Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Obrazowanie na żywo dynamiki mikrotubul w komórkach glejaka atakujących mózg danio pręgowanego

2.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/64093

⸱

29 lipca 2022

 ,  , 
1Cell Polarity, Migration and Cancer Unit, Université Paris-Cité, Institut Pasteur, Équipe Labellisée Ligue Contre le Cancer

W tym artykule

Podsumowanie

Zgłaszamy technikę pozwalającą na obrazowanie na żywo dynamiki mikrotubul w komórkach glejaka (GBM) atakujących tkankę mózgową kręgowców. Sprzężenie ortotopowego wstrzykiwania fluorescencyjnie znakowanych komórek GBM do przezroczystego mózgu danio pręgowanego z obrazowaniem przyżyciowym o wysokiej rozdzielczości umożliwia pomiar dynamiki cytoszkieletu podczas inwazji raka in situ.

Streszczenie

Z fatalną medianą czasu przeżycia w rzeczywistych populacjach - od 6 do 15 miesięcy - glejak wielopostaciowy (GBM) jest najbardziej niszczycielskim złośliwym nowotworem mózgu. Niepowodzenie leczenia wynika głównie z inwazyjności komórek GBM, co przemawia za potrzebą lepszego zrozumienia właściwości ruchliwych GBM. Aby zbadać mechanizm molekularny wspierający inwazję GBM, potrzebne są nowe modele fizjologiczne umożliwiające dogłębną charakterystykę dynamiki białek podczas inwazji. Obserwacje te utorowałyby drogę do odkrycia nowych celów do blokowania infiltracji guza i poprawy wyników leczenia pacjentów. W artykule opisano, w jaki sposób ortotopowy ksenoprzeszczep komórek GBM w mózgu danio pręgowanego umożliwia subkomórkowe obrazowanie na żywo w trybie intrażyciowym. Koncentrując się na mikrotubulach (MT), opisujemy procedurę znakowania MT w komórkach GBM, mikroiniekcji komórek GBM do przezroczystego mózgu larw zebrygowanego danio pręgowanego 3 dni po zapłodnieniu (dpf), obrazowania przyżyciowego MT w rozsiewających ksenoprzeszczepach, zmiany dynamiki MT w celu oceny ich roli podczas inwazji GBM oraz analizy uzyskanych danych.

Wprowadzenie

Ruchliwość komórek to stereotypowy proces wymagający ustanowienia osi polaryzacji i rearanżacji cytoszkieletu generujących siłę. Polimeryzacja aktyny i jej związek z miozyną są uznawane za główne czynniki przyczyniające się do powstawania i kurczenia sił wymaganych do ruchu komórek1. Mikrotubule są uważane za głównych aktorów polaryzacji komórek i trwałości kierunkowej podczas migracji2. W ostatnich latach wykazano również, że MT tworzą i stabilizują wypukłości, aby wspierać siły mechanokompresyjne podczas inwazji komórek w 3D3. Ostatnio MT są bezpośrednio zaangażowane w mechanotransdukcję w zrostach ogniskowych i migrację mechanowrażliwą4. Niestabilność dynamiczna, która charakteryzuje dynamikę końcową MT-plus, składa się z powtarzających się faz polimeryzacji (wzrostu) i depolimeryzacji (skurczu), które są kontrolowane przez mnóstwo białek wiążących mikrotubule i wewnątrzkomórkowych kaskad sygnałowych, takich jak te regulowane przez RHO-GTPazy5,6,7. Rola sieci MT w migracji i inwazji komórek sprawiła, że badanie dynamiki MT stało się kluczowym elementem lepszego zrozumienia mechanizmów naprowadzania komórek odpornościowych, gojenia się ran i inwazji raka.

Zdolność komórek rakowych do ucieczki z rdzenia pierwotnego guza, rozprzestrzeniania się w tkankach i generowania wtórnych guzów jest kluczowym krokiem w zapobieganiu globalnemu sukcesowi w wojnie z rakiem ogłoszonej 50 lat temu8,9. Jedną z największych przeszkód było zrozumienie, w jaki sposób komórki rakowe aktywnie atakują tkankę. Kluczowe mechanizmy inwazji opierają się na tych samych zasadach, które rządzą migracją komórek nienowotworowych10. Pojawiły się jednak specyficzne aspekty migracji komórek nowotworowych11, co wywołało potrzebę lepszego scharakteryzowania tego typu migracji. W szczególności, ponieważ mikrośrodowisko guza wydaje się być kluczowym graczem w progresji raka12, obserwacja i analiza inwazji komórek rakowych w odpowiednim kontekście fizjologicznym jest niezbędna do rozwikłania mechanizmów rozprzestrzeniania się komórek rakowych.

MTs są kluczowe dla progresji raka, aby utrzymać zarówno proliferację, jak i inwazję. Precyzyjna analiza dynamiki MT in situ może pomóc w identyfikacji czynników zmieniających MT (MTA) w obu procesach. Dynamika MT zmienia się drastycznie w zależności od zmiany środowiska. In vitro leczenie środkami destabilizującymi MT, takimi jak nokodazol, zapobiega powstawaniu wypukłości komórek, gdy komórki są osadzone w żelach w 3D, podczas gdy ma niewielki wpływ na migrację komórek 2D13,14. Chociaż jest to wyzwanie techniczne, postępy w obrazowaniu przyżyciowym umożliwiają analizę in vivo dynamiki MT podczas inwazji komórek nowotworowych. Na przykład obserwacja MT w podskórnie ksenoprzeszczepowanych komórkach włókniakomięsaka u myszy ujawniła, że makrofagi związane z nowotworem wpływają na dynamikę MT w komórkach nowotworowych15. Jednak te mysie modele obejmują rozległe zabiegi chirurgiczne i pozostają niezadowalające w przypadku mniej dostępnych nowotworów, takich jak wysoce inwazyjny guz mózgu, GBM.

Pomimo fatalnego średniego czasu przeżycia wynoszącego 15 miesięcy16, niewiele wiadomo na temat sposobu rozprzestrzeniania się GBM w miąższu mózgu lub kluczowych elementów molekularnych podtrzymujących inwazję komórek GBM w tkance mózgowej. Udoskonalenie mysiego ortotopowego ksenoprzeszczepu (PDX) i ustanowienie okien czaszkowych stworzyło nowe perspektywy dla badań nad inwazją komórek GBM17,18. Jednak ze względu na nieoptymalną jakość obrazowania, model ten umożliwił głównie obrazowanie podłużne powierzchownych ksenoprzeszczepów i nie był dotychczas z powodzeniem stosowany do badania subkomórkowego obrazowania białek cytoszkieletu. Ponadto, w ślad za nakazem "3R" dotyczącym ograniczenia wykorzystywania gryzoni i zastąpienia ich niższymi kręgowcami, ustanowiono alternatywne modele.

Korzystając z pierwotnej odporności obserwowanej u larw danio pręgowanego (Danio rerio), opracowano ortotopowe wstrzykiwanie komórek GBM do mózgu ryby19,20,21. Wstrzyknięcie w okolice komór w rozwijającym się śródmózgowiu podsumowuje większość patofizjologii GBM u człowieka21, i obserwuje się ten sam preferowany wzorzec inwazji GBM, co w przypadku kooptacji naczynia ludzkiego22. Dzięki przezroczystości larw ryb, model ten pozwala na wizualizację komórek GBM atakujących mózg z obszarów okołokomorowych, w których uważa się, że powstaje większość GBM23.

Ponieważ MT są niezbędne do inwazji komórek GBM in vitro24,25, potrzebna jest lepsza charakterystyka dynamiki MT i identyfikacja kluczowych regulatorów podczas inwazji komórek. Jednak do tej pory dane wygenerowane za pomocą modelu ortotopowego danio pręgowanego nie obejmowały subkomórkowej analizy dynamiki MT podczas procesu inwazji. W artykule przedstawiono protokół badania dynamiki MT in vivo i określenia jej roli podczas inwazji raka mózgu. Po stabilnym znakowaniu mikrotubulami, komórki GBM są mikrowstrzykiwane z prędkością 3 dpf do mózgów larw danio pręgowanego i obrazowane w czasie rzeczywistym w wysokiej rozdzielczości czasoprzestrzennej podczas ich progresji w tkance mózgowej. Obrazowanie na żywo fluorescencyjnych MT umożliwia jakościową i ilościową analizę dynamiki MT plus-end. Co więcej, model ten umożliwia ocenę wpływu MTA na dynamikę MT oraz na właściwości inwazyjne komórek GBM w czasie rzeczywistym. Ten stosunkowo nieinwazyjny protokół w połączeniu z dużą liczbą larw obsługiwanych jednocześnie i łatwością aplikacji leku (w wodzie dla ryb) sprawia, że model ten jest atutem w testach przedklinicznych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Unii Europejskiej dotyczącymi obchodzenia się ze zwierzętami laboratoryjnymi. Wszystkie protokoły zostały zatwierdzone przez Komitet Etyczny ds. Doświadczeń na Zwierzętach Instytutu Pasteura - CEEA 89 oraz francuskie Ministerstwo Badań i Edukacji (zezwolenie #01265.03). Podczas iniekcji lub sesji obrazowania na żywo zwierzęta były znieczulane Tricaine.At zakończeniu procedur eksperymentalnych były poddawane eutanazji przez przedawkowanie środka znieczulającego. Szczegółowe informacje na temat materiałów, sprzętu i oprogramowania użytego w tym protokole można znaleźć w Tabeli materiałów. Ogólny przebieg pracy protokołu jest opisany w Rysunek 1.

1. Generacja komórek glejaka stabilnie wyrażających α-tubulinę-mKate2

UWAGA: Następujące kroki są wykonywane w komorze bezpieczeństwa biologicznego BSL2+.

  1. Wytwarzać cząstki lentiwirusowe eksprymujące mKate2-tubulinę przy użyciu metody fosforanu wapnia do transfekcji 7 × 106 komórek HEK-293T.
    1. W probówce mikrowirówki o pojemności 1,5 ml dodać 10 μg plazmidu pakującego psPAX2 drugiej generacji, 5 μg plazmidu otoczki wirusa pMD2.G i 10 μg plazmidu będącego przedmiotem zainteresowania, pGK-mKate2-ludzkiej tubuliny α1a z 50 μl CaCl2 (zapas 2,5 M). Dostosować do 500 μl ze sterylnym H2O.
      bez DNA UWAGA: Ważne jest, aby dodać CaCl2 na końcu.
    2. Wymieszać, kilkakrotnie odwracając probówkę i inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej (RT).
    3. Podczas inkubacji należy przygotować kolejną probówkę mikrowirówkową o pojemności 1,5 ml z 500 μl soli fizjologicznej buforowanej przez HEPES (HBS), pH 7,0 (2x).
    4. Po 20 minutach dodawać mieszaninę CaCl2/DNA kropla po kropli do roztworu HBS (2x). Wymieszaj, obracając rurkę kilka razy. Inkubować przez 12 minut w temperaturze pokojowej.
    5. Po 12 minutach delikatnie dodaj CaCl2 / DNA zmieszany z HBS bezpośrednio na 70% zlewające się 10-centymetrowe naczynie komórek HEK-293T, kropla po kropli.
    6. Pozostawić komórki w nawilżonym inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 36-48 godzin.
    7. Zebrać supernatant i odwirować go do 3 000 × g przez 5 minut, aby usunąć resztki komórkowe.
    8. Aby zagęścić cząsteczki wirusa, należy załadować supernatant do probówki ultrawirówkowej i odwirowywać go do 47 508 × g przez 90 minut w temperaturze 4 °C.
    9. Wyrzuć supernatant i umieść probówkę do góry nogami na papierze, aby wysuszyć wnętrze probówki.
    10. Dodaj 30 μl PBS do osadu wirusowego. Nie zawieszać ponownie granulatu. Pozostawić w temperaturze 4 °C na 2 godziny.
    11. Delikatnie zawiesić cząsteczki wirusa, pipetując w górę i w dół. Unikaj robienia bąbelków. Przechowywać w temperaturze -80 °C.
      UWAGA: Większe ilości cząstek wirusa mogą być wytwarzane przez transfekcję wielu płytek komórek HEK-2-93T.
  2. Infekuj komórki glejaka cząstkami lentiwirusa.
    UWAGA: Ten protokół jest napisany dla komercyjnych linii komórkowych glejaka, takich jak U-87 MG, U-373 MG lub T98. Aby użyć pierwotnych komórek glejaka pochodzącego od pacjenta, należy użyć specyficznej powłoki płytek i pożywki nieopartej na surowicy26.
    1. Przygotuj 70% zlewające się 10 cm naczynie z komórkami glejaka U-87 MG wyhodowanymi w minimalnej pożywce Eagle (MEM) uzupełnionej 10% płodową surowicą cielęcą, penicyliną-streptomycyną (100 jednostek/ml stężenie końcowe dla penicyliny i 100 μg/ml dla streptomycyny) oraz aminokwasami endogennymi (1x).
    2. Dodaj cząsteczki wirusa w rozcieńczeniu 1 do 5,000 bezpośrednio na komórki. Wymieszaj delikatnym zawijasem. Pozwól wirusom zainfekować komórki nie dłużej niż 20 godzin.
    3. Usunąć pożywkę zawierającą wirusa i zastąpić ją świeżą pożywką hodowlaną. Zezwól na wyrażenie oznaczonej tubuliny dla 48-72 h.
      UWAGA: Poniższe czynności należy wykonać w komorze bezpieczeństwa biologicznego BSL2.
    4. FACS - sortuj komórki, aby wybrać najjaśniejsze 15% komórek mKate2+. Po usunięciu zanieczyszczeń i komórek dubletowych za pomocą bramkowania rozproszenia do przodu i z boku (FCS vs SSC), zastosuj kolejne bramkowanie na najjaśniejszych komórkach 30% mKate2+, aby zachować górne 15%.
    5. Wzmocnij komórki znakowane MT.
      UWAGA: Alternatywnie, selekcję klonalną na podstawie wysokich poziomów tubuliny-mKate2 można przeprowadzić pod mikroskopem epifluorescencyjnym.

2. Przygotuj larwy danio pręgowanego do mikroiniekcji

  1. Generuj jaja danio pręgowanego.
    1. Umieść trzy samce i cztery samice pożądanego szczepu danio pręgowanego w zbiorniku godowym uzupełnionym kulkami na 4 dni przed ksenotransplantacją, późnym popołudniem.
      UWAGA: Linie Tg(fli1a:gfp), Tg(gfap:gfp) lub Tg(Huc:gfp) są używane odpowiednio do oznaczania naczyń endogennych, nerwowych komórek macierzystych/astrocytów i neuronów.
    2. Zbierz jaja wyprodukowane przez tarło wywołane marmurem następnego ranka.
    3. Oczyść jaja, przenosząc je do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml wypełnionej wodą mineralną27 uzupełnioną wybielaczem (0,004% final). Delikatnie odwróć rurkę przez 5 minut. Umyć dwukrotnie tylko wodą mineralną.
    4. Przenieść jaja na szalkę Petriego zawierającą wodę mineralną uzupełnioną 0,28 mg/ml błękitu metylenowego.
    5. Usuń niezapłodnione i zatrzymane w rozwoju jaja. Inkubować zarodki w temperaturze 28 °C.
  2. Stwórz przezroczyste larwy.
    1. Wprowadzić N-fenylotiomocznik (PTU) (0,003% końcowy) do pożywki 8 godzin później, aby zapobiec pigmentacji melaniny i zapewnić przezroczystość optyczną. Zachowaj PTU w medium do końca protokołu.
      UWAGA: Ponieważ leczenie PTU może powodować wady rozwojowe, do ksenotransplantacji należy wybierać tylko normalnie rozwinięte larwy. Jako alternatywę dla obróbki chemicznej można użyć zmutowanego szczepu danio pręgowanego Casper (nacre and roy orbison double mutant), w którym brak jest pigmentacji28.
    2. Podnieść temperaturę inkubacji do 29 °C.
    3. Temperaturę należy zwiększać codziennie o 1 °C, tak aby 3 larwy dpf osiągnęły 32 °C w dniu wstrzyknięcia.
  3. Przygotować płytkę do mikroiniekcji.
    1. Przygotuj 20 ml 1% agarozy + 0,28 mg/ml błękitu metylenowego z wodą mineralną.
    2. Wlej agarozę do 10 cm szalki Petriego i szybko nałóż plastikową formę do mikroiniekcji do góry nogami, aby utworzyć rowy w kształcie litery V o szerokości 2,5 mm (Rysunek 2B).
      UWAGA: Plastikowa forma jest dostępna na rynku lub może być zbudowana we własnym zakresie zgodnie z projektem opisanym w Zebrafish Book29.
    3. Ostrożnie wyjmij plastikową formę, gdy agaroza stężeje.
      UWAGA: Płyty odlewane metodą mikroiniekcji można przechowywać w temperaturze 4 °C do 2 miesięcy.
  4. Przygotuj larwy do ksenotransplantacji.
    1. W dniu wstrzyknięcia przeprowadzić badanie przesiewowe pod kątem wybranej fluorescencyjnej ekspresji transgenu w larwach 3 dpf. Usuń niefluorescencyjne, nienormalnie wyglądające zwierzęta.
    2. Odcięj larwy ręcznie za pomocą kleszczy zegarmistrzowskich z cienką końcówką. Przy 3 dpf delikatnie szturchnij lub rozerwij kosmówkę dwiema parami kleszczy z cienką końcówką, aby uwolnić larwy z kosmówki.
      UWAGA: Alternatywnie, leczenie enzymatyczne pronazą A może być stosowane do dekorionacji larw, zwykle w stężeniu 24 hpf.
    3. Utrzymuj zdekorionowane larwy w podłożu z wodą mineralną z błękitem metylenowym (0,28 mg/ml) i PTU (0,003% final).

3. Procedura ksenotransplantacji

  1. Przygotuj igły do mikroiniekcji.
    1. Weź kapilarnę ze szkła borokrzemianowego bez centralnego filamentu i umieść ją w pionowym ściągaczu do igieł.
    2. Korzystając z następujących ustawień - zwiększ 8,5 i grzałkę 3 - rozciągnij kapilarę, aby zamienić ją w igłę do mikroiniekcji.
  2. Skonfiguruj mikrowtryskiwacz.
    1. Załaduj olej mineralny do ręcznego mikrowtryskiwacza. Usuń pęcherzyki powietrza.
    2. Podłącz uniwersalny uchwyt kapilarny do mikrowtryskiwacza i mocno przymocuj go do mechanicznego mikromanipulatora (Rysunek 2A).
  3. Zbierz komórki glejaka.
    UWAGA: Poniższe kroki są wykonywane w szafie bezpieczeństwa biologicznego BSL2.
    1. Przygotuj 10 cm płytkę komórek glejaka, aby osiągnęły 80% zbiegu w dniu przeszczepu.
    2. (Opcjonalnie) Przejściowo oznacz jądra komórkowe, dodając Hoechst 35480 (200 ng / ml) do komórek. Inkubować przez 20 minut w temperaturze 37 °C w inkubatorze z nawilżanymi komórkami i przemyć 2x PBS.
    3. Wyjąć płytkę z komórkami z inkubatora i przemyć ją raz PBS. Odłącz komórki, dodając 1 ml 0,05% trypsyny-EDTA i inkubując przez 5-10 minut w temperaturze 37 °C w inkubatorze komórkowym, aż wszystkie komórki zostaną całkowicie odłączone.
      UWAGA: Ten krok ma kluczowe znaczenie, ponieważ słaba trypsyna spowoduje, że agregaty komórkowe utkną w igle.
    4. Ponownie zawiesić komórki w 5 ml kompletnej pożywki komórkowej glejaka w probówce wirówkowej o pojemności 50 ml. Dodać 45 ml lodowatego PBS i odwirować w stężeniu 134 × g przez 5 minut.
    5. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki za pomocą 1 ml lodowatego PBS, dokładnie pipetując w górę i w dół.
      UWAGA: Ten etap dysocjacji mechanicznej znacznie pomaga zapobiec ryzyku zatkania kapilary podczas mikroiniekcji.
    6. Dodać 49 ml lodowatego PBS i odwirować przy 134 × g przez 5 minut. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 200 μl lodowatego PBS. Przechowywać na lodzie przez czas trwania zabiegu przeszczepu.
  4. Mikrowstrzyknij komórki glejaka do śródmózgowia larw danio pręgowanego.
    1. Napełnij odlewaną płytkę do mikroiniekcji 6 ml E3-medium30 uzupełnionej 160 mg/l trikainy.
    2. Przenieś kilkanaście larw z odkorionowaną osłoną do płytki do mikroiniekcji. Gdy przestaną reagować na dotyk, ustaw je w rowach na boku, głową do góry, a woreczek żółtkowy przyciśnij do ściany rowu za pomocą pędzla o rozmiarze 00 (Rysunek 2B,C).
    3. Ponownie zawiesić komórki glejaka. Załaduj 5 μl komórek do mikrokapilary za pomocą końcówek do mikroładowania i włóż kapilę do uniwersalnego uchwytu kapilary.
    4. Umieścić płytkę do mikroiniekcji zawierającą niereagujące larwy pod mikroskopem stereoskopowym. Umieścić końcówkę mikrokapilary na granicy płytki do mikroiniekcji za pomocą pokręteł mikromanipulatora. Rozbij go skalpelem, aby utworzyć ostry punkt wejścia, mniej więcej wielkości średnicy komórki.
    5. Sprawdzić, czy komórki wypływają z naczynia włosowatego, delikatnie wpuszczając olej do mikrowstrzykiwacza i zanurzając końcówkę igły w podłożu. Skoncentruj komórki na końcu naczynia włosowatego, aby zmaksymalizować liczbę wstrzykiwanych komórek na wyrzuconą objętość i unikaj wypełniania tkanki mózgowej PBS (Rysunek 2C).
    6. Dokładnie zbadaj komórki wychodzące z mikrokapilary, gdy olej jest ręcznie wprowadzany do wtryskiwacza. Określ empirycznie, ile obrotu jest potrzebne na ręcznym pokrętle, aby dostarczyć od 20 do 50 komórek. Zazwyczaj, jeśli komórki są wystarczająco skoncentrowane, wystarczy jeden delikatny obrót, aby wyrzucić ~10 komórek.
      UWAGA: Jeśli płyn nie wypływa prawidłowo z mikrokapilary, spróbuj poluzować mocowanie mikrokapilary w uchwycie kapilary. W ten sposób olej może wyciekać i kapać wzdłuż kapilary.
    7. Zbliż się do końcówki naczynia włosowatego w kierunku lewego Optic Tectum (OT), tuż nad żyłą środkową mózgu (MCeV, Ryc. 2F).
    8. Delikatnie dociśnij naczynia włosowate do larw, aż błona skórna pęknie (Rysunek 2D,E).
      UWAGA: Nie naciskaj zbyt mocno, ponieważ spowoduje to wstrzyknięcie komórek zbyt głęboko w mózg, gdzie niższa przejrzystość optyczna uniemożliwi szczegółową obserwację MT. Technika obrazowania jest możliwa dla głębokości sięgającej 250-300 μm. Zaleca się jednak, aby nie wstrzykiwać głębiej niż 100 μm od powierzchni ryby.
    9. Po osiągnięciu odpowiedniej pozycji w OT wysuń ogniwa. Uważnie obserwuj końcówkę naczynia włosowatego, aby uwidocznić strumień komórek wchodzących do wnętrza zwierzęcia, zapewniając w ten sposób udane wstrzyknięcie.
      UWAGA: Należy uważać, aby nie wstrzykiwać do komór (Ryc. 2E). Po dostaniu się do komór komórki mają tendencję do gromadzenia się i zacinania zamiast infiltrować tkankę (Rysunek 2I). Iniekcja komorowa charakteryzuje się intensywnym obrzękiem mózgu i obserwowalnym rozprzestrzenianiem się wstrzykniętych komórek do przodomózgowia i tyłomózgowia (Ryc. 2J).
    10. Powtórzyć procedurę z kroków 3.4.9-3.4.11 dla tylu zwierząt, ile jest to wymagane. Postępuj szybko, aby zapobiec zlepianiu się komórek w naczyniach włosowatych.
      UWAGA: W zależności od tego, jak szybko eksperymentator wstrzykuje, zmiana igły może być potrzebna co 10 do 20 larw.
    11. Po zakończeniu ksenotransplantacji należy usunąć larwy z płytki do mikroiniekcji i umieścić je na 24-dołkowej płytce wypełnionej wodą mineralną + PTU + podłożem z błękitem metylenowym.
    12. Potwierdź udaną iniekcję, obserwując larwy pod fluorescencyjnym mikroskopem stereoskopowym (Rysunek 2G). Wybieraj tylko ksenoprzeszczepy zawierające pojedynczą masę guza utworzoną przez 20-50 komórek zlokalizowanych w górnych 200 μm (w z) OT (Rysunek 2H vs nieudane wstrzyknięcie w Rysunek 2I-K).
      UWAGA: Wydajność pomyślnie zlokalizowanych ksenoprzeszczepów waha się od 10% na początku do prawie 100% po nabraniu praktyki.
    13. Pozwól larwom dojść do siebie przez co najmniej 4 godziny w temperaturze 32 °C przed obrazowaniem.
      UWAGA: Dodanie antybiotyków do pożywki nie zwiększa przeżywalności larw. Na tym etapie, jeśli mikroiniekcja została wykonana prawidłowo, przeżywa prawie 100% ryb.

4. Obrazowanie przyżyciowe ksenoprzeszczepów glejaka

  1. Zamontuj larwy do obrazowania na żywo.
    UWAGA: Larwy można obrazować od 4 godzin po wstrzyknięciu (hpi). Obrazowanie MT na żywo jest zwykle wykonywane od 20 hpi, kiedy inwazyjne komórki GBM zaczęły wysuwać wypukłości i migrować od masy guza.
    1. Przygotuj 1% niskotopliwy roztwór agarozy. Przenieść 500 μl ugotowanego 1% niskotopliwego roztworu agarozy do probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml i pozostawić do ostygnięcia w temperaturze 37 °C na bloku grzewczym. Dodaj trikainę (112 μg/ml) do agarozy i dobrze wymieszaj.
    2. Przenieść od jednej do czterech ksenoprzeszczepowanych larw na 3,5 cm szalkę Petriego wypełnioną wodą mineralną + PTU + pożywką metylenową uzupełnioną trikainą (112 μg/ml). Gdy larwy przestaną reagować na dotyk, należy je ostrożnie przenieść do probówki zawierającej agarozę i trikainę za pomocą pipety do przenoszenia z cienką końcówką.
      UWAGA: Ogranicz objętość pożywki do minimum, aby ograniczyć rozcieńczanie agarozy.
    3. Delikatnie wymieszaj larwy z agarozą. Używając normalnej (dużej bańki) pipety transferowej, umieść larwy zmieszane z agarozą na środku naczynia do obrazowania wideo o średnicy 3,5 cm ze szklanym dnem. Pod mikroskopem stereoskopowym szybko umieść larwy na grzbiecie za pomocą końcówki do mikroładowania, aby manipulować rybą.
      UWAGA: Ponieważ w tym protokole do obrazowania mózgu w trybie przyżyciowym używany jest mikroskop konfokalny z odwróconym wirującym dyskiem, larwy są montowane grzbietowo. Dostosuj odpowiednio położenie larw, jeśli używasz pionowego mikroskopu konfokalnego.
    4. Usuń dodatkową agarozę, aby zachować jak najcieńszą warstwę agarozy. Gdy agaroza zastygnie, dodaj 2,5 ml mineralnej wody źródłowej + PTU + 0,2x trikainy (podłoże do obrazowania) i przejdź do następnego kroku.
  2. Obrazowanie in vivo na żywo dynamiki MT w inwazyjnych komórkach glejaka wielopostaciowego
    UWAGA: Jakość optyczna obrazów w dużej mierze zależy od wydajności używanego mikroskopu. Protokół został napisany dla mikroskopu konfokalnego z odwróconym dyskiem wirującym, wyposażonego w kamerę sCMOS (rozmiar piksela 6,5 μm, 2048 x 2044 pikseli), obiektyw o dużej odległości roboczej i komorę środowiskową o kontrolowanej temperaturze.
    1. Umieścić naczynie do obrazowania wideo zawierające larwy ksenoprzeszczepu zanurzone w agarozie w komorze środowiskowej odwróconego mikroskopu konfokalnego, w temperaturze ustawionej na 32 °C. Znajdź larwy w naczyniu do obrazowania wideo z obiektywem 10x, używając zmotoryzowanego stolika XY.
    2. Naciśnij ESC, aby obniżyć wieżyczkę obiektywu, dodaj olej mineralny do obiektywu olejowego 60x (1.4 NA, odległość robocza: 0.13 mm) i naciśnij ESC, aby powrócić do początkowej pozycji ogniskowej.
    3. Obserwuj atakujące komórki glejaka w kanale czerwonym (źródło lasera 561 nm, 20% moc lasera, czas ekspozycji: 200 ms) i wybierz komórkę z rozproszoną siecią MT i łatwo rozróżnialnymi włóknami MT (Rysunek 3B).
    4. Skonfiguruj ustawienia serii z. Korzystając ze stolika piezoelektrycznego o zasięgu 200 μm, wybierz górną i dolną pozycję sieci MT: stos z o głębokości 10-30 μm wystarczy, aby uwidocznić sieć mikrotubul w występie migrującej komórki, z krokiem warstwy Z wynoszącym 0,3 μm.
    5. Ustaw ustawienia akwizycji poklatkowej, aby umożliwić optymalną równowagę między szybkością akwizycji, głębokością stosu z i sygnałem fluorescencyjnym, aby uniknąć szybkiego fotowybielania. Uzyskuj obrazy MT co 5-10 s przez kilka minut. Pobieranie i zapisywanie hiperstosu 5D (x,y,z,t,c).
      UWAGA: Aby uniknąć dryftów w z podczas akwizycji, użyj mikroskopu wyposażonego w doskonały system ustawiania ostrości jako sprzętową stabilizację ostrości.
  3. (Opcjonalnie) Określ wpływ czynników zmieniających mikrotubule (MTA) na MTs.
    UWAGA: Poniższe kroki pozwalają na przetestowanie wpływu MTA na sieć MT w migrujących komórkach glejaka w czasie rzeczywistym.
    1. Delikatnie wyjmij nośnik obrazowania z naczynia do obrazowania wideo. Nie dotykaj dna naczynia, ponieważ pozycja xyz zostanie utracona.
    2. Przygotować nowy nośnik obrazowania zawierający MTA w różnych stężeniach. Delikatnie dodawaj pożywkę zawierającą MTA do naczynia do obrazowania wideo, kropla po kropli.
    3. Zdobądź długoterminowe filmy (2-16 godzin, jeden obraz co 10-20 minut), aby obserwować wpływ każdego stężenia MTA na sieć MT i migrację komórek (Rysunek 4A).
    4. (Opcjonalnie) Wypłucz MTA, delikatnie usuwając pożywkę i dodając 2,5 ml świeżej pożywki do obrazowania bez MTA. Powtórz procedurę wymywania 3 razy, aby usunąć wszelkie ślady MTA w podłożu.
    5. (Opcjonalnie) Zdobądź podobny długoterminowy film jak w 4.3.3 (Rysunek 4B).
      UWAGA: Powyższe kroki określają minimalne stężenie zmieniające sieć MT bez wpływu na przeżywalność larw. Etapy wymywania określają, czy działanie leku jest odwracalne.
  4. Oceń wpływ MTA na inwazję glejaka za pomocą obrazowania sekwencyjnego.
    1. Postępuj zgodnie z krokami od 4.1 do 4.2.1 4 godziny po mikroiniekcji.
      UWAGA: Ta część protokołu może być również osiągnięta z innymi fluorescencyjnie znakowanymi liniami komórkowymi glejaka. Najlepiej jest znakować GBM znacznikiem cytozolowym i znacznikiem jądra, aby zapewnić wykrycie globalnej morfologii komórki.
    2. Przełącz się na obiektyw wodny o dużej odległości roboczej 40x (NA: 1.15, WD: 0.6 mm).
    3. Ustaw zakres serii Z, aby uzyskać region OT. Uzyskaj stos z za pomocą kamery sCMOS o wysokiej czułości (rozmiar piksela 11 μm, 1,200 x 1,200 pikseli, wydajność kwantowa 95%).
      UWAGA: Z-stack zwykle zaczyna się w najbardziej grzbietowej części OT (blisko powierzchni) i kończy się wystarczająco głęboko w mózgu, aby objąć całą masę komórek nowotworowych.
    4. Wyjmij miskę do obrazowania wideo z mikroskopu. Uwolnij larwy z agarozy za pomocą końcówki do mikroładowania i delikatnie szturchaj agarozę wokół zwierzęcia.
      UWAGA: Ponieważ larwy 3 dpf są nadal bardzo delikatne, należy zachować ostrożność podczas usuwania ich z agarozy.
    5. Gdy zwierzę zostanie uwolnione z agarozy, delikatnie przenieś je do pojedynczej studzienki na 24-dołkowej płytce wypełnionej wodą mineralną + błękitem metylenowym + podłożem PTU. Zaznacz studzienkę, aby zidentyfikować larwy do późniejszego obrazowania.
    6. Dodać do pożywki interesujący nas MTA o stężeniu ustalonym wcześniej (krok 4.3.3). Codziennie odświeżaj podłoże uzupełnione lekiem. Powtarzaj procedurę obrazowania od kroków 4.4.1 do 4.4.5 codziennie przez 3-4 dni.

5. Analiza obrazu

  1. Analizuj dynamikę MT za pomocą bezpłatnych wtyczek FIJI.
    UWAGA: Wiele recenzji i protokołów opisuje metody analizy dynamiki MT w komórkach31,32,33,34 i mogą być stosowane na tym etapie. Protokół ten będzie pokrótce odnosił się do dwóch metod pomiaru podstawowych właściwości dynamicznych MT.
    1. Otwórz hiperstos 5D i wygeneruj stos 4D, w którym wycinki z zostały rzutowane w jednej płaszczyźnie, aby utworzyć projekcję maksymalnej intensywności (MIP) w z (Obraz | Stosy | Projekt Z | Maksymalna intensywność) (Rysunek 3B).
    2. Otwórz stos 4D MIP i ręcznie śledź koniec MT opartego na wystających elementach za pomocą funkcji śledzenia ręcznego w FIJI (Wtyczki | Śledzenie | Śledzenie ręczne). (Rysunek 3D). Wyodrębnij parametry dynamiki MT, takie jak prędkość wzrostu, prędkość skurczu, częstotliwość ratownictwa i częstotliwość katastrof.
    3. Alternatywnie, narysuj segmentowaną linię o szerokości 10 pikseli wzdłuż MT, aby przeanalizować (Rysunek 3B). Korzystanie z funkcji Multi Kymograph (Analiza | Multi Kymograph) (Rysunek 3C) na FIDŻI. Obserwuj i mierz fazy wzrostu MT (G), długość przerw (P) i częstotliwość katastrof MT.
  2. Analiza długotrwałej inwazji glejaka
    UWAGA: Ta analiza wymaga użycia wizualizacji i analizy 4D za pomocą oprogramowania do bioobrazowania.
    1. Przekonwertuj surowy stos 4D Z kroku 4.4.3 (4 hpi) na odpowiedni format oprogramowania za pomocą oprogramowania File Converter.
    2. Otwórz oprogramowanie i zaimportuj przekonwertowany plik z-stack w widoku Surpass (Rysunek 5A).
    3. Aby podzielić komórki nowotworowe na segmenty i odrzucić nieistotną autofluorescencję w czerwonym kanale, kliknij Dodaj nowe powierzchnie i postępuj zgodnie z 5-etapowym procesem.
      1. Sprawdź ustawienia domyślne, klikając następną strzałkę, gdy pojawi się okno. Przejdź do kroku 2/5.
        UWAGA: Jeśli sygnał fluorescencyjny zostanie uzyskany w kanale 561, autofluorescencja z resztkowej pigmentacji oka może być silna i zmienić proces automatycznej segmentacji. Jest to problematyczne, jeśli ksenoprzeszczep znajduje się blisko oka. W takim przypadku segmentacja musi zostać zakończona ręcznie, przecinając i usuwając sygnały komórkowe inne niż glejak.
      2. Przejdź do pozycji Kanał źródłowy | Kanał 561. Wygładź obraz (filtr Gaussa), dodając 1,50 μm w polu Szczegóły powierzchni i dodając 2,5 μm w polu Odejmij tło. Kliknij następną strzałkę i przejdź do kroku 3/5.
      3. W zależności od intensywności sygnału ręcznie dostosuj próg (odejmowanie tła), aby uwzględnić każdy proces komórkowy. Przejdź do kroku 4/5.
      4. Przefiltruj podzielony na segmenty sygnał, usuwając zdarzenia, które nie reprezentują części komórki (np. szczątki, autofluorescencja). Kliknij Typ filtra | głośność i dostosuj próg ręcznie, aby wykluczyć wszystkie zdarzenia poniżej najmniejszego woluminu reprezentującego część komórki. Przejdź do kroku 5/5.
        UWAGA: Jeśli sygnały autofluorescencji mają większą objętość niż najmniejsza część komórki, kontynuuj mimo to i ręcznie usuń niepożądane sygnały, klikając lewym przyciskiem myszy i usuwając je.
      5. Odrzuć etap klasyfikacji i zakończ kreatora segmentacji, klikając podwójną zieloną strzałkę, aby zakończyć tworzenie widoku powierzchni komórek nowotworowych (Rysunek 5B).
    4. Jeśli segmentowane komórki nie stykają się ze sobą i nie tworzą unikalnego obiektu, połącz je sztucznie, aby utworzyć obiekt masy komórek nowotworowych. W skrócie, kliknij na Statystyki | szczegółowe | konkretne wartości | objętość. Wybierz wszystkie wydarzenia, klikając lewym przyciskiem myszy na górnym, a następnie przytrzymując Shift i klikając lewym przyciskiem myszy ostatnie. Przejdź do menu edycja | zaznaczenie | ujednolicenie.
    5. Zdefiniuj środek ciężkości masy komórek nowotworowych. Kliknij Dodaj nowe miejsca | Pomiń automatyczne tworzenie | Dodaj (kursor przecina się z) | Środek obiektu. Przytrzymaj Shift i kliknij lewym przyciskiem myszy, aby utworzyć miejsce, które jest środkiem ciężkości segmentowanej masy komórek nowotworowych.
    6. Zmierz odległość 3D między każdą komórką GBM a środkiem ciężkości masy guza. Aby to zrobić, utwórz odległość do kanału środka ciężkości, pozostając w widoku punktowym i wybierając ikonę narzędzia | Transformacja odległości. Poczekaj, aż zostanie utworzona nowa odległość do kanału środka ciężkości, obok kanału 488 i 561 (na niebiesko, Rysunek 5C).
      UWAGA: Intensywność każdego woksela w tym kanale odpowiada odległości 3D między wokselem a środkiem ciężkości masy komórek nowotworowych.
    7. Zmierz odległość 3D do środka ciężkości każdej segmentowanej komórki, klikając Dodaj nowe miejsca | Pomiń automatyczne tworzenie | Dodaj (kursor przecina się z) | Specjalny kanał 561. Przytrzymaj Shift i kliknij lewym przyciskiem myszy obszar jądra komórkowego. Wykonaj to zadanie dla każdej komórki (Rysunek 5D).
      UWAGA: Usuń widok powierzchni, aby lepiej docenić sygnał fluorescencji komórek. Alternatywnie, jeśli jest obecny, użyj sygnału jądra (sygnał 405 nm lub 647 nm), aby uzyskać lepszą dokładność.
    8. Kliknij Statystyki | Szczegółowe | Konkretne wartości | średnia intensywności Ch = odległość do środka ciężkości.
      UWAGA: Wartość intensywności to odległość 3D w μm między obszarem jądra komórkowego a środkiem ciężkości.
    9. Uśrednij te intensywności, aby obliczyć promień masy guza przy 4 hpi. Powtórz procedurę dla każdego punktu czasowego analizy (24 hpi, 48 hpi i 72 hpi).
      UWAGA: Mierz tylko 10 lub 20 najbardziej rozsianych komórek, aby uniknąć niedoszacowania inwazji komórek. Rzeczywiście, wymuszone zagęszczenie komórek podczas wstrzyknięcia może zapobiec migracji komórek w środku masy guza.
    10. Oblicz wskaźnik inwazji (II) jako stosunek średnich odległości 3D przy t = 24 hpi/48 hpi/72 hpi najbardziej rozproszonych komórek w stosunku do średniego promienia masy guza przy t = 4 hpi (Rysunek 5E).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Aby przeanalizować rolę, jaką odgrywają mikrotubule (MT) podczas inwazji GBM in vivo, opisujemy tutaj główne etapy przeprowadzania stabilnego znakowania MT w komórkach GBM za pomocą infekcji lentiwirusowej, ortotopowej ksenotransplantacji komórek GBM do larw zebrafish w 3. dniu po zapłodnieniu (dpf), wysokorozdzielczego obrazowania intravitalnego dynamiki MT, traktowania MTA i jego wpływu na inwazję GBM, a także analizy obrazowej dynamiki MT i inwazji in vivo (Rysunek 1)

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Obrazowanie ksenoprzeszczepów nowotworowych w rozdzielczości pojedynczej komórki prawdopodobnie stanie się niezbędnym narzędziem do lepszego zrozumienia biologii GBM. Obrazowanie na żywo w mysich modelach PDX doprowadziło do cennych odkryć dotyczących tego, w jaki sposób GBM kolektywnie atakuje tkankę mózgową18. Jednak do tej pory rozdzielczość czasoprzestrzenna nie jest wystarczająco wysoka, aby ujawnić dynamikę białek kontrolujących inwazję GBM. Doszliśmy do wniosku, że poprzez sprzężenie ortoto...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Jesteśmy niezmiernie wdzięczni Dr. P. Herbomel (Institut Pasteur, Francja) i jego laboratorium, szczególnie Valérie Briolat, oraz Emmie Colucci-Guyon za dostarczenie nam linii do danio pręgowanego i plastikowej formy do płytek do mikroiniekcji, a także za ich cenną wiedzę na temat procedur eksperymentalnych dla danio pręgowanego. Z wdzięcznością dziękujemy firmie UtechS Photonic BioImaging (C2RT, Institut Pasteur, wspieranej przez francuską Narodową Agencję Badawczą France BioImaging oraz ANR-10-INBS-04; Inwestycje na przyszłość). Prace te były wspierane przez Ligue contre le cancer (EL2017. LNCC), Centre National de la Recherche Scientifique i Institut Pasteur oraz dzięki hojnym darowiznom pani Marguerite MICHEL i pana Porqueta.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Hodowla komórek glejaka
Płodowa surowica cielęcaEurobioCVFSVF00-01Odczynnik
MEM NEAAGibco11140-050Odczynnik
modyfikowany Eagle's MediumOdczynnik EurobioCM1MEM18-01
Penicylina– streptomycynaGibco15140-122Odczynnik
U-87 MGECACC89081402-1VLKomórki
Produkcja lenitiwirusa
BD FACSAria IIIBD bioscience
Instrument BD FACSDiva software v8.0BD bioscienceSoftware
HEK-293TMerck12022001Cells
pMD2.GAddgene Plasmid #12259Odczynnik
psPAX2AddgenePlasmid #12260Odczynnik
Ultrawirówka Optima XPN-80Beckman CoulterInstrument
Przenikanie i barwienie komórek
dPBSGibco14190-094Chemiczny
Hoechst 34580Sigma-Aldrich63493Trypsyna chemiczna
EDTA (0,05%)Gibco25300-054Odczynnik
Hodowla danio pręgowanego
Stereomikroskop fluorescencyjny LEICA M165FCLEICAhttps://www.leica-microsystems.com/fr/produits/stereomicroscopes-et-macroscopes/informations-detaillees/leica-m165-fc/Instrument
Hydrat błękitu metylenowegoSigma-AldrichM4159Chemiczny
N-fenylotiomocznik (PTU)Sigma-AldrichP7629-25G
Pipety do transportu chemicznego cienkie końcówkiSamco Scientific232Transfer sprzętu
Pipety Duża Żarówka 3mLSamco Scientific225Sprzęt
Trikaina (3-aminobenzoesan etylu metanosulfonian)Sigma-AldrichCat#: A5040Chemiczna
woda źródłowa VolvicDUTSCHER DOMINIQUE SASOdczynnik
Ksenotransplantacja
24-dołkowa płytkaTPP92024Sprzęt
Kapilary ze szkła borokrzemianowego (1,0 ODx0,58IDx150L mm)Aparat Harvarda(#30-0017 GC100-15Sprzęt
Mikrowtryskiwacz oleju CellTram varioEppendorf5176000.025Przyrząd Końcówki
do pipet do mikroładowania (Microloader) 20 i mikro; LEppendorf  5242956003Sprzęt
MikromanipulatorNARISHIGEhttps://products.narishige-group.com/group1/injection/english.html Sprzęt
Olej mineralnySigmaM8410-100mlSprzęt
Mikroskop stereoskopowyOlympusKL 2500 LCDInstrument
Uniwersalny uchwyt kapilarnyEppendorf5176190002Equipment
Pionowy ściągacz do pipetKOPF (Roucaire)Model 720Instrument
Intravital Obrazowanie
3,5 cm talerz do obrazowania wideo ze szklanym dnemMatTek Life Sciences, MA, USAP35G-1,5-14-C
Oprogramowanie do pozyskiwania sprzętu: NIS-Elements-AR wersja 5.21Blok
TechneDRI-BLOCK DB-2D
Sprzęt Głowica mikroskopu Nikon Ti2ENikonInstrument
sCMOS kamera Prime 95BInstrument fotometrycznyKamera
sCMOS Orca Flash 4HammatsuInstrument
Ultrapure Agaroza o niskiej temperaturze topnieniaInvitrogen16520-050Chemiczny
dysk przędzalniczy Yokagawa CSU-W1 jednostkaHammatsuInstrument
Leczenie lekami
DMSOSigma-AldrichD2650-100MLChemiczny
NocodazolSigma-AldrichM1404-2MGChemiczny
Analiza obrazu
Imaris 9.5.1 oprogramowanieOxford Oprogramowanie Instruments
ImarisFileConverter 9.5.1Oprogramowanie Oxford Instruments
999556 grzewczy oprogramowania Nikon

Bibliografia

  1. Pollard, T. D., Borisy, G. G. Cellular motility driven by assembly and disassembly of actin filaments. Cell. 112 (4), 453-465 (2003).
  2. Etienne-Manneville, S. Microtubules in cell migration. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 29, 471-499 (2013).
  3. Bouchet, B. P., Akhmanova, A. Microtubules in 3D cell motility. Journal of Cell Science. 130 (1), 39-50 (2017).
  4. Seetharaman, S., et al. Microtubules tune mechanosensitive cell responses. Nature Materials. 21 (3), 366-377 (2022).
  5. Etienne-Manneville, S. From signaling pathways to microtubule dynamics: the key players. Current Opinion in Cell Biology. 22 (1), 104-111 (2010).
  6. Garcin, C., Straube, A. Microtubules in cell migration. Essays in Biochemistry. 63 (5), 509-520 (2019).
  7. Dogterom, M., Koenderink, G. H. Actin-microtubule crosstalk in cell biology. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (1), 38-54 (2019).
  8. Nature editorial. The 'war on cancer' isn't yet won. Nature. 601 (297), (2022).
  9. Chaffer, C. L., Weinberg, R. A. A perspective on cancer cell metastasis. Science. 331 (6024), 1559-1564 (2011).
  10. Friedl, P., Wolf, K. Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms. Nature Reviews Cancer. 3 (5), 362-374 (2003).
  11. Friedl, P., Alexander, S. Cancer invasion and the microenvironment: plasticity and reciprocity. Cell. 147 (5), 992-1009 (2011).
  12. Clark, A. G., Vignjevic, D. M. Modes of cancer cell invasion and the role of the microenvironment. Current Opinion in Cell Biology. 36, 13-22 (2015).
  13. Meyer, A. S., et al. 2D protrusion but not motility predicts growth factor-induced cancer cell migration in 3D collagen. Journal of Cell Biology. 197 (6), 721-729 (2012).
  14. Bouchet, B. P., et al. Mesenchymal cell invasion requires cooperative regulation of persistent microtubule growth by SLAIN2 and CLASP1. Developmental Cell. 39 (6), 708-723 (2016).
  15. Luthria, G., et al. In vivo microscopy reveals macrophage polarization locally promotes coherent microtubule dynamics in migrating cancer cells. Nature Commun. 11 (1), 3521(2020).
  16. Wen, P. Y., Kesari, S. Malignant gliomas in adults. New England Journal of Medicine. 359 (5), 492-507 (2008).
  17. Ricard, C., Stanchi, F., Rougon, G., Debarbieux, F. An orthotopic glioblastoma mouse model maintaining brain parenchymal physical constraints and suitable for intravital two-photon microscopy. Journal of Visualized Experiments. (86), e55108(2014).
  18. Osswald, M., et al. Brain tumour cells interconnect to a functional and resistant network. Nature. 528 (7580), 93-98 (2015).
  19. Astell, K. R., Sieger, D. Investigating microglia-brain tumor cell interactions in vivo in the larval zebrafish brain. Methods in Cell Biology. , 593-626 (2017).
  20. Zeng, A., et al. Identify a blood-brain barrier penetrating drug-TNB using zebrafish orthotopic glioblastoma xenograft model. Scientific Reports. 7 (1), 14372(2017).
  21. Welker, A. M., et al. Correction: Standardized orthotopic xenografts in zebrafish reveal glioma cell-line-specific characteristics and tumor cell heterogeneity. Disease Models & Mechanisms. 9 (9), 1063-1065 (2016).
  22. Umans, R. A., Ten Kate, M., Pollock, C., Sontheimer, H. Fishing for contact: modeling perivascular glioma invasion in the zebrafish brain. ACS Pharmacology & Translational Science. 4 (4), 1295-1305 (2021).
  23. Lee, J. H., et al. Human glioblastoma arises from subventricular zone cells with low-level driver mutations. Nature. 560 (7717), 243-247 (2018).
  24. Pagano, A., et al. Epothilone B inhibits migration of glioblastoma cells by inducing microtubule catastrophes and affecting EB1 accumulation at microtubule plus ends. Biochemical Pharmacology. 84 (4), 432-443 (2012).
  25. Berges, R., et al. The novel tubulin-binding checkpoint activator BAL101553 inhibits EB1-dependent migration and invasion and promotes differentiation of glioblastoma stem-like cells. Molecular Cancer Therapeutics. 15 (11), 2740-2749 (2016).
  26. Lee, J., et al. Tumor stem cells derived from glioblastomas cultured in bFGF and EGF more closely mirror the phenotype and genotype of primary tumors than do serum-cultured cell lines. Cancer Cell. 9 (5), 391-403 (2006).
  27. Volvic source water mineral composition. Volvic. , Available from: https://www.volvic.co.uk/volcanic-water/composition (2022).
  28. White, R. M., et al. Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell Stem Cell. 2 (2), 183-189 (2008).
  29. Westerfield, M. The Zebrafish Book. A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Brachydanio rerio). The University of Oregon Press, Eugene. , Chapter 5 (2000).
  30. E3, M. Recipe E3 medium (for zebrafish embryos. , Cold Spring Harbor Protocols. (2011).
  31. Straube, A. How to measure microtubule dynamics. Methods in Molecular Biology. 777, 1-14 (2011).
  32. Honore, S., Braguer, D. Investigating microtubule dynamic instability using microtubule-targeting agents. Methods in Molecular Biology. 777, 245-260 (2011).
  33. Movsisyan, N., Pardo, L. A. Measurement of microtubule dynamics by spinning disk microscopy in monopolar mitotic spindles. Journal of Visualized Experiments. (153), e60478(2019).
  34. Serikbaeva, A., Tvorogova, A., Kauanova, S., Vorobjev, I. A. Analysis of microtubule dynamics heterogeneity in cell culture. Methods in Molecular Biology. 1745, 181-204 (2018).
  35. Schnurr, M. E., Yin, Y., Scott, G. R. Temperature during embryonic development has persistent effects on metabolic enzymes in the muscle of zebrafish. Journal of Experimental Biology. 217 (8), 1370-1380 (2014).
  36. Yan, C., et al. Visualizing engrafted human cancer and therapy responses in immunodeficient zebrafish. Cell. 177 (7), 1903-1914 (2019).
  37. Li, G., Moore, J. K. Microtubule dynamics at low temperature: evidence that tubulin recycling limits assembly. Molecular Biology of the Cell. 31 (11), 1154-1166 (2020).
  38. Wu, J. S., et al. Plasticity of cancer cell invasion: Patterns and mechanisms. Translational Oncology. 14 (1), 100899(2021).
  39. Hamilton, L., Astell, K. R., Velikova, G., Sieger, D. A zebrafish live imaging model reveals differential responses of microglia toward glioblastoma cells in vivo. Zebrafish. 13 (6), 523-534 (2016).
  40. Gillespie, S., Monje, M. An active role for neurons in glioma progression: making sense of Scherer's structures. NeuroOncology. 20 (10), 1292-1299 (2018).
  41. Wolf, K. J., et al. A mode of cell adhesion and migration facilitated by CD44-dependent microtentacles. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (21), 11432-11443 (2020).
  42. Zhou, Y. X., et al. Transcriptional upregulation of microtubule-associated protein 2 is involved in the protein kinase A-induced decrease in the invasiveness of glioma cells. Neuro-Oncology. 17 (12), 1578-1588 (2015).
  43. Monzo, P., et al. Mechanical confinement triggers glioma linear migration dependent on formin FHOD3. Molecular Biology of the Cell. 27 (8), 1246-1261 (2016).
  44. Vollmann-Zwerenz, A., Leidgens, V., Feliciello, G., Klein, C. A., Hau, P. Tumor cell invasion in glioblastoma. International Journal of Molecular Science. 21 (6), 1932(2020).
  45. Feng, H., et al. EGFRvIII stimulates glioma growth and invasion through PKA-dependent serine phosphorylation of Dock180. Oncogene. 33 (19), 2504-2512 (2014).
  46. Liu, R., et al. Cdk5-mediated regulation of the PIKE-A-Akt pathway and glioblastoma cell invasion. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (21), 7570-7575 (2008).
  47. Xiao, J., Glasgow, E., Agarwal, S. Zebrafish xenografts for drug discovery and personalized medicine. Trends in Cancer. 6 (7), 569-579 (2020).
  48. Baxendale, S., van Eeden, F., Wilkinson, R. The power of zebrafish in personalised medicine. Personalised Medicine: Lessons from Neurodegeneration to Cancer. 1007, 179-197 (2017).
  49. Cramer, S. W., et al. Through the looking glass: A review of cranial window technology for optical access to the brain. Journal of Neuroscience Methods. 354, 109100(2021).
  50. Stanchi, F., Matsumoto, K., Gerhardt, H. Imaging glioma progression by intravital microscopy. Methods in Molecular Biology. 1862, 227-243 (2019).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Inwazja glejaka wielopostaciowegoksenoprzeszczep ortotopowymikroskopia konfokalnaznakowanie mikrotubulobrazowanie intravitalneleczenie nocodazolemmodele raka mózgu
Obrazowanie na żywo dynamiki mikrotubul w komórkach glejaka atakujących mózg danio pręgowanego
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.