Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Suplementacja lipidów w celu długowieczności i analizy transkrypcji genów w Caenorhabditis elegans

2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/64092

⸱

9 grudnia 2022

 ,  ,  , 
1Graduate Program in Developmental Biology, Baylor College of Medicine, 2Huffington Center on Aging, Baylor College of Medicine, 3Integrative Program of Molecular and Biochemical Sciences, Baylor College of Medicine, 4Department of Molecular and Human Genetics, Baylor College of Medicine, 5Howard Hughes Medical Institute, Baylor College of Medicine

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Obecny protokół opisuje metody suplementacji lipidów w kulturach płynnych i na płytkach dla Caenorhabditis elegans, w połączeniu z badaniami podłużnymi i analizą transkrypcji genów z dużej ilości lub kilku robaków i tkanek robaków.

Streszczenie

Starzenie się to złożony proces charakteryzujący się postępującymi zmianami fizjologicznymi wynikającymi zarówno z wpływu środowiska, jak i genetyki. Lipidy odgrywają kluczową rolę w tworzeniu składników strukturalnych błon komórkowych, magazynowaniu energii i jako cząsteczki sygnałowe. Regulacja metabolizmu lipidów i sygnalizacji jest niezbędna do aktywacji odrębnych szlaków długowieczności. Glista Caenorhabditis elegans jest doskonałym i potężnym organizmem do analizy udziału metabolizmu lipidów i sygnalizacji w regulacji długowieczności. Wiele badań naukowych opisało, w jaki sposób suplementacja diety określonymi cząsteczkami lipidów może przedłużyć życie C. elegans; Jednak niewielkie różnice w warunkach suplementacji mogą powodować problemy z odtwarzalnością wśród naukowców w różnych laboratoriach. W tym miejscu opisano dwie szczegółowe metody suplementacji C. elegans wykorzystujące suplementację lipidów za pomocą bakterii wysianych na płytkach lub zawiesiny bakteryjnej w płynnej kulturze. W niniejszym dokumencie podano również szczegóły dotyczące wykonywania testów długości życia z dożywotnią suplementacją lipidów i analizą qRT-PCR przy użyciu całego lizatu robaka lub wypreparowanych tkanek pochodzących od kilku robaków. Wykorzystując połączenie badań podłużnych i badań transkrypcyjnych dotyczących suplementacji lipidów, testy żywieniowe zapewniają wiarygodne podejścia do analizy, w jaki sposób lipidy wpływają na długowieczność i zdrowe starzenie się. Metodologia ta może być również zaadaptowana do różnych podejść do badań przesiewowych odżywiania w celu oceny zmian w podzbiorze transkryptów przy użyciu niewielkiej liczby wypreparowanych tkanek lub kilku zwierząt.

Wprowadzenie

Lipidy
Lipidy to małe hydrofobowe lub amfipatyczne cząsteczki rozpuszczalne w rozpuszczalnikach organicznych, ale nierozpuszczalne w wodzie1,2. Odrębne cząsteczki lipidów różnią się od siebie na podstawie liczby atomów węgla zawartych w ich łańcuchach, lokalizacji, liczby wiązań podwójnych i związanych struktur, w tym glicerolu lub fosforanów. Lipidy odgrywają kluczową rolę w różnych komórkach i między nimi, regulując funkcje organizmu, w tym tworząc dwuwarstwy błony, zapewniając magazynowanie energii i działając jako cząsteczki sygnałowe3,4.

Po pierwsze, lipidy są strukturalnymi składnikami błon biologicznych, w tym błony plazmatycznej i wewnątrzkomórkowych błon subkomórkowych, które dzielą wewnętrzne kompartmenty od środowiska zewnątrzkomórkowego. Po drugie, lipidy są główną formą magazynowania energii u kręgowców i bezkręgowców. Obojętne lipidy, w tym triacyloglicerole, są magazynowane przez dłuższy czas w różnych tkankach, w tym w tkance tłuszczowej. U nicienia Caenorhabditis elegans jelito jest głównym narządem magazynującym tłuszcz metaboliczny; Jego funkcja bierze udział nie tylko w trawieniu i wchłanianiu składników odżywczych, ale także w procesie detoksykacji, który przypomina aktywność hepatocytów ssaków. Inne tkanki magazynujące tłuszcz obejmują linię zarodkową, w której lipidy są niezbędne do rozwoju oocytów, oraz tkankę podskórną, która składa się z komórek naskórka podobnych do skóry3,5. Po trzecie, w ostatnich latach pojawiło się więcej dowodów sugerujących, że lipidy są silnymi cząsteczkami sygnałowymi zaangażowanymi w sygnalizację wewnątrz- i zewnątrzkomórkową poprzez bezpośrednie działanie na różne receptory, w tym receptory sprzężone z białkiem G i jądrowe, lub pośrednio poprzez modulację płynności błony lub modyfikacje potranslacyjne6,7,8,9. Dalsze badania będą kontynuowane, aby wyjaśnić podstawowe mechanizmy molekularne sygnalizacji lipidowej w promowaniu długowieczności i długości zdrowia.

Organizmy modelowe są ważne dla rozwiązywania konkretnych zagadnień biologicznych, które są zbyt złożone, aby badać je u ludzi. Na przykład glista C. elegans jest doskonałym modelem do przeprowadzania analiz genetycznych w celu zbadania procesów biologicznych istotnych dla żywienia człowieka i choroby10. Wysoce konserwatywne szlaki molekularne istotne dla fizjologii człowieka, złożone tkanki, wzorce behawioralne i liczne narzędzia manipulacji genetycznej sprawiają, że C. elegans jest niezwykłym organizmem modelowym11. Na przykład C. elegans doskonale radzi sobie z przekazywaniem genetycznych badań przesiewowych w celu identyfikacji genów specyficznych dla fenotypu, a także w odwracalnych genetycznych badaniach przesiewowych całego genomu poprzez interferencję RNA12.

W laboratoriach nicienie są hodowane na agarowych płytkach Petriego obsianych trawnikiem bakterii Escherichia coli, dostarczając makroelementów, takich jak białka, węglowodany oraz nasycone i nienasycone kwasy tłuszczowe jako źródła energii i budulców, oraz mikroelementy, takie jak kofaktory i witaminy13. Podobnie jak ssaki, nicienie syntetyzują cząsteczki kwasów tłuszczowych zarówno z kwasu palmitynowego, jak i kwasu stearynowego (nasycone cząsteczki odpowiednio 16-węglowe i 18-węglowe), które są kolejno desaturowane i wydłużane do różnych jednonienasyconych kwasów tłuszczowych (MUFA) i wielonienasyconych kwasów tłuszczowych (PUFA)14,15,16,17,18. Co ciekawe, C. elegans jest zdolny do syntezy de novo wszystkich wymaganych kwasów tłuszczowych i enzymów rdzeniowych biorących udział w biosyntezie, desaturacji i wydłużaniu kwasów tłuszczowych, ułatwiając syntezę długołańcuchowych PUFAs19. W odróżnieniu od innych gatunków zwierząt, C. elegans może przekształcać 18-węglowe i 20-węglowe ω-6 kwasy tłuszczowe w ω-3 kwasy tłuszczowe z własnymi enzymami desaturazy ω-3. Dodatkowo robaki posiadają desaturazę Δ12, która katalizuje tworzenie kwasu linolowego (LA) z kwasu oleinowego (OA, 18:1)20,21. Większość zwierząt lub roślin nie ma zarówno desaturazy Δ12, jak i ω-3, a zatem polega na spożyciu ω-6 i ω-3 w celu uzyskania PUFA, podczas gdy C. elegans nie wymaga dietetycznych kwasów tłuszczowych22. Wyizolowane mutanty pozbawione funkcjonalnych enzymów desaturazy wykorzystano do badania funkcji określonych kwasów tłuszczowych w różnych procesach biologicznych, w tym reprodukcji, wzrostu, długowieczności i neuroprzekaźnictwa. Wpływ poszczególnych kwasów tłuszczowych na określone szlaki biologiczne można określić zarówno za pomocą podejścia genetycznego, jak i suplementacji diety16,17,23. Do tej pory badania nad lipidami koncentrowały się na charakterystyce genów zaangażowanych w syntezę, degradację, magazynowanie i rozkład lipidów w stanach neurologicznych i rozwojowych24. Jednak rola lipidów w regulacji długowieczności dopiero zaczyna być odkrywana.

Sygnalizacja lipidowa w regulacji długowieczności
Lipidy odgrywają kluczową rolę w regulacji długowieczności poprzez aktywację kaskad sygnalizacji komórkowej w różnych tkankach i typach komórek. Ostatnie badania podkreśliły aktywną rolę lipidów w modulowaniu transkrypcji i komunikacji komórka-komórka poprzez białka wiążące lipidy lub rozpoznawanie receptorów błonowych25. Ponadto suplementacja lipidów w diecie stanowi doskonałe narzędzie do analizy, w jaki sposób metabolizm lipidów wpływa na długość życia C. elegans. Wykazano, że różne MUFA i PUFA promują długowieczność poprzez aktywację czynników transkrypcyjnych26,27.

Modele długowieczności, w tym sygnalizacja insuliny/IGF-1 i ablacja komórek prekursorowych linii zarodkowej, są związane ze szlakiem biosyntezy MUFA, a suplementacja MUFA, w tym kwasu oleinowego, kwasu palmitynowego i cis-vaccenic, jest wystarczająca do przedłużenia życia C. elegans26. Chociaż efekt długowieczności wynikający z podawania MUFA wymaga dalszych badań, leżący u jego podstaw mechanizm prawdopodobnie jest pośredniczony przez czynnik transkrypcyjny SKN-1/Nrf2, który jest kluczowym aktywatorem odpowiedzi na stres oksydacyjny i regulacji długowieczności28,29. Wśród MUFA szczególna klasa tłuszczowych etanoloamidów acyloa, zwana N-acyloetanoloaminami (NAE), odgrywa kluczową rolę w różnych mechanizmach, takich jak zapalenie, alergie, uczenie się, pamięć i metabolizm energetyczny30. W szczególności cząsteczka lipidu znana jako oleoiloetanoloamid (OEA) została zidentyfikowana jako pozytywny regulator długowieczności poprzez promowanie translokacji białka wiążącego lipidy 8 (LBP-8) do jądra w celu aktywacji receptorów hormonów jądrowych NHR-49 i NHR-807. Suplementacja analogu OEA KDS-5104 jest wystarczająca do przedłużenia życia i indukuje ekspresję genów zaangażowanych w reakcje na stres oksydacyjny i mitochondrialne β-oksydacyjne7,8.

Jednocześnie, rola PUFA została również powiązana z regulacją długowieczności. Podawanie kwasu tłuszczowego PUFA ω-3 kwasu tłuszczowego α-linolenowego (ALA) sprzyja długowieczności poprzez aktywację czynników transkrypcyjnych NHR-49/PPARα, SKN-1/NRF i indukowanie utleniania β mitochondrialnego31. Co ciekawe, peroksydowane produkty ALA, określane jako oksylipiny, aktywują SKN-1/NRF, co sugeruje, że zarówno PUFA, jak i ich pochodne utleniające mogą przynosić korzyści w zakresie długowieczności23. Suplementacja kwasu tłuszczowego ω-6, kwasu arachidonowego (AA) i kwasu dihomo-γ-linolenowego (DGLA) przedłuża żywotność poprzez aktywację autofagii, promując kontrolę jakości białka i powodując degradację marnotrawnych i toksycznych agregatów białkowych27,32. Niedawno wykazano, że nieautonomiczna regulacja sygnalizacji w komórce, w której pośredniczy białko wiążące lipidy 3 (LBP-3) i DGLA, ma kluczowe znaczenie dla promowania długowieczności poprzez wysyłanie sygnałów obwodowych do neuronów, co sugeruje długoterminową rolę cząsteczek lipidów w komunikacji międzytkankowej na poziomie ogólnoustrojowym33. Niniejsze badanie przedstawia każdy etap przeprowadzania suplementacji lipidów bakteriami wysianymi na płytkach lub zawiesiną bakteryjną w płynnej kulturze. Metodologie te są wykorzystywane do oceny długości życia i analizy transkrypcyjnej, wykorzystując zawartość całego ciała lub wypreparowane tkanki pochodzące od kilku robaków. Poniższe techniki można dostosować do różnych badań żywieniowych i stanowią ważne narzędzie do analizy, w jaki sposób metabolizm lipidów wpływa na długowieczność i zdrowe starzenie się.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Rysunek 1 przedstawia schemat podawania lipidów przy użyciu różnych ustawień eksperymentalnych.

1. Przygotowanie bakterii kondycjonowanych lipidowo

  1. Przygotować roztwór bazowy BDR (Bacterial Lushed Dietary Restriction), rozpuszczając 5,85 g NaCl, 1,0 gK2HPO4 i 6,0 g KH2PO4 (patrz tabela materiałów) w 999 ml wody dejonizowanej. Dostosuj pH do 6,0 za pomocą 0,5 M KOH, a następnie przefiltruj przez filtr 0,22 μm.
    UWAGA: Roztwór BDR może być przechowywany w temperaturze pokojowej w celu długotrwałego przechowywania.
  2. Przygotować pożywkę BDR, dodając 10 μl 5 mg/ml cholesterolu (rozpuszczonego w 200-procentowym etanolu) do każdych 10 ml roztworu zasadowego BDR.
  3. Bakterie OP50 należy przetransportować z materiału o temperaturze -80 °C na płytki agarowe LB i inkubować w temperaturze 37 °C przez noc.
    UWAGA: Po całonocnej inkubacji w temperaturze 37 °C, płytka OP50 może być przechowywana w temperaturze 4 °C przez okres do 1 tygodnia, aby uzyskać stabilne wyniki karmienia.
  4. Zaszczepić bakterie OP50 z płytki agarowej OP50 LB na pożywce LB i inkubować w wytrząsarce o temperaturze 37 °C przez noc (16 godzin).
    UWAGA: Wymagana objętość medium LB zależy od ustawień eksperymentalnych. Zaleca się użycie 200 μl 5 skoncentrowanych bakterii wysianych na każdą z 6 cm płytek i 1 ml 5 x skoncentrowanych bakterii na każdą z 10 cm płytek i każdą powtórzoną wersję warunków karmienia płynem. W związku z tym należy przygotować odpowiednio 1 ml i 5 ml początkowej inokulacji LB dla każdej kultury żywiącej się lipidami.
  5. Zebrać bakterie przez odwirowanie przy 4 000 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Odrzucić supernatant.
  6. Zawiesić osad bakteryjny w 20 ml zasady BDR i odwirować przy 4 000 x g przez 10 minut. Wyrzucić supernatant.
    UWAGA: Ten krok ma kluczowe znaczenie dla zmycia resztek LB w granulkach bakteryjnych.
  7. Zawieś każdą osadkę bakteryjną w pożywce BDR, aby uzyskać 20-krotny zapas bakterii BDR. Przed użyciem rozcieńczyć 20x bulion bakteryjny BDR pożywką BDR do 5x.
    UWAGA: Użyj 1/20 objętości pożywki BDR o oryginalnej objętości LB, aby osiągnąć 20-krotne stężenie dla bakterii. 20x wywar bakteryjny można przechowywać w temperaturze 4 °C do 1 tygodnia.
  8. Przygotować podstawowy roztwór lipidów, używając etanolu lub dimetylosulfotlenku (DMSO) jako rozpuszczalnika w nowej szklanej fiolce z autoklawem i napełnić szklaną fiolkę argonem lub azotem, aby zapobiec utlenianiu.
    UWAGA: Stężenie roztworu podstawowego wynosi zwykle od 250 mM do 1 mM.
  9. Przenieś podstawowy roztwór lipidów do żądanej ilości roztworu bakteryjnego BDR, aby osiągnąć pożądane stężenie końcowe w warunkach karmienia. Dokładnie wymieszać przez wirowanie przez 20 s.
    UWAGA: Końcowe stężenie lipidów w karmieniu wynosi zwykle od 1 μM do 1 mM, w zależności od lipidów i warunków testowania. Zaleca się najpierw przeprowadzenie eksperymentu pilotażowego w celu przetestowania różnych stężeń w zakresie od 0,1 μM do 1 mM w przypadku pracy z nowymi lipidami. Wymieszać podstawowy roztwór lipidów z bakteriami BDR bezpośrednio przed wysiewem go na płytkę lub umieszczeniem w płynnych kulturach robaków. Przygotuj bakterie kondycjonowane lipidami nie później niż 1 godzinę przed karmieniem robaków.
  10. Zmieszać te same objętości przefiltrowanego etanolu lub DMSO (w zależności od tego, który jest używany do grupy żywienia lipidami) z bakteriami BDR, aby służyły jako kontrola nośnika.

2. Przygotowanie zsynchronizowanych C. elegans do suplementacji lipidów

  1. Przygotować bufor M9 przez zmieszanie (przy użyciu określonych stężeń końcowych) 22 mM KH2PO4, 22 mM Na2HPO4, 85 mM NaCl i 2 mMMgSO4 (patrz tabela materiałów). Bufor należy sterylizować w autoklawie.
  2. Przygotować świeży roztwór wybielacza z 60% wybielaczem domowym (v/v, patrz tabela materiałów) i końcowym stężeniem 1,6 M NaOH.
  3. Zebrać gravidy dorosłe osobniki do stożkowej probówki o pojemności 15 ml, używając 10 ml buforu M9.
    UWAGA: Liczba robaków i płytek potrzebnych do synchronizacji zależy od ustawień eksperymentalnych (tj. liczby warunków i powtórzeń oraz metod karmienia). Idealnie byłoby, gdyby każda pełna 6-centymetrowa płytka dorosłych robaków była w stanie dać co najmniej 600 robaków L1 po synchronizacji.
  4. Odwirowywać robaki w temperaturze 1,450 x g przez 30 s. Usunąć supernatant i ponownie przepłukać robaki 10 ml buforu M9.
  5. Odwirowywać robaki w temperaturze 1,450 x g przez 30 s. Odessać supernatant, pozostawiając 4 ml porcji w stożkowej probówce. Dodaj 2 ml roztworu wybielacza i energicznie wstrząsaj przez 1 minutę.
  6. Wiruj robaki w temperaturze 1,450 x g przez 30 s w temperaturze pokojowej.
  7. Usunąć supernatant i dodać 4 ml buforu M9 i 2 ml roztworu wybielacza. Potrząsaj rurką, aż ciałka robaka się rozpuszczą.
  8. Odwiruj jajka w temperaturze 1 450 x g przez 30 s w temperaturze pokojowej.
  9. Usunąć supernatant i umyć jaja 10 ml buforu M9.
  10. Powtórz kroki 2.8 i 2.9 3x.
  11. Zawiesić zarodki za pomocą 6 ml buforu M9. Kołysz zarodki na rotatorze w temperaturze 20 °C przez 2 dni, aby mogły się wykluć i zsynchronizować.
  12. Przenieś larwy L1 na talerze z nasionami OP50. Inkubować w temperaturze 20 °C przez 48 godzin w celu zebrania zsynchronizowanych robaków L4, 72 godziny dla dorosłych w dniu 1 i 96 godzin dla dorosłych w dniu 2.
    UWAGA: Płytki OP50 przygotowuje się przez dodanie 1 ml 20 bakterii OP50 do każdej 10 cm płytki z pożywką do wzrostu nicieni (NGM)34. 30 000 robaków L1 można wysiać na każdą z płytek OP50, jeśli chcesz zebrać robaki na etapie L4, a 20 000 robaków L1 można wysiać na każdą z płytek OP50, jeśli chcesz zebrać dorosłe osobniki w dniu 1 w obecnych warunkach eksperymentalnych. Może to być różne dla różnych ustawień laboratoryjnych, dlatego zaleca się przetestowanie liczby robaków, które można wysiać, aby upewnić się, że robaki mają wystarczającą ilość pożywienia przed zebraniem.
  13. Zbierz L4, dorosłe robaki z dnia 1 lub dorosłego dnia 2 w stożkowej probówce o pojemności 15 ml, używając 10 ml buforu M9. Użyj kolejnych 5 ml buforu M9, aby spłukać resztki robaków z płytek.
  14. Obracać robaki w temperaturze 1 450 x g przez 30 s i wyrzucić supernatant. Przemyć osad robaka 10 ml pożywki BDR, odwirować przy 1,450 x g przez 30 s i odrzucić supernatant.
  15. W przypadku robaków w metodzie karmienia płynnego przenieś pożywkę BDR do robaków, aby osiągnąć stężenie robaków 3,000 robaków/ml. W przypadku robaków w metodach podawania na płytce należy zmniejszyć objętość pożywki BDR dodawanej do robaków, aby skrócić czas schnięcia na płytce.

3. Suplementacja lipidów dla C. elegans

  1. Wykonaj suplementację lipidów w płynnej kulturze, postępując zgodnie z poniższymi krokami.
    UWAGA: Ta metoda jest odpowiednia do testowania zmian transkrypcji przy użyciu robaków masowych uzupełnionych lipidami.
    1. Przenieś żądaną ilość lipidów lub kontroli nośnika do każdej z studzienek na 12-dołkowej płytce. Przygotuj trzy do czterech studzienek dla każdego warunku karmienia jako replikację biologiczną.
    2. Wymieszaj zawiesinę robaków z kroku 2.15 z 5 bakteriami BDR w stosunku 1:1, aby uzyskać końcowe stężenie 1 500 robaków/ml i 2,5 razy dla bakterii.
    3. Przenieść 2 ml mieszaniny robaków i bakterii w pożywce BDR do każdego dołka płytki 12-dołkowej.
    4. Owinąć 12-dołkową płytkę folią i wstrząsnąć w inkubatorze o temperaturze 20 °C z prędkością 100 obr./min, aby uzyskać żądaną długość inkubacji.
      UWAGA: Aby przetestować różne warunki karmienia, inkubuj lipidy z robakami przez różny czas, na przykład przez 6 godzin, 12 godzin i 24 godziny. Ponadto w celu uzyskania optymalnych wyników można testować różne stadia robaków, w tym karmienie lipidami od stadium L4 lub dorosłego dnia 1.
  2. Wykonaj suplementację lipidów na 10 cm płytkach agarowych NGM, postępując zgodnie z poniższymi krokami.
    UWAGA: Ta metoda jest odpowiednia do testowania zmian transkrypcji przy użyciu robaków masowych uzupełnionych lipidami.
    1. Wysiew 1 ml bakterii kondycjonowanych lipidami z kroku 1.9 na środek każdej z 10-centymetrowych płytek. Po przygotowaniu dużej liczby talerzy, należy kilkakrotnie wymieszać końcowy roztwór roboczy między siewami. Wysuszyć płytki w ciemności za pomocą kaptura bezpieczeństwa biologicznego.
    2. Przenieś 3 000 robaków z kroku 2.15 na każdą z 10-centymetrowych płytek. Wysuszyć płytki w kapturze bezpieczeństwa biologicznego, aż robaki będą mogły pełzać po płytkach uzupełnionych lipidami zamiast pływać.
    3. Inkubować robaki na płytkach kondycjonowanych lipidami w inkubatorze o temperaturze 20 °C przez żądany okres czasu. Chronić przed światłem w przypadku stosowania lipidów wielonienasyconych.
      UWAGA: Aby przetestować różne warunki karmienia, inkubuj lipidy z robakami przez różny czas, np. 6 godzin, 12 godzin i 24 godziny. Ponadto w celu uzyskania optymalnych wyników można testować różne stadia robaków, w tym karmienie lipidami w stadium L4 lub dorosłym w 1. dniu.
  3. Przeprowadzić suplementację lipidów na 6 cm płytkach agarowych NGM w celu analizy transkrypcyjnej.
    UWAGA: Ta metoda jest odpowiednia do testowania zmian transkrypcyjnych u kilku robaków uzupełnionych lipidami.
    1. Wysiewaj 300 μl bakterii kondycjonowanych lipidami z kroku 1.9 na środek każdej z 6 cm płytki. Po przygotowaniu dużej liczby talerzy, należy kilkakrotnie wymieszać końcowy roztwór roboczy między siewami. Wysuszyć płytki w ciemności za pomocą kaptura bezpieczeństwa biologicznego.
    2. Przenieś do 300 robaków z kroku 2.15 na każdą z 6-centymetrowych płytek. Wysuszyć płytki w kapturze bezpieczeństwa biologicznego, aż robaki będą mogły pełzać po płytkach uzupełnionych lipidami zamiast pływać.
    3. Inkubować robaki na płytkach kondycjonowanych lipidami w inkubatorze o temperaturze 20 °C przez żądany okres czasu. Chronić przed światłem w przypadku stosowania lipidów wielonienasyconych.
      UWAGA: Aby przetestować różne warunki karmienia, inkubuj lipidy z robakami w różnych punktach czasowych, takich jak 6 godzin, 12 godzin i 24 godziny. Ponadto w celu uzyskania optymalnych wyników można testować różne stadia robaków, w tym karmienie lipidami w stadium L4 lub dorosłym w 1. dniu.
  4. Przeprowadzić suplementację lipidów na 6 cm płytkach agarowych NGM w celu przeprowadzenia testu podłużnej żywotności.
    1. Wysiewaj 200 μl bakterii kondycjonowanych lipidami (z 1x stężeniem lipidów i 5x skoncentrowanymi bakteriami) na środku każdej z 6 cm płytek NGM. Przygotuj trzy płytki na każde warunki karmienia.
      UWAGA: Talerze muszą być przygotowane świeżo w dniu użycia (najlepiej tuż przed użyciem).
    2. Wysuszyć płytki w kapturze bezpieczeństwa biologicznego. Wyłącz światła w okapie i pomieszczeniu, jeśli używasz wielonienasyconych lipidów.
    3. Wybierz 30-40 zsynchronizowanych robaków L4 do każdej z płyt. Przechowywać płytki z robakami w inkubatorze o temperaturze 20 °C. W przypadku karmienia lipidami wielonienasyconymi płytki należy przechowywać w lekkoszczelnym pudełku w inkubatorze w temperaturze 20 °C.
      UWAGA: Możliwe jest użycie OP50 z normalnej 6 cm płytki przejściowej (niekondycjonowanej OP50) jako kleju do zbierania robaków, ale ważne jest, aby nie pozostawiać dużej ilości niekondycjonowanego OP50 na płytce testowej.
    4. Przenoś robaki na nowe, świeżo przygotowane płytki kondycjonowane lipidami codziennie lub co drugi dzień, w zależności od pożądanych warunków karmienia. Przeżywalność jest oceniana w taki sam sposób, jak opisano wcześniej4.

4. Ekstrakcja RNA do analizy transkrypcyjnej

  1. Wykonaj ekstrakcję RNA z dużej liczby całych robaków.
    1. Przenieś robaki w płynnej kulturze z kroku 3.1 do 1,5 ml probówek mikrowirówek. Zmyj robaki z 10 cm płytek z kroku 3.2 za pomocą bufora M9 i przenieś robaki z bufora M9 do probówek mikrowirówek o pojemności 1,5 ml.
    2. Krótko odwirować robaki za pomocą mini wirówki stołowej (patrz tabela materiałów) przez 10 s i szybko zassać supernatant.
    3. Przenieś resztki robaków ze studzienek do karmienia płynem lub umyj z karmionych płytek do tej samej probówki i odwiruj. Usunąć supernatant.
    4. Umyj granulki robaków 1 ml lodowatego M9, krótko wiruj przez 10 s za pomocą mini wirówki i odessaj supernatant. Powtórzyć 1x lub 2x w zależności od przezroczystości supernatantu.
    5. Umieść probówki wirówkowe na lodzie na 2 minuty i usuń jak najwięcej supernatantu za pomocą pipety o pojemności 200 μl, pozostawiając zapakowany granulat robaka o objętości nie większej niż 15 μl.
    6. Przenieś 15 μl roztworu do ekstrakcji RNA zawierającego fenol i izotiocyjanian guanidyny (tabela materiałów) do każdej z probówek do mikrowirówek i miel robaki za pomocą młynka silnikowego przez około 30 s, aż nie będą widoczne nienaruszone robaki.
      UWAGA: Roztwór do ekstrakcji RNA jest toksyczny i łatwopalny, a każdy etap obejmujący otwarty pojemnik z tym odczynnikiem musi być obsługiwany w kapturze chemicznym.
    7. Przenieś 285 μl roztworu ekstrakcyjnego RNA do probówki mikrowirówkowej, jednocześnie spłukując zawartość robaków z końcówki młynka silnikowego do probówki mikrowirówkowej. Dokładnie wymieszać.
      UWAGA: To jest punkt pauzy. Próbki można przechowywać w roztworze do ekstrakcji RNA w temperaturze -80 °C przez kilka miesięcy. Po wyjęciu z temperatury -80 °C pozostawić próbki do rozmrożenia w temperaturze pokojowej.
    8. Przenieść 60 μl chloroformu do każdej próbki i energicznie wirować. Pozostaw próbki w temperaturze pokojowej na 10 minut
      UWAGA: Chloroform jest toksyczny i należy się z nim obchodzić w kapturze chemicznym.
    9. Wirować przy 21 000 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C. Ostrożnie przenieść 140 μl warstwy wodnej na wierzchu do nowej i wolnej od RNaz probówki mikrowirówkowej za pomocą pipety 200 μl, przenosząc 2x po 70 μl za każdym razem.
      UWAGA: Począwszy od tego etapu, wszystkie końcówki i pojemniki do pipet, które mają bezpośredni kontakt z próbką, muszą być wolne od RNaz. Sugeruje się również użycie roztworu do dekontaminacji RNazy w celu wytarcia całego sprzętu i przestrzeni roboczej.
    10. Przenieść 140 μl izopropanolu do probówki z próbką. Energicznie wirować i pozostawić próbkę w temperaturze pokojowej na 10 minut. Wirować przy 21 000 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C i ostrożnie usunąć cały sklarowany szwanek.
    11. Przenieś 0,5 ml lodowatego 80% etanolu (v/v) do probówki z próbką z osadem RNA. Energicznie wirować, aż osadek RNA opuści dno rurki i unosi się w roztworze etanolu. Wirować przy 21 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C i usunąć supernatant.
    12. Krótko odwirować probówki z próbkami w mini wirówce przez 15 sekund, aby odwirować rozpuszczalnik przylegający do ścianki probówki, a następnie usunąć jak najwięcej roztworu etanolu za pomocą pipety.
    13. Pozostaw nasadkę probówki otwartą, aby wysuszyć osad RNA. Jeśli granulat został dokładnie umyty roztworem etanolu, etap suszenia powinien zająć mniej niż 10 min.
      UWAGA: To jest punkt pauzy. Wysuszony granulat RNA można przechowywać w temperaturze -80 °C przez okres do 1 miesiąca.
    14. Rozpuść suchy osad RNA w 40 μl wody wolnej od nukleaz i poddaj procesowi za pomocą zestawu do usuwania DNA zgodnie z instrukcjami producenta (patrz tabela materiałów).
      UWAGA: Zaleca się najpierw rozpuszczenie RNA w wodzie wolnej od nukleaz. Jeśli 40 μl wody zostanie zmieszane z 10-krotnym buforem DNazy przed przeniesieniem do probówki RNA, osadek RNA nie rozpuści się całkowicie. Próbki RNA muszą być trzymane na lodzie podczas rozpuszczania osadu RNA w wodzie. Cykle zamrażania i rozmrażania obniżają jakość RNA; dlatego należy przejść do etapu odwrotnej transkrypcji w tym samym dniu leczenia DNazą.
  2. Ekstrakcja RNA z niewielkiej liczby całych robaków.
    1. Zbierz 15-20 robaków z bakteryjnego trawnika na świeżą, nieobsianą płytkę NGM, aby usunąć bakterie z robaka.
    2. Według producenta 2-etapowego zestawu qRT-PCR (patrz tabela materiałów), należy przygotować 20 μl końcowego roztworu do lizy dla każdej próbki, mieszając 0,2 μl DNazy z 19,8 μl roztworu do lizy w probówkach PCR. Wymieszaj roztwór do lizy, pipetując w górę iw dół 5x.
    3. Przenieś 15-20 robaków z płytki NGM bez nasion do probówki PCR zawierającej 20 μl końcowego roztworu do lizy z minimalną liczbą bakterii. Inkubować reakcję lizy przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
    4. Sondy-sonicyjnie (patrz Tabela Materiałów) robaki o amplitudzie 30% przy użyciu następującego programu: sonikacja przez 5 s, przerwa na 5 s i powtórzenie 4x z całkowitym czasem sonikacji wynoszącym 20 s. Podczas sonikacji próbki należy przechowywać w lodowatej kąpieli wodnej.
    5. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 min.
      UWAGA: Dodać więcej DNazy przed inkubacją, jeśli kontrola ujemna bez RT wykazuje zanieczyszczenie DNA na niepokojącym poziomie.
    6. Przenieść 2 μl roztworu zatrzymującego do reakcji lizy i wymieszać, delikatnie wklepując. Inkubować przez 2 minuty w temperaturze pokojowej, a następnie zastygać na lodzie.
      UWAGA: Próbki można pozostawić na lodzie do 2 godzin przed przejściem do etapu odwrotnej transkrypcji.
  3. Wykonaj ekstrakcję RNA z tkanek robaka, wykonując poniższe czynności.
    1. Zbierz około 20 robaków z bakteryjnego trawnika i umieść je na świeżej, nieobsianej talerzu NGM, aby usunąć z nich bakterie.
    2. Przenieś 20 robaków (z jak najmniejszą ilością bakterii) do szkiełka zegarkowego zawierającego 500 μl roztworu M9 zawierającego 4 μM lewamizolu (patrz tabela materiałów). Unieruchomienie nastąpi w ciągu kilku sekund.
    3. Gdy robaki są unieruchomione, należy wyciąć linię zarodkową lub jelito za pomocą igły 25 G, którą można przymocować do strzykawki o pojemności 1 ml.
      1. W zakresie preparacji należy wykonać cięcie w miejscu drugiej opuszki gardłowej, aby umożliwić naturalną ekstruzję jelita i linii zarodkowej. Obie tkanki można łatwo odróżnić na podstawie ich morfologii i różnego kontrastu. Użyj pęsety lub igieł, aby delikatnie oddzielić tkanki, unikając ich uszkodzenia.
        UWAGA: Zaleca się przeprowadzenie sekcji w ciągu 5-10 minut. Jeśli cięcie nie spowoduje dobrego wycięcia tkanki, sugeruje się przejście do następnego robaka i wycięcie jak największej liczby robaków w ciągu 10 minut. Ta procedura wymaga krótkich ram czasowych, aby uniknąć zmian transkrypcji ze środowiska.
    4. Według producenta 2-etapowego zestawu qRT-PCR, przygotuj 20 μl końcowego roztworu do lizy dla każdej próbki, mieszając 0,2 μl DNazy I z 19,8 μl roztworu do lizy w probówkach PCR. Wymieszaj roztwór do lizy, pipetując w górę iw dół 5x.
    5. Użyj szklanej pipety z autoklawizem, aby przenieść wypreparowane tkanki do probówki PCR. Umieść probówki PCR na lodzie na 2 minuty, aby umożliwić osadzenie materiału na dnie. Usunąć supernatant, dodać 20 μl końcowego roztworu do lizy do probówki PCR i wymieszać, stukając.
    6. Inkubować reakcję lizy przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Następnie przenieść 2 μl roztworu zatrzymującego do reakcji lizy i wymieszać, stukając. Inkubować przez 2 minuty w temperaturze pokojowej.
      UWAGA: Próbki można pozostawić na lodzie do 2 godzin przed przejściem do etapu odwrotnej transkrypcji.

5. Odwrotna transkrypcja i qRT-PCR

  1. Wykonaj odwrotną transkrypcję i qRT-PCR z robaków masowych.
    1. Zmierz stężenie RNA i przygotuj 5 μg całkowitego RNA do odwrotnej transkrypcji.
    2. Przygotuj zbiorczą próbkę RNA, mieszając równe ilości RNA z każdej próbki i dostosowując końcowe stężenie RNA do 0,556 g/l (5 μg/9 μl). Użyj zbiorczej próbki RNA do krzywej wzorcowej qRT-PCR i kontroli RT-ujemnych.
    3. Wykonaj odwrotną transkrypcję zgodnie z instrukcjami producenta (patrz tabela materiałów). Przeprowadź następujące reakcje odwrotnej transkrypcji kontroli jakości wraz z poszczególnymi próbkami RNA.
      1. Wykonaj odwrotną transkrypcję z zbiorczą próbką RNA jako matrycą (dla krzywej wzorcowej qRT-PCR).
      2. Wykonaj odwrotną transkrypcję z zbiorczą próbką RNA jako matrycą, bez odwrotnej transkryptazy (kontrola RT-ujemna; kontrola jakości pod kątem potencjalnego zanieczyszczenia DNA genomu).
      3. Przeprowadzić odwrotną transkrypcję z wodą wolną od nukleaz jako matrycą (kontrola RT-ujemna; kontrola jakości pod kątem potencjalnego zanieczyszczenia RNA w odczynnikach).
        UWAGA: To jest punkt pauzy. Próbki można pozostawić w termocyklerze na noc lub przechowywać w temperaturze -20 °C przez kilka miesięcy.
    4. Rozcieńczyć cDNA wygenerowane z połączonych próbek RNA czterokrotnie, 20 razy, 100 razy i 500 razy wodą wolną od nukleaz dla krzywych wzorcowych qRT-PCR.
    5. Rozcieńczyć cDNA wygenerowane z każdej próbki RNA 20-100 razy, aby użyć jako matryc do reakcji qRT-PCR.
      UWAGA: Stosunek rozcieńczenia zależy od obfitości genu będącego przedmiotem zainteresowania. W przypadku genów o wysokiej ekspresji, takich jak geny porządkowe lub egl-3 i egl-21 użyte w tym badaniu, zaleca się 100-krotne rozcieńczenie. W przypadku genów o niskiej ekspresji, takich jak lbp-8, zaleca się 20-krotne rozcieńczenie.
    6. Wykonaj qRT-PCR z odczynnikami qRT-PCR zgodnie z instrukcjami producenta w następujący sposób: 95 °C przez 10 minut, powtórz 40 razy w 95 °C przez 15 s i 60 °C przez 1 minutę, a następnie wykonaj domyślny program krzywej topnienia i przytrzymaj w temperaturze 8 °C przez czas nieokreślony.
  2. Wykonaj odwrotną transkrypcję i qRT-PCR z kilku robaków lub tkanek robaków.
    1. Przenieść 25 μl buforu RT i 2,5 μl mieszanki enzymów 20x RT z 2-etapowego zestawu qPCR (patrz tabela materiałów) do każdej probówki zawierającej lizat ślimakowy z kroku 4.2.6 lub kroku 4.3.6.
      UWAGA: Kontrola RT-ujemna ma kluczowe znaczenie dla qRT-PCR z kilku robaków. Każde doświadczenie musi obejmować próbkę lizatu robaków (od kroku 4.2.6) z buforem RT, ale bez enzymu RT w celu zbadania zanieczyszczenia DNA w próbkach. Jeśli problemem jest zanieczyszczenie DNA, rozważ dodanie większej ilości DNazy do buforu do lizy lub większej ilości DNazy do próbki po lizie robaków. Alternatywnie można przeprowadzić kontrolę RT-ujemną dla każdej próbki, używając połowy lizatu w normalnej reakcji RT, a drugiej połowy w reakcji RT bez odwrotnej transkryptazy.
    2. Wymieszaj, delikatnie stukając. Wirować za pomocą mini wirówki przez 10 sekund.
    3. Załaduj próbki do termocyklera zgodnie z instrukcjami producenta: 37 °C przez 60 minut, 95 °C przez 5 minut i 8 °C przez nieokreślony czas.
      UWAGA: To jest punkt pauzy. Próbki można pozostawić w termocyklerze na noc lub przechowywać w temperaturze -20 °C przez kilka miesięcy.
    4. Przechowuj wszystkie odczynniki i próbki na lodzie i chroń odczynniki qRT-PCR przed światłem.
    5. Przygotuj 96-dołkową płytkę qPCR i w każdym dołku wymieszaj 6 μl wody wolnej od nukleaz, 10 μl odczynnika qRT-PCR, 2 μl mieszanki starterów 5 μM (do przodu i do tyłu) oraz 2 μl cDNA. Przykryj powierzchnię 96-dołkowej płytki qPCR ochronną folią optyczną i dociśnij, aby uszczelnić.
    6. Uruchom program qRT-PCR na termocyklerze zgodnie z instrukcjami producenta w następujący sposób: 50 °C przez 2 min, 95 °C przez 2 min, powtórz 40 razy z 95 °C przez 3 s i 60 °C przez 30 s, a następnie 8 °C przez czas nieokreślony.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Walidacja zmian transkrypcyjnych przy użyciu niewielkiej liczby całych nicieni po suplementacji lipidami
Aby zbadać, czy protokół ekstrakcji i odwrotnej transkrypcji RNA do cDNA z niewielkiej liczby całych nicieni jest powtarzalny i porównywalny z danymi uzyskanymi z populacji nicieni, wykorzystano długowieczny szczep nicieni nadekspresujący lizosomalną lipase kwaśną lipl-4 w jelicie7,8,33,

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Suplementacja lipidów została wykorzystana w badaniach nad starzeniem się w celu wyjaśnienia bezpośredniego wpływu niektórych gatunków lipidów na zdrowe starzenie się 6,7,23,26,27,31. Jednak procedura suplementacji lipidów może być trudna, a wszelkie niespójności między eksperymentami mogą powodować niepowtarzalne wyniki. W t...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie pozostają w konflikcie interesów.

Podziękowania

Dziękujemy P. Svayowi za wsparcie techniczne. Praca ta była wspierana przez granty NIH R01AG045183 (MCW), R01AT009050 (MCW), R01AG062257 (MCW), DP1DK113644 (MCW), March of Dimes Foundation (MCW), Welch Foundation (MCW), badacz HHMI (M.C.W.) oraz NIH T32 ES027801 stypendysta przeddoktoranckiego (MS). Niektóre szczepy zostały dostarczone przez CGC, które jest finansowane przez Biuro Programów Infrastruktury Badawczej NIH (P40 OD010440).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1,5 ml tłuczkaGenesee Scientific93-165P15Do mielenia robaków za pomocą Trizol
AgarozaSigmaA9639-500G
AmfiRivert Synteza cDNA Platinum Master MixGenDEPOTR5600Do odwrotnej transkrypcji z masowych próbek robaków
Applied Biosystems QuanStudio 3 Real-Time PCRThermoFisherA28567Do qRT-PCR
Benchmark Scientific StripSpin 12 MikrowirówkaBenchmark ScientificC1248Do probówek do PCR z wirowaniem
Branson 450 Digital Sonifier, z końcówką 1/8"Branson Ultrasonic Corporation100-132-888R
ChloroformFisher ScientificC298-500
CholesterolSigmaC8503-25G
Dimetylosulfotlenek (DMSO)SigmaD8418-100ML
Wirówka Eppendorf 5424 REppendorf22620444RDo ekstrakcji RNA
Eppendorf vapo protect mastercycler proEppendorf950030010Do odwrotnej transkrypcji
Etanol, absolutny (200 proof)Fisher ScientificBP2818-500
Greiner Bio-One CELLSTAR, 12 W PłytaNeta Scientific66518012-dołkowa Talerze do karmienia licuidów
Greiner Bio-One szalka Petriego, Ps, 100 x 20 mmNeta Scientific664161Do bakteryjnych płytek LB i robaków 10-cm Płytki
NGM Greiner Bio-One Petri, Ps, 60 x 15 mmNeta Scientific628161Do robakówPłytki NGM 6 cm
Invitrogen woda bez nukleazThermoFisherAM9937
IsoproanolSigmaPX1835-2
Chlorowodorek lewamizoluVWRSPCML1054
lipl-4TgMCW LabN/ATransgeniczny C. elegans
lipl-4Tg; FAT-3(WA22)MCW LabN/ATransgeniczny C. elegans
Luria Bulion BaseThermoFisher12795-084
Siarczan magnezu (MgSO4)SigmaM2643-500G
MicroAmp EnduraPlate Optyczna 96-dołkowa, szybka, przezroczysta płytka reakcyjna z kodem kreskowymThermoFisher448335496-dołkowa płytka
qPCRFolia kleju optycznego MicroAmpApplied BioSystem4311971Do uszczelniania 96-dołkowej płytki qPCR
System oczyszczania wody Milli-Q Advantage A10SigmaZ00Q0V0WWWoda dejonizowana używana do wytwarzania wszystkich odczynników, w tym pożywek buforowych i hodowlanych, chyba że jest określona jako woda wolna od nukleaz w protokole
N2Caenorhabditis Genetics CenterN/AC. elegans dziki izolat
Spektrofotometr NanoDrop ND-1000ThermoFisherN/ADo pomiaru stężenia RNA
OP50Caenorhabditis Genetics CenterN/A Bakteriestosowane jako C. elegans żywność
Trójwodny fosforan potasu (K2HPO4· 3H2O)SigmaP5504-1KG
Fosforan potasu jednozasadowy (KH2PO4)SigmaP0662-2.5KG
Power SYBR Zestaw do zielonych komórek ThermoFisher4402953Do odwrotnej transkrypcji i qPCR z kilku robaków lub tkanek robaka
Power SYBR Green Master MixThermoFisher4367659Dla qPCR z masowych próbek robaków
Pure Bright bakteriobójczy ultra wybielacz KIK Międzynarodowa Sp. z o.o.596472101436% wybielacz domowy Do przygotowania jaj robaków
Pyrex spot plate z dziewięcioma wgłębieniamiSigmaCLS722085-18EASzkiełko zegarkowe do wycinania robaków
RNaseZap Roztwór do dekontaminacji RNazyThermoFisherAM9780
Kloryd sodu (NaCl)SigmaS7653-1KG
Wodorotlenek sodu (NaOH)SigmaSX0590-3
Fosforan sodu dwuzasadowy siedmiowodny (Na2HPO4· 7H2O)SigmaS9390-1KG
Thermo Sorvall Legend Mach 1.6R WirówkaThermo7500-4337Do zbierania bakterii
Wirówka Thermo Sorvall ST 8Thermo7500-7200Do przygotowania jaj robaków
Odczynnik TRIzolTheroFisher15596018odczynnik do ekstrakcji RNA
Zestaw Turbo bez DNAThermoFisherAM1907Do usuwania zanieczyszczeń DNA podczas ekstrakcji RNA
Vortexer 59Denville Scientific INVS7030
VWR Jednorazowe mieszalniki peletów i silnik akumulatorowyVWR47747-370Do mielenia ślimakowego za pomocą Trizol
Mini wirówka VWR Kinetic Energy 26 dżuli C1413 V-115VWRN/ADo zbierania robaków. Model wycofany z produkcji, podobny dostępny w VWR z Cat# 76269-064
Zbieracz robakówWormStuff59-AWP

Bibliografia

  1. Fahy, E., et al. Update of the LIPID MAPS comprehensive classification system for lipids 1. Journal of Lipid Research. 50, 9-14 (2009).
  2. Liebisch, G., et al. Update on LIPID MAPS classification, nomenclature, and shorthand notation for MS-derived lipid structures. Journal of Lipid Research. 61 (12), 1539-1555 (2020).
  3. Mutlu, A. S., Duffy, J., Wang, M. C. Lipid metabolism and lipid signals in aging and longevity. Developmental Cell. 56 (10), 1394-1407 (2021).
  4. Kimura, T., Jennings, W., Epand, R. M. Roles of specific lipid species in the cell and their molecular mechanism. Progress in Lipid Research. 62, 75-92 (2016).
  5. Duffy, J., Mutlu, A. S., Wang, M. C. Lipid Metabolism, Lipid Signalling and Longevity. Ageing: Lessons from C. elegans. Healthy Ageing and Longevity. Olsen, A., Gill, M. , Springer. Cham. 307-329 (2017).
  6. Lesa, G. M., et al. Long chain poly-unsaturated fatty acids are required for efficient neurotransmission in C. elegans. Journal of Cell Science. 116 (24), 4965-4975 (2003).
  7. Folick, A., et al. Lysosomal signaling molecules regulate longevity in Caenorhabditis elegans. Science. 347 (6217), 83-86 (2015).
  8. Ramachandran, P. V., et al. Lysosomal signaling promotes longevity by adjusting mitochondrial activity. Developmental Cell. 48 (5), 685-696 (2019).
  9. Byrne, E. F. X., et al. Structural basis of Smoothened regulation by its extracellular domains. Nature. 535 (7613), 517-522 (2016).
  10. Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. A. Transparent window into biology: a primer on Caenorhabditis elegans. Genetics. 200 (2), 387-407 (2015).
  11. Nigon, V. M., Félix, M. -A. History of research on C. elegans and other free-living nematodes as model organisms. WormBook. , 1-84 (2017).
  12. Kutscher, L. M., Shaham, S. Forward and reverse mutagenesis in C. elegans. WormBook. , 1-26 (2014).
  13. Brooks, K. K., Liang, B., Watts, J. L. The influence of bacterial diet on fat storage in C. elegans. PloS ONE. 4 (10), 7545(2009).
  14. Brock, T. J., Browse, J., Watts, J. L. Fatty acid desaturation and the regulation of adiposity in Caenorhabditis elegans. Genetics. 176 (2), 865-875 (2007).
  15. Brock, T. J., Browse, J., Watts, J. L. Genetic regulation of unsaturated fatty acid composition in C. elegans. PloS Genetics. 2 (7), 108(2006).
  16. Watts, J. L., Phillips, E., Griffing, K. R., Browse, J. Deficiencies in C20 poly-unsaturated fatty acids cause behavioral and developmental defects in Caenorhabditis elegans fat-3 mutants. Genetics. 163 (2), 581-589 (2003).
  17. Watts, J. L., Browse, J. Genetic dissection of poly-unsaturated fatty acid synthesis in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences. 99 (9), 5854-5859 (2002).
  18. Watts, J. L., Browse, J. A. Palmitoyl-CoA-specific Δ9 fatty acid desaturase from Caenorhabditis elegans. Biochemical and Biophysical Research Communications. 272 (1), 263-269 (2000).
  19. Watts, J. L. Fat synthesis and adiposity regulation in Caenorhabditis elegans. Trends in Endocrinology & Metabolism. 20 (2), 58-65 (2009).
  20. Peyou-Ndi, M. M., Watts, J. L., Browse, J. Identification and characterization of an animal Δ12 fatty acid desaturase gene by heterologous expression in Saccharomyces cerevisiae. Archives of Biochemistry and Biophysics. 376 (2), 399-408 (2000).
  21. Spychalla, J. P., Kinney, A. J., Browse, J. Identification of an animal ω-3 fatty acid desaturase by heterologous expression in Arabidopsis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 94 (4), 1142-1147 (1997).
  22. Watts, J. L., Browse, J. Isolation and characterization of a Δ5-fatty acid desaturase from Caenorhabditis elegans. Archives of Biochemistry and Biophysics. 362 (1), 175-182 (1999).
  23. Deline, M. L., Vrablik, T. L., Watts, J. L. Dietary supplementation of polyunsaturated fatty acids in Caenorhabditis elegans. Journal of Visualized Experiments. (81), e50879(2013).
  24. Estes, R. E., Lin, B., Khera, A., Davis, M. Y. Lipid metabolism influence on neurodegenerative disease progression: is the vehicle as important as the cargo. Frontiers in Molecular Neuroscience. 14, 788695(2021).
  25. Sunshine, H., Iruela-Arispe, M. L. Membrane lipids and cell signaling. Current Opinion in Lipidology. 28 (5), 408-413 (2017).
  26. Han, S., et al. Mono-unsaturated fatty acids link H3K4me3 modifiers to C. elegans lifespan. Nature. 544 (7649), 185-190 (2017).
  27. O'Rourke, E. J., Kuballa, P., Xavier, R., Ruvkun, G. ω-6 Poly-unsaturated fatty acids extend life span through the activation of autophagy. Genes & Development. 27 (4), 429-440 (2013).
  28. Steinbaugh, M. J., et al. Lipid-mediated regulation of SKN-1/Nrf in response to germ cell absence. eLife. 4, 07836(2015).
  29. Blackwell, T. K., Steinbaugh, M. J., Hourihan, J. M., Ewald, C. Y., Isik, M. SKN-1/Nrf, stress responses, and aging in Caenorhabditis elegans. Free Radical Biology and Medicine. 88, 290-301 (2015).
  30. Ezzili, C., Otrubova, K., Boger, D. L. Fatty acid amide signaling molecules. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 20 (20), 5959-5968 (2010).
  31. Qi, W., et al. The ω-3 fatty acid α-linolenic acid extends Caenorhabditis elegans lifespan via NHR-49/PPARα and oxidation to oxylipins. Aging Cell. 16 (5), 1125-1135 (2017).
  32. Shemesh, N., Meshnik, L., Shpigel, N., Ben-Zvi, A. Dietary-induced signals that activate the gonadal longevity pathway during development regulate a proteostasis switch in Caenorhabditis elegans adulthood. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 254(2017).
  33. Savini, M., et al. Lysosome lipid signalling from the periphery to neurons regulates longevity. Nature Cell Biology. 24 (6), 906-916 (2022).
  34. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , (2006).
  35. Wang, M. C., O'Rourke, E. J., Ruvkun, G. Fat metabolism links germline stem cells and longevity in C. elegans. Science. 322 (5903), 957-960 (2008).
  36. Jacob, T. C., Kaplan, J. M. The EGL-21 carboxypeptidase E facilitates acetylcholine release at Caenorhabditis elegans neuromuscular junctions. The Journal of Neuroscience. 23 (6), 2122-2130 (2003).
  37. Kass, J., Jacob, T. C., Kim, P., Kaplan, J. M. The EGL-3 proprotein convertase regulates mechanosensory responses of Caenorhabditis elegans. The Journal of Neuroscience. 21 (23), 9265-9272 (2001).
  38. Bael, S. V., et al. Mass spectrometric evidence for neuropeptide-amidating enzymes in Caenorhabditis elegans. Journal of Biological Chemistry. 293 (16), 6052-6063 (2018).
  39. Fu, D., et al. In vivo metabolic fingerprinting of neutral lipids with hyperspectral stimulated Raman scattering microscopy. Journal of the American Chemical Society. 136 (24), 8820-8828 (2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

cie ki d ugowieczno citest d ugo ci yciaekstrakcja RNAsekcja tkanekanaliza qRT PCRpo ywka do wzrostu nicienirestrykcja kaloryczna
Suplementacja lipidów w celu długowieczności i analizy transkrypcji genów w Caenorhabditis elegans
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.