Badanie tanich metod pomiaru długości życia i długości zdrowia u Caenorhabditis elegans

Toni Castro Torres; Darius Moaddeli; Maxim Averbukh; Aeowynn J. Coakley; Naibedya Dutta; Gilberto Garcia; Ryo Higuchi-Sanabria

doi:10.3791/64091

Artykuł metodologiczny

Badanie tanich metod pomiaru długości życia i długości zdrowia u Caenorhabditis elegans

6.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/64091

⸱

18 maja 2022

Toni Castro Torres^*¹ , Darius Moaddeli^*¹ , Maxim Averbukh¹ , Aeowynn J. Coakley¹ , Naibedya Dutta¹ , Gilberto Garcia¹ , Ryo Higuchi-Sanabria¹

¹Leonard Davis School of Gerontology, University of Southern California

^* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Caenorhabditis elegans służy jako doskonały system modelowy z solidnymi i tanimi metodami badania zdrowia, długości życia i odporności na stres.

Streszczenie

Odkrycie i rozwój Caenorhabditis elegans jako organizmu modelowego miało wpływ na biologię, szczególnie na dziedzinę starzenia. Wiele historycznych i współczesnych badań zidentyfikowało tysiące paradygmatów zmieniających długość życia, w tym mutacje genetyczne, transgeniczną ekspresję genów i hormezę, korzystną ekspozycję na stres o niskim stopniu nasilenia. Dzięki swoim licznym zaletom, w tym krótkiej żywotności, łatwej i taniej konserwacji oraz w pełni zsekwencjonowanemu genomowi z homologią do prawie dwóch trzecich wszystkich ludzkich genów, C. elegans szybko został przyjęty jako wybitny model biologii stresu i starzenia się. W tym miejscu bada się kilka znormalizowanych metod pomiaru długości życia i zdrowia, które można łatwo dostosować do prawie każdego środowiska badawczego, zwłaszcza tych o ograniczonym sprzęcie i funduszach. Przedstawiono niezwykłą użyteczność C. elegans, podkreślając zdolność do przeprowadzania potężnych analiz genetycznych w biologii starzenia się bez konieczności korzystania z rozległej infrastruktury. Na koniec omówiono ograniczenia każdej z analiz i alternatywne podejścia do rozważenia.

Wprowadzenie

Od czasu publikacji 'The genetics of Caenorhabditis elegans', jednego z najbardziej wpływowych artykułów Sydneya Brennera w 1974 roku, ten mikroskopijny robak jest uważany za wybitny system modelowy do badania tajemnic biologicznych¹. W 1977 Michael R. Klass opublikował metodę pomiaru długości życia C. elegans i stworzył ten model do badania starzenia się². Badania mające na celu zrozumienie związku między stresem a długowiecznością rozpoczęły się od zidentyfikowania pojedynczej mutacji w genie wieku 1, co spowodowało wydłużenie życia C. elegans³. Co więcej, współczesne badania zidentyfikowały inne mutacje zwiększające długość życia, które ujawniły długowieczne zmutowane robaki, które wykazują zwiększoną odporność na stres⁴^,⁵^,⁶. Dzięki swoim wielu zaletom, w tym krótkiej żywotności, łatwej konserwacji, całkowicie zsekwencjonowanemu genomowi zawierającemu homologię do około dwóch trzecich wszystkich genów powodujących choroby u ludzi, dostępności i łatwości korzystania z bibliotek interferencji RNA (RNAi) oraz fizjologicznemu podobieństwu do ludzi⁷^,⁸^,⁹, C. elegans szybko został przyjęty jako wybitny model dla biologii stresu i starzenia się.

Być może największymi zaletami C. elegans są niezwykle niskie koszty utrzymania, łatwość eksperymentowania i różnorodność narzędzi genetycznych dostępnych do badań. C. elegans są zwykle uprawiane na stałym podłożu agarowym ze źródłem pożywienia E. coli. Dwa powszechnie używane szczepy E. coli to standardowy OP50, szczep B, który jest prawdopodobnie najczęściej używany¹⁰, oraz HT115, szczep K-12, który jest używany głównie do eksperymentów RNAi¹¹^,¹². Szczep HT115 K-12 jest nosicielem delecji RNazy RNAIII, mutacji, która jest niezbędna w metodach RNAi, w których wykorzystuje się plazmidy eksprymujące dsRNA odpowiadające poszczególnym genom C. elegans. Wektory żywieniowe dsRNA pozwalają na silne eliminację genów C. elegans bez konieczności skomplikowanych krzyżówek lub edycji genomu, ponieważ bakterie przenoszące te plazmidy mogą być bezpośrednio karmione nicieniami. Tysiące tych bakteryjnych wektorów RNAi istnieje w tle HT115, w tym najpopularniejsza biblioteka Vidal RNAi z >19 000 indywidualnych konstruktów RNAi¹³ oraz biblioteka Ahringer RNAi z 16 757 konstruktami RNAi¹⁴. Jednak diety bakteryjne OP50 i HT115 mają duże różnice w profilu metabolicznym, w tym różnice w witaminie B12¹⁵^,¹⁶. Dlatego zaleca się przeprowadzanie wszystkich eksperymentów na jednym źródle bakterii, jeśli to możliwe, aby uniknąć interakcji gen-dieta, które mogą wprowadzić wiele czynników zakłócających, jak opisano wcześniej¹⁷^,¹⁸^,¹⁹. Ze względu na jego łatwość, zwierzęta są utrzymywane na OP50 we wszystkich opisanych tutaj warunkach eksperymentalnych, ale wszystkie eksperymenty są wykonywane na HT115, jak opisano wcześniej²⁰. Krótko mówiąc, zwierzęta są utrzymywane w OP50 i przenoszone do HT115 po synchronizacji (po bieleniu) w celu uzyskania spójności między eksperymentami RNAi i nie-RNAi. Alternatywnie można również użyć szczepu OP50 kompetentnego do RNAi, który zawiera podobną delecję RNazy RNAIII znajdującej się w szczepie E. coli K12 HT115²¹.

Być może jednym z głównych ograniczeń dla eksperymentów RNAi u C. elegans jest obawa o skuteczność knockdownu. Chociaż skuteczność knockdown można zweryfikować za pomocą qPCR lub western blot, wymagają one drogiego sprzętu i odczynników oraz ograniczają się do analizy masowej. Jest to jeszcze bardziej niepokojące, biorąc pod uwagę konkretne komórki, takie jak neurony, które są oporne (mniej wrażliwe) na RNAi. Podczas gdy wydajność RNAi w określonych komórkach może być zwiększona poprzez nadekspresję SID-1, białka transbłonowego niezbędnego do wychwytu dsRNA²², jest to nadal ograniczone do specyficznych dla typu komórki wzorców ekspresji promotorów używanych do tych konstruktów, a zatem nokauty i mutacje genów są najbardziej niezawodnymi sposobami na wyczerpanie funkcji genów. Poza knockdownem za pośrednictwem RNAi, C. elegans są również wysoce podatne na edycję genomu za pomocą strategii opartych na CRISPR²³^,²⁴^,²⁵ i nadekspresja konstruktów transgenicznych poprzez mikroiniekcje, z opcją integracji konstruktów transgenicznych poprzez napromieniowanie lub integrację opartą na transpozonach²⁶^,²⁷^,²⁸^,²⁹. Metody te wymagają jednak drogiego sprzętu do mikroiniekcji, a wysoki koszt przewodników RNA lub enzymu Cas9 może uniemożliwić stosowanie tych metod w instytucjach o ograniczonych funduszach. Zamiast tego tysiące transgenicznych linii i mutantów są łatwo dostępne za kilka dolarów zarówno w Caenorhabditis Genetics Center (CGC), jak i National Bioresource Project (NBRP). NBRP oferuje izolowane mutanty dla dużej liczby genów C. elegans, w tym opublikowane, a zatem zweryfikowane zmutowane szczepy, mutanty pochodzące z projektów pilotażowych oraz mutanty, które nie zostały jeszcze scharakteryzowane. W przeciwieństwie do tego, CGC jest depozytariuszem w większości opublikowanych i uznanych linii C. elegans ze społeczności naukowej. Obie firmy wysyłają szczepy na cały świat po bardzo rozsądnych cenach i oferują szeroką gamę opcji dla osób o ograniczonej zdolności do syntezy szczepów we własnym zakresie.

Tutaj oferowana jest kolekcja wyselekcjonowanych metod, które prawdopodobnie będą najtańszymi metodami do oznaczania długości życia i zdrowia C. elegans. Wszystkie przedstawione tutaj metody wymagają taniego sprzętu i materiałów eksploatacyjnych oraz wykorzystują wyłącznie szczepy łatwo dostępne w CGC. Być może najbardziej zaporowy dla testów długowieczności i przeżycia u C. elegans jest koszt płytek z pożywkami wzrostowymi nicieni (NGM). Ponieważ C. elegans są hermafrodytami i samozapładniają, standardowe testy przeżywalności wymagają, aby dorosłe zwierzęta były stale oddalane od ich potomstwa, aby uniknąć zakażenia potomstwem. Proces ten jest nie tylko czasochłonny, ale może stać się kosztowny ze względu na konieczność użycia około 100 płytek na warunek do przeprowadzenia jednego testu żywotności. W tym przypadku dostępne są dwie alternatywy: wykorzystanie wrażliwego na temperaturę mutanta bezzarodkowego, GLP-4(bn2) lub sterylizacja chemiczna przy użyciu 5-fluoro-2'-deoksyurydyny (FUDR). glp-4 koduje syntetazę tRNA valyl-aminoacylu, a wrażliwe na temperaturę GLP-4(bn2) są nierozrodcze w ograniczonych temperaturach z powodu zmniejszonej translacji białek³⁰^,³¹. FUDR to solidna metoda chemicznej sterylizacji C. elegans poprzez zapobieganie replikacji DNA, a tym samym hamowanie reprodukcji³². Chociaż FUDR może być zbyt drogi dla niektórych laboratoriów, do chemicznej sterylizacji robaków wymagana jest tylko niewielka ilość, a jego stabilność w postaci proszku może sprawić, że będzie to wykonalne dla większości grup. Wykorzystanie wrażliwego na temperaturę mutanta glp-4(bn2) jest z pewnością najtańszą opcją, ponieważ jedynym wymogiem jest inkubator do przestawienia zwierząt do restrykcyjnej temperatury 25 °C; Należy jednak zauważyć, że wzrost w temperaturze 25 °C może powodować łagodny stres cieplny³³^,³⁴. Niezależnie od metody, wykorzystanie sterylnych zwierząt może znacznie obniżyć koszty materiałów eksploatacyjnych wymaganych do testów związanych z wiekiem.

Aby badać starzenie się, standardowe testy długości życia są konwencjonalne, ponieważ paradygmaty, które zmieniają długowieczność, mają bezpośredni wpływ na starzenie się. Jednak pomiary długości zdrowia i tolerancji na stres dostarczają dodatkowych informacji na temat zdrowia organizmu. W tym miejscu oferowanych jest kilka metod pomiaru długości zdrowia: 1) płodność jako miara zdrowia reprodukcyjnego; 2) liczebność lęgu jako miara zdrowia rozwojowego i żywotności wypuszczonego potomstwa; oraz 3) zachowanie lokomotoryczne jako miara funkcji i motoryki mięśni, które są bezpośrednio skorelowane ze starzeniem się. Dodatkowo oferowane są testy tolerancji na stres: przeżycie na stres ER, stres mitochondrialny/oksydacyjny oraz przeżycie stresu termicznego. Rzeczywiście, zwierzęta o zwiększonej odporności na stres ER ³⁵^,³⁶, mitochondrialny stres³⁷ i stres termiczny³⁸ wykazują zwiększoną długość życia. Stres ER jest stosowany poprzez wystawienie C. elegans na działanie tunicycyny, która blokuje glikozylację sprzężoną z N i powoduje akumulację nieprawidłowo sfałdowanych białek³⁹. Stres mitochondrialny/oksydacyjny jest indukowany przez ekspozycję na parakwat, który indukuje powstawanie ponadtlenków szczególnie w mitochondriach⁴⁰. Stres cieplny jest stosowany poprzez inkubację zwierząt w temperaturze 34-37 °C³³^,⁴¹. Wszystkie opisane tutaj testy można wykonać przy minimalnym sprzęcie i funduszach oraz oferują różnorodne narzędzia do badania starzenia się w różnych grupach.

Protokół

1. Wzrost i utrzymanie C. elegans

Nalewanie płytek z pożywką do wzrostu nicieni (NGM)
1. Hoduj C. elegans na standardowych 2% płytkach agarowych z pożywką do wzrostu nicieni (NGM) składającą się z 1 mM CaCl₂, 5 μg / ml cholesterolu, 25 mM KPO₄ (pH 6,0), 1 mM MgSO₄, 0,25% w/v peptonu i 51,3 mM NaCl.
2. Na 1 l płytek agarowych NGM odmierz 2,5 g peptonu, 3,0 g NaCl i 20 g agaru do 1-litrowej kolby z mieszadłem.
  UWAGA: Zaleca się standaryzację określonego źródła agaru, ponieważ zaobserwowaliśmy różnice w sztywności między markami, co może mieć wpływ na odtwarzalność. Tutaj Bacto-Agar jest ściśle stosowany. Dodatkowo zaleca się dodawanie agaru bezpośrednio do autoklawowanej kolby, ponieważ agar nie rozpuści się całkowicie bez podgrzania, a przeniesienie roztworu zawierającego agar spowoduje utratę agaru i błędy w stężeniu.
3. Dodać dH₂O do 970 ml.
  UWAGA: 30 ml płynnych dodatków po sterylizacji spowoduje, że ostateczna objętość wyniesie 1 l. W naszych rękach ~951 ml dH₂O będzie potrzebne do osiągnięcia 970 ml końcowej objętości.
4. Sterylizuj roztwór agaru NGM za pomocą standardowego sterylizatora w autoklawie lub pożywce w celu skutecznej sterylizacji.
  UWAGA: W tym momencie sterylny agar NGM może być przechowywany przez kilka miesięcy w temperaturze pokojowej. W przypadku przechowywania, agar NGM można zawiesić w kuchence mikrofalowej z impulsami 15-45 s, aby zapobiec wykipieniu roztworu, lub w podgrzanej łaźni wodnej.
5. Pozwól roztworowi mieszać, aż ostygnie do temperatury 60-75 °C. Mieszanie podczas chłodzenia jest ważne, aby zapobiec nierównomiernemu chłodzeniu, które może spowodować zestalenie się niektórych agarów.
6. Gdy roztwór ostygnie, podgrzej łaźnię wodną lub kąpiel perełkową do temperatury 65-70 °C.
7. Gdy roztwór ostygnie do 60-75 °C, dodaj płynne dodatki: 2,0 ml 0,5 M CaCl₂, 1 ml 5 mg/ml cholesterolu, 25 ml 1 M KPO₄ (pH 6,0) i 0,5 M_MgSO4 (patrz Tabela 1 dla przepisów dla wszystkich odczynników) i pozostaw roztwór do wymieszania przez ~5 minut, aby zapewnić całkowite wymieszanie.
  UWAGA: Leki mogą być również zawarte na tabliczkach (np. dodać 1 ml 100 mg/ml karbenicyliny i 1 ml 1 M IPTG; dodać 10 ml 2,5 mg/ml tunikamycyny; dodać 10 ml 400 mM parakwatu).
8. Zanurzyć kolbę zawierającą agar NGM w łaźni wodnej o temperaturze 65-70 °C, aby zapobiec krzepnięciu agaru NGM podczas nalewania do płytek.
9. Odpipetować 9-11 ml roztworu do każdej płytki o średnicy 60 mm lub 20-30 ml roztworu do każdej płytki o średnicy 100 mm.
  UWAGA: Zaleca się używanie najmniejszej dostępnej objętości pipety, aby uniknąć wycieków NGM spowodowanych rozszerzaniem się powietrza w pipecie. Pipetowanie o 1-2 ml więcej pożywki niż zostanie dodane do każdej płytki, aby uniknąć całkowitego opróżnienia pipety, pomoże zapobiec tworzeniu się pęcherzyków powietrza. Alternatywnie, płytki można przelewać ręcznie bezpośrednio z butelki do talerza, ale zdecydowanie zaleca się pipetowanie, aby uzyskać płytki o równej objętości. Płytki o jednakowej objętości są ważne dla zapewnienia podobnych stężeń roztworów przy stosowaniu metod, w których roztwory są nakładane bezpośrednio na płytkę (patrz krok 1.1.17). Równe objętości pozwalają również na łatwą mikroskopię w celu utrzymania podobnej płaszczyzny ogniskowej na płytkach.
10. Umieść pipetę z powrotem w podgrzanym roztworze, aby utrzymać temperaturę i zapobiec zestaleniu się agaru NGM.
11. Powtórz powyższe dwa kroki dla wszystkich płyt.
12. Pozwól płytkom agarowym NGM zestalać się przez noc.
13. Po zastygnięciu szalek należy je przechowywać do 3 miesięcy w temperaturze 4 °C lub przejść do kroku 1.1.14 w przypadku płytek wysiewających z bakteriami. Przechowuj talerze w szczelnych pojemnikach, aby zatrzymać wilgoć i utrzymać jakość płyty.
14. Hoduj kulturę OP50 w bulionie lizogenicznym (LB) lub równoważnym pożywce do wyboru przez 24-48 godzin w temperaturze otoczenia (~22-25 °C) lub hoduj kulturę HT115 w LB + antybiotyki (ampicylina/węglowodan + tetracyklina jest zalecana dla HT115) z wytrząsaniem w temperaturze 37 °C przez 12-16 h.
  UWAGA: Zaleca się uprawę OP50 w temperaturze pokojowej, ponieważ stwierdzono bardziej agresywny wzrost OP50 w temperaturze 37 °C, co wpływa na długość życia C. elegans. W przeciwieństwie do tego, HT115 ma wolniejsze tempo wzrostu i tworzy mniej gęste kultury; dlatego zaleca się uprawę HT115 w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem.
15. Wysiewać objętość 100-200 μl nasyconej kultury OP50/HT115 na płytkę 60 mm lub 1 ml na płytkę 100 mm.
16. Pozostaw talerze do wyschnięcia na noc na blacie i odczekaj dodatkowy dzień na wyschnięcie, jeśli talerze są nadal mokre. Przechowywać płytki w szczelnie zamkniętych pojemnikach w temperaturze 4 °C przez ~2 miesiące.
17. Opcjonalnie: Dodaj leki bezpośrednio na płytki agarowe NGM (np. 100 μl 10 mg/ml roztworu FUDR), aby chemicznie wysterylizować robaki.
Utrzymywanie zasobów C. elegans
1. Prawidłowo oznacz spód płytki z agarem NGM z nasionami. Oznacz krawędzie na spodzie płytki, aby zapobiec blokowaniu przepływu światła na standardowych mikroskopach preparacyjnych.
2. Używając standardowego mikroskopu preparacyjnego, zgarnij wybrane bakterie na C. elegans pick.
  UWAGA: W tym protokole użyto kilofa składającego się z drutu 90%/10% platynowo-irydowego przymocowanego do końca szklanej pipety Pasteura.
3. Za pomocą bakterii zbierz 10-20 jaj, zwierząt L1, L2 lub L3 i przenieś je na nowo oznakowaną płytkę agarową NGM z nasionami.
  UWAGA: Najlepiej zbierać młodsze zwierzęta; Z doświadczenia autorów wynika, że w przypadku standardowych zwierząt typu dzikiego przemieszczenie 10-20 jaj na młode zwierzę pozwoli na wzrost płytki w temperaturze 15 °C bez głodu. W przypadku zwierząt transgenicznych lub zmutowanych ze zmniejszoną płodnością należy wprowadzić więcej zwierząt na płytkę.
4. W przypadku zwierząt o płodności typu dzikiego i hodowanych w temperaturze 15 °C należy powtarzać kroki 1.2.1–1.2.3 co 7 dni w celu utrzymania tygodniowego stada. W przypadku zwierząt hodowanych w temperaturze 20 °C kroki 1.2.1–1.2.3 należy powtarzać co 4–5 dni, aby zapobiec głodowi.
Synchronizacja robaków za pomocą bleaching
UWAGA: Pełna płytka z agarem NGM o średnicy 60 mm (np. 1-tygodniowe płytki wyjściowe uprawiane w temperaturze 15 °C) zapewni wystarczającą liczbę zwierząt dla większości opisanych standardowych testów. Ogólnie rzecz biorąc, jeden dorosły osobnik (dorosły osobnik pełen jaj) dostarczy 10-15 jaj⁴², a pełna, 60-milimetrowa płytka z agarem NGM ma od 100 do 200 ciężarnych dorosłych, co daje ~1000-2000 jaj.
1. W przypadku eksperymentów na większą skalę, wymagających większej liczby zwierząt, pokrój pełny agar NGM o średnicy 60 mm na cztery do sześciu równych kawałków i pokrój je na płytki o średnicy 100 mm w celu ekspansji.
  UWAGA: W tym przypadku chunking odnosi się do przecięcia kawałka płytki agarowej NGM zawierającej robaki i przeniesienia całego kawałka agaru + robaków na nową płytkę, stroną robakową do dołu, aby umożliwić robakom czołganie się po nowej płytce. Jako punkt odniesienia, zwierzęta z płodnością typu dzikiego będą produkować pełną płytkę o średnicy 100 mm, jeśli będą uprawiane w temperaturze 20 °C przez 2-3 dni po rozdrobnieniu.
2. Aby rozpocząć zbieranie nicieni, należy wlać niewielką ilość roztworu M9 (Tabela 1) na płytki zawierające robaki, uważając, aby nie przepełnić szalki Petriego. Delikatnie zamieszaj roztwór M9, aby usunąć robaki z trawników bakteryjnych.
3. Zebrać grawitacyjne dorosłe robaki za pomocą pipety serologicznej, uważając, aby nie przebić agaru końcówką pipety.
  UWAGA: Zalecane są szklane pipety serologiczne, ponieważ C. elegans ma tendencję do przyklejania się do plastiku. Jeśli szklane pipety nie są dostępne, zaleca się rozpoczęcie od większej liczby zwierząt niż jest to konieczne, ponieważ część z nich zostanie utracona z powodu przyklejenia się do plastikowych pipet.
4. Granulować zwierzęta przez odwirowanie przez 30 s przy 1 100 x g. Odessać supernatant.
  UWAGA: Osad C. elegans jest bardzo luźny, dlatego należy uważać, aby nie potrząsnąć ani nie zakłócić wysiewu podczas zasysania supernatantu.
5. Podczas gdy zwierzęta wirują, przygotuj 5 ml roztworu wybielającego na szczep (szczegóły przepisu znajdują się w Tabeli 1); na 5 ml roztworu wymieszaj 1,5 ml 6% podchlorynu sodu (wybielacza), 0,75 ml 5 M NaOH lub KOH i 2,75 ml dH₂O.
  UWAGA: Podchloryn sodu i roztwory wodorotlenków o wysokim stężeniu są, dlatego podczas obsługi zaleca się noszenie rękawic i fartucha laboratoryjnego.
6. Dodać 5 ml roztworu wybielającego do mieszaniny granulek robaków/M9.
7. Sprawdzaj robaki pod mikroskopem preparacyjnym co kilka minut, aż wszystkie dorosłe ciała robaków zostaną rozpuszczone i w mieszance pozostaną tylko jaja. Energicznie wstrząśnij mieszanką robaka i wybielacza, aby przyspieszyć proces wybielania.
  UWAGA: Pozostawienie jaj w mieszance wybielacza przez dłuższy czas spowoduje uszkodzenie jaj i wpłynie na żywotność zwierząt. W przypadku zwierząt typu dzikiego bielenie trwa zwykle 4-6 minut z potrząsaniem. Dlatego zaleca się badanie zwierząt pod mikroskopem w odstępach 30 sekund, począwszy od znaku 4 minut.
8. Jaja obrabiać w pelety, obracając mieszankę jajek i wybielacza przez 30 s przy 1,100 x g.
  UWAGA: Niektóre stożkowe probówki o pojemności 15 ml mają gradientowe linie po wewnętrznej stronie probówki. W przypadku tych probówek zaleca się wirowanie jaj z większą prędkością (np. 30 s przy 2,000 x g), aby upewnić się, że jaja osadzają się na dnie rurki i nie pozostają na liniach gradientu.
9. Odessać roztwór wybielający.
  UWAGA: Granulka jaja jest sztywniejsza niż granulka robaka, ale nadal może zostać łatwo rozerwana. Dlatego uważaj, aby nie potrząsnąć probówką po odwirowaniu.
10. Umyj jajka, dodając roztwór M9 do 15 ml i odwracając probówkę cztery lub pięć razy, aby upewnić się, że jaja są całkowicie rozproszone w roztworze M9.
11. Jaja otulić przez odwirowanie przez 30 s przy 1,100 x g i odessać roztwór M9.
12. Powtórz powyższe dwa kroki, w sumie cztery prania, aby wyeliminować wybielacz z mieszanki jajecznej.
13. Ponownie zawiesić jaja w 100 μl do 2 ml roztworu M9 (tj. w zależności od całkowitej liczby wybielonych robaków) po ostatnim płukaniu. Dokładnie wstrząśnij jajkami, aby rozbić grudki i upewnić się, że granulka jest całkowicie zawieszona.
14. Alternatywnie, zwierzęta mogą być zatrzymane L1 w celu ściślejszej synchronizacji czasowej; w celu zatrzymania L1 dodaj roztwór M9 do osadu jaj do ~10 ml w stożkowej probówce o pojemności 15 ml. Pozwól robakom obracać się w rotatorze do 24 godzin w temperaturze 20 °C lub temperaturze otoczenia. Zwierzęta L1 zazwyczaj potrzebują o pół dnia mniej na osiągnięcie dorosłości w porównaniu z czasem składania jaj opisanym w kroku 1.3.16.
15. Przybliżyć stężenie w jajach (lub stężenie L1; patrz krok 1.3.14), odmierzając pipetowanie 4 μl mieszanki jaja/M9 na płytkę NGM wysianą bakteriami. Policz i oblicz, ile jaj jest obecnych na μl platerowanych. Powtórz liczenie trzy lub cztery razy, aby poprawić przybliżenie.
  UWAGA: Przybliżenie stężenia jaj zapewni, że posiew zostanie zebrana wystarczająca liczba zwierząt dla odpowiedniej wielkości próbki do eksperymentów bez nadmiernego posiewu, co spowoduje głód.
16. Na podstawie przybliżenia umieść odpowiednią liczbę jaj na płytkach agarowych NGM wysianych wybranymi bakteriami. W przypadku tablic OP50 należy umieścić maksymalnie 200 zwierząt na tabliczce o średnicy 60 mm i 1 000 zwierząt na tabliczce o średnicy 100 mm. W przypadku płyt HT115 należy umieścić maksymalnie 150 zwierząt na płytce o średnicy 60 mm i 600 zwierząt na płytce o średnicy 100 mm.
  UWAGA: Są to przybliżone liczby oparte na naszych warunkach laboratoryjnych i mogą się zmieniać w zależności od grubości trawnika bakteryjnego. Jaja wyhodowane w temperaturze 15 °C potrzebują ~5 dni, aby osiągnąć dorosłość w 1. dniu (~140 godzin, aby osiągnąć maksymalne składanie jaj, grawitację dorosłości). Jaja wyhodowane w temperaturze 20 °C potrzebują ~4 dni, aby osiągnąć dorosłość w 1. dniu (~96 godzin, aby osiągnąć maksymalne składanie jaj, w stanie dorosłym). Jaja wyhodowane w temperaturze 25 °C potrzebują ~3,5 dnia, aby osiągnąć dorosłość w 1. dniu (~62 godziny, aby osiągnąć maksymalne złożenie jaj w stadium dorosłym
Składanie jaj jako alternatywna metoda synchronizacji populacji C. elegans
1. Jeśli protokoły bielenia nie są wykonalne (np. brak dostępnej wirówki), jako alternatywną metodę synchronizacji populacji C. elegans, należy przeprowadzić procedurę składania jaj. Należy pamiętać, że ten protokół jest bardziej pracochłonny i spowoduje mniejsze plony zwierząt.
2. Do składania jaj umieść 8-12 dorosłych osobników na standardowej płytce z agarem NGM wysianej wybranymi bakteriami i udokumentuj dokładną liczbę zwierząt umieszczonych na talerzu.
  UWAGA: Procedury składania jaj powinny być wykonywane w temperaturze, która będzie używana do eksperymentów.
3. Pozwól zwierzętom składać jaja przez 4-8 godz.
  UWAGA: Czas pozostawiania zwierząt na talerzu można dostosować w razie potrzeby. Na przykład większą liczbę zwierząt można położyć na talerzu na krótszy czas składania jaj, gdy dostępnych jest mniej czasu. C. elegans zazwyczaj składają jaja w seriach, które można oszacować na około pięć jaj/h dla zwierząt z płodnością typu dzikiego⁴³. Postępuj zgodnie z zaleceniami w kroku 1.3.16, aby uniknąć nadmiernego powlekania zwierząt.
4. Usuń wszystkie dorosłe zwierzęta z talerza.
  UWAGA: Wszystkie dorosłe zwierzęta pozostawione na talerzu będą nadal składać jaja, co spowoduje niezsynchronizowaną populację.
5. Umieść jaja w temperaturze 15 °C przez ~5 dni lub 20 °C przez ~4 dni, aby osiągnąć dorosłość w 1 dniu.

2. Pomiar długowieczności u C. elegans

Standardowa żywotność
1. Przygotuj płytki agarowe NGM, wysiewając je ze 100 μl wybranych bakterii. Aby zapewnić spójność, upewnij się, że te same bakterie są używane we wszystkich kontrpróbach. Ponieważ robaki są przenoszone codziennie w fazie składania jaj w wieku dorosłym, wysiewaj od pięciu do siedmiu zestawów płytek agarowych NGM na czas trwania życia i od dwóch do czterech płytek na szczep, aby wyhodować zwierzęta do dorosłości (tj. jeśli używasz ośmiu płytek po 15 zwierząt przez całe życie, należy wysiać 40-56 płytek na warunek).
2. Pozostaw talerze do wyschnięcia na noc przed przechowywaniem.
  UWAGA: Zaleca się, aby talerze były przechowywane w temperaturze 4 °C, a wymagana liczba płyt była codziennie wyjmowana z chłodni, aby zapobiec tworzeniu się przez bakterie grubych trawników, które mogą utrudniać przenoszenie/liczenie żywotności. Upewnij się, że płytki są rozgrzane przed poszyciem robaków.
3. Zbierz zsynchronizowaną populację C. elegans za pomocą standardowego testu bielenia, jak opisano w krokach 1.3 i 1.4.
4. Przenieś 10-15 dorosłych zwierząt dnia 1 na 8-12 talerzy każde. Aby uzyskać standardową długość życia, zacznij od ~120 zwierząt, aby upewnić się, że wielkość próby nie spadnie zbyt daleko poniżej 100 po wydarzeniach cenzury (np. osiem tabliczek z 15 zwierzętami = 120 zwierząt; 12 tabliczek z 10 zwierzętami = 120 zwierząt).
  UWAGA: W obecnym przypadku 10-15 zwierząt to liczba możliwa do opanowania dla większości badaczy, chociaż sześć tabliczek po 20 zwierząt jest również wykonalne, aby obniżyć koszt materiałów eksploatacyjnych.
5. Przez pierwsze 7-8 dni lub do momentu, gdy potomstwo przestanie być widoczne, dorosłe zwierzęta należy odsuwać od potomstwa co 1-2 dni.
  UWAGA: Zwierzęta mogą być przenoszone co drugi dzień w celu zaoszczędzenia materiałów, ale należy zachować ostrożność, aby zapewnić, że jaja/larwy nie są przenoszone wraz z dorosłymi osobami, aby zapobiec zanieczyszczeniu dorosłych populacji potomstwem. W tym badaniu najprostszą metodą jest przemieszczanie zwierząt codziennie od 1 do 3 dnia, kiedy składanie jaj jest na najwyższym poziomie, a następnie przejście na przemieszczanie zwierząt co drugi dzień przez 5-8 dni, kiedy składanie jaj jest minimalne. Dzięki tej metodzie nie jest konieczne zapobieganie przenoszeniu jaj/larw w dniach 1-3, ponieważ dorosłe osobniki będą przenoszone codziennie, a jaja/larwy nie mogą rozwinąć się do dorosłości w ciągu 1 dnia.
6. Po tym, jak zwierzęta przestaną produkować potomstwo, oceniaj długość życia co drugi dzień, aż wszystkie zwierzęta zostaną ocenione jako martwe lub ocenzurowane. Usuń wszystkie martwe lub ocenzurowane zwierzęta z talerza, aby uniknąć pomyłek i przeliczania tego samego zwierzęcia.
  UWAGA: Śmierć jest zaliczana za zwierzęta, które nie wykazują ruchu po delikatnym dotknięciu kilofem. Cenzura jest punktowana jako zwierzęta, które są zapakowane w worki, wykazują wystające srom/jelita lub czołgają się do boków talerza, gdzie wysuszają.
Długość życia ze sterylizacją chemiczną przy użyciu FUDR
1. Przygotuj płytki agarowe NGM, wysiewając je ze 100 μl wybranych bakterii. Aby zapewnić spójność, upewnij się, że te same bakterie są używane we wszystkich kontrpróbach. Wysiewaj 8-12 talerzy na szczep do eksperymentów z długością życia i od dwóch do czterech talerzy na szczep, aby wyhodować zwierzęta do dorosłości. Pozostaw talerze do wyschnięcia na noc.
2. Dodaj 100 μl 10 mg/ml FUDR na środek trawnika bakteryjnego, aby uzyskać 8-12 płytek, które będą używane do oznaczania długości życia. Pamiętaj, aby pozostawić dwie do czterech płytek bez FUDR jako talerzy startowych, aby zwierzęta mogły dorosnąć do dorosłości. Pozostaw talerze do wyschnięcia na noc.
  UWAGA: FUDR blokuje syntezę DNA, dlatego zaleca się noszenie rękawiczek podczas obsługi.
3. Zbierz zsynchronizowaną populację C. elegans za pomocą standardowego testu bielenia, jak opisano w krokach 1.3 i 1.4.
  UWAGA: Zwierzęta te muszą być hodowane na talerzach bez FUDR, ponieważ FUDR spowoduje zatrzymanie/śmierć zwierząt.
4. Przenieś 10-15 dorosłych zwierząt dnia 1 na 8-12 płytek każdy, zawierających FUDR. Aby uzyskać standardową długość życia, zacznij od ~120 zwierząt, aby upewnić się, że wielkość próby nie spadnie zbyt daleko poniżej 100 po wydarzeniach cenzury (np. osiem tabliczek z 15 zwierzętami = 120 zwierząt; 12 tabliczek z 10 zwierzętami = 120 zwierząt).
  UWAGA: Zwierzęta mogą być również przenoszone do FUDR na etapie L4, jeśli konieczne jest całkowite uniknięcie tworzenia się potomstwa, ale zwierzęta nie mogą być przenoszone zbyt wcześnie, ponieważ spowoduje to, że zwierzęta będą bardziej narażone na wystające srom/jelita i zwiększy cenzurę.
5. Oceniaj długość życia co drugi dzień, dopóki wszystkie zwierzęta nie zostaną ocenione jako martwe lub ocenzurowane. Usuń wszystkie martwe lub ocenzurowane zwierzęta z talerza, aby uniknąć pomyłek i przeliczania tego samego zwierzęcia.
  UWAGA: W przypadku długości życia FUDR każde potomstwo można zignorować, ponieważ zatrzyma się na etapie L1 i ostatecznie umrze.
Długość życia przy użyciu sterylnych mutantów wrażliwych na temperaturę
1. Przygotuj płytki agarowe NGM, wysiewając je ze 100 μl wybranych bakterii. Aby zapewnić spójność, upewnij się, że te same bakterie są używane we wszystkich kontrpróbach. Wysiewaj 8-12 talerzy na szczep do eksperymentów z długością życia i 2-4 talerze na szczep, aby wyhodować zwierzęta do dorosłości. Pozostaw talerze do wyschnięcia na noc.
2. Zbierz zsynchronizowaną populację C. elegans za pomocą standardowego testu bielenia, jak opisano w krokach 1.3 i 1.4. Pamiętaj, aby hodować zwierzęta w restrykcyjnej temperaturze 25 °C, aby zapewnić im bezpłodność.
3. Przenieś 10-15 dorosłych zwierząt dnia 1 na 8-12 talerzy każde. Aby uzyskać standardową długość życia, zacznij od ~120 zwierząt, aby upewnić się, że wielkość próby nie spadnie zbyt daleko poniżej 100 po wydarzeniach cenzury (np. osiem tabliczek z 15 zwierzętami = 120 zwierząt; 12 tabliczek z 10 zwierzętami = 120 zwierząt).
4. Oceniaj długość życia co drugi dzień, dopóki wszystkie zwierzęta nie zostaną ocenione jako martwe lub ocenzurowane. Usuń wszystkie martwe lub ocenzurowane zwierzęta z talerza, aby uniknąć pomyłek i przeliczania tego samego zwierzęcia.
  UWAGA: W przypadku szczepów krótkożyciowych zaleca się codzienne ocenianie długości życia, ponieważ żywotność w temperaturze 25 °C jest znacznie krótsza, a zatem zakres dynamiki jest ograniczony. Z doświadczenia autorów wynika, że zwierzęta można przestawić z powrotem do 20 °C po 2 dniu, a zwierzęta pozostaną bezpłodne, jeśli preferowane jest osiągnięcie długości życia w temperaturze 20 °C.

3. Pomiar zdrowotności u C. elegans

Pomiary zachowań lokomotorycznych poprzez młócenie
1. Zbierz zsynchronizowaną populację C. elegans za pomocą standardowego testu bielenia, jak opisano w krokach 1.3 i 1.4.
2. Przenieś małą kolonię dorosłych robaków dnia 1 na płytkę agarową NGM pod lunetą sekcyjną na 10-20 μl roztworu M9. Zaleca się 10-15 zwierząt jako możliwą do opanowania liczbę zwierząt do policzenia.
3. Skupiając się na jednym robaku na raz, policz, ile razy próbka zmienia się z formacji wklęsłej na wypukłą w ciągu 15 sekund. Użyj licznika ręcznego i timera, aby skupić się na robaku na czas trwania testu.
  UWAGA: W celu dokładniejszej/łatwiejszej analizy można nagrać film przedstawiający płytę. Na przykład standardowe nasadki do okularów mikroskopowych są dostępne dla większości smartfonów i aparatów cyfrowych (15-30 USD) i są świetną opcją do nagrywania filmów przy niskich kosztach.
4. Powtórz krok 3.1.3 dla innych robaków w cieczy, uśredniając całkowity współczynnik ruchliwości dla 10-15 robaków. W przypadku większej wielkości próbki powtórz kroki 3.1.2-3.1.4.
5. Starzej robaki do pożądanego wieku. Podobne metody oznaczania długości życia opisane w krokach 2.1-2.3 można zastosować do starzenia się robaków. Powtórz kroki 3.1.2-3.1.4, aby sprawdzić młócenie w żądanym wieku.
  UWAGA: Alternatywną metodą dla kroku 3.1.2 jest dodanie ~30 μl lub więcej roztworu M9 na grupę robaków na płytce. Pozwoli to zaoszczędzić czas na ręcznym przenoszeniu robaków, chociaż ze względu na losowy przypadek, w którym robaki znajdują się na jednej płytce, nie ma gwarancji, że grupa robaków pozostanie w jednym punkcie na talerzu.
Pomiary płodności (liczby jaj) u C. elegans
1. Zbierz zsynchronizowaną populację C. elegans za pomocą standardowego testu bielenia, jak opisano w krokach 1.3 i 1.4. Testy liczby komórek jajowych rozpoczynają się na etapie L4, czyli ~1 dzień przed 1. dniem dorosłości (~3 dni w temperaturze 15 °C lub ~2 dni w temperaturze 20 °C po zatrzymaniu L1).
2. Wyodrębnij robaki L4 na oddzielnych płytkach agarowych NGM obsianych wybranymi bakteriami. Zaleca się wykorzystanie ~10-15 zwierząt do testu płodności.
  UWAGA: Zaleca się rozcieńczenie wybranych bakterii o 50% (tj. nie jest to kultura nasycona), aby poprawić widoczność jaj na trawniku bakteryjnym.
3. Pozwól zwierzętom rosnąć przez noc w temperaturze 20 °C. Upewnij się, że nowo wysiana partia talerzy jest gotowa na następny dzień.
4. W 1 dniu dorosłości przenieś dorosłe robaki na świeże płytki agarowe NGM wysiane rozcieńczonymi wybranymi bakteriami.
  UWAGA: Zaleca się używanie świeżo wysianych talerzy lub przechowywanie talerzy w temperaturze 4 °C do czasu użycia, aby zapobiec powstawaniu grubych trawników bakteryjnych.
5. Policz całkowitą liczbę jaj złożonych na każdej płytce agarowej NGM.
  UWAGA: Aby pomóc w skanowaniu płytki, na pokrywie talerza można narysować siatkę i umieścić ją pod nacinaną płytką na jajka. Płytkę można następnie zeskanować wzdłuż linii siatki, aby zachować orientację podczas przesuwania płytki i zapobiec ponownemu przeliczaniu jaj.
6. Powtarzaj kroki 3.2.4-3.2.5 przez 7-8 dni lub do momentu, gdy jaja przestaną być widoczne na talerzu.
  UWAGA: W dniach 1-3, kiedy wskaźniki składania jaj są wysokie, zaleca się przemieszczanie zwierząt co najmniej co 12 godzin i testowe liczenie jaj dwa razy dziennie. Zwiększa to jednak ilość pracy i koszty materiałów eksploatacyjnych, a co za tym idzie, przemieszczanie zwierząt i pomiary można ograniczyć do jednego dnia dziennie, ale należy zadbać o to, aby wszystkie jaja i wyklute zwierzęta były prawidłowo policzone. Do celów tego testu wszystkie wyklute zwierzęta są liczone jako jaja.
Pomiar wielkości (rozwoju) lęgów potomstwa C. elegans
1. Zbierz zsynchronizowaną populację C. elegans za pomocą standardowego testu bielenia, jak opisano w krokach 1.3 i 1.4. Testy wielkości czerwiu rozpoczynają się na etapie L4, czyli ~1 dzień przed 1. dniem dorosłości (~3 dni w temperaturze 15 °C lub ~2 dni w temperaturze 20 °C po zatrzymaniu L1).
2. Wyodrębnij robaki L4 na oddzielnych płytkach agarowych NGM obsianych wybranymi bakteriami. Zaleca się wykorzystanie ~10-15 zwierząt do testu płodności.
3. Pozwól zwierzętom rosnąć przez noc w temperaturze 20 °C. Upewnij się, że nowo wysiana partia talerzy jest gotowa na następny dzień.
4. W 1 dniu dorosłości przenieś dorosłe robaki na świeże płytki agarowe NGM obsiane wybranymi bakteriami.
5. Co 12-24 godziny (2x dziennie lub 1x dziennie) przenosić dorosłe robaki na świeże płytki agarowe NGM obsiane wybranymi bakteriami przez 7-8 dni lub do momentu, gdy potomstwo przestanie być widoczne. Przechowywać wszystkie talerze zawierające jajka w temperaturze 20 °C.
6. Powtarzaj krok 3.3.5 przez 7-8 dni lub do momentu, gdy potomstwo przestanie być widoczne. Wszystkie talerze zawierające jajka należy przechowywać w temperaturze 20 °C.
  UWAGA: Płytki potomstwa mogą być również przechowywane w temperaturze 15 °C, aby wydłużyć czas przed ich nacięciem.
7. Dwa dni po przeniesieniu robaków policz rozwinięte potomstwo na płytkach. Należy policzyć rozwijające się robaki w stadium L4 (tj. 2 dni po wykluciu w temperaturze 20 °C) lub wcześniej, aby upewnić się, że pokolenie F2 (tj. potomstwo potomstwa) nie zafałszuje wyników. Policz wszystkie żywe robaki.
  1. Usuń wszystkie robaki z płytki podczas ich liczenia. Utrzymuj płytki przez dodatkowe 1-2 dni przed ponownym nacięciem, aby upewnić się, że żadne zwierzęta z opóźnionym wykluciem/rozwojem nie zostaną pominięte.
8. Powtórzyć krok 3.3.7 dla każdej zebranej płytki do składania jaj.
  UWAGA: Testy wielkości czerwiu można przeprowadzić w połączeniu z testem liczby jaj (krok 3.2), aby zminimalizować robociznę i koszty materiałów eksploatacyjnych poprzez zebranie dwóch zestawów danych z jednego eksperymentu. Pozwoli to również na bezpośrednie porównanie wielkości lęgu i liczby jaj u tych samych zwierząt.

4. Pomiar odporności na stres u C. elegans

Pomiary wrażliwości na stres ER za pomocą tunikamycyny
1. Przygotować płytki agarowe NGM przez płytki wysiewające zawierające tunikamycynę (patrz krok 1.1.7, UWAGA) ze 100 μl wybranych bakterii.
  UWAGA: Podczas obchodzenia się z tunikamycyną należy nosić rękawice.
2. Aby zapewnić spójność, upewnij się, że te same bakterie są używane we wszystkich kontrpróbach. Wysiewaj 8-12 płytek tunikamycyny na szczep do testów przetrwania i dwie do czterech płytek bez tunikamycyny na szczep, aby wyhodować zwierzęta do dorosłości. Pozostaw talerze do wyschnięcia na noc.
3. Zbierz zsynchronizowaną populację C. elegans za pomocą standardowego testu bielenia, jak opisano w krokach 1.3 i 1.4.
  UWAGA: Zwierzęta muszą być hodowane na płytkach bez tunikamycyny do 1. dnia dorosłości, ponieważ zwierzęta zostaną zatrzymane/umrą po zażyciu tunikamycyny.
4. Przenieś 10-15 dorosłych zwierząt dnia 1 na 8-12 talerzy każde. W przypadku standardowych testów przeżycia należy zacząć od ~120 zwierząt, aby upewnić się, że wielkość próbki nie spadnie zbyt daleko poniżej 100 po wydarzeniach cenzury (np. osiem płytek po 15 zwierząt = 120 zwierząt; 12 płytek po 10 zwierząt = 120 zwierząt).
  UWAGA: Podobnie jak w przypadku testów FUDR, testy przeżycia tunikamycyny można przeprowadzić bez przemieszczania zwierząt, ponieważ tunikamycyna powoduje śmierć/zatrzymanie zwierząt L1. Jednak podczas wykonywania kontroli DMSO, potomstwo rozwinie się na płytkach DMSO, więc zwierzęta muszą być przemieszczane codziennie lub wymagana będzie technika sterylizacji (identyczne metody stosowane w sekcji 2 dla długości życia mogą być stosowane do testów przeżycia).
5. Testy przeżycia są oceniane podobnie jak długość życia. Usuń wszystkie martwe lub ocenzurowane zwierzęta z talerza, aby uniknąć pomyłek i przeliczania tego samego zwierzęcia.
  UWAGA: Chociaż możliwe jest ocenianie zwierząt co drugi dzień, ponieważ śmierć następuje szybko w przypadku tunikamycyny, zaleca się codzienne ocenianie testów przeżycia.
Pomiary wrażliwości na stres mitochondrialny/oksydacyjny za pomocą parakwatu
1. Przygotować płytki agarowe NGM poprzez płytki wysiewające zawierające parakwat (patrz krok 1.1.7; UWAGA) ze 100 μL wybranych bakterii.
  UWAGA: Podczas pracy z parakwitem należy nosić rękawice, ponieważ stanowi to zagrożenie dla środowiska. Skontaktuj się z instytucją ds. zdrowia i bezpieczeństwa środowiskowego, aby uzyskać informacje na temat wymagań dotyczących wyrzucania, ponieważ wiele instytucji badawczych będzie wymagać szczegółowych instrukcji dotyczących odrzutów w przypadku zagrożeń dla środowiska.
2. Aby zapewnić spójność, upewnij się, że te same bakterie są używane we wszystkich kontrpróbach. Wysiewaj 8-12 płytek na szczep do testów przetrwania i od dwóch do czterech płytek bez parakwatu na szczep, aby wyhodować zwierzęta do dorosłości. Pozostaw talerze do wyschnięcia na noc.
3. Zbierz zsynchronizowaną populację C. elegans za pomocą standardowego testu bielenia, jak opisano w krokach 1.3 i 1.4.
  UWAGA: Pamiętaj, aby hodować zwierzęta na talerzach bez parakwatu do 1 dnia dorosłości; Konieczne jest jednak wykonanie techniki sterylizacji lub odsunięcie dorosłych osobników od potomstwa, ponieważ niektóre zwierzęta mogą rozwinąć się do dorosłości na płytkach parakwatu (patrz kroki 2.2-2.3).
4. Przenieś 10-15 dorosłych zwierząt dnia 1 na 8-12 talerzy każde. W przypadku standardowego testu przeżycia należy zacząć od ~120 zwierząt, aby upewnić się, że wielkość próby nie spadnie zbyt daleko poniżej 100 po wydarzeniach cenzury (np. osiem tabliczek po 15 zwierząt = 120 zwierząt; 12 płytek po 10 zwierząt = 120 zwierząt).
5. Testy przeżycia są oceniane podobnie jak długość życia. Usuń wszystkie martwe lub ocenzurowane zwierzęta z talerza, aby uniknąć pomyłek i przeliczania tego samego zwierzęcia.
  UWAGA: Chociaż możliwe jest ocenianie zwierząt co drugi dzień, ponieważ śmierć następuje szybko na parakwacie, zaleca się codzienne ocenianie testów przeżycia. Jest to szczególnie ważne w przypadku stosowania zwierząt z gatunku glp-4(bn2) hodowanych w temperaturze 25 °C, ponieważ śmierć następuje bardzo szybko.
Pomiary wrażliwości na stres cieplny (termotolerancja) przy użyciu podwyższonych temperatur
1. Zbierz zsynchronizowaną populację C. elegans za pomocą standardowego testu bielenia, jak opisano w krokach 1.3 i 1.4.
2. Przed przeniesieniem zwierząt na płytki należy wstępnie ogrzać płytki agarowe NGM do temperatury 37 °C, umieszczając je w inkubatorze o temperaturze 37 °C na co najmniej 1 godzinę.
3. Przenieś 10-15 dorosłych zwierząt dnia 1 na cztery do sześciu wstępnie podgrzanych talerzy każdy. Aby uzyskać standardową termotolerancję, zacznij od ~60 zwierząt (np. cztery płytki po 15 zwierząt = 60 zwierząt; sześć płytek po 10 zwierząt = 60 zwierząt)
4. Umieszczać zwierzęta w inkubatorze o temperaturze 37 °C i co 2 godziny oceniać wynik za śmierć. Śmierć definiuje się jako zwierzęta, które nie wykazują ruchu po delikatnym dotknięciu kilofem. Usuń wszystkie martwe lub ocenzurowane zwierzęta z talerza, aby uniknąć pomyłek i opowiadania o tym samym zwierzęciu.
5. Upewnij się, że płytki są wyjmowane z inkubatora w temperaturze 37 °C przez możliwie najkrótszy czas, ponieważ płytki pozostawione w temperaturze otoczenia przez długi czas podczas nacinania zmienią wyniki termotolerancji.
  UWAGA: Zaleca się wyciąganie tylko jednego szczepu na raz, aby uzyskać punktację, ponieważ temperatura agaru nie powinna się drastycznie zmieniać w czasie potrzebnym do nacięcia jednego szczepu.
6. Mediana tolerancji termicznej jest zwykle osiągana w ciągu 7-9 godzin, dlatego należy zapewnić prawidłowy test po 7 godzinach, 9 godzinach i 11 godzinach
  UWAGA: Chociaż można pominąć 1-5 godzin ze względu na zmienność inkubatorów, grubość płytek i inne czynniki zakłócające w każdym laboratorium, ważne jest, aby czas był starannie miareczkowany w każdym laboratorium, jeśli planuje się pominięcie punktów czasowych. Zobacz odniesienie ⁴⁴, aby uzyskać pełny przewodnik na temat termotolerancji.
7. Alternatywnie, przeprowadzić test termotolerancji w temperaturze 34 °C zamiast 37 °C.
  UWAGA: Mediana tolerancji termicznej w temperaturze 34 °C występuje znacznie później (10-14 godzin w tym badaniu), co pozwala na przygotowanie testów termotolerancji późno w nocy (umieszczenie w inkubatorze o temperaturze 34 °C) i rozpoczęcie punktacji wcześnie następnego dnia. Pozwala to na ~8 godzin ciągłego oceniania zamiast typowego okresu 12 godzin wymaganego do testu termotolerancji 37 °C.

Wyniki

C. elegans stanowią doskonały model organizmu do badań nad starzeniem się, ponieważ większość mechanizmów starzenia jest u nich zachowana w porównaniu z ludźmi. Co istotne, wiążą się one z bardzo niskimi kosztami utrzymania i przeprowadzania eksperymentów przy minimalnych wymaganiach dotyczących sprzętu i materiałów eksploatacyjnych, co czyni je pożądanym systemem modelowym dla instytucji z ograniczonymi funduszami. Ponadto mnogość prostych testów z łatwym procesem nauki sprawia, że są one doskonałym systemem nawet dla najmłodszych badaczy z niewielkim lub żadnym doświadczeniem. Wszystkie te czynniki w połączeniu z potężną genetyką C. elegans w tym łatwość edycji genomu, tysiące dostępnych mutantów i zwierząt transgenicznych przy nominalnych kosztach, a także dostępne biblioteki RNAi do wyciszania genetycznego niemal każdego genu, czynią je idealnym systemem dla uczelni licencjackich. Przedstawiono tutaj niektóre z najtańszych metod badania starzenia się w C. elegans zostały przeanalizowane, koncentrując się przede wszystkim na testach o minimalnych kosztach sprzętowych i materiałowych oraz niskim progu wejścia. W rzeczywistości wszystkie protokoły oraz procesy gromadzenia danych zostały opracowane i przeprowadzone przez młodszych badaczy z <5 miesięcy doświadczenia badawczego, głównie u studentów studiów licencjackich.

Badania nad długowiecznością u C. elegans są bardzo proste ze względu na krótki czas życia zwierząt, wynoszący od 14 do 20 dni. Co istotne, testy długości życia są wysoce zestandaryzowane i wymagają jedynie inkubatora, standardowego mikroskopu stereoskopowego, standardowego zgłębnika do nicieni oraz materiałów eksploatacyjnych do przygotowania płytek z agarem NGM. Być może najbardziej kosztownym aspektem pomiarów długości życia u C. elegans są wymagane materiały eksploatacyjne. Wynika to z faktu, że C. elegans są hermafrodytami, które zapylają się samoistnie; w związku z tym dorosłe osobniki monitorowane w testach długowieczności muszą być codziennie oddzielane od potomstwa. Zwierzęta można jednak wysterylizować poprzez poddanie ich działaniu FUDR lub stosując mutanty, takie jak termowrażliwy mutant pozbawiony linii zarodkowej glp-4(bn2) hodowany w temperaturze ograniczającej 25 °C, aby zmniejszyć ilość wymaganych materiałów eksploatacyjnych³⁰^,³¹^,³². W niniejszym badaniu testy długości życia przeprowadzono z zastosowaniem FUDR lub mutantów pozbawionych linii zarodkowej glp-4(bn2), które wykazują wyniki zbliżone do standardowej długości życia mierzonej u osobników niesterylnych. Chociaż długość życia typu dzikiego nie jest identyczna ze względu na wpływ FUDR⁴⁵ lub wzrostu w 25 °C na długość życia², osobniki z wyciszeniem genu hsf-1 o skróconym czasie życia niezawodnie wykazują znaczny spadek długości życia we wszystkich warunkach (Rysunek 1). Gen hsf-1 koduje czynnik transkrypcyjny heat-shock factor-1, który bierze udział w regulacji odpowiedzi na stres termiczny, a jego wyciszenie prowadzi do znacznego skrócenia długości życia³⁸^,⁴⁶.

Choć długowieczność jest ważnym czynnikiem w biologii starzenia, często nie koreluje ona ze wzrostem zdrowia, nawet u C. elegans⁴⁷. Dlatego, jako podejście komplementarne, przedstawiamy kilka metod pomiaru stanu zdrowia organizmu, w tym zdrowia rozrodczego, zachowania lokomotorycznego oraz odporności na stres. Zdrowie rozrodcze można mierzyć na dwa sposoby. Po pierwsze, pomiar liczby jaj daje bezpośrednią informację o tym, ile jaj znosi pojedynczy, samopłodny hermafrodyta. Jednak ze względu na to, że zwierzęta produkują więcej oocytów niż plemników, zniesione są również niektóre niezapłodnione jaja, które nigdy nie dadzą żywotnego potomstwa⁴⁸. Aby zatem lepiej zrozumieć rzeczywistą zdolność rozrodczą zwierzęcia, pomiary wielkości lęgu pozwalają określić, ile żywotnych potomków zostało wyprodukowanych. Często zwiększona odporność na stres może w rzeczywistości zmniejszyć zdolność rozrodczą, co potencjalnie wynika z immanentnego wpływu odczuwanego stresu na reprodukcję⁴⁹. Podobnie, znaczący spadek zarówno liczby zniesionych jaj, jak i wielkości lęgu obserwuje się u zwierząt z nadekspresją hsf-1 w porównaniu z kontrolnymi zwierzętami typu dzikiego (Rycina 2A,B). W rzeczywistości niektóre zwierzęta z nadekspresją hsf-1 wykazują całkowitą sterylność, co stanowi dowód na to, że zdrowie rozrodcze może być odwrotnie skorelowane z długowiecznością.

Choć zdrowie reprodukcyjne jest istotne dla zrozumienia stanu linii zarodkowej, funkcjonalnej mejozy i ogólnej zdolności rozrodczej, zazwyczaj nie istnieje bezpośrednia korelacja między długowiecznością a wielkością lęgu⁵⁰. Dlatego jako podejście komplementarne, zachowanie lokomotoryczne jest proponowane jako złoty standard metody oceny okresu zdrowia C. elegans podczas starzenia się⁵¹. Istnieje wiele metod pomiaru zachowania lokomotorycznego, lecz większość z nich wymaga zaawansowanych kamer, oprogramowania do śledzenia lub kosztownych odczynników. W przeciwieństwie do nich, testy thrashingu nie wymagają praktycznie żadnego wyposażenia poza tym, którym dysponuje standardowe laboratorium C. elegans: mikroskopem stereoskopowym, igłą do przenoszenia nicieni, pipetą oraz materiałami eksploatacyjnymi do przygotowania płytek z agarem NGM. Tempo thrashingu stanowi niezawodną metodę pomiaru okresu zdrowia podczas starzenia się, co objawia się znacznym spadkiem częstotliwości thrashingu u starszych zwierząt w porównaniu z młodymi (Rycina 2C).

Wreszcie, testy przeżywalności w warunkach stresu stanowią dodatkowy pomiar fizjologiczny odporności. Zdolność do aktywacji odpowiedzi stresowej zazwyczaj spada w procesie starzenia, co sprawia, że zwierzęta stają się mniej odporne i bardziej wrażliwe na stres. W związku z tym odporność na stres może być wykorzystana jako wiarygodny wskaźnik stanu zdrowia organizmu. Przedstawiono tutaj metody badania wrażliwości na: 1) stres ER w odpowiedzi na ekspozycję na tunikamycynę, środek chemiczny blokujący glikozylację białek zależną od N, co prowadzi do akumulacji białek o błędnej strukturze w ER; 2) stres mitochondrialny/oksydacyjny poprzez ekspozycję na paraquat, środek chemiczny indukujący powstawanie anionów ponadtlenkowych w mitochondriach; oraz 3) stres termiczny poprzez ekspozycję na podwyższone temperatury. W przypadku testów z tunikamycyną i paraquatem, lek jest wprowadzany do podłoża NGM-agar podczas przygotowywania płytek. Przy wysokich stężeniach tunikamycyny potomstwo zazwyczaj się nie rozwija, zatem techniki sterylizacji nie są wymagane. Przedstawiony tutaj protokół zaleca stężenie końcowe tunikamycyny wynoszące 25 ng/µL, jednak w przypadku ograniczonego budżetu stężenie 10 ng/µL również wykazuje znaczną redukcję przeżywalności (Rysunek 3A). Oba stężenia ograniczają rozwój potomstwa, więc metody sterylizacji nie są konieczne, choć kontrola DMSO będzie wymagać zastosowania techniki sterylizacji lub przeniesienia zwierząt na nowe płytki. Wynika to z faktu, że toksyczność tunikamycyny zapobiega rozwojowi potomstwa, natomiast DMSO jest praktycznie nietoksyczny, co pozwala na pełny rozwój potomstwa przy hodowli na tunikamycynie.

W przypadku testów z użyciem parakwatu wymagane jest zastosowanie techniki sterylizacji lub przeniesienie zwierząt, ponieważ traktowanie parakwatem nie zapobiega rozwojowi potomstwa do wieku dorosłego. Wysokie stężenia parakwatu (4 mM) znacznie skracają długość życia, podczas gdy niskie stężenia parakwatu (0,25 mM) wydłużają długość życia ze względu na efekt hormetyczny (Ryc. 3B), co jest zgodne z wcześniej opublikowanymi wynikami⁵². Wreszcie, testy termotolerancji wymagają jedynie inkubatora zdolnego do osiągnięcia temperatury 30-37 °C i nie wymagają dodatkowych odczynników. Nadekspresja hsf-1 zwiększa termotolerancję w temperaturze 37 °C (Ryc. 3C), zgodnie z wcześniejszymi publikacjami⁵³. Jednakże, jak wykazano wcześniej oraz w ramach obecnych danych, głównym problemem w testach termotolerancji jest ich zmienność. Do zmienności w testach termotolerancji może przyczyniać się wiele czynników, w tym różnice między inkubatorami oraz czas, przez który zwierzęta przebywają poza inkubatorem podczas oceny termotolerancji w każdej godzinie. Szczegółowe wytyczne dotyczące termotolerancji znajdują się w literaturze ⁴¹.

Wykresy analizy długości życia wykazujące przeżywalność w warunkach: N2, FUDR, glp-4(bn2), temperatura 20-25°C.
Rysunek 1: Porównanie pomiarów długości życia z zastosowaniem i bez zastosowania sterylizacji. (A) Długość życia nicieni typu dzikiego N2 hodowanych na płytkach z agarem NGM zaszczepionych bakteriami z pustym wektorem (ev) lub RNAi przeciwko hsf-1 w temperaturze 20 °C. Zwierzęta były oddzielane od potomstwa w 1., 3., 5. i 7. dniu dorosłości. (B) Długość życia nicieni typu dzikiego N2 hodowanych na płytkach NGM-agar-FUDR zaszczepionych bakteriami z pustym wektorem (ev) lub RNAi przeciwko hsf-1 w temperaturze 20 °C. Zwierzęta hodowano do dorosłości na standardowych płytkach ev lub RNAi przeciwko hsf-1, a następnie przeniesiono na płytki FUDR w 1. dniu dorosłości. (C) Długość życia mutantów glp-4(bn2) hodowanych na płytkach z agarem NGM zaszczepionych pustym wektorem (ev) lub RNAi przeciwko hsf-1 w temperaturze 25 °C. We wszystkich warunkach śmierć zwierząt odnotowywano co 2 dni, aż do momentu, gdy wszystkie zwierzęta uznano za martwe lub ocenzurowane. Za ocenzurowane uznano zwierzęta z baggingiem, wypadaniem lub pęknięciem vulvy, a także te, które wspięły się na ścianki płytek i wyschły. Wszystkie analizy statystyczne przeprowadzono za pomocą testu Log-Rank Mantel-Cox, a wyniki znajdują się w Tabeli 2. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Porównanie miotania się nicieni, liczby jaj i wielkości lęgu; wykresy słupkowe; wyniki analizy statystycznej.
Rycina 2: Liczba jaj, wielkość lęgu i miotanie się jako mierniki długości okresu zdrowia (healthspan). (A) Testy miotania się przeprowadzono na zwierzętach mutantach glp-4(bn2) hodowanych na płytkach z agarem NGM z zasianym pustym wektorem w 25 °C w 1. dniu (kolor niebieski), 4. dniu (kolor czerwony) i 9. dniu (kolor zielony) życia zwierząt. Miotanie się oceniano u zwierząt umieszczonych w roztworze M9 na płytce z agarem NGM; nagrano wideo za pomocą standardowej kamery smartfona zamontowanej na okularze standardowego mikroskopu stereoskopowego, a następnie w celu zapewnienia dokładności oceniano miotanie się w zwolnionym tempie. n = 15 zwierząt na grupę. (B) Liczbę jaj zmierzono u zwierząt typu dzikiego N2 (kolor niebieski) oraz sur-5p::hsf-1 (kolor czerwony). Zwierzęta hodowano w 20 °C, przenoszono na świeże płytki i przeliczano jaja co 12 h. Obliczono całkowitą liczbę złożonych jaj. n = 7 zwierząt dla typu dzikiego i 9 zwierząt dla sur-5p::hsf-1. (C) Testy wielkości lęgu przeprowadzono na tych samych zwierzętach co w punkcie (B), gdzie jaja inkubowano w 20 °C przez 2 dni do czasu wyklucia, a następnie przeliczono wszystkie wyklute jaja. *** = p < 0.001 obliczone przy użyciu nieparametrycznego testu Mann-Whitney. Każda kropka reprezentuje pojedyncze zwierzę, a linie reprezentują medianę i rozstęp międzykwartylny. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

Analiza przeżywalności Kaplana-Meiera, krzywe długości życia przy różnych opracowaniach; wykresy; badanie naukowe.
Rycina 3: Odporność na stres jako wskaźnik stanu zdrowia organizmu. (A) Test przeżywalności zwierząt N2 hodowanych na bakteriach RNAi z pustym wektorem w temperaturze 20 °C. Zwierzęta przeniesiono na płytki zawierające 1% DMSO, 10 ng/µL tunicamycyny (TM) lub 25 ng/µL TM w 1. dniu dorosłości. (B) Test przeżywalności zwierząt N2 hodowanych na bakteriach RNAi z pustym wektorem w temperaturze 20 °C. Zwierzęta hodowano od momentu wyklucia na płytkach zawierających wodę, 0,25 mM parakwatu (PQ) lub 4 mM PQ. Dla A-B śmierć zwierząt odnotowywano co 2 dni, aż do momentu, gdy wszystkie zwierzęta zostały uznane za martwe lub ocenzurowane. Zwierzęta z objawami baggingu, wypadaniem lub pęknięciem wulwy, a także te, które wpełzły na ścianki płytek i wyschły, zostały ocenzurowane. Wszystkie analizy statystyczne przeprowadzono za pomocą testu Log-Rank Mantel-Cox (Tabela 2). (C) Zbiorcze dane ze wszystkich testów termotolerancji w 37 °C dla zwierząt N2 typu dzikiego w porównaniu z nadekspresją hsf-1 (sur-5p::hsf-1). Dane przedstawiono jako procent przeżywalności w czasie t = 9 h testu termotolerancji, gdzie każda linia reprezentuje dopasowany eksperyment wykonany tego samego dnia. Zwierzęta hodowano na bakteriach RNAi z pustym wektorem w 20 °C i przeniesiono do 37 °C w 1. dniu dorosłości w celu przeprowadzenia testu. n = 60 zwierząt na szczep w powtórzeniu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Odczynnik	Receptura
Roztwór wybielacza	1,8% (v/v) podchloryn sodu, 0,375 M KOH
Karbenicylina	roztwór zapasowy o stężeniu 100 mg/ml (1000x) w wodzie. Przechowywać w temperaturze 4 °C przez maksymalnie 6 miesięcy lub -20 °C do długotrwałego przechowywania
FUDR	roztwór o stężeniu 10 mg/mL w wodzie. Przechowywać w temperaturze -20 °C.
IPTG	1 M roztwór w wodzie.
Pożywka LB (Lysogeny Broth)	W niniejszym protokole zastosowano komercyjną pożywkę LB (patrz Tabela materiałów), jednak wszystkie standardowe domowe receptury na pożywkę LB z wykorzystaniem tryptonu Bacto, ekstraktu drożdżowego i NaCl są wystarczające.
roztwór M9	22 mM KH₂PO₄ jednobazowy, 42,3 mM Na₂HPO (histochemia i patologia ustna)₄, 85,6 mM NaCl, 1 mM MgSO4₄
Pożywka do wzrostu nicieni (NGM)	1 mM CaCl2₂, 5 µg/mL cholesterol, 25 mM KPO₄ pH 6,0, 1 mM MgSO4₄, 2% (w/v) agar, 0,25% (w/v) Bacto-Peptone, 51,3 mM NaCl
płytki NGM do RNAi	1 mM CaCl2₂, 5 µg/mL cholesterol, 25 mM KPO₄ pH 6,0, 1 mM MgSO₄₄, 2% (w/v) agaru, 0,25% (w/v) Bacto-Peptone, 51,3 mM NaCl, 1 mM IPTG, 100 µg/mL karbenicylina/ampicylina. Przechowywać w 4 ° C w ciemności do 3 miesięcy
NGM RNAi DMSO	1 mM CaCl2₂, 5 µg/mL cholesterol, 25 mM KPO₄ pH 6,0, 1 mM MgSO₄₄, 2% (w/v) agaru, 0,25% (w/v) Bacto-Peptone, 51,3 mM NaCl, 1 mM IPTG, 100 µg/mL karbenycylina/ampicylina; 1% DMSO
(kontrola dla tunikamycyny)
NGM RNAi TM	1 mM CaCl2₂, 5 µg/mL cholesterol, 25 mM KPO₄ pH 6,0, 1 mM MgSO₄₄, 2% (w/v) agaru, 0,25% (w/v) Bacto-Peptonu, 51,3 mM NaCl, 1 mM IPTG, 100 µg/mL karbenycylina/ampicylina; 1% DMSO, 25 ng/µL tunikamycyna
Paraquat	roztwór 400 mM w wodzie – należy przygotować na świeżo
Tetracyklina	roztwór stokowy o stężeniu 10 mg/ml (500x) w 100% etanolu. Przechowywać w temperaturze -20 °C
Tunicamycyna	roztwór zapasowy o stężeniu 2,5 mg/mL w 100% DMSO. Przechowywać w temperaturze -80 °C do długotrwałego przechowywania. Jest to roztwór 100x (25 ng/µL roztwór roboczy)

Tabela 1. Składy odczynników i pożywek do protokołów.

Odpowiadający panel rysunku	Szczep, traktowanie	Mediana długości życia	Liczba zgonów/Suma	Wartość p (Log-Rank)
1A	N2, vector RNAi, 20 °C	17	74/120	--
	N2, hsf-1 RNAi, 20 °C	11	65/120	<0.001
1B	N2, vector RNAi, FUDR, 20 °C	19	120/120	--
	N2, hsf-1 RNAi, FUDR, 20 °C	11	116/120	<0.001
1C	N2, glp-4(bn2), vector RNAi, 25 °C	13	115/121	--
	N2, glp-4(bn2), hsf-1 RNAi, 25 °C	4	120/120	< 0.001
2A	N2, vector RNAi, 20 °C, 1% DMSO	19	85/120	--
	N2, vector RNAi, 20 °C, 10 ng/µL tunicamicyny	15	109/120	<0.001
	N2, vector RNAi, 20 °C, 25 ng/µL tunicamicyny	12	117/120	<0.001
2B	N2, vector RNAi, 20 °C	19	84/120	--
	N2, vector RNAi, 20 °C, 0.25 mM parakwatu	24	91/120	<0.001
	N2, vector RNAi, 20 °C, 4 mM parakwatu	6	50/120	<0.001

Tabela 2. Statystyki dotyczące długości życia i odporności na stres.

Dyskusja

Długość życia, najprościej definiowana jako czas trwania życia, jest wyraźnym zjawiskiem binarnym w większości organizmów - albo organizm żyje, albo go nie ma. Jednak długowieczność nie zawsze koreluje ze zdrowiem organizmu. Na przykład modele hormezy mitochondrialnej, w których narażenie na stres mitochondrialny dramatycznie wydłuża życie, są na ogół jednymi z najdłużej żyjących zwierząt, ale wykazują zahamowanie wzrostu i obniżoną funkcję metaboliczną^37,54. Podobnie, zwierzęta z nadpobudliwymi reakcjami na stres retikulum endoplazmatycznego również wykazują pewne zachowania i fenotypy, które mogą być skorelowane z pogorszeniem stanu zdrowia, pomimo radykalnej poprawy homeostazy białek i długości życia^36,49. Wreszcie, wiele paradygmatów długowieczności w organizmach modelowych, w tym zwiększona funkcja HSF-1⁵⁵, zwiększona funkcja XBP-1⁵⁶ i zmieniona sygnalizacja FoxO⁵⁷, jest skorelowanych ze zwiększonym ryzykiem raka i nie można zaprzeczyć, że wydłużona długość życia nie jest korzystna, jeśli organizm jest w ciągłej walce z rakiem i innymi dolegliwościami zdrowotnymi. Dlatego długowieczność nie może być samodzielnym pomiarem w biologii starzenia się.

W związku z tym koncepcja zdrowia jest rozwijającą się dziedziną w biologii starzenia się. Długość zdrowia, luźno zdefiniowana jako okres życia, w którym jest się zdrowym, jest trudniejsza do ustalenia niż długowieczność. Jednak w przeciwieństwie do długowieczności, pojęcie "zdrowia" jest skomplikowane, ponieważ istnieje wiele różnych odczytów zdrowia organizmu: na poziomie organizmu są to funkcja/siła mięśni, funkcje neuronalne/poznawcze, zdrowie reprodukcyjne itp.; Na poziomie komórkowym występuje homeostaza białek, homeostaza lipidów, homeostaza glukozy, metabolizm itp. W 2014 roku starzejący się biolodzy definitywnie scharakteryzowali biologiczne cechy starzenia się za pomocą ustrukturyzowanej definicji, że musi to być coś, co naturalnie rozkłada się podczas starzenia się i może być eksperymentalnie zmienione tak, że eksperymentalne zaostrzenie powinno przyspieszyć starzenie się, a interwencja eksperymentalna powinna spowolnić starzenie się. Te dziewięć cech charakterystycznych starzenia się obejmuje niestabilność genomu, ścieranie telomerów, zmiany epigenetyczne, utratę homeostazy białek (proteostazę), wyczerpanie komórek macierzystych, zmienioną sygnalizację międzykomórkową, dysfunkcję mitochondriów, rozregulowane wykrywanie składników odżywczych i^{starzenie się} komórek. Od tego czasu liczne badania dowodzą, że należy uwzględnić inne czynniki, w tym białka zewnątrzkomórkowe i fizjologię ogólnoustrojową, taką jak odporność i stan zapalny⁵⁹. Ostatecznie, złożona definicja długości zdrowia wymaga, aby zdrowie organizmu było mierzone przy użyciu wielu różnych metod.

Dlatego w tym manuskrypcie przedstawiono wiele metod pomiaru różnych aspektów zdrowia przy użyciu modelu nicieni, C. elegans. Badamy zachowania lokomotoryczne za pomocą testów młócenia, zdrowie reprodukcyjne za pomocą liczby jaj i wielkości lęgu oraz wrażliwość na stres. Rzeczywiście, zachowanie lokomotoryczne jest złotym standardem w mierzeniu długości zdrowia, ponieważ organizmy wykazują znaczną utratę ruchliwości i ruchu podczas starzenia^się. Utrata zachowań lokomotorycznych może być przypisana wielu cechom starzenia się, ponieważ funkcja mięśni u C. elegans zależy od prawidłowej proteostazy⁶⁰, dysfunkcji mitochondriów⁶¹ i sygnalizacji neuron-mięśnie⁶². Chociaż ten manuskrypt koncentruje się na jednym pomiarze zachowania lokomotorycznego, ważne jest, aby zauważyć, że istnieje wiele innych metod, w tym ruchliwość zwierząt na stałej płytce agarowej, reakcja na dotyk⁵¹ i testy chemotaksji⁶³. Jednak metody te na ogół wymagają bardziej wyrafinowanych urządzeń rejestrujących, użycia oprogramowania do śledzenia robaków lub użycia drogich, niebezpiecznych lub lotnych chemikaliów, z których wszystkie mogą być zaporowe w niektórych warunkach badawczych.

Ponadto testy liczby jaj i wielkości czerwiu są przedstawiane jako metoda pomiaru zdrowia reprodukcyjnego i jako najprostsza metoda pomiaru podziału komórek u dorosłych robaków, ponieważ dorosłe robaki są postmitotyczne i tylko komórki rozrodcze i zarodki ulegają podziałowi komórkowemu w obrębie dorosłego robaka⁶⁴. Jako miara podziału komórek, zdrowie reprodukcyjne może być istotne dla cech starzenia się starzenia się komórek i wyczerpania komórek macierzystych. Na zdrowie reprodukcyjne może mieć wpływ wiele czynników, w tym infekcja patogenna⁶⁵ lub narażenie na stres⁴⁹, chociaż nie ma bezpośredniej korelacji między zdrowiem reprodukcyjnym a długowiecznością. W rzeczywistości niektóre długowieczne zwierzęta wykazują znaczny spadek wielkości lęgu⁴⁹, a nawet możliwe jest, że istnieje odwrotna korelacja między długowiecznością a wielkością lęgu⁵⁰. Nie jest to zjawisko specyficzne dla C. elegans, ponieważ szkodliwy wpływ reprodukcji na długowieczność od dawna obserwowano u ludzi⁶⁶, psów towarzyszących⁶⁷ i myszy⁶⁸. Mimo to podajemy liczbę jaj i wielkość lęgu jako wiarygodną i tanią metodę pomiaru zdrowia reprodukcyjnego z zastrzeżeniem, że zdrowie reprodukcyjne może nie korelować z długowiecznością lub długością zdrowia.

Wreszcie, testy przeżycia są oferowane jako pośrednia miara zdrowia organizmu. Co ważne, reakcje na stres komórkowy, w tym odpowiedź na stres termiczny⁶⁹ i stres ER³⁵, gwałtownie spadają podczas procesu starzenia się i mają bezpośrednie znaczenie dla cechy charakterystycznej starzenia się^{proteostazy 70,71}. W przeciwieństwie do tego, hiperaktywacja reakcji na stres może znacznie wydłużyć życie, promując odporność na stres 35,37,38. Chociaż badanie to koncentruje się na najprostszych i najtańszych metodach, istnieje wiele alternatywnych metod oznaczania odporności na stres dla termotolerancji⁴¹ i stresu oksydacyjnego⁶⁶, z których każda wymaga innego zestawu sprzętu i materiałów eksploatacyjnych. Poza prostymi badaniami narażenia na czynniki stresogenne, w zależności od dostępu do sprzętu, można zastosować inne metody fizjologiczne. Na przykład analizator strumienia zewnątrzkomórkowego może monitorować funkcję mitochondriów i oddychanie komórkowe⁷³; fluorescencyjne mikroskopy preparacyjne pozwolą na pomiary reporterów transkrypcyjnych pod kątem aktywacji reakcji na stres²⁰; Mikroskopy złożone lub konfokalne o wysokiej rozdzielczości mogą być używane do pomiaru morfologii organelli za pomocą sond fluorescencyjnych dla mitochondriów⁷⁴, retikulum endoplazmatycznego ^75,76 i cytoszkieletu aktynowego⁷⁷.

Jako ostatnią przestrogę dla pomiarów długowieczności, chociaż chemiczne i genetyczne metody sterylizacji robaków są oferowane w celu znacznego obniżenia kosztów, ważne jest, aby pamiętać, że obie mogą bezpośrednio wpływać na długość życia. Na przykład wcześniej donoszono, że narażenie na FUDR wpływa zarówno na długość życia, jak i tolerancję termiczną⁴⁵. I chociaż sam mutant glp-4(bn2) nie ma bezpośredniego wpływu na długość życia, wzrost w temperaturze 25 °C jest łagodnym stresem cieplnym^33,34, a zatem może wpływać na długość życia². Istnieją inne metody sterylizacji C. elegans, w tym sterylność za pośrednictwem auksyny⁷⁸ lub alternatywne mutanty z niedoborem plemników^{wrażliwe na temperaturę 79}. Jednak wszystkie metody mają pewne zastrzeżenia i należy zachować ostrożność, aby wykorzystać jak najmniej szkodliwy test dla potrzeb naukowych każdego laboratorium. Ostatnim ograniczeniem badań długowieczności jest potencjalna zmienność, która może wystąpić z powodu małej wielkości próby lub po prostu z powodu obiektywnego błędu badacza. Można to obejść, ponieważ nowe technologie rodzą się w zautomatyzowanych technologiach wydłużania życia⁸⁰, ale również w tym przypadku systemy te są kosztowne i wymagają pewnego sprzętu i umiejętności inżynieryjnych i obliczeniowych. Ostatecznie przedstawiony tutaj zbiór metod jest niezawodnym zestawem narzędzi, które można szybko dostosować i nauczyć się w prawie każdej instytucji i stanowią solidną podstawę biologii starzenia się.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Podziękowania

G.G. jest wspierany przez T32AG052374, a R.H.S. jest wspierany przez R00AG065200 z National Institute on Aging. Dziękujemy CGC (finansowane przez NIH Office of Research Infrastructure Program P40 OD010440) za szczepy.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
APEX IPTG	Genesee	18-242	do RNAi
Bacto Agar	VWR	90000-764	do płytek NGM
Bacto Peptone	VWR	97064-330	do płytek NGM
Chlorek wapnia dwuwodny	VWR	97061-904	do płytek NGM
Karbenicylina	VWR	76345-522	do RNAi
Cholesterol	VWR	80057-932	do płytek NGM
DMSO	VWR	BDH1115-1LP	rozpuszczalnik do leków
Bulion LB VWR		95020-778	do LB
Siarczan magnezu siedmiowodny	VWR	97062-132	do płytek NGM, M9
Paraquat	Sigma-Aldrich	36541	do stresu oksydacyjnego/mitochondrialnego
Chlorek potasu	VWR	97061-566	do roztworu wybielacza
Fosforan potasu dwuzasadowy	VWR	EM-PX1570-2	do płytek NGM
Fosforan potasu jednozasadowy	VWR	EM-PX1565-5	do
lunety prosektoryjnej M9 S7E Standardowy	mikroskop preparacyjny	Leica	10450840
Chlorek sodu	VWR	EM-SX0420-5	do płytek NGM, M9
Podchloryn sodu	VWR	RC7495.7-32	do roztworu wybielacza
Fosforan sodu dwuzasadowy	VWR	71003-472	do
chlorowodorku tetracykliny	VWR	97061-638	do RNAi
Tunikamycyna	Sigma-Aldrich	T7765-50MG	do stresu ER

Bibliografia

Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).
Klass, M. R. Aging in the nematode Caenorhabditis elegans: major biological and environmental factors influencing life span. Mechanisms of Ageing and Development. 6 (6), 413-429 (1977).
Friedman, D. B., Johnson, T. E. A mutation in the age-1 gene in Caenorhabditis elegans lengthens life and reduces hermaphrodite fertility. Genetics. 118 (1), 75-86 (1988).
Kenyon, C., Chang, J., Gensch, E., Rudner, A., Tabtiang, R. A C. elegans mutant that lives twice as long as wild type. Nature. 366 (6454), 461-464 (1993).
Lithgow, G. J., White, T. M., Melov, S., Johnson, T. E. Thermotolerance and extended life-span conferred by single-gene mutations and induced by thermal stress. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (16), 7540-7544 (1995).
Epel, E. S., Lithgow, G. J. Stress biology and aging mechanisms: toward understanding the deep connection between adaptation to stress and longevity. The Journals of Gerontology. Series A, Biological Sciences and Medical Sciences. 69, Suppl 1 10-16 (2014).
Luo, Y. Long-lived worms and aging. Redox Report: Communications in Free Radical Research. 9 (2), 65-69 (2004).
Tissenbaum, H. A. Using C. elegans for aging research. Invertebrate Reproduction & Development. 59, 59-63 (2015).
Zhang, S., Li, F., Zhou, T., Wang, G., Li, Z. Caenorhabditis elegans as a useful model for studying aging mutations. Frontiers in Endocrinology. 11, 554994(2020).
Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).
Rual, J. -F., et al. Toward improving Caenorhabditis elegans phenome mapping with an ORFeome-based RNAi library. Genome Research. 14 (10), 2162-2168 (2004).
Timmons, L., Court, D. L., Fire, A. Ingestion of bacterially expressed dsRNAs can produce specific and potent genetic interference in Caenorhabditis elegans. Gene. 263 (1-2), 103-112 (2001).
Reboul, J., et al. Open-reading-frame sequence tags (OSTs) support the existence of at least 17,300 genes in C. elegans. Nature Genetics. 27 (3), 332-336 (2001).
Lee, S. S., et al. A systematic RNAi screen identifies a critical role for mitochondria in C. elegans longevity. Nature Genetics. 33 (1), 40-48 (2003).
Reinke, S. N., Hu, X., Sykes, B. D., Lemire, B. D. Caenorhabditis elegans diet significantly affects metabolic profile, mitochondrial DNA levels, lifespan and brood size. Molecular Genetics and Metabolism. 100 (3), 274-282 (2010).
Revtovich, A. V., Lee, R., Kirienko, N. V. Interplay between mitochondria and diet mediates pathogen and stress resistance in Caenorhabditis elegans. PLOS Genetics. 15 (3), 1008011(2019).
Pang, S., Curran, S. P. Adaptive capacity to bacterial diet modulates aging in C. elegans. Cell Metabolism. 19 (2), 221-231 (2014).
Brooks, K. K., Liang, B., Watts, J. L. The influence of bacterial diet on fat storage in C. elegans. PLOS ONE. 4 (10), 7545(2009).
Soukas, A. A., Kane, E. A., Carr, C. E., Melo, J. A., Ruvkun, G. Rictor/TORC2 regulates fat metabolism, feeding, growth, and life span in Caenorhabditis elegans. Genes & Development. 23 (4), 496-511 (2009).
Bar-Ziv, R., et al. Measurements of physiological stress responses in C. Elegans. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), e61001(2020).
Xiao, R., et al. RNAi interrogation of dietary modulation of development, metabolism, behavior, and aging in C. elegans. Cell Reports. 11 (7), 1123-1133 (2015).
Calixto, A., Chelur, D., Topalidou, I., Chen, X., Chalfie, M. Enhanced neuronal RNAi in C. elegans using SID-1. Nature Methods. 7 (7), 554-559 (2010).
Dickinson, D. J., Goldstein, B. CRISPR-based methods for Caenorhabditis elegans genome engineering. Genetics. 202 (3), 885-901 (2016).
Kim, H. -M., Colaiácovo, M. P. CRISPR-Cas9-guided genome engineering in C. elegans. Current Protocols in Molecular Biology. 129 (1), 106(2019).
Farboud, B., Severson, A. F., Meyer, B. J. Strategies for efficient genome editing using CRISPR-Cas9. Genetics. 211 (2), 431-457 (2019).
Evans, T. C. Transformation and Microinjection. WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK19648/ (2006).
Frøkjaer-Jensen, C., et al. Single-copy insertion of transgenes in Caenorhabditis elegans. Nature Genetics. 40 (11), 1375-1383 (2008).
Kaymak, E., et al. Efficient generation of transgenic reporter strains and analysis of expression patterns in Caenorhabditis elegans using Library MosSCI. Developmental Dynamics: an Official Publication of the American Association of Anatomists. 245 (9), 925-936 (2016).
Mariol, M. -C., Walter, L., Bellemin, S., Gieseler, K. A rapid protocol for integrating extrachromosomal arrays with high transmission rate into the C. elegans genome. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (82), (2013).
Rastogi, S., et al. Caenorhabditis elegans glp-4 encodes a valyl aminoacyl tRNA synthetase. G3: Genes|Genomes|Genetics. 5 (12), 2719-2728 (2015).
Beanan, M. J., Strome, S. Characterization of a germ-line proliferation mutation in C. elegans. Development. 116 (3), Cambridge, England. 755-766 (1992).
Santi, D. V., McHenry, C. S. 5-Fluoro-2′-Deoxyuridylate: covalent complex with thymidylate synthetase. Proceedings of the National Academy of Sciences. 69 (7), 1855-1857 (1972).
Lithgow, G. J., White, T. M., Hinerfeld, D. A., Johnson, T. E. Thermotolerance of a long-lived mutant of Caenorhabditis elegans. Journal of Gerontology. 49 (6), 270-276 (1994).
Labbadia, J., Morimoto, R. I. The biology of proteostasis in aging and disease. Annual Review of Biochemistry. 84 (1), 435-464 (2015).
Taylor, R. C., Dillin, A. XBP-1 is a cell-nonautonomous regulator of stress resistance and longevity. Cell. 153 (7), 1435-1447 (2013).
Higuchi-Sanabria, R., et al. Divergent nodes of non-autonomous UPRER signaling through serotonergic and dopaminergic neurons. Cell Reports. 33 (10), 108489(2020).
Durieux, J., Wolff, S., Dillin, A. The cell-non-autonomous nature of electron transport chain-mediated longevity. Cell. 144 (1), 79-91 (2011).
Morley, J. F., Morimoto, R. I. Regulation of longevity in Caenorhabditis elegans by heat shock factor and molecular chaperones. Molecular Biology of the Cell. 15 (2), 657-664 (2004).
Heifetz, A., Keenan, R. W., Elbein, A. D. Mechanism of action of tunicamycin on the UDP-GlcNAc:dolichyl-phosphate Glc-NAc-1-phosphate transferase. Biochemistry. 18 (11), 2186-2192 (1979).
Castello, P. R., Drechsel, D. A., Patel, M. Mitochondria are a major source of paraquat-induced reactive oxygen species production in the brain. The Journal of Biological Chemistry. 282 (19), 14186-14193 (2007).
Park, H. -E. H., Jung, Y., Lee, S. -J. V. Survival assays using Caenorhabditis elegans. Molecules and Cells. 40 (2), 90-99 (2017).
Gardner, M., Rosell, M., Myers, E. M. Measuring the effects of bacteria on C. Elegans behavior using an egg retention assay. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (80), e51203(2013).
Waggoner, L. E., Hardaker, L. A., Golik, S., Schafer, W. R. Effect of a neuropeptide gene on behavioral states in Caenorhabditis elegans egg-laying. Genetics. 154 (3), 1181-1192 (2000).
Zevian, S. C., Yanowitz, J. L. Methodological considerations for heat shock of the nematode Caenorhabditis elegans. Methods. 68 (3), San Diego, Calif. 450-457 (2014).
Feldman, N., Kosolapov, L., Ben-Zvi, A. Fluorodeoxyuridine improves Caenorhabditis elegans proteostasis independent of reproduction onset). PLOS ONE. 9 (1), 85964(2014).
Hsu, A. -L., Murphy, C. T., Kenyon, C. Regulation of aging and age-related disease by DAF-16 and heat-shock factor. Science. 300 (5622), 1142-1145 (2003).
Bansal, A., Zhu, L. J., Yen, K., Tissenbaum, H. A. Uncoupling lifespan and healthspan in Caenorhabditis elegans longevity mutants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (3), 277-286 (2015).
Hodgkin, J., Barnes, T. M. More is not better: brood size and population growth in a self-fertilizing nematode. Proceedings. Biological Sciences. 246 (1315), 19-24 (1991).
Ozbey, N. P., et al. Tyramine Acts Downstream of Neuronal XBP-1s to coordinate inter-tissue UPRER activation and behavior in C. elegans. Developmental Cell. 55 (6), 754-770 (2020).
Lee, Y., et al. Inverse correlation between longevity and developmental rate among wild C. elegans strains. Aging. 8 (5), Albany NY. 986-994 (2016).
Swierczek, N. A., Giles, A. C., Rankin, C. H., Kerr, R. A. High-throughput behavioral analysis in C. elegans. Nature Methods. 8 (7), 592-598 (2011).
Lee, S. -J., Hwang, A. B., Kenyon, C. Inhibition of respiration extends C. elegans life span via reactive oxygen species that increase HIF-1 activity. Current Biology: CB. 20 (23), 2131-2136 (2010).
Baird, N. A., et al. HSF-1-mediated cytoskeletal integrity determines thermotolerance and life span. Science. 346 (6207), 360-363 (2014).
Houtkooper, R. H., et al. Mitonuclear protein imbalance as a conserved longevity mechanism. Nature. 497 (7450), 451-457 (2013).
Carpenter, R. L., Gökmen-Polar, Y. HSF1 as a cancer biomarker and therapeutic target. Current Cancer Drug Targets. 19 (7), 515-524 (2019).
Chen, S., et al. The emerging role of XBP1 in cancer. Biomedicine & Pharmacotherapy. 127, 110069(2020).
Yadav, R. K., Chauhan, A. S., Zhuang, L., Gan, B. FoxO transcription factors in cancer metabolism. Seminars in Cancer Biology. 50, 65-76 (2018).
López-Otín, C., Blasco, M. A., Partridge, L., Serrano, M., Kroemer, G. The hallmarks of aging. Cell. 153 (6), 1194-1217 (2013).
Kennedy, B. K., et al. Geroscience: linking aging to chronic disease. Cell. 159 (4), 709-713 (2014).
Ben-Zvi, A., Miller, E. A., Morimoto, R. I. Collapse of proteostasis represents an early molecular event in Caenorhabditis elegans aging. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (35), 14914-14919 (2009).
Hewitt, J. E., et al. Muscle strength deficiency and mitochondrial dysfunction in a muscular dystrophy model of Caenorhabditis elegans and its functional response to drugs. Disease Models & Mechanisms. 11 (12), (2018).
Gao, S., Zhen, M. Action potentials drive body wall muscle contractions in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (6), 2557-2562 (2011).
Margie, O., Palmer, C., Chin-Sang, I. C. elegans chemotaxis assay. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (74), e50069(2013).
Flemming, A. J., Shen, Z. Z., Cunha, A., Emmons, S. W., Leroi, A. M. Somatic polyploidization and cellular proliferation drive body size evolution in nematodes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (10), 5285-5290 (2000).
Madhu, B. J., Salazar, A. E., Gumienny, T. L. Caenorhabditis elegans egg-laying and brood-size changes upon exposure to Serratia marcescens and Staphylococcus epidermidis are independent of DBL-1 signaling. microPublication Biology. 2019, (2019).
Westendorp, R. G., Kirkwood, T. B. Human longevity at the cost of reproductive success. Nature. 396 (6713), 743-746 (1998).
Hoffman, J. M., Creevy, K. E., Promislow, D. E. L. Reproductive capability is associated with lifespan and cause of death in companion dogs. PLOS ONE. 8 (4), 61082(2013).
Garratt, M., Try, H., Smiley, K. O., Grattan, D. R., Brooks, R. C. Mating in the absence of fertilization promotes a growth-reproduction versus lifespan trade-off in female mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (27), 15748-15754 (2020).
Labbadia, J., Morimoto, R. I. Repression of the heat shock response is a programmed event at the onset of reproduction. Molecular Cell. 59 (4), 639-650 (2015).
Higuchi-Sanabria, R., Frankino, P. A., Paul, J. W., Tronnes, S. U., Dillin, A. A futile battle? Protein quality control and the stress of aging. Developmental Cell. 44 (2), 139-163 (2018).
Dutta, N., Garcia, G., Higuchi-Sanabria, R. Hijacking cellular stress responses to promote lifespan. Frontiers in Aging. 3, https://www.frontiersin.org/article/10.3389/fragi.2022.860404 (2022).
Senchuk, M. M., Dues, D. J., Van Raamsdonk, J. M. Measuring oxidative stress in Caenorhabditis elegans: paraquat and juglone sensitivity assays. Bio-protocol. 7 (1), 2086(2017).
Leung, D. T. H., Chu, S. Measurement of oxidative stress: mitochondrial function using the seahorse system. Methods in molecular biology. 1710, Clifton, N.J. 285-293 (2018).
Daniele, J. R., et al. High-throughput characterization of region-specific mitochondrial function and morphology. Scientific Reports. 7 (1), 6749(2017).
Xu, N., et al. The FATP1-DGAT2 complex facilitates lipid droplet expansion at the ER-lipid droplet interface. The Journal of Cell Biology. 198 (5), 895-911 (2012).
Daniele, J. R., et al. UPRER promotes lipophagy independent of chaperones to extend life span. Science Advances. 6 (1), 1441(2020).
Higuchi-Sanabria, R., et al. Spatial regulation of the actin cytoskeleton by HSF-1 during aging. Molecular Biology of the Cell. 29 (21), 2522-2527 (2018).
Kasimatis, K. R., Moerdyk-Schauwecker, M. J., Phillips, P. C. Auxin-mediated sterility induction system for longevity and mating studies in Caenorhabditis elegans. G3: Genes|Genomes|Genetics. 8 (8), 2655-2662 (2018).
Fabian, T. J., Johnson, T. E. Production of age-synchronous mass cultures of Caenorhabditis elegans. Journal of Gerontology. 49 (4), 145-156 (1994).
Stroustrup, N., et al. The Caenorhabditis elegans lifespan machine. Nature Methods. 10 (7), 665-670 (2013).

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Pomiar długości życia test stanu zdrowia biologia starzenia synchronizacja nicieni test thrashingu wielkość lęgu odporność na stres analiza genetyczna

Badanie tanich metod pomiaru długości życia i długości zdrowia u Caenorhabditis elegans