Method Article

Obrazowanie i analiza pojedynczych komórek całego mózgu nienaruszonych mózgów noworodków myszy za pomocą rezonansu magnetycznego, oczyszczania tkanek i mikroskopii świetlnej

DOI:

10.3791/64096

⸱

August 1st, 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1UNC Neuroscience Center, University of North Carolina, Chapel Hill, 2Department of Genetics, University of North Carolina, Chapel Hill, 3Department of Psychiatry, University of North Carolina, Chapel Hill, 4Center for Animal Magnetic Resonance Imaging, The University of North Carolina at Chapel Hill, 5Biomedical Research Imaging Center, The University of North Carolina at Chapel Hill, 6Department of Neurology, The University of North Carolina at Chapel Hill, 7Department of Computer Science, The University of North Carolina at Greensboro

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje metody przeprowadzania rezonansu magnetycznego, oczyszczania i znakowania immunologicznego nienaruszonych mózgów myszy za pomocą iDISCO+, a następnie szczegółowy opis obrazowania za pomocą mikroskopii świetlnej i dalszych analiz za pomocą NuMorph.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Oczyszczanie tkanek, a następnie mikroskopia świetlna (LSFM) umożliwia obrazowanie nienaruszonej struktury mózgu w rozdzielczości komórkowej, umożliwiając ilościową analizę zmian strukturalnych spowodowanych zaburzeniami genetycznymi lub środowiskowymi. Obrazowanie całego mózgu skutkuje dokładniejszą kwantyfikacją komórek i badaniem różnic specyficznych dla regionu, które mogą zostać pominięte w przypadku powszechnie stosowanej mikroskopii fizycznie wyciętej tkanki. Użycie mikroskopii arkuszowej światła do obrazowania oczyszczonych mózgów znacznie zwiększa szybkość akwizycji w porównaniu z mikroskopią konfokalną. Chociaż obrazy te generują bardzo duże ilości danych strukturalnych mózgu, większość narzędzi obliczeniowych, które przeprowadzają kwantyfikację cech na obrazach oczyszczonej tkanki, ogranicza się do zliczania rzadkich populacji komórek, a nie wszystkich jąder.

Tutaj demonstrujemy NuMorph (Nuclear-Based Morphometry), grupę narzędzi analitycznych, do ilościowego oznaczania wszystkich jąder i markerów jądrowych w opisanych regionach mózgu myszy po urodzeniu w 4. dniu (P4) po oczyszczeniu i zobrazowaniu pod mikroskopem świetlnym. Opisujemy obrazowanie metodą rezonansu magnetycznego (MRI) w celu pomiaru objętości mózgu przed skurczem spowodowanym etapami odwodnienia oczyszczania tkanek, oczyszczania tkanek metodą iDISCO+, w tym znakowania immunologicznego, a następnie mikroskopii świetlnej przy użyciu dostępnej na rynku platformy do obrazowania mózgów myszy w rozdzielczości komórkowej. Następnie demonstrujemy ten potok analizy obrazu za pomocą NuMorph, który służy do korygowania różnic intensywności, łączenia kafelków obrazu, wyrównywania wielu kanałów, liczenia jąder i opisywania regionów mózgu poprzez rejestrację w publicznie dostępnych atlasach.

Zaprojektowaliśmy to podejście, korzystając z publicznie dostępnych protokołów i oprogramowania, umożliwiając każdemu badaczowi dysponującemu niezbędnym mikroskopem i zasobami obliczeniowymi wykonywanie tych technik. Te narzędzia do oczyszczania, obrazowania i obliczeń tkanek umożliwiają pomiar i kwantyfikację trójwymiarowej (3D) organizacji typów komórek w korze mózgowej i powinny być szeroko stosowane w każdym projekcie badania myszy typu dzikiego/nokautowego.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obrazowanie całego mózgu w rozdzielczości pojedynczej komórki jest ważnym wyzwaniem w neurobiologii. Obrazy mózgu o rozdzielczości komórkowej pozwalają na szczegółową analizę i mapowanie obwodów mózgowych na poziomie systemu oraz tego, jak obwody te są zakłócane przez genetyczne lub środowiskowe czynniki ryzyka zaburzeń neuropsychiatrycznych, zachowania komórkowe w rozwijających się zarodkach, a także obwody neuronalne w mózgu dorosłego1,2,3. Istnieje wiele metod histologicznych, które pozwalają na uzyskanie obrazów zrekonstruowanego mózgu 3D w wysokiej rozdzielczości; jednak techniki te wymagają drogiego, specjalistycznego sprzętu, mogą nie być kompatybilne z immunoznakowaniem, a dwuwymiarowy (2D) charakter niektórych metod może prowadzić do uszkodzenia tkanek i ścinania podczas sekcji4,5.

Ostatnie osiągnięcia dostarczyły alternatywnego podejścia do obrazowania całych mózgów, które nie wymaga cięcia tkanek; polegają one na użyciu oczyszczania tkanek w celu uczynienia mózgów przezroczystymi. Przezroczystość osiąga się w większości metod oczyszczania tkanek zarówno poprzez usuwanie lipidów, ponieważ są one głównym źródłem rozpraszania światła, jak i dopasowanie współczynnika załamania światła (RI) obiektu do RI roztworu zanurzeniowego próbki podczas obrazowania. Światło może następnie przejść przez granicę między materiałami bez rozpraszania6,7,8,9.

Metody oczyszczania tkanek, takie jak iDISCO+, są często łączone z szybkim obrazowaniem 3D za pomocą mikroskopii wzbudzenia pojedynczych fotonów, takich jak LSFM6,7,10. W przezroczystych tkankach znakowanych fluoroforem, obrazy z mikroskopii fluorescencyjnej arkusza świetlnego są wycinane przez wzbudzenie cienką płaszczyzną światła11. Główną zaletą LSFM jest to, że pojedyncza sekcja optyczna jest oświetlana na raz, a cała fluorescencja cząsteczek w tej sekcji jest wzbudzana, co minimalizuje fotowybielanie. Co więcej, obrazowanie całego wycinka optycznego umożliwia wykrywanie tego wzbudzonego wycinka za pomocą kamery, zwiększając prędkość w stosunku do skanowania punktowego12. LSFM nieniszcząco wytwarza dobrze zarejestrowane przekroje optyczne, które nadają się do rekonstrukcji 3D.

Podczas gdy metoda iDISCO+ pozwala na niedrogie usunięcie tkanek w ciągu ~3 tygodni, etapy odwodnienia w protokole mogą prowadzić do kurczenia się tkanek i potencjalnej zmiany morfologii próbki, wpływając w ten sposób na pomiary objętościowe6,10. Dodanie wtórnej metody obrazowania, takiej jak rezonans magnetyczny, która ma być stosowana przed procedurą oczyszczania tkanek, może zmierzyć stopień skurczu wywołanego oczyszczaniem tkanki w próbce. Podczas etapów odwodnienia różnice we właściwościach mechanicznych między istotą szarą i białą mogą prowadzić do niejednorodnych deformacji materii mózgowej, co skutkuje odmiennymi deformacjami objętości wywołanymi oczyszczaniem tkanek między próbkami typu dzikiego i zmutowanego i może zakłócać interpretacje różnic objętościowych w tych próbkach10,13. MRI wykonuje się poprzez najpierw perfuzję zwierzęcia środkiem kontrastowym (np. gadolinem), a następnie inkubację wyekstrahowanej tkanki będącej przedmiotem zainteresowania w roztworze immersyjnym (np. fomblinie) przed obrazowaniem14. MRI jest kompatybilny z oczyszczaniem tkanek i wykonywaniem LSFM na tej samej próbce.

LSFM jest często używany do tworzenia wielkoskalowych obrazów mikroskopowych do jakościowej wizualizacji tkanki mózgowej będącej przedmiotem zainteresowania, a nie do ilościowej oceny struktury mózgu (Rysunek 1). Bez oceny ilościowej trudno jest wykazać różnice strukturalne wynikające z urazów genetycznych lub środowiskowych. Wraz z poprawą technologii oczyszczania tkanek i obrazowania, a także zmniejszeniem kosztów przechowywania i mocy obliczeniowej, ilościowe określanie lokalizacji typów komórek w tkance będącej przedmiotem zainteresowania staje się coraz bardziej dostępne, co pozwala większej liczbie badaczy na uwzględnienie tych danych w swoich badaniach.

Z ponad 100 milionami komórek w mózgu myszy15 i sesjami obrazowania całego mózgu, które mogą generować terabajty danych, istnieje zwiększone zapotrzebowanie na zaawansowane narzędzia do analizy obrazów, które pozwalają na dokładne określenie ilościowe cech na obrazach, takich jak komórki. Istnieje wiele metod segmentacji dla obrazów wyczyszczonych tkankowo, które stosują progi intensywności barwienia jądrowego i filtrują obiekty o predefiniowanych kształtach, rozmiarach lub gęstościach10,16,17,18. Jednak niedokładne interpretacje wyników mogą wynikać z różnic w parametrach, takich jak rozmiar komórki, kontrast obrazu i intensywność etykietowania. W tym artykule opisano nasz ustalony protokół ilościowego oznaczania jąder komórkowych w mózgu myszy. Najpierw szczegółowo opisujemy kroki pobierania tkanek z mózgu myszy P4, a następnie protokół oczyszczania tkanek i znakowania immunologicznego zoptymalizowany na podstawie publicznie dostępnej metody iDISCO+10. Po drugie, opisujemy akwizycję obrazu za pomocą rezonansu magnetycznego i mikroskopii arkuszowej, w tym parametry używane do przechwytywania obrazów. Na koniec opisujemy i demonstrujemy NuMorph19, zestaw narzędzi do analizy obrazu opracowanych przez naszą grupę, które umożliwiają kwantyfikację specyficzną dla typu komórki po oczyszczeniu tkanki, znakowaniu immunologicznym za pomocą markerów jądrowych i obrazowaniu obszarów z adnotacjami za pomocą arkusza świetlnego.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie myszy zostały użyte zgodnie z i zatwierdzone przez Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) na Uniwersytecie Północnej Karoliny w Chapel Hill.

1. Sekcja i perfuzja myszy

UWAGA: Następujące sekcje zostały przeprowadzone na myszach P4 i P14 za pomocą strzykawki. Objętość płynu perfuzyjnego będzie się różnić w zależności od wieku zwierzęcia.

  1. Perfuzja
    UWAGA: Paraformaldehyd (PFA) jest niebezpieczną substancją chemiczną. Wykonaj wszystkie etapy perfuzji w dygestoriach chemicznych.
    1. Przed zabiegiem należy podać pentobarbital we wstrzyknięciu dootrzewnowym (100 mg/kg) i poczekać, aż zacznie działać środek znieczulający.
    2. Gdy zwierzę osiągnie chirurgiczną płaszczyznę znieczulenia, użyj metody reakcji szczypania palców, aby potwierdzić brak reakcji.
    3. Wykonaj boczne nacięcie pod klatką piersiową, aby odsłonić klatkę piersiową zwierzęcia.
    4. Za pomocą zakrzywionych, chirurgicznych nożyczek ostrożnie przeciąć klatkę piersiową aż do obojczyka po jednej stronie zwierzęcia i wykonać identyczne cięcie po przeciwnej stronie, umożliwiając uniesienie mostka, odsłaniając serce.
    5. Nie uszkadzając aorty zstępującej, ostrożnie przytnij wszelkie tkanki połączone z sercem przed wykonaniem małego nacięcia na prawym przedsionku, aby umożliwić przepływ krwi z naczyń krwionośnych.
    6. Stosując metodę opartą na strzykawce, przeprowadź perfuzję myszy przez lewą komorę z 10 ml i 7 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) odpowiednio dla P14 i P4, z szybkością perfuzji 1,5 ml / min przez system.
    7. Po oczyszczeniu krwi należy ponownie przeprowadzić perfuzję z 10 ml PBS + 4% PFA i 7 ml PBS + 4% PFA odpowiednio dla P14 i P4, w temperaturze 4 °C z szybkością perfuzji 1,5 ml/min, aby utrwalić zwierzę.
      UWAGA: Będą obserwowane drżenia fiksacji, a zwierzę będzie sztywne po zakończeniu. W przypadku stosowania MRI na próbkach, należy wykonać perfuzję z podobnymi objętościami PBS i PFA dla każdego punktu czasowego + 20% środka kontrastowego MRI na bazie gadolinu w roztworze PFA.
    8. Zdejmij głowę za pomocą nożyczek chirurgicznych i utrwal kroplę za pomocą PBS + 4% PFA przez 24 godziny w temperaturze 4 °C, aby uzyskać całkowite utrwalenie.
      UWAGA: Na tym etapie mózg pozostaje nienaruszony z założoną czaszką (patrz sekcja 2). Punkt pauzy: na tym etapie mózgi mogą być przechowywane przez kilka miesięcy w PBS + 0,1% azydku sodu w temperaturze 4 °C.

2. Obrazowanie dużych struktur mózgu na podstawie rezonansu magnetycznego z nienaruszoną czaszką i analizą

UWAGA: Mózg musi być perfundowany i inkubowany w gadolinie, jak opisano powyżej, bez wyjmowania go z czaszki. Wszystkie badania MRI odbywają się przed usunięciem mózgu z czaszki, aby uniknąć niezamierzonej utraty tkanki podczas sekcji. Obrazowanie z nienaruszoną czaszką zapewnia również wsparcie dla mózgu w uchwycie próbki (tj. strzykawce) podczas przygotowywania próbki i obrazowania.

  1. Przygotowanie próbki
    UWAGA: Poniższe kroki są zoptymalizowane pod kątem próbek mózgu myszy P4 i P14. Wymagany rozmiar strzykawki będzie zależał od fizycznej wielkości próbki.
    1. W przypadku wykonywania rezonansu magnetycznego na próbce, należy usunąć skórę z czaszki i inkubować w PBS + 3% gadolinu przez 23 dni w temperaturze 4 °C przed obrazowaniem14. Po 23 dniach szybko przepłukać próbki w PBS.
    2. Użyj strzykawek o pojemności 5 ml, aby utworzyć uchwyt na próbkę do rezonansu magnetycznego, używając tłoków strzykawki, aby zamknąć każdy koniec uchwytu wykonanego za pomocą strzykawki20. Użyj plastikowych elementów, aby mocno przytrzymać czaszkę w uchwycie (Rysunek 2A). Usunąć oznaczenia ze strzykawki za pomocą etanolu, aby zapobiec artefaktom podczas obrazowania.
    3. Bezpiecznie umieść czaszkę w uchwycie na próbkę i napełnij ją roztworem zanurzeniowym zgodnym z MRI (patrz Tabela materiałów). Zamknąć uchwyt i usunąć wszystkie pęcherzyki powietrza za pomocą strzykawki.
      UWAGA: Punkt pauzy: Czaszka może być przechowywana w roztworze zanurzeniowym przez kilka miesięcy przed obrazowaniem.
  2. Obrazowanie dużej struktury mózgu (MRI)
    1. Zobrazuj próbki za pomocą systemu MRI dla zwierząt o średnicy poziomej 9,4 T/30 cm z otworem poziomym przy użyciu cewki objętościowej 15 mm i sekwencji opartej na echu spinowym o następujących parametrach: Rozdzielczość przestrzenna: 60 μm x 60 μm x 60 μm; całkowity czas skanowania: 7 h 12 min; czas do echa (TE): 6,83 ms; czas powtarzania (TR): 40 ms; kąty odwrócenia wzbudzenia/ponownego ogniskowania: 90/180 stopni; Rozmiar obrazu:166 x 168 x 209 wokseli; Pole widzenia (FOV): 9,9 mm x 10,1 mm x 12,4 mm; szerokość pasma: 100 000 kHz.
  3. Obliczeniowa analiza struktury mózgu
    1. Usuń otaczającą czaszkę z surowych obrazów MRI, ręcznie śledząc mózg myszy za pomocą oprogramowania do segmentacji. Następnie zastosuj operację mnożenia wokseli między obrazem maski a surowym obrazem MRI, aby wygenerować obraz MRI mózgu pozbawionego czaszki.
      UWAGA: Wyjściem jest binarny obraz maski, w którym intensywność wokseli mózgowych jest ustawiona na 1, a w przeciwnym razie na 0.
    2. Zastosuj sztywną rejestrację obrazu (szacując tylko translację i obrót) za pomocą 'flirt' w pakiecie FSL21,22, aby wyrównać obraz MRI z czaszką (ruchomy obraz) do odpowiedniego obrazu mikroskopowego z arkusza świetlnego (obraz referencyjny).
    3. Zastosuj niesztywną rejestrację (używając 'SyN' w oprogramowaniu ANTS23), aby znaleźć zależności punkt-punkt między sztywno wyrównanym obrazem MRI w kroku 2.3.2 a obrazem na arkuszu świetlnym (ten sam obraz referencyjny w kroku 2.3.2).
      UWAGA: Dane wyjściowe obejmują zniekształcony obraz MRI i pole deformacji związane ze zmianami objętości z MRI na obrazy z arkusza świetlnego.
    4. Oblicz wyznacznik jakobianu na polu deformacji wygenerowanym w kroku 2.3.3, który określa ilościowo zmianę objętości w lokalnym sąsiedztwie wokseli o wymiarach 3 x 3 x 3.
    5. Dopasuj obrazy z czaszką do atlasu mózgu myszy rozwojowej Allena za pomocą deformowalnej rejestracji obrazu.
      UWAGA: Ustalona przestrzenna zgodność punkt-punkt umożliwia automatyczną adnotację obszarów mózgu będących przedmiotem zainteresowania na nowym obrazie myszy (Rysunek 2C-H).

3. Wycięcie mózgu z czaszki

  1. Wykonaj nacięcie w linii środkowej wzdłuż górnej części czaszki od szyi do nosa, aby odsłonić czaszkę.
  2. Odsłoń podstawę czaszki, odcinając pozostały mięsień szyi i wszystkie inne pozostałości mięśni.
  3. Używając ostrych nożyczek chirurgicznych, ostrożnie tnij wzdłuż wewnętrznej powierzchni czaszki, uważając, aby nie uszkodzić mózgu, utrzymując delikatny nacisk w górę podczas cięcia ostrym sprzętem chirurgicznym.
  4. Użyj pęsety, aby oderwać dwie odcięte połówki czaszki od mózgu i ostrożnie odciąć nadmiar tłuszczu przyczepionego do mózgu.
  5. Użyj nożyczek chirurgicznych, aby przyciąć oponę twardą, która łączy mózg z czaszką, a następnie użyj szpatułki, aby delikatnie usunąć mózg z głowy.
  6. Usunąć mózg, przemyć PBS, a następnie zamienić na PBS z 0,1% azydkiem sodu i przechowywać w temperaturze 4 °C do długotrwałego przechowywania.

4. Oczyszczanie tkanek

UWAGA: Ten protokół jest zaadaptowany z protokołu iDISCO+ dla myszy P46, z niewielkimi zmianami. Niektóre szczegóły mogą ulec zmianie dla różnych punktów czasowych/gatunków/eksperymentów). UWAGA: Metanol, dichlorometan (DCM) i eter dibenzylowy (DBE) są niebezpiecznymi chemikaliami. Te etapy oczyszczania tkanek są wykonywane w chemicznym okapie oparowym.

  1. Walidacja przeciwciał
    UWAGA: Należy sprawdzić kompatybilność metanolu z nieprzetestowanymi przeciwciałami, ponieważ mogą one mieć negatywny wpływ na ostre płukanie metanolem wymagane w protokole iDISCO+. Listę przeciwciał, które okazały się skuteczne w iDISCO+, można znaleźć na stronie internetowej24.
    1. Zebrać 10 μm zamrożonych skrawków tkanki utrwalonej w PFA na szkiełkach stereologicznych.
    2. Inkubować skrawki w 100% metanolu przez 3 godziny w temperaturze pokojowej.
    3. Ponownie nawodnić się w PBS przed przystąpieniem do standardowych protokołów immunohistochemicznych w celu ustalenia, czy przeciwciało wykazuje oczekiwany wzór fluorescencji po płukaniu metanolem. Do kontroli pozytywnej należy użyć szkiełka, które nie zostało poddane działaniu metanolu.
  2. Przygotowanie buforu
    1. Przygotuj zgodnie z oficjalnym protokołem iDISCO. Patrz Tabela materiałów, aby zapoznać się ze składem i innych roztworów stosowanych w tym protokole.
  3. Wstępnej obróbki
    1. Odwodnić próbkę za pomocą serii metanol/PBS: 20%, 40%, 60%, 80%, 100%; po 1 godzinie w temperaturze pokojowej.
      UWAGA: Stosowanie PBS podczas odwadniania pomaga zapobiegać pękaniu próbek w płukaniach metanolem.
    2. Próbkę przemywać w 100% metanolu przez 1 godzinę, a następnie schłodzić w temperaturze 4 °C przez 1 godzinę przed inkubacją przez noc z wytrząsaniem w 66% DCM/33% metanolu w temperaturze pokojowej.
    3. Umyć próbkę 2x w 100% metanolu w temperaturze pokojowej, a następnie schłodzić w temperaturze 4 °C.
    4. Użyć świeżego 5% H2O2 w metanolu do wybielania próbki przez noc w temperaturze 4 °C.
    5. Ponownie hydratem próbki za pomocą metanolu/PBS serii: 80%, 60%, 40%, 20%, PBS; po 1 godzinie w temperaturze pokojowej i przemywać 2x przez 1 godzinę w PTx.2 w temperaturze pokojowej.
    6. Inkubować próbkę w 1x PBS/0,2% TritonX-100/20% DMSO w temperaturze 37 °C przez noc.
    7. Inkubować próbkę w 1x PBS/0,1% Tween-20/0,1% TritonX-100/0,1% Deoksycholan/0,1% NP40/20% DMSO w temperaturze 37 °C przez noc.
    8. Prać w PTx.2 w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę dwa razy.
  4. Znakowanie immunologiczne
    1. Próbki inkubować w roztworze przepuszczalnym w temperaturze 37 °C przez 2 dni (~48 godzin).
    2. Próbki należy przechowywać w roztworze blokującym w temperaturze 37 °C na 2 dni (~48 h).
    3. Inkubować próbki z przeciwciałem pierwszorzędowym w surowicy PTwH / 5% DMSO / 3% w temperaturze 37 °C przez 4 dni (~96 h) (np. mAb królika(Rb) Brn2/POU3F2 (1:100) i przeciwciało anty-Ctip2 szczur(Rt) (1:400) (tabela materiałów).
    4. Myć 3 x 1 h w PTwH. Prać przez kolejne 2 godziny w PTwH. Pozostawić w roztworze myjącym na noc w temperaturze pokojowej.
    5. Próbki inkubować z przeciwciałem drugorzędowym i barwnikiem jądrowym, takim jak TO-PRO-3, w surowicy PTwH / 3% w temperaturze 37 °C przez 4 dni (~96 godzin; np. kozi anty-Rb(1:50) i (kozioł anty-Rt(1:200)) (Tabela materiałów).
    6. Mycie 3 x 1 h w PTwH Mycie przez kolejne 2 godziny w PTwH. Pozostawić w roztworze myjącym na noc w temperaturze pokojowej.
  5. polana
    1. Odwodnić w serii metanol/PBS -20%, 40%, 60%, 80%, 100%-1 h w temperaturze pokojowej. Inkubować przez 3 godziny, wytrząsając, w 66% DCM / 33% metanolu w temperaturze pokojowej.
      UWAGA: Próbkę można pozostawić na noc w temperaturze pokojowej bezpośrednio po odwodnieniu w 100% metanolu.
    2. Inkubować w 100% DCM przez 15 minut dwa razy w temperaturze pokojowej (z wytrząsaniem) w celu umycia MeOH.
    3. Inkubować w eterze dibenzylowym (DBE) bez wstrząsania w temperaturze pokojowej. Upewnij się, że probówka jest prawie całkowicie wypełniona DBE, aby zapobiec utlenianiu się próbki. Zakończ mieszanie roztworu, odwracając go kilka razy przed obrazowaniem.

5. Obrazowanie za pomocą arkuszy świetlnych

UWAGA: mózgi oczyszczone tkankowo z iDISCO zostały zobrazowane za pomocą mikroskopu z arkuszami świetlnymi, wyposażonego w obiektyw 2X/0,5 NA, komplementarną kamerę półprzewodnikową z tlenku metalu oraz oprogramowanie do obsługi mikroskopu i akwizycji obrazu przy 0,75 x 0,75 x 4 μm/woksel dla punktu czasowego P4, ponieważ pozwalało to na rozdzielczość pojedynczej komórki w korze mózgowej (Rysunek 3A,B).

  1. Przykładowy montaż
    1. Ostrożnie zamontuj próbkę w uchwycie o odpowiednim rozmiarze próbki, tak aby próbka była zorientowana z wymiarem z na głębokości nie większej niż 5,2 mm ze względu na znamionową odległość roboczą mikroskopu z arkuszami świetlnymi (5,7 mm minus 0,5 mm marginesu bezpieczeństwa)25.
    2. Umieść uchwyt w kołysce na próbkę ze śrubą uchwytu pod kątem 45° do wsporników kołyski (Rysunek 1B). Ustaw kołyskę tak, aby ścieżka światła była prostopadła do próbki (Rysunek 1C).
  2. Parametry obrazowania
    1. Ustaw korpus zoomu w mikroskopie na powiększenie 4x lub wyższe, co daje 0,75 μm/piksel.
      UWAGA: Jednokomórkowe analizy obliczeniowe na obrazach z arkuszy świetlnych P4 można wykonać za pomocą dowolnego dostępnego na rynku mikroskopu z arkuszami świetlnymi, który umożliwia rozdzielczość 0,75 x 0,75 x 4 μm/woksel lub wyższą. Niższa rozdzielczość jest wystarczająca dla mózgów w późniejszych punktach czasowych, w których jądra są rzadziej rozmieszczone.
    2. W oprogramowaniu do akwizycji obrazu wybierz pojedynczy arkusz świetlny o NA = ~0,08 (grubość 9 μm/krok 4 μm).
      UWAGA: To ustawienie w połączeniu z poziomym dynamicznym ogniskowaniem umożliwia obrazowanie całego mózgu w rozdzielczości pojedynczej komórki mózgu myszy w rozsądnym czasie. W przypadku mózgu w 4. dobie porodowej (P4) czas akwizycji obrazu szacuje się na 11-15 godzin dla trzech kanałów, w zależności od wielkości mózgu.
    3. Aby zapewnić zachowanie rozdzielczości osiowej na całej szerokości obrazu, wybierz opcję Horizontal Dynamic Focus (Dynamiczne ogniskowanie w poziomie) i zastosuj zalecaną liczbę kroków w zależności od długości fali lasera. W przypadku całego mózgu myszy P4 ustaw dynamiczne ustawianie ostrości w poziomie na 11. Dostosuj precyzyjną ostrość dla każdego kanału w odniesieniu do kanału rejestracji.
      UWAGA: Tutaj kanał TO-PRO-3 (647 nm) jest zarejestrowany w atlasie mózgu myszy rozwojowej Allena, ponieważ oznacza on wszystkie jądra.
    4. Dostosuj moc lasera na kanał w odniesieniu do właściwości kanału.
      UWAGA: Dłuższe fale wymagają większej mocy lasera w porównaniu z krótszymi falami. Na przykład kanał 780 nm musi być obrazowany przy wysokiej mocy lasera (70% - 75%) i niskiej ekspozycji (50 ms), podczas gdy kanał 647 nm wymaga średniej mocy lasera (40% - 45%) i niskiej ekspozycji (50 ms).
    5. Dostosuj szerokość arkusza świetlnego do ~50%, aby upewnić się, że moc arkusza jest optymalnie rozłożona w wymiarze y dla tego rozmiaru próbki.
      UWAGA: W połączeniu z dynamicznym ustawianiem ostrości w poziomie, szerokość arkusza wynosząca 50% zapewnia średni rozkład mocy na obrazie przy zmniejszonym ryzyku fotowybielania25.
    6. Ustaw liczbę kafelków w odniesieniu do rozmiaru próbki z zalecanym nakładaniem się 15% między kafelkami i przechwytuj obrazy dla każdego kanału sekwencyjnie dla każdego stosu w danej pozycji kafelka.

6. Przetwarzanie obrazu za pomocą NuMorph

UWAGA: Potok NuMorph składa się z trzech głównych części do analizy obrazów 3D: wstępnego przetwarzania, analizy i oceny. Te części zostały podzielone odpowiednio na NMp_template.m, NMa_template.m i NMe_template.m, które omówiono poniżej. Dodatkowo dodawany jest NM_setup.m do pobierania i instalowania pakietów oprogramowania potrzebnych do płynnego działania NuMorph. NM_samples.m udostępnia również szablon do wprowadzania informacji o pozyskiwaniu obrazu.

  1. Konfiguracja NuMorph
    1. Pobierz i zainstaluj menedżera środowiska conda dla Linux26. Pobierz i zainstaluj narzędzia do przetwarzania obrazów NuMorph19.
    2. W wierszu poleceń uruchom program Matlab. Uruchom NM_setup.m z NuMorph, aby pobrać i zainstalować pakiety oprogramowania do analizy obrazów potrzebne do analizy.
      UWAGA: Ten krok zapewnia, że środowisko conda jest poprawnie skonfigurowane, a także zapewnia, że wszystkie narzędzia i dodatki potrzebne do uruchomienia każdego z trzech potoków Matlab są poprawnie pobrane i zainstalowane. Najbardziej godne uwagi są tutaj Elastix do uruchamiania rejestracji i 3D-Unet do wykrywania i zliczania komórek.
  2. Określ nazwy próbek, katalogi wejściowe i wyjściowe, informacje o kanałach i parametry obrazowania arkusza świetlnego, edytując plik NM_samples.m.
    UWAGA: W tym przypadku zaleca się dwukrotne sprawdzenie, czy właściwe informacje, zwłaszcza katalog wejściowy obrazu, są prawidłowo określone. Błędy zwykle nie są wywoływane w tym miejscu, dopóki nie zostaną uruchomione kolejne kroki.
  3. Wstępne przetwarzanie obrazu
    1. Regulacja intensywności
      1. W NMp_template ustaw regulację intensywności = true.
        UWAGA: Ustaw wartość true, jeśli wymagana jest regulacja intensywności. Jeśli nie, ustaw regulację intensywności = false. Istnieje również możliwość użycia opcji "aktualizacja" w celu nadpisania poprzednich parametrów korekty.
      2. Ustaw użycie przetworzonych obrazów = false podczas pracy z nowym zestawem obrazów. W przeciwnym razie wskaż wszystkie wcześniej zapisane zestawy danych obrazów w katalogu wyjściowym (np. "wyrównane", "zszyte"), które mają być używane w kolejnych krokach przetwarzania.
        UWAGA: Ta opcja jest dostępna w przypadku, gdy obrazy wejściowe zostały już wstępnie przetworzone. W takim przypadku wstępnie przetworzone obrazy zostaną użyte jako obrazy wejściowe, a opcja zostanie ustawiona na nazwę podkatalogu w katalogu wyjściowym.
      3. Ustaw obrazy zapisu = true.
        UWAGA: Użycie tej opcji gwarantuje, że przetworzone obrazy zostaną zapisane w katalogu wyjściowym; W przeciwnym razie zostaną obliczone i zapisane tylko parametry.
      4. Ustaw zapis próbek = true.
        UWAGA: Ta opcja zapewnia, że przykładowe wyniki są zapisywane dla każdego głównego kroku.
      5. Ustaw opcję Dostosuj cieniowanie płytek = podstawowe, aby zastosować korekcję cieniowania za pomocą algorytmu BaSiC27 lub ręcznie, aby zastosować korekcję cieniowania płytek przy użyciu pomiarów z mikroskopu arkusza świetlnego przy określonych szerokościach arkusza światła.
        UWAGA: Ta opcja koryguje nierównomierne oświetlenie wzdłuż wymiaru y spowodowane kształtem talii prześcieradła.
    2. Wyrównanie kanału obrazu
      1. W NMp_template ustaw wyrównanie kanału = true. Ustaw tę opcję na true, jeśli wymagane jest wyrównanie kanału. Jeśli nie, ustaw wartość false. Ustaw metodę wyrównania kanału na translację (sztywny) lub elastix (niesztywny).
        UWAGA: Metoda translacji wykorzystuje sztywne podejścia do rejestracji 2D do wyrównywania wielu kanałów, podczas gdy metoda elastix wykorzystuje niesztywne B-splajny28 do korygowania dryfu obrotowego, który może wystąpić podczas akwizycji długiego obrazu19.
    3. Iteracyjne łączenie obrazów
      1. W NMp_template ustaw obrazy ściegu = true.
        UWAGA: Ustaw tę opcję na true, jeśli wymagane jest zszywanie.
      2. Ustaw zagęszczenie przesiewania = true.
        UWAGA: Ta opcja służy do dalszego uściślania translacji w xy za pomocą Scale Invariant Feature Transform29.
      3. Ustaw parametry wyrównania obciążenia = true.
        UWAGA: Ta opcja wykorzystuje translacje wyrównania kanałów podczas zszywania. Ta opcja jest zalecana w przypadku obrazowania wielokanałowego. W przeciwnym razie ustaw wartość false.
      4. Ustaw nakładanie = 0,15, aby dopasować nakładanie się kafelków podczas obrazowania.
    4. Aby uruchomić którykolwiek z tych kroków przetwarzania wstępnego, uruchom następujące polecenie w Matlabie poza NMp_template środowiskiem:
      1. Określ nazwę próbki. Ustaw config = NM_config(proces,próbka).
      2. Uruchom dowolny z kroków przetwarzania wstępnego, określając NM_process(config,stage) i określ etap za pomocą intensywności, wyrównania lub ściegu dla dowolnego procesu. Sprawdź katalog wyjściowy dla plików wyjściowych dla każdego z etapów (Rysunek 3 i Rysunek 4).
  4. Analiza obrazu
    1. Przed NuMorph
      1. Zacznij od obrazu atlasu 3D i powiązanego obrazu adnotacji, który przypisuje każdy woksel do określonej struktury.
        UWAGA: W tym miejscu użyto atlasu P4 Allen Developmental Mouse Brain Atlas wygenerowanego z klasy MagellanMapper30.
      2. Wyrównaj zarówno obraz atlasu, jak i plik adnotacji, aby upewnić się, że są prawidłowo dopasowane we właściwej orientacji.
    2. W ramach NuMorph
      UWAGA: Teraz, gdy atlas i jego adnotacje są poprawnie wyrównane, pliki muszą zostać "zmunowane" lub przetworzone w NuMorph, aby można je było zapisać do późniejszego wykorzystania. Aby to zrobić, użyj funkcji munge_atlas, aby określić dane wejściowe, jak pokazano poniżej.
      1. Określ Atlas_file: (ciąg). Podaj pełną ścieżkę do pliku atlasu.
      2. Określ Annotation_file: (ciąg). Podaj pełną ścieżkę do skojarzonych adnotacji.
      3. Określ rozdzielczość: (numerycznie 1x3). Określ rozdzielczość atlasu y,x,z w mikronach na piksel.
      4. Określ orientację: (1 x 3 znaki). Podaj orientację atlasu i upewnij się, że pasuje do układu próbki w kołysce (przednia (a)/tylna (p), górna (s) / dolna (i), lewa (l)/prawa (r)).
      5. Określ półkulę: Określ, która półkula mózgu została zobrazowana ("lewa", "prawa", "oba", "brak").
      6. Określ out_resolution:(int). Określ rozdzielczość izotropową danych wyjściowych atlasu w mikronach. (domyślnie: 25).
      7. Uruchom polecenie "munge_atlas(atlas_file, annotation_file, rozdzielczość, orientacja, półkula)", aby wygenerować adnotacje w formacie munged w /data/annotation_data i kopię obrazu atlasu w /data/atlas.
      8. Przeczytaj strukturę Matlaba i plik atlasu, aby upewnić się, że oba pliki są poprawnie zmiksowane we właściwej orientacji.
        UWAGA: Dodatkowy etap klasyfikacji komórek można przeprowadzić w celu ilościowego określenia typów komórek na podstawie kolokalizacji markerów białkowych znakowanych immunologicznie.
    3. Ponowne próbkowanie
      1. W NMa_template ustaw resample images = true, jeśli wykonujesz rejestrację obrazu w celu odwołania się do atlasu lub wygenerowania woluminów o zmniejszonej rozdzielczości zestawów danych o wysokiej rozdzielczości.
        UWAGA: NMa_template.m będzie używany do ustawiania parametrów ponownego próbkowania, rejestracji, wykrywania jąder i zliczania komórek.
      2. Ustaw rozdzielczość ponownego próbkowania, aby była zgodna z atlas.
        UWAGA: W tym przypadku używana jest rozdzielczość izotropowa 25 μm3/woksel, ponieważ atlas odniesienia ma tę rozdzielczość.
      3. Określ numer kanału, który ma zostać ponownie próbkowany, używając opcji resample channels = [ ].
        UWAGA: W tym miejscu numer kanału jest ustawiony tak, aby odpowiadał kanałowi jądrowemu. Jeśli ta opcja jest pusta, próbkowany zostanie tylko kanał rejestracji.
    4. rejestracja
      1. W NMa_template ustaw register images = true. Ustaw wartość true, jeśli wymagana jest rejestracja. Jeśli nie, ustaw registration = false.
      2. Określ plik atlasu tak, aby był zgodny z plikiem w katalogu atlasu.
      3. Ustaw parametry rejestracji = default.
        UWAGA: Ta opcja wykorzystuje afininę, po której następuje transformacja splajnu B w celu oszacowania zgodności przestrzennej. W przeciwnym razie zdefiniuj nowy zestaw parametrów rejestracji za pomocą Elastix w /data/elastix_parameter_files/atlas_registration.
      4. Ustaw zapisywanie zarejestrowanych obrazów = true.
        UWAGA: Pliki wyjściowe z rejestracji i ponownego próbkowania można pobrać i wizualnie sprawdzić w Matlabie lub innych narzędziach do wizualizacji, takich jak FIJI31.
    5. Wykrywanie jąder, liczenie i klasyfikacja komórek
      UWAGA: Błędy występujące w tym miejscu mogą wynikać z nieprawidłowego określenia pliku adnotacji lub niedopasowania wieku próbki do właściwej adnotacji.
      1. W NMa_template ustaw zarówno liczbę jąder, jak i klasyfikuj komórki = prawda.
      2. Ustaw metodę liczenia = 3dunet.
        UWAGA: Ta opcja umożliwia korzystanie z wytrenowanego modelu 3D-Unet model19. W przeciwnym razie wybierz opcję Hessian, która korzysta z metody wykrywania obiektów blob Hessian.
      3. Ustaw min_intensity, aby zdefiniować minimalny próg intensywności dla wykrywanych obiektów.
        UWAGA: Odpowiedni próg określa się empirycznie na podstawie stosunku sygnału do szumu etykietowania jądrowego.
      4. Ustaw classify_method na dowolny próg, który jest oparty na nienadzorowanej intensywności fluorescencji w pozycjach środka ciężkości lub svm, który modeluje nadzorowany liniowy klasyfikator wektorów nośnych (SVM).
        UWAGA: Ten krok sklasyfikuje wszystkie wykryte komórki do czterech głównych klas z obrazowaniem 3-kanałowym. Za pomocą tego protokołu generowane są wartości Ctip2+/Brn2-, Ctip2-/Brn2+, Ctip2-/Brn2- i wartości odstające.
    6. Etapy analizy
      1. Określ nazwę próbki. Ustaw konfigurację =NM_config(analiza,próbka).
      2. Uruchom dowolny z kroków analizy, określając NM_analyze(config,stage) i określ etap za pomocą polecenia resample, register, count lub classify. Sprawdź katalog wyjściowy dla plików wyjściowych dla każdego z etapów (Rysunek 5).
    7. Klasyfikacja typów komórek i analiza grupowa
      1. W NMe_template ustaw update = true i nadpisz wszystkie poprzednie obliczone statystyki.
        UWAGA: NMe_template.m umożliwia przeprowadzenie analizy grupowej typu komórki w różnych regionach mózgu tego samego analizowanego mózgu.
      2. Ustaw compare_structures_by na indeks, aby porównać według wszystkich unikatowych adnotacji, lub tabelę, aby porównać struktury zgodnie z tabelą.
      3. Ustaw template_file, który określa wszystkie możliwe indeksy struktury i musi istnieć w /annotations.
      4. Ustaw structure_table i określ struktury do oceny.
      5. Określ zliczanie komórek i klasyfikację typów komórek zgodnie z opisem w NMa_template.m.
      6. Ustaw compare_groups, aby określić grupy do porównania.
      7. Ustaw wartość sparowaną na wartość true lub false, aby wykonać sparowany test t lub test t dla dwóch prób.
    8. Uruchom polecenie analysis.
      UWAGA: Aby wykonać ten krok, uruchom następujące polecenie w Matlabie poza środowiskiem NMe_template.m.
      1. Określ nazwę próbki. Ustaw konfigurację =NM_config(oceń,próbka).
      2. Uruchom krok analizy, określając NM_evaluate(config,stage) i określ etap. Sprawdź katalog wyjściowy pod kątem plików wyjściowych dla analizy grupy.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ponieważ protokół iDISCO+ wprowadza znaczne zmniejszenie tkanki, które jest łatwo zauważalne gołym okiem (Rysunek 2B), dodaliśmy do tego procesu etap MRI przed oczyszczaniem tkanek, aby określić ilościowo skurcz wywołany przez oczyszczanie tkanki. Przepływ pracy rozpoczyna się od usunięcia tkanki innej niż mózgowa z obrazu MR (Rysunek 2C). Następnie stosuje się sztywną transformację (3 kąty przesunięcia i 3 kąty obrotu) w celu wyrównania obrazu MR do obrazu z arkusza świetlnego (

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Metody oczyszczania tkanek są przydatnymi technikami pomiaru organizacji komórkowej 3D mózgu. W literaturze opisano wiele metod oczyszczania tkanek, z których każda ma swoje zalety i ograniczenia 6,7,8,9. Możliwości narzędzi obliczeniowych do analizy typów komórek na obrazach oczyszczonych z tkanek są stosunkowo ograniczone. Inne dostępne narzędzia zostały wdrożone w celu zmniejszenia rzadkich ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez NIH (R01MH121433, R01MH118349 i R01MH120125 do JLS oraz R01NS110791 do GW) oraz Fundację Nadziei. Dziękujemy Pablo Arielowi z Laboratorium Usług Mikroskopowych za pomoc w obrazowaniu próbek. Laboratorium Usług Mikroskopowych na Wydziale Patologii i Medycyny Laboratoryjnej jest częściowo wspierane przez Cancer Center Core Support Grant P30 CA016086 dla University of North Carolina (UNC) Lineberger Comprehensive Cancer Center. Neuroscience Microscopy Core jest wspierany przez grant P30 NS045892. Badania opisane w tej publikacji były częściowo wspierane przez North Carolina Biotech Center Institutional Support Grant 2016-IDG-1016.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Skaner MRI Bruker 9,4 T/30 cmBruker BiospecSystem rezonansu magnetycznego zwierząt z otworem poziomym
Eter dibenzylowySigma-Aldrich108014-1KG
Dichlorometan (DCM)Sigma-Aldrich270997-1L
Dimetylosulfotlenek (DMSO)Fisher-ScientificICN19605590
Serum dla osłaSigma-AldrichS30-100ML
EVO 860 4TB zewnętrzny dysk SSD
Fomblin YSpeciality Fluids CompanyYL-VAC-25-6perfluoropolieterowy środek
kontrastowy gadolinu (ProHance)Bracco DiagnosticsA9576
gadolinowy środek kontrastowy (ProHance)Bracco Diagnostics0270-1111-03
Karta graficzna GeForce GTX 1080 Ti 11GB EVGA08G-P4-6286-KR
GlicynaSigma-AldrichG7126-500G
Sól sodowa heparynySigma-AldrichH3393-10KURozpuszczona w H2O do 10 mg/ml
Roztwór nadtlenku wodoru, 30%Sigma-AldrichH1009-100ML
Oprogramowanie do akwizycji obrazówmikroskopu ImSpector ProLaVision BioTec
Oprogramowanie do segmentacjiITK Snap
MetanolFisher-ScientificA412SK-4
MVPLAPO 2x/0.5 NA ObiektywOlympus
Paraformaldehyd, proszek, 95% (PFA)Sigma-Aldrich30525-89-4rozpuszczony w 1x PBS do 4%
Sól fizjologiczna buforowana fosforanem 10x (PBS)Corning46-013-CMRozcieńczony do 1x w H2O
Azydek soduSigma-AldrichS2002-100GRozpuszczony w H2O do 10%
Deoksycholan soduSigma-AldrichD6750-10G
Tergitol typ NP-40Sigma-AldrichNP40S-100ML
TritonX-100Sigma-AldrichT8787-50ML
Tween-20Fisher-ScientificBP337 500
Ultramikroskop II Mikroskop arkuszowy światłaLaVision BioTec
Xeon Procesor E5-2690 v4IntelE5-2690
Zyla sCMOSKamera iorKomplementarna kamera półprzewodnikowa z tlenkiem metalu
Przeciwciało< / silny>Stężenie robocze< / silny>
Alexa Fluor Goat 790 Anti-RabbitThermofisher ScientificA11369(1:50)
Alexa Fluor Goat 568 Anti-RatThermofisher ScientificA11077(1:200)
Szczur anty-Ctip2Abcamab18465(1:400)
Technologia sygnalizacji komórkowejkrólika anty-Brn212137(1:100)
To-Pro 3 (TP3)Thermofisher ScientificT3605(1:400)

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dodt, H. U., et al. Ultramicroscopy: Three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nature Methods. 4 (4), 331-336 (2007).
  2. Hägerling, R., et al. A novel multistep mechanism for initial lymphangiogenesis in mouse embryos based on ultramicroscopy. The EMBO Journal. 32 (5), 629-644 (2013).
  3. Tomer, R., Khairy, K., Keller, P. J. Shedding light on the system: studying embryonic development with light sheet microscopy. Current Opinion in Genetics & Development. 21 (5), 558-565 (2011).
  4. Li, A., et al. Micro-optical sectioning tomography to obtain a high-resolution atlas of the mouse brain. Science. 330 (6009), 1404-1408 (2010).
  5. Stoner, R., et al. Patches of disorganization in the neocortex of children with autism. The New England Journal of Medicine. 370 (13), 1209-1219 (2014).
  6. Renier, N., et al. IDISCO: A simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
  7. Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
  8. Richardson, D. S., et al. Tissue clearing. Nature Reviews. Methods Primers. 1 (1), 84(2021).
  9. Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying tissue clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
  10. Renier, N., et al. Mapping of brain activity by automated volume analysis of immediate early genes. Cell. 165 (7), 1789-1802 (2016).
  11. Santi, P. A. Light sheet fluorescence microscopy: a review. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 59 (2), 129-138 (2011).
  12. Girkin, J. M., Carvalho, M. T. The light-sheet microscopy revolution. Journal of Optics. 20 (5), 053002(2018).
  13. Budday, S., et al. Mechanical properties of gray and white matter brain tissue by indentation. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 46, 318-330 (2015).
  14. Johnson, G. A., et al. High-throughput morphologic phenotyping of the mouse brain with magnetic resonance histology. NeuroImage. 37 (1), 82-89 (2007).
  15. Herculano-Houzel, S., Mota, B., Lent, R. Cellular scaling rules for rodent brains. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (32), 12138-12143 (2006).
  16. Matsumoto, K., et al. Advanced CUBIC tissue clearing for whole-organ cell profiling. Nature Protocols. 14 (12), 3506-3537 (2019).
  17. Fürth, D., et al. An interactive framework for whole-brain maps at cellular resolution. Nature Neuroscience. 21 (1), 139-149 (2018).
  18. Chandrashekhar, V., et al. CloudReg: automatic terabyte-scale cross-modal brain volume registration. Nature Methods. 18 (8), 845-846 (2021).
  19. Krupa, O., et al. NuMorph: Tools for cortical cellular phenotyping in tissue-cleared whole-brain images. Cell Reports. 37 (2), 109802(2021).
  20. Petiet, A., Delatour, B., Dhenain, M. Models of neurodegenerative disease - Alzheimer's anatomical and amyloid plaque imaging. Methods in Molecular Biology. 771, 293-308 (2011).
  21. Jenkinson, M., Beckmann, C. F., Behrens, T. E. J., Woolrich, M. W., Smith, S. M. FSL. NeuroImage. 62, 782-790 (2012).
  22. Jenkinson, M., Bannister, P., Brady, M., Smith, S. Improved optimization for the robust and accurate linear registration and motion correction of brain images. NeuroImage. 17 (2), 825-841 (2002).
  23. Avants, B. B., Epstein, C. L., Grossman, M., Gee, J. C. Symmetric diffeomorphic image registration with cross-correlation: evaluating automated labeling of elderly and neurodegenerative brain. Medical Image Analysis. 12 (1), 26-41 (2008).
  24. iDISCO method. , Available from: https://idisco.info/ (2022).
  25. Ariel, P. UltraMicroscope II - A User Guide. University of North Carolina at Chapel Hill. , UniversityLibraries. Chapel Hill (NC). (2019).
  26. Anaconda Distribution - Anaconda documentation. , Available from: https://docs.anaconda.com/anaconda/ (2022).
  27. Peng, T., et al. A BaSiC tool for background and shading correction of optical microscopy images. Nature Communications. 8, 14836(2017).
  28. Klein, S., Staring, M., Murphy, K., Viergever, M. A., Pluim, J. P. W. elastix: a toolbox for intensity-based medical image registration. IEEE Transactions on Medical Imaging. 29, 196-205 (2010).
  29. Lowe, G. Sift-the scale invariant feature transform. International Journal. 2 (91-110), 2(2004).
  30. Young, D. M., et al. Whole-brain image analysis and anatomical atlas 3D generation using MagellanMapper. Current Protocols in Neuroscience. 94 (1), Editorial Board, Jacqueline N. Crawley ... [et al] 104(2020).
  31. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  32. Velíšek, L. Under the (Light) sheet after the iDISCO. Epilepsy Currents / American Epilepsy Society. 16 (6), 405-407 (2016).
  33. ITK-SNAP home. , Available from: http://www.itksnap/org/pmwiki/pmwiki.php (2022).
  34. Young, D. M., et al. Constructing and optimizing 3D atlases from 2D data with application to the developing mouse brain. eLife. 10, (2021).
  35. Yun, D. H., et al. Ultrafast immunostaining of organ-scale tissues for scalable proteomic phenotyping. bioRxiv. , (2019).
  36. Silvestri, L., et al. Universal autofocus for quantitative volumetric microscopy of whole mouse brains. Nature Methods. 18 (8), 953-958 (2021).
  37. Frasconi, P., et al. Large-scale automated identification of mouse brain cells in confocal light sheet microscopy images. Bioinformatics. 30 (17), 587(2014).
  38. Kruskal, J. B. On the shortest spanning subtree of a graph and the traveling salesman problem. Proceedings of the American Mathematical Society. American Mathematical Society. 7 (1), 48-50 (1956).
  39. Wang, Q., et al. The allen mouse brain common coordinate framework: A 3D reference atlas. Cell. 181, 936-953 (2020).
  40. Borland, D., et al. Segmentor: a tool for manual refinement of 3D microscopy annotations. BMC Bioinformatics. 22 (1), 260(2021).
  41. Kumar, A., et al. Dual-view plane illumination microscopy for rapid and spatially isotropic imaging. Nature Protocols. 9 (11), 2555-2573 (2014).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Whole Brain ImagingTissue ClearingLight Sheet MicroscopySingle Cell AnalysisNeonatal Mouse BrainMRI Brain ImagingNuclei Quantification3D Brain AtlasCell Type ClassificationImage Stitching

Related Articles