Artykuł metodologiczny

Rekonstrukcja zespołu septyny na błonach w celu zbadania właściwości i funkcji biofizycznych

2.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/64090

⸱

28 lipca 2022

 ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Biophysics, University of North Carolina at Chapel Hill, 2Curriculum in Genetics and Molecular Biology, University of North Carolina at Chapel Hill, 3Department of Biology, University of North Carolina at Chapel Hill

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Rekonstytucja bez komórek była kluczowym narzędziem do zrozumienia montażu cytoszkieletu, a prace w ostatniej dekadzie ustaliły podejścia do badania dynamiki septyny w systemach minimalnych. Przedstawiono tutaj trzy uzupełniające się metody obserwacji montażu septyny w różnych kontekstach membranowych: dwuwarstwy płaskie, podpory sferyczne i podpory prętowe.

Streszczenie

Większość komórek może wykrywać i zmieniać swój kształt, aby przeprowadzać podstawowe procesy komórkowe. U wielu eukariontów cytoszkielet septynowy jest integralnym elementem koordynującym zmiany kształtu, takie jak cytokineza, spolaryzowany wzrost i migracja. Septyny to białka tworzące włókna, które łączą się, tworząc różne struktury wyższego rzędu i, w wielu przypadkach, znajdują się w różnych obszarach błony plazmatycznej, w szczególności w regionach o dodatniej krzywiźnie w skali mikronów. Monitorowanie procesu składania septyny in vivo jest utrudnione ze względu na ograniczenia mikroskopii świetlnej w komórkach, a także złożoność interakcji zarówno z błonami, jak i elementami cytoszkieletu, co utrudnia ilościowe określenie dynamiki septyny w organizmach żywych. Na szczęście w ciągu ostatniej dekady nastąpił znaczny postęp w rekonstrukcji cytoszkieletu septyny w systemie bezkomórkowym w celu przeanalizowania mechanizmów kontrolujących składanie septyny w wysokich rozdzielczościach przestrzennych i czasowych. Podstawowe etapy składania septyny obejmują asocjację heterooligomerów septyny i dysocjację z membraną, polimeryzację we włókna oraz tworzenie struktur wyższego rzędu poprzez interakcje między włóknami. W tym miejscu przedstawiamy trzy metody obserwacji montażu septyny w różnych kontekstach: dwuwarstwy płaskie, podpory sferyczne i podpory prętowe. Metody te mogą być stosowane do określania parametrów biofizycznych septyn na różnych etapach składania: jako pojedyncze oktamery wiążące błonę, jako włókna i jako zespoły włókien. Używamy tych parametrów w połączeniu z pomiarami próbkowania krzywizny i adsorpcji preferencyjnej, aby zrozumieć, jak działa wykrywanie krzywizny w różnych skalach długości i czasu.

Wprowadzenie

Kształty komórek i wiele ich wewnętrznych kompartmentów są zależne od otaczających je błon lipidowych. Membrany to lepkosprężyste struktury, które mogą ulegać deformacji poprzez interakcje z białkami, sortowanie lipidów oraz działanie sił wewnętrznych i zewnętrznych w celu generowania różnorodnych kształtów1,2,3,4. Kształty te są często opisywane w kategoriach krzywizny membrany. Komórki wykorzystują różnorodny zestaw białek zdolnych do preferencyjnego gromadzenia się lub "wyczuwania" określonych krzywizn błony, aby zapewnić określoną czasoprzestrzenną kontrolę nad procesami, w tym transportem komórkowym, cytokinezą i migracją5,6. Dynamika maszynerii komórkowej na błonie jest szczególnie trudna do zaobserwowania ze względu na trudności w zrównoważeniu czasu i rozdzielczości przestrzennej ze zdrowiem komórki. Chociaż techniki superrozdzielczości mogą zapewnić szczegółowy obraz takich konstrukcji, wymagają one długotrwałych przejęć, które nie są dostosowane do ram czasowych montażu/demontażu w przypadku większości maszyn. Ponadto złożoność molekularna tych zespołów w ich naturalnym środowisku oraz mnogość ról, jakie może odgrywać pojedynczy składnik, sprawiają, że systemy minimalnej rekonstytucji są cennym narzędziem do badania zdolności funkcjonalnych cząsteczek.

Minimalny mimetyk błony został opracowany do badania właściwości błony i interakcji białko-błona na zewnątrz komórki. Mimetyki błonowe różnią się od wolnostojących dwuwarstw lipidowych, takich jak liposomy lub gigantyczne pęcherzyki jednowarstwowe, do wspieranych dwuwarstw lipidowych (SLB)7,8,9,10. SLB to błony biomimetyczne zakotwiczone w leżącym pod spodem podparciu, zwykle wykonane ze szkła, miki lub krzemionki11,12. Można użyć różnych geometrii, w tym powierzchni płaskich, kul, prętów, a nawet pofałdowanych lub mikrowzorów podłoży, aby jednocześnie badać interakcje białko-błona zarówno na wklęsłych, jak i wypukłych krzywiznach13,14,15,16,17,18. Tworzenie dwuwarstw rozpoczyna się od adsorpcji pęcherzyków na powierzchni hydrofilowej, po której następuje fuzja i pęknięcie, tworząc ciągłą dwuwarstwę (Rysunek 1)19. Dwuwarstwy są szczególnie podatne na mikroskopię świetlną i elektronową, zapewniając zarówno lepszą rozdzielczość czasową, jak i przestrzenną niż często osiągalna w komórkach. Zakrzywione SLB stanowią szczególnie atrakcyjny środek do badania wrażliwości krzywizny białka przy braku znacznej deformacji błony, co pozwala na rozróżnienie między wykrywaniem krzywizny a indukcją krzywizny, które często są niemożliwe do rozdzielenia w systemach wolnostojących.

Septyny to klasa białek cytoszkieletu tworzących włókna, dobrze znana ze swojej zdolności do gromadzenia się na dodatnio zakrzywionych błonach6,18,20. W trakcie cyklu komórkowego u drożdży septyny łączą się w pierścień i muszą się przegrupować, tworząc struktury klepsydry i podwójnego pierścienia związane odpowiednio z pojawianiem się pąków i cytokinezą21. Podczas gdy piękna praca została wykonana przy użyciu mikroskopii elektronowej z repliką platyny do obserwacji architektury septyny na różnych etapach cyklu komórkowego22, obserwowanie składania septyny w czasie za pomocą mikroskopii świetlnej w drożdżach spotkało się z ograniczoną rozdzielczością przestrzenną. Wcześniejsze prace nad septynami przy użyciu monowarstw lipidowych uwidocznionych za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM) były w stanie odtworzyć kilka interesujących struktur septynowych, takich jak pierścienie, wiązki i gazy23. Jednak techniki EM są również ograniczone pod względem rozdzielczości czasowej, w przeciwieństwie do mikroskopii fluorescencyjnej. Aby lepiej określić parametry kinetyczne wieloskalowego procesu składania septyny, zwróciliśmy się do wspieranej mimetyki membranowej, w której można dokładnie kontrolować geometrię membrany, warunki próbki i modalność obrazowania.

Opisane tutaj protokoły wykorzystują płaskie lub zakrzywione SLB, oczyszczone białko i kombinację technik mikroskopowych. Ilościowa fluorescencyjna mikroskopia konfokalna i mikroskopia fluorescencyjna całkowitego wewnętrznego odbicia (TIRFM) wykorzystano do pomiaru zarówno masowego wiązania białek na różnych krzywiznach błony, jak i do pomiaru kinetyki wiązania pojedynczych cząsteczek. Co więcej, protokół ten został dostosowany do stosowania w skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM) do badania ultrastruktury białek na różnych krzywiznach błony. Chociaż protokoły te koncentrują się na cytoszkielecie septyny, protokoły można łatwo modyfikować w celu zbadania wrażliwości na krzywiznę dowolnego białka, które czytelnik uzna za interesujące. Ponadto osoby pracujące w dziedzinach takich jak endocytoza lub transport pęcherzykowy mogą uznać te techniki za przydatne do badania zależnych od krzywizny zespołów kompleksów wielobiałkowych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

UWAGA: Tworzenie dwuwarstw lipidowych wymaga przygotowania monorozproszonych małych pęcherzyków jednowarstwowych (SUV). Proszę zapoznać się z wcześniej opublikowanym protokołem24 na temat formowania SUV-ów. Krótko mówiąc, wszystkie SUV-y są formowane przez sonikację sondy przez łącznie 12 minut przy 70% amplitudzie poprzez 4-minutowe okresy sonikacji, po których następują 2-minutowe okresy odpoczynku w lodowatej wodzie. Rozwiązania dla SUV-ów muszą być dobrze sprecyzowane i monorozproszone pod względem wielkości. Rozkłady wielkości SUV-ów można mierzyć na przykład za pomocą dynamicznego rozpraszania światła25.

1. Planarne dwuwarstwy lipidowe

  1. Czyszczenie plazmowe szkiełek
    UWAGA: Czyszczenie plazmowe usuwa zanieczyszczenia organiczne i zwiększa hydrofilowość szkła, zapewniając wydajną adsorpcję lipidów. Poniższe kroki mogą ulec zmianie lub wymagać optymalizacji w zależności od użytego środka do czyszczenia plazmowego i szklanych szkiełek nakrywkowych.
    1. Płucz myjkę plazmową przez 5 minut tlenem, aby usunąć powietrze z przewodów i komory. Ma to na celu zapewnienie, że podczas pracy czyszczalni plazmowej w przewodach i komorze znajduje się głównie tlen, co zapewnia bardziej spójne przygotowanie dwuwarstwowe.
    2. Podczas przedmuchiwania rozpylaj gaz obojętny, taki jak N2 lub Ar, na szkiełka z mikro pokrywą, aby usunąć kurz i cząstki stałe.
      OPCJONALNIE: Szkiełka nakrywkowe można myć, spryskując z każdej strony 100% izopropanolem, a następnie wodą. Powtórzyć płukanie izopropanolem z wodą 3x, a następnie wysuszyć strumieniemN2.
    3. Ułóż suche szkiełka nakrywkowe w ceramicznej kołysce. Umieść kołyskę z tyłu komory plazmowej tak, aby szkiełka nakrywkowe były równoległe do dłuższej krawędzi komory (dzięki temu pozostaną na miejscu podczas czyszczenia plazmowego). Uruchom myjkę plazmową na 15 minut z tlenem o maksymalnej mocy.
  2. Przygotowanie komory
    UWAGA: Opisana tutaj metoda wykorzystuje domowe komory z plastikowych probówek PCR do podtrzymywania objętości reakcji, ale odpowiednie mogą być również inne materiały o niskiej przyczepności, takie jak studzienki silikonowe.
    1. Za pomocą żyletki lub nożyczek odetnij nakrętkę tuż pod matową częścią probówki PCR o pojemności 0,2 ml (Rysunek 2).
    2. Pomaluj krawędź probówki PCR klejem aktywowanym promieniami UV, omijając wnętrze probówki. Delikatnie umieść klej w tubce PCR na środku szkiełka nakrywkowego oczyszczonego plazmowo.
      UWAGA: Aby uniknąć przedostania się kleju do wnętrza komory, użyj minimalnej ilości kleju, aby uzyskać uszczelnienie, i natychmiast potraktuj UV bez uderzania lub naruszania komory.
    3. Umieść komorę pod światłem UV o dużej długości fali na 5-7 minut, aby utwardzić klej.
  3. Formacja dwuwarstwowa
    UWAGA: Na tym etapie należy zastosować monorozproszone SUV-y, aby zapewnić wydajne formowanie dwuwarstwowe. Tabela 1 zawiera receptury dla wszystkich stosowanych w tworzeniu dwuwarstwowym, w tym stężenia podstawowe i końcowe stężenia buforowe.
    1. Dodać 40 μl wspieranego dwuwarstwowego buforu lipidowego (SLBB: 300 mM KCl, 20 mM HEPES, pH 7,4, 1 mM MgCl2; Tabela 1), 10 μl 5 mM SUV i 1 μL 100 mM CaCl2 do studzienki. Delikatnie potrząsać komorami z boku na bok, aby rozerwać działanie SUV-ów, a następnie inkubować w temperaturze 37 °C przez 20 min.
      UWAGA: Aby ograniczyć parowanie, inkubować na przykrytej szalce Petriego wilgotną chusteczką.
  4. Wypłukiwanie nadmiaru lipidów
    UWAGA: Ten krok usuwa nadmiar SUV-ów i działa jako etap wymiany bufora. Bardzo ważne jest, aby podczas mycia nie skrobać dwuwarstwy końcówką pipety; Jeśli szkło zostanie odsłonięte, septyny i wiele innych białek zwiążą się nieodwracalnie, zmniejszając efektywne stężenie białka.
    1. Po inkubacji przepłukać dwuwarstwę 6x 150 μl SLBB, pipetując w górę i w dół, aby za każdym razem wymieszać, unikając pęcherzyków.
      UWAGA: Dodać 150 μl bezpośrednio do 50 μl buforu i SUV już obecnych, co daje w sumie 200 μl w basenie reakcyjnym.
    2. Gdy będziesz gotowy do rozpoczęcia inkubacji z septynami lub innym wybranym białkiem, przemyj dwuwarstwę 6x 150 μl buforu reakcyjnego (RXN: 33,3 mM KCl, 50 mM HEPES, pH 7,4, 1,4 mg/ml BSA, 0,14% metylocelulozy, 1 mM BME).
      UWAGA: Aby uzyskać najlepsze wyniki, należy przygotować świeży bufor reakcyjny i zachować szczególną ostrożność podczas dobrego mieszania w reakcji, aby uniknąć pęcherzyków.
    3. Na ostatnim etapie płukania usunąć 125 μl buforu reakcyjnego, pozostawiając 75 μl w studzience. Dodać 25 μl septyn rozcieńczonych w buforze do przechowywania septyny (SSB: 300 mM KCl, 50 mM HEPES, pH 7,4, 1 mM BME) w żądanym stężeniu i zobrazować za pomocą mikroskopii TIRF26.
      UWAGA: Podczas ustawiania tego testu po raz pierwszy lub wprowadzania nowego składu lipidowego, dobrą praktyką jest zapewnienie swobodnej dyfuzji lipidów na powierzchni za pomocą odzyskiwania fluorescencji po fotowybielaniu (FRAP). Chociaż tempo odzysku będzie różne dla różnych składów lipidowych i z natury niższe niż w przypadku systemów wolnostojących, lipidy nie powinny być unieruchomione.

Obsługiwany dwuwarstwowy bufor lipidowy (SLBB)
składgłośnośćKońcowe stężenie
2 mln KCl1,5 ml300 mM
1 M SZYBY200 μL20 mM
500 mM MgCl220 μL1 mM
Woda8 ml
Bufor przed reakcją (PRB)
składgłośnośćKońcowe stężenie
2 mln KCl166 μL33,3 mln
1 M SZYBY500 μL50 mM
Woda9,33 ml
Bufor reakcyjny
składgłośnośćKońcowe stężenie
2 mln KCl166 μL33,3 mln
1 M SZYBY300 μL50 mM
10 mg/ml masy ciała1,39 ml1,39 mg/ml
1% Metyloceluloza1,39 ml0,0014
WodaDo 10 ml
Bme0,7 μl1 mM
Septin Bufor pamięci masowej (SSB)
składgłośnośćKońcowe stężenie
2 mln KCl1,5 ml300 mM
1 M SZYBY500 μL50 mM
WodaDo 10 ml
Bme0,7 μl1 mM

Tabela 1: Składniki buforowe do przygotowania wspieranej dwuwarstwy lipidowej i reakcji. Pokazane są objętości roztworów podstawowych, które są włączone do, oraz końcowe stężenia każdego składnika. SLB i PRB mogą być przechowywane w temperaturze pokojowej i ponownie wykorzystywane między eksperymentami. Bufor reakcyjny i SSB są odnawiane dla każdego eksperymentu.

2. Sferyczne dwuwarstwy lipidowe

UWAGA: Ten protokół wykorzystuje mikrosfery krzemionkowe zawieszone w ultraczystej wodzie o gęstości 10%. W przypadku wszelkich prac nad parametrami kinetycznymi składania białek ważne jest ścisłe kontrolowanie całkowitej powierzchni błony między eksperymentami a krzywiznami. Tabela 2 przedstawia skorygowane objętości kulek i bufora w celu utrzymania 5mm2 całkowitej powierzchni membrany. Ten protokół rozszerza poprzednio opublikowaną metodę8,18.

  1. Formacja dwuwarstwowa
    UWAGA: Jeśli chodzi o dwuwarstwowe płaszczyzny, ważne jest, aby mieć wysokiej jakości SUV-y do solidnego formowania dwuwarstwowego. W tabeli 2 wymieniono objętość kulek z roztworu o gęstości 10% oraz odpowiadające im objętości SLBB, które są używane do uzyskania końcowej powierzchni 5mm2 dla różnych średnic ściegów.
    1. Mikrosfery krzemionkowe (zwane również kulkami) mają tendencję do osiadania i zbijania się razem; aby wymieszać kulki i rozbić wszelkie skupiska, należy wirować butelkę przez 15 s, następnie kąpiel sonikacyjną przez 1 minutę i ponownie wirować przez 15 s.
    2. Wymieszać odpowiednią objętość kulek (Tabela 2) z odpowiednią objętością SLBB i 10 μl 5 mM SUV w probówce mikrowirówkowej o niskiej przyczepności o pojemności 0,5 ml.
    3. Kołysz mieszaninę kulek i lipidów od końca do końca przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Upewnij się, że ta inkubacja jest wykonywana na rotatorze, aby zapobiec sedymentacji.
  2. Przygotować komory na pegylowanych szkiełkach nakrywkowych
    UWAGA: Jeśli chodzi o dwuwarstwy płaskie, domowe komory z plastikowych probówek PCR są używane do podtrzymywania objętości reakcji, ale inne materiały o niskiej przyczepności, takie jak studzienki silikonowe, mogą działać równie dobrze.
    1. Podczas gdy koraliki się kołyszą, rozmrozić pegylowane szkiełko nakrywkowe w temperaturze pokojowej. Wytnij probówkę PCR o pojemności 0,2 ml i przyklej ją do szkiełka nakrywkowego zgodnie z opisem w kroku 1.2. W przypadku prowadnic 24 mm x 50 mm na jednej prowadnicy można zmieścić do 10 komór.
      UWAGA: W tym protokole wykorzystuje się szkiełka nakrywkowe ze szkła PEGylowanego o wymiarach 24 mm x 50 mm, które są przygotowywane z wyprzedzeniem. Krótko mówiąc, szkiełka nakrywkowe są dokładnie czyszczone poprzez sonikację w acetonie, metanolu i 3 M KOH. Szkiełka nakrywkowe są następnie funkcjonalizowane n-2-aminoetylo-3-aminopropylotrimetoksysilanem i kowalencyjnie łączone z walerianianem sukcynimidylu mPEG. Gotowe szkiełka nakrywkowe PEGylowane są przechowywane w zamknięciu próżniowym w temperaturze -80 °C. Aby zapoznać się z podobnym protokołem pasywacji, zobacz pracę Gidi et al.27. Chociaż sugerowane są tutaj szkiełka nakrywkowe ze szkła pegylowanego, skuteczne mogą być inne metody pasywacji, takie jak metody BSA lub poli-L-lizyny.
  3. Wypłukiwanie nadmiaru lipidów
    UWAGA: Ten krok służy do usunięcia nadmiaru SUV-ów i przeprowadzenia wymiany bufora. Kulki są płukane łącznie 4x buforem przedreakcyjnym (PRB: 33,3 mM KCl, 50 mM HEPES, pH 7,4). W tabeli 3 wymieniono prędkości wirowania w RCF dla różnych średnic ściegu.
    1. Wiruj koraliki w wyznaczonym RCF przez 30 s (Tabela 3). Jeśli używasz wielu rozmiarów koralików, utrzymuj koraliki na kołysaniu, aż nadejdzie czas na ich pranie.
      UWAGA: Nie warto sedymentować większych kulek w tym samym obrocie, co mniejsze kulki o mniejszej prędkości sedymentacji kulek, aby zaoszczędzić czas. Może to spowodować przyklejanie się koralików do siebie i naruszenie integralności dwuwarstwy.
    2. Po pierwszym wirowaniu usunąć 50 μl supernatantu i dodać 200 μl PRB. Po drugim i trzecim wirowaniu usuń 200 μl i dodaj 200 μl PRB. Po czwartym wirowaniu usunąć 200 μl i dodać 220 μl PRB. Energicznie pipetować do każdego prania.
      UWAGA: Ostateczna objętość zawiesiny jest inna niż w przypadku płukania. Nie wiruj kulek po inkubacji z lipidami, ponieważ może to pozostawić luki w dwuwarstwach. Aby uniknąć sedymentacji podczas pracy z innymi rozmiarami ściegów lub ustawiania innych części testu, umieść mieszaniny kulek z powrotem na rotatorze od końca do końca.
  4. Przygotowanie reakcji
    UWAGA: Ta reakcja ma na celu zachowanie całkowitej powierzchni błony reakcji na poziomie 5mm2 i uzyskanie końcowych warunków reakcji 100 mM KCl, 50 mM HEPES, 1 mg/ml BSA, 0,1% metylocelulozy i 1 mM BME.
    1. Jeśli wykonujesz test konkursowy z wieloma rozmiarami kulek, przygotuj mieszaninę 1:1, mieszając ze sobą równe objętości każdego rozmiaru kulki. Następnie wymieszaj 29 μl żądanej mieszaniny kulek (lub pojedynczej kulki) z 721 μl buforu RXN.
      UWAGA: Ważne jest, aby dokładnie wymieszać kulki na każdym etapie za pomocą pipety, aby uniknąć gęstych skupisk kulek; Spowoduje to bardziej równomierne rozłożenie ściegu i dokładną powierzchnię całkowitą.
    2. Zmieszać 75 μl rozcieńczonych kulek i 25 μl białka rozcieńczonego w SSB z dołkami.
      UWAGA: Autorzy zazwyczaj obrazują kompleksy septyny drożdży przy 1-50 nM.
    3. W przypadku pomiaru septyny w stanie ustalonym należy inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę, a następnie obrazować za pomocą mikroskopii zbliżeniowej TIRF lub konfokalnej.
pkt. pkt. TGL pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt.
Średnica ściegu (μm)Objętość dobrze wymieszanych kulek (μL)Objętość buforu SLB (μL)Objętość SUV-ów (μL)
Godzina 6,468,9461,110
Norma 5,067Rozdział 6310
Pytanie 3,17Godzina 4,3965,610
0,961,3368,710
0,540,7569,310
0,310,4369,610

Tabela 2: Znormalizowane objętości mikrosfer. W celu utrzymania równej powierzchni każdego rozmiaru kulki i utrzymania całkowitej powierzchni membrany na stałym poziomie między eksperymentami, obliczono objętości dla każdego rozmiaru kulki i bufora, które normalizowały całkowitą powierzchnię.

pkt. pkt. pkt. TGL
Średnica ściegu (μm)Prędkość sedymentacji (RCF)
0,31Rozdział 4.5
0,54Rozdział 4.5
0,962.3
Pytanie 3,170,8
Norma 5,060,3

Tabela 3: Prędkości sedymentacji dla mikrosfer o różnych średnicach. Dla każdej średnicy kulki pokazane minimalne prędkości sedymentacji wykorzystano do granulowania kulek w celu wypłukania niezwiązanych liposomów.

3. Dwuwarstwowe warstwy lipidowe podparte pręcikiem

UWAGA: W przeciwieństwie do innych testów przedstawionych tutaj, test prętowy nie pozwala na dokładną kontrolę całkowitej powierzchni membrany. Można być konsekwentnym pod względem ilości i objętości między eksperymentami, ale ponieważ skutkuje to prętami o różnych długościach i średnicach, trudno jest ekstrapolować całkowitą powierzchnię błony w reakcji. Tak więc, chociaż jest to doskonały test do badania wykrywania krzywizny z wieloma krzywiznami na jednej powierzchni i był przydatny do badania ultrastruktury septyny, nie jest zalecany do pomiarów kinetycznych. Ta metoda była wcześniej zgłaszana18 i jest tutaj rozwijana.

  1. Otrzymywanie prętów borokrzemianowych z filtrów z mikrofibry szklanej
    1. Rozerwij pojedynczy filtr z włókna szklanego GF/C o średnicy 42,5 mm na małe kawałki i umieść je w zlewce o pojemności 100 ml z 60 ml 100% etanolu. Kąpiel sonikować, aż roztwór stanie się nieprzezroczysty; Może to zająć zaledwie 20-30 minut przy drobno rozdrobnionym filtrze.
      UWAGA: Dokładnie poddaj sonikacji, aby rozbić duże kawałki; Im bardziej zdysocjowany/nieprzezroczysty, tym lepiej.
    2. Przykryj roztwór folią i przechowuj roztwór w temperaturze pokojowej przez noc.
  2. Formowanie dwuwarstw na prętach
    UWAGA: Ten etap jest wykonywany z nadmiarem lipidów, aby uzyskać pełne pokrycie pręcika, ponieważ niemożliwe jest ilościowe określenie całkowitej powierzchni w tej metodzie.
    1. Następnego dnia roztwór etanolu zostanie osadzony (krok 3.1.2.), więc dobrze go wymieszaj przed użyciem. Połączyć 10 μl roztworu pałeczki i 70 μl SLBB.
    2. Wirować z maksymalną prędkością w mini wirówce przez 30 s i usunąć 50 μl supernatantu. Ponownie zawiesić w kolejnych 50 μl SLBB i powtarzać wirowanie, w sumie cztery płukania, aby rozcieńczyć etanol.
      UWAGA: Podpórki pod pręty nie utworzą stałego granulu na dnie rury. Zamiast tego są rozmazane wzdłuż boku rurki; To sprawia, że trudno je całkowicie zachować podczas prania. Ponieważ całkowita powierzchnia w tym teście nie jest kontrolowana, nie ma nic złego w tym, że są one zakłócone.
    3. Połącz 10 μl dobrze wymieszanego roztworu pałeczki z 50 μl 5 mM SUV i 20 μl SLBB. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, obracając się od końca do końca, jak podczas tworzenia dwuwarstw na mikrosferach.
  3. Wypłukiwanie nadmiaru lipidów
    1. Podobnie jak w kroku 3.2.2., wirować roztwór pałeczki lipidowej z maksymalną prędkością w mini wirówce przez 30 sekund, aby wyprowadzić pręty pokryte membraną z roztworu.
    2. Po pierwszym wirowaniu usunąć 50 μl supernatantu i dodać 200 μl PRB. Po drugim i trzecim wirowaniu usuń 200 μl i dodaj 200 μl PRB. Po czwartym wirowaniu usunąć 200 μl, dodać 220 μl PRB i energicznie pipetować do wymieszania.
  4. Przygotowanie reakcji
    1. W probówce do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml wymieszać 721 μl buforu reakcyjnego z 29 μl roztworu pręcikowego. Dobrze wymieszaj.
    2. W probówce PCR o pojemności 0,2 ml wymieszaj 75 μl pałeczek w buforze reakcyjnym i 25 μl septyn w pożądanym stężeniu, rozcieńczonych w SSB. Pozostaw do inkubacji w temperaturze pokojowej przez co najmniej 1 godzinę.
  5. Przygotowanie do skaningowej mikroskopii elektronowej
    1. Po inkubacji dodać 100 μl mieszaniny septyny i pałeczki na okrągłe, pokryte PEG 12 mm szkiełko nakrywkowe i inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę na zamkniętej szalce Petriego.
    2. Utrwalić próbkę, wypełniając dno szalki Petriego (10 ml powinno wystarczyć) 2,5% aldehydem glutarowym w 0,05 M kakodylanu sodu (NaCo), pH 7,4, przez 30 minut. Odsysać ciecz szklaną pipetą. Przemyć próbkę przez inkubację z 10 ml 0,05 M NaCo przez 5 minut i powtórzyć czyny, łącznie dwa przemycia.
    3. Załóż w 0,5% buforze kakodylowym OsO4 przez 30 min, a następnie przemyj 3x w 0,05 M NaCo (5 min/pranie).
    4. Inkubować próbkę z 1% kwasem garbnikowym przez 15 min, a następnie przemywać w NaCo 3x. Inkubować przez 15 min w 0,5% OsO4 i przemywać 3x NaCo.
    5. Odwodnić próbki, stosując zwiększające stężenie etanolu: 30% EtOH przez 5 minut, 2 razy; 50% EtOH przez 5 minut; 75% EtOH przez 5 minut; i 100% EtOH przez 5 minut, 2 razy. Następnie wykonaj kolejne 10 minut inkubacji.
    6. Inkubować w płynie przejściowym (heksametylodilazan) 3x (5 min, 10 min, następnie 5 min).
    7. Pozostawić do wyschnięcia na powietrzu, a następnie umieścić próbki w eksykatorze do momentu napylenia. Warstwę 4 nm należy napylić stopem złota i palladu, a następnie zobrazować na skaningowym mikroskopie elektronowym.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Po przygotowaniu każdej SLB septyny lub białko zainteresowania można inkubować z odpowiednim podłożem i obrazować za pomocą TIRFM, mikroskopii konfokalnej lub SEM. Przedstawione tutaj wyniki uzyskano przy użyciu septyn rekombinowanych, ekspresowanych i oczyszczonych z E. coli17. Wykorzystując TIRFM na płaskich SLB, można określić długość filamentów i ich elastyczność, zmierzyć współczynniki dyfuzji oraz obserwować proces składania w czasie28,

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Błony komórkowe przybierają wiele różnych kształtów, krzywizn i właściwości fizykochemicznych. W celu zbadania maszynerii w skali nanometrowej, za pomocą której komórki budują zespoły w skali mikrometrowej, konieczne jest zaprojektowanie minimalnych systemów rekonstytucji mimetyki błonowej. Protokół ten przedstawia techniki, które precyzyjnie kontrolują zarówno krzywiznę, jak i skład membrany, umożliwiając jednocześnie użytkownikowi łatwe wykonywanie ilościowych pomiarów fluorescencji przy użyciu powszechnie dostępnych t...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie pozostają w konflikcie interesów.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez National Institutes of Health (NIH) Grant nr R01 GM-130934 oraz National Science Foundation (NSF) Grant MCB- 2016022. B.N.C, E.J.D.V. i K.S.C. były częściowo wspierane przez grant z Narodowego Instytutu Ogólnych Nauk Medycznych w ramach nagrody T32 GM119999.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Probówki do PCR 0,2 ml z płaską nakrętką, naturalneProbówki o137-211C(EX)
0,5 mlUSA Scientific1405-2600
Beta merkaptoetanol (BME)Sigma-AldrichM6250-100ML
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)Sigma-AldrichA4612-25G
Szkło nakrywkowe do produkcji szkiełek nakrywkowych PEGylowanychThermo Scientific152450Richard-Allan Scientific SLIP-RITE Szkło osłonowe 24x50 #1.5
DOPCAvanti Polar Lipids850375
Egg Liss Rhodamine PEAvanti Polar Lipids810146
EMS Aldehyd glutarowy wodny 25%, klasa EMVWR16220
EMS Bufor kakodylanu soduVWR11652
Etanol, 200 proofFisher Scientific04-355-223EA
HEPESSigma AldrichH3375-1KG
HeksametyldisilazanSigma-Aldrich440191
Chlorek magnezuVWR7791-18-6
Metyloceluloza 4000cpSigma-AldrichM052-100G
Szkiełka nakrywkowe z mikroszkła do dwuwarstw płaskichMatsunamiWycofanez produkcji 22x22
Mini wirówka
Niefunkcjonalizowane mikrosfery krzemionkoweBangs Laboratories, Inc.Zależy od rozmiaru: SS0200*-SS0500*Krzemionka w zawiesinie wodnej
Klej optycznyNorland ThorlabsNOA 68Elastyczny klej do szkła lub tworzyw sztucznych
Tetratlenek osmuMillipore Sigma20816-12-0
ParafilmVWR52858-000
Środek do czyszczeniaplazmy Wytrawianie plazmowePE-25Napięcie: 120V, 60Hz. Prąd: 15 AMPERÓW
Chlorek potasuVWR0395-1kg
Okrągła szklana szklana, #1.5 12mm   VWR64-0712
Wanna SonicatorBranson1510R-MTMyjka ultradźwiękowa Branson. 50-60 Hz. Moc wyjściowa: 70W
Soy PIAvanti Polar Lipids840044
Wirówka stołowaEppendorf22331
SpektrolinaUVENF-260C115 V, 60 Hz, 0,20 AMPS
Bibuła filtracyjna z mikrofibry WhatmanGlassVWR28455-030Średnica 42,5 mm, klasa GF/C
niskiej przyczepności Watson lampy

Bibliografia

  1. Zimmerberg, J., Kozlov, M. M. How proteins produce cellular membrane curvature. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (1), 9-19 (2006).
  2. Parthasarathy, R., Groves, J. T. Curvature and spatial organization in biological membranes. Soft Matter. 3 (1), 24-33 (2007).
  3. Mao, Y., Baum, B. Tug of war-The influence of opposing physical forces on epithelial cell morphology. Developmental Biology. 401 (1), 92-102 (2015).
  4. Ranganathan, R., Alshammri, I., Peric, M. Lipid organization in mixed lipid membranes driven by intrinsic curvature difference. Biophysical Journal. 118 (8), 1830-1837 (2020).
  5. Bigay, J., Casella, J. -F., Drin, G., Mesmin, B., Antonny, B. ArfGAP1 responds to membrane curvature through the folding of a lipid packing sensor motif. The EMBO Journal. 24 (13), 2244-2253 (2005).
  6. Bridges, A. A., Jentzsch, M. S., Oakes, P. W., Occhipinti, P., Gladfelter, A. S. Micron-scale plasma membrane curvature is recognized by the septin cytoskeleton. Journal of Cell Biology. 213 (1), 5-6 (2016).
  7. Picard, F., Paquet, M. -J., Dufourc, ÉJ., Auger, M. Measurement of the lateral diffusion of dipalmitoylphosphatidylcholine adsorbed on silica beads in the absence and presence of melittin: A 31P two-dimensional exchange solid-state NMR study. Biophysical Journal. 74 (2), 857-868 (1998).
  8. Fu, R., et al. Spherical nanoparticle supported lipid bilayers for the structural study of membrane geometry-sensitive molecules. Journal of the American Chemical Society. 137 (44), 14031-14034 (2015).
  9. Vanni, S., Hirose, H., Barelli, H., Antonny, B., Gautier, R. A sub-nanometre view of how membrane curvature and composition modulate lipid packing and protein recruitment. Nature Communications. 5 (1), 4916(2014).
  10. Gill, R. L., et al. Structural basis for the geometry-driven localization of a small protein. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (15), 1908-1915 (2015).
  11. Pan, J., Dalzini, A., Song, L. Cholesterol and phosphatidylethanolamine lipids exert opposite effects on membrane modulations caused by the M2 amphipathic helix. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1861 (1), 201-209 (2019).
  12. Beckers, D., Urbancic, D., Sezgin, E. Impact of nanoscale hindrances on the relationship between lipid packing and diffusion in model membranes. The Journal of Physical Chemistry B. 124 (8), 1487-1494 (2020).
  13. Lee, A. A., et al. Stochasticity and positive feedback enable enzyme kinetics at the membrane to sense reaction size. Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (47), 2103626118(2021).
  14. Ferhan, A. R., et al. Nanoplasmonic sensing architectures for decoding membrane curvature-dependent biomacromolecular interactions. Analytical Chemistry. 90 (12), 7458-7466 (2018).
  15. Beber, A., et al. Membrane reshaping by micrometric curvature sensitive septin filaments. Nature Communications. 10 (1), 420(2019).
  16. Lou, H. -Y., et al. Membrane curvature underlies actin reorganization in response to nanoscale surface topography. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (46), 23143-23151 (2019).
  17. Bridges, A. A., et al. Septin assemblies form by diffusion-driven annealing on membranes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (6), 2146-2151 (2014).
  18. Cannon, K. S., Woods, B. L., Crutchley, J. M., Gladfelter, A. S. An amphipathic helix enables septins to sense micrometer-scale membrane curvature. Journal of Cell Biology. 218 (4), 1128-1137 (2019).
  19. Johnson, J. M., Ha, T., Chu, S., Boxer, S. G. Early steps of supported bilayer formation probed by single vesicle fluorescence assays. Biophysical Journal. 83 (6), 3371-3379 (2002).
  20. Lobato-Márquez, D., et al. Mechanistic insight into bacterial entrapment by septin cage reconstitution. Nature Communications. 12 (1), 4511(2021).
  21. Gladfelter, A. S., Pringle, J. R., Lew, D. J. The septin cortex at the yeast mother-bud neck. Current Opinion in Microbiology. 4 (6), 681-689 (2001).
  22. Ong, K., Wloka, C., Okada, S., Svitkina, T., Bi, E. Architecture and dynamic remodelling of the septin cytoskeleton during the cell cycle. Nature Communications. 5, 1-10 (2014).
  23. Bertin, A., et al. Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate promotes budding yeast septin filament assembly and organization. Journal of Molecular Biology. 404 (4), 711-731 (2010).
  24. Bridges, A. A., Gladfelter, A. S. In vitro reconstitution of septin assemblies on supported lipid bilayers. Methods in Cell Biology. 136, 57-71 (2016).
  25. Hupfeld, S., Holsæter, A. M., Skar, M., Frantzen, C. B., Brandl, M. Liposome size analysis by dynamic/static light scattering upon size exclusion-/field flow-fractionation. Journal of Nanoscience and Nanotechnology. 6 (9), 3025-3031 (2006).
  26. Johnson, D. S., Jaiswal, J. K., Simon, S. Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy illuminator for improved imaging of cell surface events. Current Protocols in Cytometry. (1), Chapter 12, Unit 12.29(2012).
  27. Gidi, Y., Bayram, S., Ablenas, C. J., Blum, A. S., Cosa, G. Efficient one-step PEG-silane passivation of glass surfaces for single-molecule fluorescence studies. ACS Applied Materials & Interfaces. 10 (46), 39505-39511 (2018).
  28. Woods, B. L., et al. Biophysical properties governing septin assembly. bioRxiv. , (2021).
  29. Cannon, K. S., et al. A gene duplication of a septin provides a developmentally-regulated filament length control mechanism. bioRxiv. , (2021).
  30. Pincet, F., et al. FRAP to characterize molecular diffusion and interaction in various membrane environments. PLOS One. 11 (7), 0158457(2016).
  31. Reimhult, E., Höök, F., Kasemo, B. Intact vesicle adsorption and supported biomembrane formation from vesicles in solution: Influence of surface chemistry, vesicle size, temperature, and osmotic pressure. Langmuir. 19 (5), 1681-1691 (2003).
  32. Cha, T., Guo, A., Zhu, X. -Y. Formation of supported phospholipid bilayers on molecular surfaces: Role of surface charge density and electrostatic interaction. Biophysical Journal. 90 (4), 1270-1274 (2006).
  33. Andrews, J. T., et al. Formation of supported lipid bilayers (SLBs) from buffers containing low concentrations of group I chloride salts. Langmuir. 37 (44), 12819-12833 (2021).
  34. Gurtovenko, A. A., Vattulainen, I. Effect of NaCl and KCl on phosphatidylcholine and phosphatidylethanolamine lipid membranes: Insight from atomic-scale simulations for understanding salt-induced effects in the plasma membrane. The Journal of Physical Chemistry B. 112 (7), 1953-1962 (2008).
  35. Danuser, G., Waterman-Storer, C. M. Quantitative fluorescent speckle microscopy of cytoskeleton dynamics. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 35 (1), 361-387 (2006).
  36. Chan, Y. -H. M., Boxer, S. G. Model membrane systems and their applications. Current Opinion in Chemical Biology. 11 (6), 581-587 (2007).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Rekonstytucja b onwspierane dwuwarstwy lipidoweoddzia ywanie bia ek z b onamiformowanie filament w septynwykrywanie krzywiznymikroskopia TIRFmikroskopia konfokalnaprzygotowanie liposom w

Powiązane artykuły