie oczyszczone przez ultrawirowanie (278 000 i razy; g) przez 60 minut, przed użyciem.
G-bufferDomowy3 mM Tris-HCl (pH 8,0), 0,2 mM CaCl2, 0,5 mM DTT, 0,2 mM ATP
HEK BuforDomowy20 mM HEPES (pH 7,5), 1 mM EDTA (pH 8,0), 50 mM KCl
Lód
Wiadro
Komory obrazowaniaIBIDI, Fitchburg, WI80666Zamów komory bez dna, aby wykorzystać różne powłoki szkieł nakrywkowych
Kamera iXon Life 897 EMCCDAndor, Belfast, Irlandia Północna8114137
Oprogramowanie mikroskopowe LASX PremiumLeica Microsystems11640611
Metyloceluloza (4,000 cp)Sigma Aldrich IncM0512
Podstawa mikroskopu wyposażona w moduł TIRFLeica Microsystems, Wetzlar, Niemcy
mPEG-silan (MW 2,000)Laysan Bio Inc, Arab, ALmPEG-SIL-2000Dozowany do podwielokrotności 10-15 mg, wypełniony azotem, sparafilmowany zamknięty i przechowywany w temperaturze -20 oC ze środkiem osuszającym do czasu użycia
Podgrzewacz obiektywu i podgrzewana wkładka scenicznaOKO labs, Pozzioli, Włochy8113569Ustaw regulator temperatury na 35-37 oC. Skorzystaj z sugestii producenta, aby uzyskać dokładną kalibrację.
Pompa perfuzyjnaHarvard Apparatus, Holliston, MA704504Można zastąpić strzykawkę i rurkę.
Szalka Petriego, 100 x 15 mmGenesee Scientific, San Diego, CA32-107
Plastikowy pojemnik na koperty przesuwneFisher ScientificHS15986
SA-S-1L-SecureSeal o grubości 0,12 mmGrace Biolabs, Bend, OR620001Zdecydowanie zaleca się dwustronną taśmę o precyzyjnych wymiarach.
Mały pojemnik styropianowyAbcam, Cambridge, Wielka BrytaniaPonownie wykorzystany z wysyłki
Mała łódź wagowaFisher Scientific02-202-100
Spektrofotometr
TauCytoszkielet IncTA01W dostępnym na rynku preparacie Tau obecne są trzy izoformy Tau. Stężenie w tym protokole oznaczono z najwyższego pasma masy cząsteczkowej (14,3 &mikro; M, po ponownym zawieszeniu zgodnie z zaleceniami producenta s rekomendacje z 50 &mikro; L z ddH20).
Temperatura skorygowana 63 razy; Plan Apo 1.47 N.A. Zanurzeniowy obiektyw TIRFLeica Microsystems11506319
Tubulinadomowej roboty; ten protokółZapas tubuliny składający się z 7,2 i mikro; L z recyklingu 100 &mikro; M nieznakowana tubulina i 3 &mikro; L z 10 i mikro; M ponownie zawieszona w handlu tubulina znakowana fluorescencyjnie. Na każdą reakcję stosuje się jeden bulion tubulinowy, który rozmraża się/przechowuje na lodzie. Końcowe stężenie wolnej tubuliny w każdej reakcji wynosi 15 &mikro; M (4% oznakowane). Więcej niż 15 &mikro; M tubulina będzie skutkowała hiperstabilizacją (nie dynamicznymi) mikrotubulami, podczas gdy stężenia poniżej 7,5 & mikro; Tubulina wolna M nie polimeryzuje dobrze. Wymagane jest staranne określenie stężenia białka i obchodzenia się z nim.
Nieznakowana aktyna (ciemna)Cytoskeleton Inc; DomoweAKL99są prawie zawsze obecne w dostępnych na rynku (liofilizowanych) lub mrożonych aktynach i przyczyniają się do zmienności pomiarów ilościowych (Spudich i in. (1971)47; Liu i in. (2022)48). Aktyna z mięśni królika jest przechowywana w buforze G w temperaturze -80 oC i wstępnie oczyszczana przez ultrawirowanie przez 60 minut w temperaturze 278 000 i razy; g przed użyciem. W ciągu dnia przygotowuje się kilka roztworów podstawowych aktyny (co nie wystarcza na sześć reakcji jednocześnie  jest zdecydowanie zalecane).
grzewczywodna nasiona mikrotubul Oprogramowanie FIJI na lód11889146 jądra aktyny

Bibliografia

  1. Pimm, M. L., Henty-Ridilla, J. L. New twists in actin-microtubule interactions. Molecular Biology of the Cell. 32 (3), 211-217 (2021).
  2. Dogterom, M., Koenderink, G. H. Actin-microtubule crosstalk in cell biology. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 20 (1), 38-54 (2019).
  3. Etienne-Manneville, S. Actin and microtubules in cell motility: which one is in control. Traffic. 5 (7), 470-477 (2004).
  4. Rodriguez, O. C., et al. Conserved microtubule-actin interactions in cell movement and morphogenesis. Nature Cell Biology. 5 (7), 599-609 (2003).
  5. Prezel, E., et al. TIRF assays for real-time observation of microtubules and actin coassembly: Deciphering tau effects on microtubule/actin interplay. Methods in Cell Biology. 141, 199-214 (2017).
  6. Griffith, L. M., Pollard, T. D. The interaction of actin filaments with microtubules and microtubule-associated proteins. The Journal of Biological Chemistry. 257 (15), 9143-9151 (1982).
  7. Henty-Ridilla, J. L., Rankova, A., Eskin, J. A., Kenny, K., Goode, B. L. Accelerated actin filament polymerization from microtubule plus ends. Science. 352 (6288), 1004(2016).
  8. Elie, A., et al. Tau co-organizes dynamic microtubule and actin networks. Scientific Reports. 5 (1), 1-10 (2015).
  9. Preciado López, M., et al. Actin-microtubule coordination at growing microtubule ends. Nature Communications. 5 (1), 1-9 (2014).
  10. Oberhofer, A., et al. Molecular underpinnings of cytoskeletal cross-talk. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (8), 3944-3952 (2020).
  11. Nakos, K., et al. Septins mediate a microtubule-actin crosstalk that enables actin growth on microtubules. bioRxiv. , (2022).
  12. Kučera, O., Gaillard, J., Guérin, C., Théry, M., Blanchoin, L. Actin-microtubule dynamic composite forms responsive active matter with memory. bioRxiv. , (2022).
  13. Kundu, T., Dutta, P., Nagar, D., Maiti, S., Ghose, A. Coupling of dynamic microtubules to F-actin by Fmn2 regulates chemotaxis of neuronal growth cones. Journal of Cell Science. 134 (13), 252916(2021).
  14. Roth-Johnson, E. A., Vizcarra, C. L., Bois, J. S., Quinlan, M. E. Interaction between microtubules and the Drosophila formin Cappuccino and its effect on actin assembly. The Journal of Biological Chemistry. 289 (7), 4395-4404 (2014).
  15. Gaillard, J., et al. Differential interactions of the formins INF2, mDia1, and mDia2 with microtubules. Molecular Biology of the Cell. 22 (23), 4575-4587 (2011).
  16. Bartolini, F., et al. The formin mDia2 stabilizes microtubules independently of its actin nucleation activity. The Journal of Cell Biology. 181 (3), 523-536 (2008).
  17. Sider, J. R., et al. Direct observation of microtubule-F-actin interaction in cell free lysates. Journal of Cell Science. 112 (12), 1947-1956 (1999).
  18. Alkemade, C., et al. Cross-linkers at growing microtubule ends generate forces that drive actin transport. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 119 (11), 2112799119(2022).
  19. Axelrod, D. Total internal reflection fluorescence microscopy in cell biology. Methods in Enzymology. 361, 1-33 (2003).
  20. Amann, K. J., Pollard, T. D. Direct real-time observation of actin filament branching mediated by Arp2/3 complex using total internal reflection fluorescence microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (26), 15009-15013 (2001).
  21. Al-Bassam, J. Reconstituting dynamic microtubule polymerization regulation by TOG domain proteins. Methods in Enzymology. 540, 131-148 (2014).
  22. Smith, B. A., Gelles, J., Goode, B. L. Single-molecule studies of actin assembly and disassembly factors. Methods in Enzymology. 540, 95-117 (2014).
  23. Wioland, H., Jégou, A., Romet-Lemonne, G. Celebrating 20 years of live single-actin-filament studies with five golden rules. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 119 (3), 2109506119(2022).
  24. Ganzinger, K. A., Schwille, P. More from less - bottom-up reconstitution of cell biology. Journal of Cell Science. 132 (4), (2019).
  25. Mahamdeh, M., Howard, J. Implementation of interference reflection microscopy for label-free, high-speed imaging of microtubules. Journal of Visualized Experiments. (150), e59520(2019).
  26. King, M. R., Petry, S. Phase separation of TPX2 enhances and spatially coordinates microtubule nucleation. Nature Communications. 11 (1), 270(2020).
  27. Ramirez-Rios, S., et al. A TIRF microscopy assay to decode how tau regulates EB's tracking at microtubule ends. Methods in Cell Biology. 141, 179-197 (2017).
  28. Smith, B. A., et al. Three-color single molecule imaging shows WASP detachment from Arp2/3 complex triggers actin filament branch formation. eLife. 2, 01008(2013).
  29. Hyman, A. A., Salser, S., Drechsel, D. N., Unwin, N., Mitchison, T. J. Role of GTP hydrolysis in microtubule dynamics: information from a slowly hydrolyzable analogue GMPCPP. Molecular Biology of the Cell. 3 (10), 1155-1167 (1992).
  30. Li, G., Moore, J. K. Microtubule dynamics at low temperature: evidence that tubulin recycling limits assembly. Molecular Biology of the Cell. 31 (11), 1154-1166 (2020).
  31. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  32. Pollard, T. D., Blanchoin, L., Mullins, R. D. Molecular mechanisms controlling actin filament dynamics in nonmuscle cells. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 29, 545-576 (2000).
  33. Kapoor, V., Hirst, W. G., Hentschel, C., Preibisch, S., Reber, S. MTrack: Automated detection, tracking, and analysis of dynamic microtubules. Scientific Reports. 9 (1), 3794(2019).
  34. Willige, D., et al. Cytolinker Gas2L1 regulates axon morphology through microtubule-modulated actin stabilization. EMBO reports. 20 (11), (2019).
  35. Hirst, W. G., Kiefer, C., Abdosamadi, M. K., Schäffer, E., Reber, S. In vitro reconstitution and imaging of microtubule dynamics by fluorescence and label-free microscopy. STAR Protocols. 1 (3), 100177(2020).
  36. Farina, F., et al. The centrosome is an actin-organizing centre. Nature Cell Biology. 18 (1), 65-75 (2016).
  37. Mishra, M., et al. In vitro contraction of cytokinetic ring depends on myosin II but not on actin dynamics. Nature Cell Biology. 15 (7), 853-859 (2013).
  38. Groen, A. C., Ngyuen, P. A., Field, C. M., Ishihara, K., Mitchison, T. J. Glycogen-supplemented mitotic cytosol for analyzing Xenopus egg microtubule organization. Methods in Enzymology. 540, 417-433 (2014).
  39. Pollard, L. W., Garabedian, M. V., Alioto, S. L., Shekhar, S., Goode, B. L. Genetically inspired in vitro reconstitution of Saccharomyces cerevisiae actin cables from seven purified proteins. Molecular Biology of the Cell. 31 (5), 335-347 (2020).
  40. Bergman, Z. J., Wong, J., Drubin, D. G., Barnes, G. Microtubule dynamics regulation reconstituted in budding yeast lysates. Journal of Cell Science. 132 (4), 219386(2018).
  41. Inoue, D., et al. Actin filaments regulate microtubule growth at the centrosome. The EMBO Journal. 38 (11), (2019).
  42. Colin, A., Singaravelu, P., Théry, M., Blanchoin, L., Gueroui, Z. Actin-network architecture regulates microtubule dynamics. Current Biology. 28 (16), 2647-2656 (2018).
  43. Torvi, J. R., et al. Reconstitution of kinetochore and microtubule dynamics reveals a role for a kinesin-8 in establishing end-on attachments. bioRxiv. , (2022).
  44. Nguyen, P. A., et al. Spatial organization of cytokinesis signaling reconstituted in a cell-free system. Science. 346 (6206), 244-247 (2014).
  45. Abu Shah, E., Keren, K. Symmetry breaking in reconstituted actin cortices. eLife. 3, 01433(2014).
  46. Vendel, K. J. A., Alkemade, C., Andrea, N., Koenderink, G. H., Dogterom, M. In vitro reconstitution of dynamic co-organization of microtubules and actin filaments in emulsion droplets. Cytoskeleton Dynamics. 2101, 53-75 (2020).
  47. Spudich, J. A., Watt, S. The regulation of rabbit skeletal muscle contraction. Biochemical studies of the interaction of the tropomyosin-troponin complex with actin and the proteolytic fragments of myosin. The Journal of Biological Chemistry. 246 (15), 4866-4871 (1971).
  48. Liu, X., Pimm, M. L., Haarer, B., Brawner, A. T., Henty-Ridilla, J. L. Biochemical characterization of actin assembly mechanisms with ALS-associated profilin variants. European Journal of Cell Biology. 101 (2), 151212(2022).
  49. Pimm, M. L., Liu, X., Tuli, F., Lojko, A., Henty-Ridilla, J. L. Visualizing functional human profilin in cells and in vitro applications. bioRxiv. , (2021).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Dynamika aktyno-mikrotubularnainterakcje cytoszkieletowerekonstytucja in vitropolimeryzacja filamentów aktynowychmontaż mikrotubulbiałka regulacyjne cytoszkieletubiałko Taukomora perfuzyjnaanaliza kymograficzna
Wizualizacja dynamiki sprzężeń aktyny i mikrotubul in vitro za pomocą mikroskopii fluorescencji całkowitego wewnętrznego odbicia (TIRF)
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.