Badanie tanich metod pomiaru długości życia i długości zdrowia u Caenorhabditis elegans

Od czasu publikacji 'The genetics of Caenorhabditis elegans', jednego z najbardziej wpływowych artykułów Sydneya Brennera w 1974 roku, ten mikroskopijny robak jest uważany za wybitny system modelowy do badania tajemnic biologicznych¹. W 1977 Michael R. Klass opublikował metodę pomiaru długości życia C. elegans i stworzył ten model do badania starzenia się². Badania mające na celu zrozumienie związku między stresem a długowiecznością rozpoczęły się od zidentyfikowania pojedynczej mutacji w genie wieku 1, co spowodowało wydłużenie życia C. elegans³. Co więcej, współczesne badania zidentyfikowały inne mutacje zwiększające długość życia, które ujawniły długowieczne zmutowane robaki, które wykazują zwiększoną odporność na stres^4,5,6. Dzięki swoim wielu zaletom, w tym krótkiej żywotności, łatwej konserwacji, całkowicie zsekwencjonowanemu genomowi zawierającemu homologię do około dwóch trzecich wszystkich genów powodujących choroby u ludzi, dostępności i łatwości korzystania z bibliotek interferencji RNA (RNAi) oraz fizjologicznemu podobieństwu do ludzi^7,8,9, C. elegans szybko został przyjęty jako wybitny model dla biologii stresu i starzenia się.

Być może największymi zaletami C. elegans są niezwykle niskie koszty utrzymania, łatwość eksperymentowania i różnorodność narzędzi genetycznych dostępnych do badań. C. elegans są zwykle uprawiane na stałym podłożu agarowym ze źródłem pożywienia E. coli. Dwa powszechnie używane szczepy E. coli to standardowy OP50, szczep B, który jest prawdopodobnie najczęściej używany¹⁰, oraz HT115, szczep K-12, który jest używany głównie do eksperymentów RNAi^11,12. Szczep HT115 K-12 jest nosicielem delecji RNazy RNAIII, mutacji, która jest niezbędna w metodach RNAi, w których wykorzystuje się plazmidy eksprymujące dsRNA odpowiadające poszczególnym genom C. elegans. Wektory żywieniowe dsRNA pozwalają na silne eliminację genów C. elegans bez konieczności skomplikowanych krzyżówek lub edycji genomu, ponieważ bakterie przenoszące te plazmidy mogą być bezpośrednio karmione nicieniami. Tysiące tych bakteryjnych wektorów RNAi istnieje w tle HT115, w tym najpopularniejsza biblioteka Vidal RNAi z >19 000 indywidualnych konstruktów RNAi¹³ oraz biblioteka Ahringer RNAi z 16 757 konstruktami RNAi¹⁴. Jednak diety bakteryjne OP50 i HT115 mają duże różnice w profilu metabolicznym, w tym różnice w witaminie B12^15,16. Dlatego zaleca się przeprowadzanie wszystkich eksperymentów na jednym źródle bakterii, jeśli to możliwe, aby uniknąć interakcji gen-dieta, które mogą wprowadzić wiele czynników zakłócających, jak opisano wcześniej^17,18,19. Ze względu na jego łatwość, zwierzęta są utrzymywane na OP50 we wszystkich opisanych tutaj warunkach eksperymentalnych, ale wszystkie eksperymenty są wykonywane na HT115, jak opisano wcześniej²⁰. Krótko mówiąc, zwierzęta są utrzymywane w OP50 i przenoszone do HT115 po synchronizacji (po bieleniu) w celu uzyskania spójności między eksperymentami RNAi i nie-RNAi. Alternatywnie można również użyć szczepu OP50 kompetentnego do RNAi, który zawiera podobną delecję RNazy RNAIII znajdującej się w szczepie E. coli K12 HT115²¹.

Być może jednym z głównych ograniczeń dla eksperymentów RNAi u C. elegans jest obawa o skuteczność knockdownu. Chociaż skuteczność knockdown można zweryfikować za pomocą qPCR lub western blot, wymagają one drogiego sprzętu i odczynników oraz ograniczają się do analizy masowej. Jest to jeszcze bardziej niepokojące, biorąc pod uwagę konkretne komórki, takie jak neurony, które są oporne (mniej wrażliwe) na RNAi. Podczas gdy wydajność RNAi w określonych komórkach może być zwiększona poprzez nadekspresję SID-1, białka transbłonowego niezbędnego do wychwytu dsRNA²², jest to nadal ograniczone do specyficznych dla typu komórki wzorców ekspresji promotorów używanych do tych konstruktów, a zatem nokauty i mutacje genów są najbardziej niezawodnymi sposobami na wyczerpanie funkcji genów. Poza knockdownem za pośrednictwem RNAi, C. elegans są również wysoce podatne na edycję genomu za pomocą strategii opartych na CRISPR^23,24,25 i nadekspresja konstruktów transgenicznych poprzez mikroiniekcje, z opcją integracji konstruktów transgenicznych poprzez napromieniowanie lub integrację opartą na transpozonach^26,27,28,29. Metody te wymagają jednak drogiego sprzętu do mikroiniekcji, a wysoki koszt przewodników RNA lub enzymu Cas9 może uniemożliwić stosowanie tych metod w instytucjach o ograniczonych funduszach. Zamiast tego tysiące transgenicznych linii i mutantów są łatwo dostępne za kilka dolarów zarówno w Caenorhabditis Genetics Center (CGC), jak i National Bioresource Project (NBRP). NBRP oferuje izolowane mutanty dla dużej liczby genów C. elegans, w tym opublikowane, a zatem zweryfikowane zmutowane szczepy, mutanty pochodzące z projektów pilotażowych oraz mutanty, które nie zostały jeszcze scharakteryzowane. W przeciwieństwie do tego, CGC jest depozytariuszem w większości opublikowanych i uznanych linii C. elegans ze społeczności naukowej. Obie firmy wysyłają szczepy na cały świat po bardzo rozsądnych cenach i oferują szeroką gamę opcji dla osób o ograniczonej zdolności do syntezy szczepów we własnym zakresie.

Tutaj oferowana jest kolekcja wyselekcjonowanych metod, które prawdopodobnie będą najtańszymi metodami do oznaczania długości życia i zdrowia C. elegans. Wszystkie przedstawione tutaj metody wymagają taniego sprzętu i materiałów eksploatacyjnych oraz wykorzystują wyłącznie szczepy łatwo dostępne w CGC. Być może najbardziej zaporowy dla testów długowieczności i przeżycia u C. elegans jest koszt płytek z pożywkami wzrostowymi nicieni (NGM). Ponieważ C. elegans są hermafrodytami i samozapładniają, standardowe testy przeżywalności wymagają, aby dorosłe zwierzęta były stale oddalane od ich potomstwa, aby uniknąć zakażenia potomstwem. Proces ten jest nie tylko czasochłonny, ale może stać się kosztowny ze względu na konieczność użycia około 100 płytek na warunek do przeprowadzenia jednego testu żywotności. W tym przypadku dostępne są dwie alternatywy: wykorzystanie wrażliwego na temperaturę mutanta bezzarodkowego, GLP-4(bn2) lub sterylizacja chemiczna przy użyciu 5-fluoro-2'-deoksyurydyny (FUDR). glp-4 koduje syntetazę tRNA valyl-aminoacylu, a wrażliwe na temperaturę GLP-4(bn2) są nierozrodcze w ograniczonych temperaturach z powodu zmniejszonej translacji białek^30,31. FUDR to solidna metoda chemicznej sterylizacji C. elegans poprzez zapobieganie replikacji DNA, a tym samym hamowanie reprodukcji³². Chociaż FUDR może być zbyt drogi dla niektórych laboratoriów, do chemicznej sterylizacji robaków wymagana jest tylko niewielka ilość, a jego stabilność w postaci proszku może sprawić, że będzie to wykonalne dla większości grup. Wykorzystanie wrażliwego na temperaturę mutanta glp-4(bn2) jest z pewnością najtańszą opcją, ponieważ jedynym wymogiem jest inkubator do przestawienia zwierząt do restrykcyjnej temperatury 25 °C; Należy jednak zauważyć, że wzrost w temperaturze 25 °C może powodować łagodny stres cieplny^33,34. Niezależnie od metody, wykorzystanie sterylnych zwierząt może znacznie obniżyć koszty materiałów eksploatacyjnych wymaganych do testów związanych z wiekiem.

Aby badać starzenie się, standardowe testy długości życia są konwencjonalne, ponieważ paradygmaty, które zmieniają długowieczność, mają bezpośredni wpływ na starzenie się. Jednak pomiary długości zdrowia i tolerancji na stres dostarczają dodatkowych informacji na temat zdrowia organizmu. W tym miejscu oferowanych jest kilka metod pomiaru długości zdrowia: 1) płodność jako miara zdrowia reprodukcyjnego; 2) liczebność lęgu jako miara zdrowia rozwojowego i żywotności wypuszczonego potomstwa; oraz 3) zachowanie lokomotoryczne jako miara funkcji i motoryki mięśni, które są bezpośrednio skorelowane ze starzeniem się. Dodatkowo oferowane są testy tolerancji na stres: przeżycie na stres ER, stres mitochondrialny/oksydacyjny oraz przeżycie stresu termicznego. Rzeczywiście, zwierzęta o zwiększonej odporności na stres ER ^35,36, mitochondrialny stres³⁷ i stres termiczny³⁸ wykazują zwiększoną długość życia. Stres ER jest stosowany poprzez wystawienie C. elegans na działanie tunicycyny, która blokuje glikozylację sprzężoną z N i powoduje akumulację nieprawidłowo sfałdowanych białek³⁹. Stres mitochondrialny/oksydacyjny jest indukowany przez ekspozycję na parakwat, który indukuje powstawanie ponadtlenków szczególnie w mitochondriach⁴⁰. Stres cieplny jest stosowany poprzez inkubację zwierząt w temperaturze 34-37 °C^33,41. Wszystkie opisane tutaj testy można wykonać przy minimalnym sprzęcie i funduszach oraz oferują różnorodne narzędzia do badania starzenia się w różnych grupach.

1. Wzrost i utrzymanie C. elegans

1. Nalewanie płytek z pożywką do wzrostu nicieni (NGM)
   1. Hoduj C. elegans na standardowych 2% płytkach agarowych z pożywką do wzrostu nicieni (NGM) składającą się z 1 mM CaCl₂, 5 μg / ml cholesterolu, 25 mM KPO₄ (pH 6,0), 1 mM MgSO₄, 0,25% w/v peptonu i 51,3 mM NaCl.
   2. Na 1 l płytek agarowych NGM odmierz 2,5 g peptonu, 3,0 g NaCl i 20 g agaru do 1-litrowej kolby z mieszadłem.
      UWAGA: Zaleca się standaryzację określonego źródła agaru, ponieważ zaobserwowaliśmy różnice w sztywności między markami, co może mieć wpływ na odtwarzalność. Tutaj Bacto-Agar jest ściśle stosowany. Dodatkowo zaleca się dodawanie agaru bezpośrednio do autoklawowanej kolby, ponieważ agar nie rozpuści się całkowicie bez podgrzania, a przeniesienie roztworu zawierającego agar spowoduje utratę agaru i błędy w stężeniu.
   3. Dodać dH₂O do 970 ml.
      UWAGA: 30 ml płynnych dodatków po sterylizacji spowoduje, że ostateczna objętość wyniesie 1 l. W naszych rękach ~951 ml dH₂O będzie potrzebne do osiągnięcia 970 ml końcowej objętości.
   4. Sterylizuj roztwór agaru NGM za pomocą standardowego sterylizatora w autoklawie lub pożywce w celu skutecznej sterylizacji.
      UWAGA: W tym momencie sterylny agar NGM może być przechowywany przez kilka miesięcy w temperaturze pokojowej. W przypadku przechowywania, agar NGM można zawiesić w kuchence mikrofalowej z impulsami 15-45 s, aby zapobiec wykipieniu roztworu, lub w podgrzanej łaźni wodnej.
   5. Pozwól roztworowi mieszać, aż ostygnie do temperatury 60-75 °C. Mieszanie podczas chłodzenia jest ważne, aby zapobiec nierównomiernemu chłodzeniu, które może spowodować zestalenie się niektórych agarów.
   6. Gdy roztwór ostygnie, podgrzej łaźnię wodną lub kąpiel perełkową do temperatury 65-70 °C.
   7. Gdy roztwór ostygnie do 60-75 °C, dodaj płynne dodatki: 2,0 ml 0,5 M CaCl₂, 1 ml 5 mg/ml cholesterolu, 25 ml 1 M KPO₄ (pH 6,0) i 0,5 M_MgSO4 (patrz Tabela 1 dla przepisów dla wszystkich odczynników) i pozostaw roztwór do wymieszania przez ~5 minut, aby zapewnić całkowite wymieszanie.
      UWAGA: Leki mogą być również zawarte na tabliczkach (np. dodać 1 ml 100 mg/ml karbenicyliny i 1 ml 1 M IPTG; dodać 10 ml 2,5 mg/ml tunikamycyny; dodać 10 ml 400 mM parakwatu).
   8. Zanurzyć kolbę zawierającą agar NGM w łaźni wodnej o temperaturze 65-70 °C, aby zapobiec krzepnięciu agaru NGM podczas nalewania do płytek.
   9. Odpipetować 9-11 ml roztworu do każdej płytki o średnicy 60 mm lub 20-30 ml roztworu do każdej płytki o średnicy 100 mm.
      UWAGA: Zaleca się używanie najmniejszej dostępnej objętości pipety, aby uniknąć wycieków NGM spowodowanych rozszerzaniem się powietrza w pipecie. Pipetowanie o 1-2 ml więcej pożywki niż zostanie dodane do każdej płytki, aby uniknąć całkowitego opróżnienia pipety, pomoże zapobiec tworzeniu się pęcherzyków powietrza. Alternatywnie, płytki można przelewać ręcznie bezpośrednio z butelki do talerza, ale zdecydowanie zaleca się pipetowanie, aby uzyskać płytki o równej objętości. Płytki o jednakowej objętości są ważne dla zapewnienia podobnych stężeń roztworów przy stosowaniu metod, w których roztwory są nakładane bezpośrednio na płytkę (patrz krok 1.1.17). Równe objętości pozwalają również na łatwą mikroskopię w celu utrzymania podobnej płaszczyzny ogniskowej na płytkach.
   10. Umieść pipetę z powrotem w podgrzanym roztworze, aby utrzymać temperaturę i zapobiec zestaleniu się agaru NGM.
   11. Powtórz powyższe dwa kroki dla wszystkich płyt.
   12. Pozwól płytkom agarowym NGM zestalać się przez noc.
   13. Po zastygnięciu szalek należy je przechowywać do 3 miesięcy w temperaturze 4 °C lub przejść do kroku 1.1.14 w przypadku płytek wysiewających z bakteriami. Przechowuj talerze w szczelnych pojemnikach, aby zatrzymać wilgoć i utrzymać jakość płyty.
   14. Hoduj kulturę OP50 w bulionie lizogenicznym (LB) lub równoważnym pożywce do wyboru przez 24-48 godzin w temperaturze otoczenia (~22-25 °C) lub hoduj kulturę HT115 w LB + antybiotyki (ampicylina/węglowodan + tetracyklina jest zalecana dla HT115) z wytrząsaniem w temperaturze 37 °C przez 12-16 h.
       UWAGA: Zaleca się uprawę OP50 w temperaturze pokojowej, ponieważ stwierdzono bardziej agresywny wzrost OP50 w temperaturze 37 °C, co wpływa na długość życia C. elegans. W przeciwieństwie do tego, HT115 ma wolniejsze tempo wzrostu i tworzy mniej gęste kultury; dlatego zaleca się uprawę HT115 w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem.
   15. Wysiewać objętość 100-200 μl nasyconej kultury OP50/HT115 na płytkę 60 mm lub 1 ml na płytkę 100 mm.
   16. Pozostaw talerze do wyschnięcia na noc na blacie i odczekaj dodatkowy dzień na wyschnięcie, jeśli talerze są nadal mokre. Przechowywać płytki w szczelnie zamkniętych pojemnikach w temperaturze 4 °C przez ~2 miesiące.
   17. Opcjonalnie: Dodaj leki bezpośrednio na płytki agarowe NGM (np. 100 μl 10 mg/ml roztworu FUDR), aby chemicznie wysterylizować robaki.
2. Utrzymywanie zasobów C. elegans
   1. Prawidłowo oznacz spód płytki z agarem NGM z nasionami. Oznacz krawędzie na spodzie płytki, aby zapobiec blokowaniu przepływu światła na standardowych mikroskopach preparacyjnych.
   2. Używając standardowego mikroskopu preparacyjnego, zgarnij wybrane bakterie na C. elegans pick.
      UWAGA: W tym protokole użyto kilofa składającego się z drutu 90%/10% platynowo-irydowego przymocowanego do końca szklanej pipety Pasteura.
   3. Za pomocą bakterii zbierz 10-20 jaj, zwierząt L1, L2 lub L3 i przenieś je na nowo oznakowaną płytkę agarową NGM z nasionami.
      UWAGA: Najlepiej zbierać młodsze zwierzęta; Z doświadczenia autorów wynika, że w przypadku standardowych zwierząt typu dzikiego przemieszczenie 10-20 jaj na młode zwierzę pozwoli na wzrost płytki w temperaturze 15 °C bez głodu. W przypadku zwierząt transgenicznych lub zmutowanych ze zmniejszoną płodnością należy wprowadzić więcej zwierząt na płytkę.
   4. W przypadku zwierząt o płodności typu dzikiego i hodowanych w temperaturze 15 °C należy powtarzać kroki 1.2.1–1.2.3 co 7 dni w celu utrzymania tygodniowego stada. W przypadku zwierząt hodowanych w temperaturze 20 °C kroki 1.2.1–1.2.3 należy powtarzać co 4–5 dni, aby zapobiec głodowi.
3. Synchronizacja robaków za pomocą bleaching
   UWAGA: Pełna płytka z agarem NGM o średnicy 60 mm (np. 1-tygodniowe płytki wyjściowe uprawiane w temperaturze 15 °C) zapewni wystarczającą liczbę zwierząt dla większości opisanych standardowych testów. Ogólnie rzecz biorąc, jeden dorosły osobnik (dorosły osobnik pełen jaj) dostarczy 10-15 jaj⁴², a pełna, 60-milimetrowa płytka z agarem NGM ma od 100 do 200 ciężarnych dorosłych, co daje ~1000-2000 jaj.
   1. W przypadku eksperymentów na większą skalę, wymagających większej liczby zwierząt, pokrój pełny agar NGM o średnicy 60 mm na cztery do sześciu równych kawałków i pokrój je na płytki o średnicy 100 mm w celu ekspansji.
      UWAGA: W tym przypadku chunking odnosi się do przecięcia kawałka płytki agarowej NGM zawierającej robaki i przeniesienia całego kawałka agaru + robaków na nową płytkę, stroną robakową do dołu, aby umożliwić robakom czołganie się po nowej płytce. Jako punkt odniesienia, zwierzęta z płodnością typu dzikiego będą produkować pełną płytkę o średnicy 100 mm, jeśli będą uprawiane w temperaturze 20 °C przez 2-3 dni po rozdrobnieniu.
   2. Aby rozpocząć zbieranie nicieni, należy wlać niewielką ilość roztworu M9 (Tabela 1) na płytki zawierające robaki, uważając, aby nie przepełnić szalki Petriego. Delikatnie zamieszaj roztwór M9, aby usunąć robaki z trawników bakteryjnych.
   3. Zebrać grawitacyjne dorosłe robaki za pomocą pipety serologicznej, uważając, aby nie przebić agaru końcówką pipety.
      UWAGA: Zalecane są szklane pipety serologiczne, ponieważ C. elegans ma tendencję do przyklejania się do plastiku. Jeśli szklane pipety nie są dostępne, zaleca się rozpoczęcie od większej liczby zwierząt niż jest to konieczne, ponieważ część z nich zostanie utracona z powodu przyklejenia się do plastikowych pipet.
   4. Granulować zwierzęta przez odwirowanie przez 30 s przy 1 100 x g. Odessać supernatant.
      UWAGA: Osad C. elegans jest bardzo luźny, dlatego należy uważać, aby nie potrząsnąć ani nie zakłócić wysiewu podczas zasysania supernatantu.
   5. Podczas gdy zwierzęta wirują, przygotuj 5 ml roztworu wybielającego na szczep (szczegóły przepisu znajdują się w Tabeli 1); na 5 ml roztworu wymieszaj 1,5 ml 6% podchlorynu sodu (wybielacza), 0,75 ml 5 M NaOH lub KOH i 2,75 ml dH₂O.
      UWAGA: Podchloryn sodu i roztwory wodorotlenków o wysokim stężeniu są, dlatego podczas obsługi zaleca się noszenie rękawic i fartucha laboratoryjnego.
   6. Dodać 5 ml roztworu wybielającego do mieszaniny granulek robaków/M9.
   7. Sprawdzaj robaki pod mikroskopem preparacyjnym co kilka minut, aż wszystkie dorosłe ciała robaków zostaną rozpuszczone i w mieszance pozostaną tylko jaja. Energicznie wstrząśnij mieszanką robaka i wybielacza, aby przyspieszyć proces wybielania.
      UWAGA: Pozostawienie jaj w mieszance wybielacza przez dłuższy czas spowoduje uszkodzenie jaj i wpłynie na żywotność zwierząt. W przypadku zwierząt typu dzikiego bielenie trwa zwykle 4-6 minut z potrząsaniem. Dlatego zaleca się badanie zwierząt pod mikroskopem w odstępach 30 sekund, począwszy od znaku 4 minut.
   8. Jaja obrabiać w pelety, obracając mieszankę jajek i wybielacza przez 30 s przy 1,100 x g.
      UWAGA: Niektóre stożkowe probówki o pojemności 15 ml mają gradientowe linie po wewnętrznej stronie probówki. W przypadku tych probówek zaleca się wirowanie jaj z większą prędkością (np. 30 s przy 2,000 x g), aby upewnić się, że jaja osadzają się na dnie rurki i nie pozostają na liniach gradientu.
   9. Odessać roztwór wybielający.
      UWAGA: Granulka jaja jest sztywniejsza niż granulka robaka, ale nadal może zostać łatwo rozerwana. Dlatego uważaj, aby nie potrząsnąć probówką po odwirowaniu.
   10. Umyj jajka, dodając roztwór M9 do 15 ml i odwracając probówkę cztery lub pięć razy, aby upewnić się, że jaja są całkowicie rozproszone w roztworze M9.
   11. Jaja otulić przez odwirowanie przez 30 s przy 1,100 x g i odessać roztwór M9.
   12. Powtórz powyższe dwa kroki, w sumie cztery prania, aby wyeliminować wybielacz z mieszanki jajecznej.
   13. Ponownie zawiesić jaja w 100 μl do 2 ml roztworu M9 (tj. w zależności od całkowitej liczby wybielonych robaków) po ostatnim płukaniu. Dokładnie wstrząśnij jajkami, aby rozbić grudki i upewnić się, że granulka jest całkowicie zawieszona.
   14. Alternatywnie, zwierzęta mogą być zatrzymane L1 w celu ściślejszej synchronizacji czasowej; w celu zatrzymania L1 dodaj roztwór M9 do osadu jaj do ~10 ml w stożkowej probówce o pojemności 15 ml. Pozwól robakom obracać się w rotatorze do 24 godzin w temperaturze 20 °C lub temperaturze otoczenia. Zwierzęta L1 zazwyczaj potrzebują o pół dnia mniej na osiągnięcie dorosłości w porównaniu z czasem składania jaj opisanym w kroku 1.3.16.
   15. Przybliżyć stężenie w jajach (lub stężenie L1; patrz krok 1.3.14), odmierzając pipetowanie 4 μl mieszanki jaja/M9 na płytkę NGM wysianą bakteriami. Policz i oblicz, ile jaj jest obecnych na μl platerowanych. Powtórz liczenie trzy lub cztery razy, aby poprawić przybliżenie.
       UWAGA: Przybliżenie stężenia jaj zapewni, że posiew zostanie zebrana wystarczająca liczba zwierząt dla odpowiedniej wielkości próbki do eksperymentów bez nadmiernego posiewu, co spowoduje głód.
   16. Na podstawie przybliżenia umieść odpowiednią liczbę jaj na płytkach agarowych NGM wysianych wybranymi bakteriami. W przypadku tablic OP50 należy umieścić maksymalnie 200 zwierząt na tabliczce o średnicy 60 mm i 1 000 zwierząt na tabliczce o średnicy 100 mm. W przypadku płyt HT115 należy umieścić maksymalnie 150 zwierząt na płytce o średnicy 60 mm i 600 zwierząt na płytce o średnicy 100 mm.
       UWAGA: Są to przybliżone liczby oparte na naszych warunkach laboratoryjnych i mogą się zmieniać w zależności od grubości trawnika bakteryjnego. Jaja wyhodowane w temperaturze 15 °C potrzebują ~5 dni, aby osiągnąć dorosłość w 1. dniu (~140 godzin, aby osiągnąć maksymalne składanie jaj, grawitację dorosłości). Jaja wyhodowane w temperaturze 20 °C potrzebują ~4 dni, aby osiągnąć dorosłość w 1. dniu (~96 godzin, aby osiągnąć maksymalne składanie jaj, w stanie dorosłym). Jaja wyhodowane w temperaturze 25 °C potrzebują ~3,5 dnia, aby osiągnąć dorosłość w 1. dniu (~62 godziny, aby osiągnąć maksymalne złożenie jaj w stadium dorosłym
   ).
4. Składanie jaj jako alternatywna metoda synchronizacji populacji C. elegans
   1. Jeśli protokoły bielenia nie są wykonalne (np. brak dostępnej wirówki), jako alternatywną metodę synchronizacji populacji C. elegans, należy przeprowadzić procedurę składania jaj. Należy pamiętać, że ten protokół jest bardziej pracochłonny i spowoduje mniejsze plony zwierząt.
   2. Do składania jaj umieść 8-12 dorosłych osobników na standardowej płytce z agarem NGM wysianej wybranymi bakteriami i udokumentuj dokładną liczbę zwierząt umieszczonych na talerzu.
      UWAGA: Procedury składania jaj powinny być wykonywane w temperaturze, która będzie używana do eksperymentów.
   3. Pozwól zwierzętom składać jaja przez 4-8 godz.
      UWAGA: Czas pozostawiania zwierząt na talerzu można dostosować w razie potrzeby. Na przykład większą liczbę zwierząt można położyć na talerzu na krótszy czas składania jaj, gdy dostępnych jest mniej czasu. C. elegans zazwyczaj składają jaja w seriach, które można oszacować na około pięć jaj/h dla zwierząt z płodnością typu dzikiego⁴³. Postępuj zgodnie z zaleceniami w kroku 1.3.16, aby uniknąć nadmiernego powlekania zwierząt.
   4. Usuń wszystkie dorosłe zwierzęta z talerza.
      UWAGA: Wszystkie dorosłe zwierzęta pozostawione na talerzu będą nadal składać jaja, co spowoduje niezsynchronizowaną populację.
   5. Umieść jaja w temperaturze 15 °C przez ~5 dni lub 20 °C przez ~4 dni, aby osiągnąć dorosłość w 1 dniu.

2. Pomiar długowieczności u C. elegans

1. Standardowa żywotność
   1. Przygotuj płytki agarowe NGM, wysiewając je ze 100 μl wybranych bakterii. Aby zapewnić spójność, upewnij się, że te same bakterie są używane we wszystkich kontrpróbach. Ponieważ robaki są przenoszone codziennie w fazie składania jaj w wieku dorosłym, wysiewaj od pięciu do siedmiu zestawów płytek agarowych NGM na czas trwania życia i od dwóch do czterech płytek na szczep, aby wyhodować zwierzęta do dorosłości (tj. jeśli używasz ośmiu płytek po 15 zwierząt przez całe życie, należy wysiać 40-56 płytek na warunek).
   2. Pozostaw talerze do wyschnięcia na noc przed przechowywaniem.
      UWAGA: Zaleca się, aby talerze były przechowywane w temperaturze 4 °C, a wymagana liczba płyt była codziennie wyjmowana z chłodni, aby zapobiec tworzeniu się przez bakterie grubych trawników, które mogą utrudniać przenoszenie/liczenie żywotności. Upewnij się, że płytki są rozgrzane przed poszyciem robaków.
   3. Zbierz zsynchronizowaną populację C. elegans za pomocą standardowego testu bielenia, jak opisano w krokach 1.3 i 1.4.
   4. Przenieś 10-15 dorosłych zwierząt dnia 1 na 8-12 talerzy każde. Aby uzyskać standardową długość życia, zacznij od ~120 zwierząt, aby upewnić się, że wielkość próby nie spadnie zbyt daleko poniżej 100 po wydarzeniach cenzury (np. osiem tabliczek z 15 zwierzętami = 120 zwierząt; 12 tabliczek z 10 zwierzętami = 120 zwierząt).
      UWAGA: W obecnym przypadku 10-15 zwierząt to liczba możliwa do opanowania dla większości badaczy, chociaż sześć tabliczek po 20 zwierząt jest również wykonalne, aby obniżyć koszt materiałów eksploatacyjnych.
   5. Przez pierwsze 7-8 dni lub do momentu, gdy potomstwo przestanie być widoczne, dorosłe zwierzęta należy odsuwać od potomstwa co 1-2 dni.
      UWAGA: Zwierzęta mogą być przenoszone co drugi dzień w celu zaoszczędzenia materiałów, ale należy zachować ostrożność, aby zapewnić, że jaja/larwy nie są przenoszone wraz z dorosłymi osobami, aby zapobiec zanieczyszczeniu dorosłych populacji potomstwem. W tym badaniu najprostszą metodą jest przemieszczanie zwierząt codziennie od 1 do 3 dnia, kiedy składanie jaj jest na najwyższym poziomie, a następnie przejście na przemieszczanie zwierząt co drugi dzień przez 5-8 dni, kiedy składanie jaj jest minimalne. Dzięki tej metodzie nie jest konieczne zapobieganie przenoszeniu jaj/larw w dniach 1-3, ponieważ dorosłe osobniki będą przenoszone codziennie, a jaja/larwy nie mogą rozwinąć się do dorosłości w ciągu 1 dnia.
   6. Po tym, jak zwierzęta przestaną produkować potomstwo, oceniaj długość życia co drugi dzień, aż wszystkie zwierzęta zostaną ocenione jako martwe lub ocenzurowane. Usuń wszystkie martwe lub ocenzurowane zwierzęta z talerza, aby uniknąć pomyłek i przeliczania tego samego zwierzęcia.
      UWAGA: Śmierć jest zaliczana za zwierzęta, które nie wykazują ruchu po delikatnym dotknięciu kilofem. Cenzura jest punktowana jako zwierzęta, które są zapakowane w worki, wykazują wystające srom/jelita lub czołgają się do boków talerza, gdzie wysuszają.
2. Długość życia ze sterylizacją chemiczną przy użyciu FUDR
   1. Przygotuj płytki agarowe NGM, wysiewając je ze 100 μl wybranych bakterii. Aby zapewnić spójność, upewnij się, że te same bakterie są używane we wszystkich kontrpróbach. Wysiewaj 8-12 talerzy na szczep do eksperymentów z długością życia i od dwóch do czterech talerzy na szczep, aby wyhodować zwierzęta do dorosłości. Pozostaw talerze do wyschnięcia na noc.
   2. Dodaj 100 μl 10 mg/ml FUDR na środek trawnika bakteryjnego, aby uzyskać 8-12 płytek, które będą używane do oznaczania długości życia. Pamiętaj, aby pozostawić dwie do czterech płytek bez FUDR jako talerzy startowych, aby zwierzęta mogły dorosnąć do dorosłości. Pozostaw talerze do wyschnięcia na noc.
      UWAGA: FUDR blokuje syntezę DNA, dlatego zaleca się noszenie rękawiczek podczas obsługi.
   3. Zbierz zsynchronizowaną populację C. elegans za pomocą standardowego testu bielenia, jak opisano w krokach 1.3 i 1.4.
      UWAGA: Zwierzęta te muszą być hodowane na talerzach bez FUDR, ponieważ FUDR spowoduje zatrzymanie/śmierć zwierząt.
   4. Przenieś 10-15 dorosłych zwierząt dnia 1 na 8-12 płytek każdy, zawierających FUDR. Aby uzyskać standardową długość życia, zacznij od ~120 zwierząt, aby upewnić się, że wielkość próby nie spadnie zbyt daleko poniżej 100 po wydarzeniach cenzury (np. osiem tabliczek z 15 zwierzętami = 120 zwierząt; 12 tabliczek z 10 zwierzętami = 120 zwierząt).
      UWAGA: Zwierzęta mogą być również przenoszone do FUDR na etapie L4, jeśli konieczne jest całkowite uniknięcie tworzenia się potomstwa, ale zwierzęta nie mogą być przenoszone zbyt wcześnie, ponieważ spowoduje to, że zwierzęta będą bardziej narażone na wystające srom/jelita i zwiększy cenzurę.
   5. Oceniaj długość życia co drugi dzień, dopóki wszystkie zwierzęta nie zostaną ocenione jako martwe lub ocenzurowane. Usuń wszystkie martwe lub ocenzurowane zwierzęta z talerza, aby uniknąć pomyłek i przeliczania tego samego zwierzęcia.
      UWAGA: W przypadku długości życia FUDR każde potomstwo można zignorować, ponieważ zatrzyma się na etapie L1 i ostatecznie umrze.
3. Długość życia przy użyciu sterylnych mutantów wrażliwych na temperaturę
   1. Przygotuj płytki agarowe NGM, wysiewając je ze 100 μl wybranych bakterii. Aby zapewnić spójność, upewnij się, że te same bakterie są używane we wszystkich kontrpróbach. Wysiewaj 8-12 talerzy na szczep do eksperymentów z długością życia i 2-4 talerze na szczep, aby wyhodować zwierzęta do dorosłości. Pozostaw talerze do wyschnięcia na noc.
   2. Zbierz zsynchronizowaną populację C. elegans za pomocą standardowego testu bielenia, jak opisano w krokach 1.3 i 1.4. Pamiętaj, aby hodować zwierzęta w restrykcyjnej temperaturze 25 °C, aby zapewnić im bezpłodność.
   3. Przenieś 10-15 dorosłych zwierząt dnia 1 na 8-12 talerzy każde. Aby uzyskać standardową długość życia, zacznij od ~120 zwierząt, aby upewnić się, że wielkość próby nie spadnie zbyt daleko poniżej 100 po wydarzeniach cenzury (np. osiem tabliczek z 15 zwierzętami = 120 zwierząt; 12 tabliczek z 10 zwierzętami = 120 zwierząt).
   4. Oceniaj długość życia co drugi dzień, dopóki wszystkie zwierzęta nie zostaną ocenione jako martwe lub ocenzurowane. Usuń wszystkie martwe lub ocenzurowane zwierzęta z talerza, aby uniknąć pomyłek i przeliczania tego samego zwierzęcia.
      UWAGA: W przypadku szczepów krótkożyciowych zaleca się codzienne ocenianie długości życia, ponieważ żywotność w temperaturze 25 °C jest znacznie krótsza, a zatem zakres dynamiki jest ograniczony. Z doświadczenia autorów wynika, że zwierzęta można przestawić z powrotem do 20 °C po 2 dniu, a zwierzęta pozostaną bezpłodne, jeśli preferowane jest osiągnięcie długości życia w temperaturze 20 °C.

3. Pomiar zdrowotności u C. elegans

1. Pomiary zachowań lokomotorycznych poprzez młócenie
   1. Zbierz zsynchronizowaną populację C. elegans za pomocą standardowego testu bielenia, jak opisano w krokach 1.3 i 1.4.
   2. Przenieś małą kolonię dorosłych robaków dnia 1 na płytkę agarową NGM pod lunetą sekcyjną na 10-20 μl roztworu M9. Zaleca się 10-15 zwierząt jako możliwą do opanowania liczbę zwierząt do policzenia.
   3. Skupiając się na jednym robaku na raz, policz, ile razy próbka zmienia się z formacji wklęsłej na wypukłą w ciągu 15 sekund. Użyj licznika ręcznego i timera, aby skupić się na robaku na czas trwania testu.
      UWAGA: W celu dokładniejszej/łatwiejszej analizy można nagrać film przedstawiający płytę. Na przykład standardowe nasadki do okularów mikroskopowych są dostępne dla większości smartfonów i aparatów cyfrowych (15-30 USD) i są świetną opcją do nagrywania filmów przy niskich kosztach.
   4. Powtórz krok 3.1.3 dla innych robaków w cieczy, uśredniając całkowity współczynnik ruchliwości dla 10-15 robaków. W przypadku większej wielkości próbki powtórz kroki 3.1.2-3.1.4.
   5. Starzej robaki do pożądanego wieku. Podobne metody oznaczania długości życia opisane w krokach 2.1-2.3 można zastosować do starzenia się robaków. Powtórz kroki 3.1.2-3.1.4, aby sprawdzić młócenie w żądanym wieku.
      UWAGA: Alternatywną metodą dla kroku 3.1.2 jest dodanie ~30 μl lub więcej roztworu M9 na grupę robaków na płytce. Pozwoli to zaoszczędzić czas na ręcznym przenoszeniu robaków, chociaż ze względu na losowy przypadek, w którym robaki znajdują się na jednej płytce, nie ma gwarancji, że grupa robaków pozostanie w jednym punkcie na talerzu.
2. Pomiary płodności (liczby jaj) u C. elegans
   1. Zbierz zsynchronizowaną populację C. elegans za pomocą standardowego testu bielenia, jak opisano w krokach 1.3 i 1.4. Testy liczby komórek jajowych rozpoczynają się na etapie L4, czyli ~1 dzień przed 1. dniem dorosłości (~3 dni w temperaturze 15 °C lub ~2 dni w temperaturze 20 °C po zatrzymaniu L1).
   2. Wyodrębnij robaki L4 na oddzielnych płytkach agarowych NGM obsianych wybranymi bakteriami. Zaleca się wykorzystanie ~10-15 zwierząt do testu płodności.
      UWAGA: Zaleca się rozcieńczenie wybranych bakterii o 50% (tj. nie jest to kultura nasycona), aby poprawić widoczność jaj na trawniku bakteryjnym.
   3. Pozwól zwierzętom rosnąć przez noc w temperaturze 20 °C. Upewnij się, że nowo wysiana partia talerzy jest gotowa na następny dzień.
   4. W 1 dniu dorosłości przenieś dorosłe robaki na świeże płytki agarowe NGM wysiane rozcieńczonymi wybranymi bakteriami.
      UWAGA: Zaleca się używanie świeżo wysianych talerzy lub przechowywanie talerzy w temperaturze 4 °C do czasu użycia, aby zapobiec powstawaniu grubych trawników bakteryjnych.
   5. Policz całkowitą liczbę jaj złożonych na każdej płytce agarowej NGM.
      UWAGA: Aby pomóc w skanowaniu płytki, na pokrywie talerza można narysować siatkę i umieścić ją pod nacinaną płytką na jajka. Płytkę można następnie zeskanować wzdłuż linii siatki, aby zachować orientację podczas przesuwania płytki i zapobiec ponownemu przeliczaniu jaj.
   6. Powtarzaj kroki 3.2.4-3.2.5 przez 7-8 dni lub do momentu, gdy jaja przestaną być widoczne na talerzu.
      UWAGA: W dniach 1-3, kiedy wskaźniki składania jaj są wysokie, zaleca się przemieszczanie zwierząt co najmniej co 12 godzin i testowe liczenie jaj dwa razy dziennie. Zwiększa to jednak ilość pracy i koszty materiałów eksploatacyjnych, a co za tym idzie, przemieszczanie zwierząt i pomiary można ograniczyć do jednego dnia dziennie, ale należy zadbać o to, aby wszystkie jaja i wyklute zwierzęta były prawidłowo policzone. Do celów tego testu wszystkie wyklute zwierzęta są liczone jako jaja.
3. Pomiar wielkości (rozwoju) lęgów potomstwa C. elegans
   1. Zbierz zsynchronizowaną populację C. elegans za pomocą standardowego testu bielenia, jak opisano w krokach 1.3 i 1.4. Testy wielkości czerwiu rozpoczynają się na etapie L4, czyli ~1 dzień przed 1. dniem dorosłości (~3 dni w temperaturze 15 °C lub ~2 dni w temperaturze 20 °C po zatrzymaniu L1).
   2. Wyodrębnij robaki L4 na oddzielnych płytkach agarowych NGM obsianych wybranymi bakteriami. Zaleca się wykorzystanie ~10-15 zwierząt do testu płodności.
   3. Pozwól zwierzętom rosnąć przez noc w temperaturze 20 °C. Upewnij się, że nowo wysiana partia talerzy jest gotowa na następny dzień.
   4. W 1 dniu dorosłości przenieś dorosłe robaki na świeże płytki agarowe NGM obsiane wybranymi bakteriami.
   5. Co 12-24 godziny (2x dziennie lub 1x dziennie) przenosić dorosłe robaki na świeże płytki agarowe NGM obsiane wybranymi bakteriami przez 7-8 dni lub do momentu, gdy potomstwo przestanie być widoczne. Przechowywać wszystkie talerze zawierające jajka w temperaturze 20 °C.
   6. Powtarzaj krok 3.3.5 przez 7-8 dni lub do momentu, gdy potomstwo przestanie być widoczne. Wszystkie talerze zawierające jajka należy przechowywać w temperaturze 20 °C.
      UWAGA: Płytki potomstwa mogą być również przechowywane w temperaturze 15 °C, aby wydłużyć czas przed ich nacięciem.
   7. Dwa dni po przeniesieniu robaków policz rozwinięte potomstwo na płytkach. Należy policzyć rozwijające się robaki w stadium L4 (tj. 2 dni po wykluciu w temperaturze 20 °C) lub wcześniej, aby upewnić się, że pokolenie F2 (tj. potomstwo potomstwa) nie zafałszuje wyników. Policz wszystkie żywe robaki.
      1. Usuń wszystkie robaki z płytki podczas ich liczenia. Utrzymuj płytki przez dodatkowe 1-2 dni przed ponownym nacięciem, aby upewnić się, że żadne zwierzęta z opóźnionym wykluciem/rozwojem nie zostaną pominięte.
   8. Powtórzyć krok 3.3.7 dla każdej zebranej płytki do składania jaj.
      UWAGA: Testy wielkości czerwiu można przeprowadzić w połączeniu z testem liczby jaj (krok 3.2), aby zminimalizować robociznę i koszty materiałów eksploatacyjnych poprzez zebranie dwóch zestawów danych z jednego eksperymentu. Pozwoli to również na bezpośrednie porównanie wielkości lęgu i liczby jaj u tych samych zwierząt.

4. Pomiar odporności na stres u C. elegans

1. Pomiary wrażliwości na stres ER za pomocą tunikamycyny
   1. Przygotować płytki agarowe NGM przez płytki wysiewające zawierające tunikamycynę (patrz krok 1.1.7, UWAGA) ze 100 μl wybranych bakterii.
      UWAGA: Podczas obchodzenia się z tunikamycyną należy nosić rękawice.
   2. Aby zapewnić spójność, upewnij się, że te same bakterie są używane we wszystkich kontrpróbach. Wysiewaj 8-12 płytek tunikamycyny na szczep do testów przetrwania i dwie do czterech płytek bez tunikamycyny na szczep, aby wyhodować zwierzęta do dorosłości. Pozostaw talerze do wyschnięcia na noc.
   3. Zbierz zsynchronizowaną populację C. elegans za pomocą standardowego testu bielenia, jak opisano w krokach 1.3 i 1.4.
      UWAGA: Zwierzęta muszą być hodowane na płytkach bez tunikamycyny do 1. dnia dorosłości, ponieważ zwierzęta zostaną zatrzymane/umrą po zażyciu tunikamycyny.
   4. Przenieś 10-15 dorosłych zwierząt dnia 1 na 8-12 talerzy każde. W przypadku standardowych testów przeżycia należy zacząć od ~120 zwierząt, aby upewnić się, że wielkość próbki nie spadnie zbyt daleko poniżej 100 po wydarzeniach cenzury (np. osiem płytek po 15 zwierząt = 120 zwierząt; 12 płytek po 10 zwierząt = 120 zwierząt).
      UWAGA: Podobnie jak w przypadku testów FUDR, testy przeżycia tunikamycyny można przeprowadzić bez przemieszczania zwierząt, ponieważ tunikamycyna powoduje śmierć/zatrzymanie zwierząt L1. Jednak podczas wykonywania kontroli DMSO, potomstwo rozwinie się na płytkach DMSO, więc zwierzęta muszą być przemieszczane codziennie lub wymagana będzie technika sterylizacji (identyczne metody stosowane w sekcji 2 dla długości życia mogą być stosowane do testów przeżycia).
   5. Testy przeżycia są oceniane podobnie jak długość życia. Usuń wszystkie martwe lub ocenzurowane zwierzęta z talerza, aby uniknąć pomyłek i przeliczania tego samego zwierzęcia.
      UWAGA: Chociaż możliwe jest ocenianie zwierząt co drugi dzień, ponieważ śmierć następuje szybko w przypadku tunikamycyny, zaleca się codzienne ocenianie testów przeżycia.
2. Pomiary wrażliwości na stres mitochondrialny/oksydacyjny za pomocą parakwatu
   1. Przygotować płytki agarowe NGM poprzez płytki wysiewające zawierające parakwat (patrz krok 1.1.7; UWAGA) ze 100 μL wybranych bakterii.
      UWAGA: Podczas pracy z parakwitem należy nosić rękawice, ponieważ stanowi to zagrożenie dla środowiska. Skontaktuj się z instytucją ds. zdrowia i bezpieczeństwa środowiskowego, aby uzyskać informacje na temat wymagań dotyczących wyrzucania, ponieważ wiele instytucji badawczych będzie wymagać szczegółowych instrukcji dotyczących odrzutów w przypadku zagrożeń dla środowiska.
   2. Aby zapewnić spójność, upewnij się, że te same bakterie są używane we wszystkich kontrpróbach. Wysiewaj 8-12 płytek na szczep do testów przetrwania i od dwóch do czterech płytek bez parakwatu na szczep, aby wyhodować zwierzęta do dorosłości. Pozostaw talerze do wyschnięcia na noc.
   3. Zbierz zsynchronizowaną populację C. elegans za pomocą standardowego testu bielenia, jak opisano w krokach 1.3 i 1.4.
      UWAGA: Pamiętaj, aby hodować zwierzęta na talerzach bez parakwatu do 1 dnia dorosłości; Konieczne jest jednak wykonanie techniki sterylizacji lub odsunięcie dorosłych osobników od potomstwa, ponieważ niektóre zwierzęta mogą rozwinąć się do dorosłości na płytkach parakwatu (patrz kroki 2.2-2.3).
   4. Przenieś 10-15 dorosłych zwierząt dnia 1 na 8-12 talerzy każde. W przypadku standardowego testu przeżycia należy zacząć od ~120 zwierząt, aby upewnić się, że wielkość próby nie spadnie zbyt daleko poniżej 100 po wydarzeniach cenzury (np. osiem tabliczek po 15 zwierząt = 120 zwierząt; 12 płytek po 10 zwierząt = 120 zwierząt).
   5. Testy przeżycia są oceniane podobnie jak długość życia. Usuń wszystkie martwe lub ocenzurowane zwierzęta z talerza, aby uniknąć pomyłek i przeliczania tego samego zwierzęcia.
      UWAGA: Chociaż możliwe jest ocenianie zwierząt co drugi dzień, ponieważ śmierć następuje szybko na parakwacie, zaleca się codzienne ocenianie testów przeżycia. Jest to szczególnie ważne w przypadku stosowania zwierząt z gatunku glp-4(bn2) hodowanych w temperaturze 25 °C, ponieważ śmierć następuje bardzo szybko.
3. Pomiary wrażliwości na stres cieplny (termotolerancja) przy użyciu podwyższonych temperatur
   1. Zbierz zsynchronizowaną populację C. elegans za pomocą standardowego testu bielenia, jak opisano w krokach 1.3 i 1.4.
   2. Przed przeniesieniem zwierząt na płytki należy wstępnie ogrzać płytki agarowe NGM do temperatury 37 °C, umieszczając je w inkubatorze o temperaturze 37 °C na co najmniej 1 godzinę.
   3. Przenieś 10-15 dorosłych zwierząt dnia 1 na cztery do sześciu wstępnie podgrzanych talerzy każdy. Aby uzyskać standardową termotolerancję, zacznij od ~60 zwierząt (np. cztery płytki po 15 zwierząt = 60 zwierząt; sześć płytek po 10 zwierząt = 60 zwierząt)
   4. Umieszczać zwierzęta w inkubatorze o temperaturze 37 °C i co 2 godziny oceniać wynik za śmierć. Śmierć definiuje się jako zwierzęta, które nie wykazują ruchu po delikatnym dotknięciu kilofem. Usuń wszystkie martwe lub ocenzurowane zwierzęta z talerza, aby uniknąć pomyłek i opowiadania o tym samym zwierzęciu.
   5. Upewnij się, że płytki są wyjmowane z inkubatora w temperaturze 37 °C przez możliwie najkrótszy czas, ponieważ płytki pozostawione w temperaturze otoczenia przez długi czas podczas nacinania zmienią wyniki termotolerancji.
      UWAGA: Zaleca się wyciąganie tylko jednego szczepu na raz, aby uzyskać punktację, ponieważ temperatura agaru nie powinna się drastycznie zmieniać w czasie potrzebnym do nacięcia jednego szczepu.
   6. Mediana tolerancji termicznej jest zwykle osiągana w ciągu 7-9 godzin, dlatego należy zapewnić prawidłowy test po 7 godzinach, 9 godzinach i 11 godzinach
      UWAGA: Chociaż można pominąć 1-5 godzin ze względu na zmienność inkubatorów, grubość płytek i inne czynniki zakłócające w każdym laboratorium, ważne jest, aby czas był starannie miareczkowany w każdym laboratorium, jeśli planuje się pominięcie punktów czasowych. Zobacz odniesienie ⁴⁴, aby uzyskać pełny przewodnik na temat termotolerancji.
   7. Alternatywnie, przeprowadzić test termotolerancji w temperaturze 34 °C zamiast 37 °C.
      UWAGA: Mediana tolerancji termicznej w temperaturze 34 °C występuje znacznie później (10-14 godzin w tym badaniu), co pozwala na przygotowanie testów termotolerancji późno w nocy (umieszczenie w inkubatorze o temperaturze 34 °C) i rozpoczęcie punktacji wcześnie następnego dnia. Pozwala to na ~8 godzin ciągłego oceniania zamiast typowego okresu 12 godzin wymaganego do testu termotolerancji 37 °C.

C. elegans są doskonałym organizmem modelowym do badań nad starzeniem się, ponieważ znaczna większość mechanizmów starzenia jest zachowana u ludzi. Co ważne, charakteryzują się bardzo niskimi kosztami utrzymania i eksperymentowania przy minimalnych wymaganiach dotyczących sprzętu i materiałów eksploatacyjnych, co czyni je pożądanym systemem modelowym dla instytucji o ograniczonych funduszach. Co więcej, mnóstwo prostych testów z płytkimi krzywymi uczenia się sprawia, że jest to doskonały system nawet dla najmłodszych badaczy z niewielkim lub zerowym doświadczeniem. Wszystkie te czynniki w połączeniu z potężną genetyką C. elegans, w tym łatwością edycji genomu, tysiącami dostępnych mutantów i transgenicznych zwierząt po nominalnych kosztach oraz dostępnymi bibliotekami RNAi do genetycznego knockdownu praktycznie każdego genu, sprawiają, że jest to idealny system dla instytucji licencjackich. W tym miejscu badane są niektóre z najtańszych metod badania starzenia się C. elegans, koncentrując się przede wszystkim na testach przy minimalnych kosztach sprzętu i materiałów eksploatacyjnych, a także płytkich krzywych uczenia się. W rzeczywistości wszystkie protokoły i gromadzenie danych zostały napisane/wykonane przez młodszych badaczy z <5-miesięcznym doświadczeniem badawczym, głównie studentów studiów licencjackich.

Badania długowieczności u C. elegans są bardzo proste ze względu na krótką długość życia zwierząt, wynoszącą od 14 do 20 dni. Co ważne, testy żywotności są wysoce ustandaryzowane i wymagają jedynie inkubatora, standardowego mikroskopu preparacyjnego, standardowego kilofa ślimakowego i materiałów eksploatacyjnych do przygotowania płytek agarowych NGM. Być może najbardziej kosztownym aspektem pomiarów żywotności C. elegans są wymagane materiały eksploatacyjne. Dzieje się tak, ponieważ C. elegans są hermafrodytami, które samozapładniają się; W związku z tym dorośli osobnicy śledzeni pod kątem testów długowieczności muszą być codziennie odsuwani od potomstwa. Jednak zwierzęta można sterylizować, wystawiając je na działanie FUDR lub używając mutantów, takich jak wrażliwy na temperaturę mutant glp-4(bn2) bez linii zarodkowej hodowany w zaporowej temperaturze 25 °C, aby zmniejszyć ilość wymaganych materiałów eksploatacyjnych30,31,32. W tym przypadku testy długości życia przeprowadzono z FUDR lub z mutantami bez linii zarodkowej glp-4(bn2), które wykazują podobne wyniki do standardowych długości życia wykonywanych na zwierzętach niesterylnych. Podczas gdy długość życia dzikich typów nie jest identyczna ze względu na wpływ FUDR45 lub wzrostu w temperaturze 25 °C na długość życia2, krótkotrwałe zwierzę powalone na hsf-1 niezawodnie wykazuje znaczny spadek długości życia we wszystkich warunkach (Rysunek 1). HSF-1 koduje czynnik transkrypcyjny czynnika szoku cieplnego-1, który bierze udział w regulacji reakcji na stres termiczny, a jego knockdown powoduje znaczne skrócenie żywotności38,46.

Chociaż długowieczność jest ważnym czynnikiem do rozważenia w biologii starzenia, często długowieczność nie koreluje z poprawą zdrowia, nawet u C. elegans47. W związku z tym, jako podejście uzupełniające, oferujemy kilka metod pomiaru zdrowia organizmu, w tym zdrowia reprodukcyjnego, zachowań lokomotorycznych i odporności na stres. Zdrowie reprodukcyjne można mierzyć na jeden z dwóch sposobów. Po pierwsze, pomiary liczby jaj dadzą bezpośredni pomiar liczby jaj składanych przez jednego samozapładniającego się hermafrodytę. Ponieważ jednak zwierzęta produkują więcej oocytów niż plemników, niektóre niezapłodnione jaja, które nigdy nie wydałyby zdolnego do życia potomstwa, są również składane48. Dlatego, aby lepiej zrozumieć prawdziwą zdolność reprodukcyjną zwierzęcia, pomiary wielkości lęgu stanowią miarę tego, ile zdolnych do życia potomstwa jest produkowanych. Często zwiększona odporność na stres może w rzeczywistości zmniejszyć zdolność reprodukcyjną, potencjalnie ze względu na nieodłączny wpływ postrzeganego stresu na reprodukcję49. Podobnie, znaczny spadek zarówno liczby składanych jaj, jak i wielkości lęgu stwierdza się u zwierząt z nadekspresją hsf-1 w porównaniu z kontrolami typu dzikiego (Rysunek 2A,B). W rzeczywistości niektóre zwierzęta z nadekspresją hsf-1 wykazują pełną bezpłodność, co dostarcza dowodów na to, że zdrowie reprodukcyjne może być odwrotnie skorelowane z długowiecznością.

Chociaż zdrowie reprodukcyjne jest ważne dla zrozumienia zdrowia linii zarodkowej, mejozy funkcjonalnej i zdolności reprodukcyjnych, ogólnie rzecz biorąc, nie ma bezpośredniej korelacji między długowiecznością a wielkością lęgu50. Tak więc, jako podejście uzupełniające, zachowanie lokomotoryczne jest oferowane jako złoty standard metody oznaczania długości zdrowia C. elegans podczas starzenia się51. Istnieje wiele metod pomiaru zachowań lokomotorycznych, ale większość metod wymaga zaawansowanych kamer, oprogramowania śledzącego lub drogich chemikaliów. W przeciwieństwie do tego, testy młócenia nie wymagają praktycznie żadnego sprzętu poza tym, w co wyposażone jest standardowe laboratorium C. elegans: mikroskop preparacyjny, wytrych, pipeta i materiały eksploatacyjne do wytwarzania płytek agarowych NGM. Wskaźniki młócenia stanowią wiarygodną metodę pomiaru długości zdrowia podczas starzenia, mierzoną znacznym spadkiem młócenia u starych zwierząt w porównaniu z młodymi zwierzętami (Rysunek 2C).

Na koniec, przeżywalność na testy stresu jest dodatkowym fizjologicznym miernikiem odporności. Zdolność do aktywacji reakcji na stres na ogół spada w procesie starzenia, co sprawia, że zwierzęta są mniej odporne i bardziej wrażliwe na stres. W ten sposób odporność na stres może być wykorzystana jako wiarygodny wskaźnik zdrowia organizmu. W tym miejscu zaproponowano metody badania wrażliwości na 1) stres ER w odpowiedzi na ekspozycję na tunikamycynę, środek chemiczny, który blokuje glikozylację sprzężoną z N i powoduje akumulację nieprawidłowo sfałdowanych białek w ER; 2) stres mitochondrialny/oksydacyjny poprzez ekspozycję na parakwat, czynnik chemiczny, który indukuje powstawanie ponadtlenków w mitochondriach; oraz 3) stres termiczny spowodowany wystawieniem na działanie podwyższonych temperatur. W przypadku testów z tunikamycyną i parakwatem lek jest wprowadzany do płytki agarowej NGM podczas produkcji płytki. W przypadku wysokich stężeń tunikamycyny potomstwo na ogół nie rozwija się, a zatem nie ma potrzeby stosowania technik sterylizacji. Przedstawiony tutaj protokół zaleca 25 ng/μL jako końcowe stężenie tunikamycyny, ale dla osób z ograniczonymi funduszami 10 ng/μL również wykazuje znaczne zmniejszenie przeżycia (Rysunek 3A). Oba stężenia ograniczają rozwój potomstwa, a co za tym idzie, nie są potrzebne żadne metody sterylizacji, chociaż kontrola DMSO będzie wymagała techniki sterylizacji lub przeniesienia zwierząt na nowe płytki. Dzieje się tak, ponieważ toksyczność tunikamycyny zapobiega rozwojowi potomstwa, ale DMSO jest praktycznie nietoksyczny, co pozwala potomstwu w pełni się rozwijać, gdy jest hodowane na tunicycynie.

Do testów parakwatu wymagana jest technika sterylizacji lub ruch zwierząt, ponieważ leczenie parakwatem nie zapobiega rozwojowi potomstwa do dorosłości. Wysoki poziom parakwatu (4 mM) znacznie skraca żywotność, podczas gdy niski poziom parakwatu (0,25 mM) wydłuża życie dzięki efektowi hormetycznemu (Rysunek 3B), zgodnie z wcześniej opublikowanymi wynikami52. Wreszcie, testy termotolerancyjne wymagają jedynie inkubatora, który może osiągnąć temperaturę 30-37 °C i nie są wymagane żadne dodatkowe odczynniki. Nadekspresja hsf-1 zwiększa tolerancję termiczną w temperaturze 37 °C (Rysunek 3C), jak wcześniej opublikowano53. Jednak, jak wykazali inni wcześniej i na podstawie obecnych danych, głównym problemem związanym z testami termotolerancji jest ich zmienność. Wiele czynników może przyczyniać się do zmienności w testach termotolerancji, w tym różnice między inkubatorami i czas spędzany przez zwierzęta poza inkubatorem podczas oceniania termotolerancji co godzinę. Dokładne wytyczne dotyczące tolerancji termicznej można znaleźć w odnośniku 41.

Rysunek 1: Porównanie pomiarów długości życia ze sterylizacją i bez sterylizacji. (A) Długość życia dzikich nicieni N2 hodowanych na płytkach agarowych NGM obsianych pustym wektorem (ev) lub bakteriami RNAi hsf-1 w temperaturze 20 °C. Zwierzęta były przenoszone od potomstwa w 1, 3, 5 i 7 dniu dorosłego życia. (B) Długość życia nicieni N2 typu dzikiego hodowanych na płytkach NGM-agar-FUDR obsianych pustym wektorem (ev) lub bakteriami RNAi hsf-1 w temperaturze 20 °C. Zwierzęta hodowano do dorosłości na standardowych płytkach RNAi ev lub hsf-1, a następnie przenoszono na płytki FUDR w pierwszym dniu dorosłości. (C) Długość życia zmutowanych zwierząt GLP-4(bn2) hodowanych na płytkach agarowych NGM obsianych pustym wektorem (ev) lub RNAi hsf-1 w temperaturze 25 °C. We wszystkich warunkach zwierzęta były oceniane pod kątem śmierci co 2 dni, dopóki wszystkie zwierzęta nie zostały zarejestrowane jako martwe lub ocenzurowane. Zwierzęta z workami, wystającymi lub eksplozyjnymi sromami, lub te, które wpełzły na boki talerzy i wysuszyły, były cenzurowane. Wszystkie statystyki zostały przeprowadzone przy użyciu testów Log-Rank Mantel-Cox i można je znaleźć w Tabeli 2. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Liczba jaj, wielkość lęgu i młócenie jako miary długości zdrowia. (A) Testy młócenia przeprowadzono na zmutowanych zwierzętach glp-4(bn2) hodowanych na płytkach agarowych NGM wysianych pustym wektorem w temperaturze 25 °C w dniu 1 (niebieski), dniu 4 (czerwony) i dniu 9 (zielony) zwierzętach. Młócenie oceniano u zwierząt umieszczonych w roztworze M9 na płytce z agarem NGM, wideo nagrywano za pomocą standardowej kamery smartfona zamontowanej na okularze standardowej lunety sekcyjnej, a młócenie oceniano w zwolnionym tempie dla dokładności. n = 15 zwierząt na warunek. (B) Liczbę jaj zmierzono u zwierząt typu dzikiego N2 (niebieski) i sur-5p::hsf-1 (czerwony). Zwierzęta hodowano w temperaturze 20 °C i przenoszono na świeże talerze, a jaja liczono co 12 godzin. Zsumowano całkowitą liczbę złożonych jaj. N = 7 zwierząt dla typu dzikiego i 9 zwierząt dla SUR-5P::HSF-1. (C) Testy czerwiu zostały zmierzone na tych samych zwierzętach, co (B), gdzie jaja były hodowane w temperaturze 20 °C przez 2 dni, aby umożliwić wylęg, a następnie policzono wszystkie wyklute jaja. = p < 0,001 obliczone za pomocą nieparametrycznego testu Manna-Whitneya. Każda kropka reprezentuje pojedyncze zwierzę, a linie reprezentują medianę i przedział międzykwartylowy. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Odporność na stres jako wskaźnik zdrowia organizmu. (A) Test przeżywalności zwierząt N2 hodowanych na pustych bakteriach wektorowych RNAi w temperaturze 20 °C. Zwierzęta przeniesiono na płytki zawierające 1% DMSO, 10 ng/μL tunikamycyny (TM) lub 25 ng/μL TM w pierwszym dniu dorosłości. (B) Test przeżywalności zwierząt N2 hodowanych na pustych bakteriach wektorowych RNAi w temperaturze 20 °C. Zwierzęta hodowano z włazu na płytkach zawierających wodę, 0,25 mM parakwatu (PQ) lub 4 mM PQ. W przypadku A-B zwierzęta były oceniane pod kątem śmierci co 2 dni, dopóki wszystkie zwierzęta nie zostały zarejestrowane jako martwe lub ocenzurowane. Zwierzęta z workami, wystającymi lub eksplozyjnymi sromami, lub te, które wpełzły na boki talerzy i wysuszyły, były cenzurowane. Wszystkie statystyki zostały przeprowadzone za pomocą testów Log-Rank Mantel-Cox (Tabela 2). (C) Zbiorcze dane ze wszystkich testów termotolerancji 37 °C dla zwierząt N2 typu dzikiego w porównaniu z nadekspresją hsf-1 (sur-5p::hsf-1). Dane są reprezentowane jako procent życia w czasie = 9 godzin testu termotolerancji, przy czym każda linia reprezentuje dopasowany eksperyment przeprowadzony tego samego dnia. Zwierzęta hodowano na pustych bakteriach wektorowych RNAi w temperaturze 20 °C i przeniesiono do 37 °C w 1. dniu dorosłości w celu przeprowadzenia testu. n = 60 zwierząt na szczep na kontrpróbę. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Tabela 1. Receptury na odczynniki i podłoża do protokołów.

Tabela 2. Statystyki dotyczące długości życia i odporności na stres.

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.