Method Article

Połączenie siłownika siły magnetycznej 3D i wielofunkcyjnego obrazowania fluorescencyjnego w celu badania mechanobiologii jądra

DOI:

10.3791/64098

⸱

July 5th, 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Mechanical and Aerospace Engineering, Herbert Wertheim College of Engineering, University of Florida, 2Department of Materials Science and Engineering, University of Florida, 3Department of Biostatistics, University of Florida, 4Department of Biomedical Engineering, College of Engineering (COE), University of Delaware (UD), 5UF Health Cancer Center, University of Florida, 6Department of Physics, College of Liberal Arts and Sciences, University of Florida, 7Department of Anatomy and Cell Biology, College of Medicine, University of Florida, 8J. Crayton Pruitt Family Department of Biomedical Engineering, University of Florida, 9Department of Physiology and Functional Genomics, University of Florida

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie przedstawia nowy protokół bezpośredniego przykładania siły mechanicznej do jądra komórkowego za pomocą mikrokulek magnetycznych dostarczanych do cytoplazmy i jednoczesnego obrazowania fluorescencyjnego żywych komórek.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fundamentalnym pytaniem w mechanobiologii jest to, jak żywe komórki odbierają zewnętrzne bodźce mechaniczne w kontekście fizjologii i patologii komórki. Uważa się, że mechano-odczucie zewnątrzkomórkowe bodźców mechanicznych odbywa się za pośrednictwem receptorów błonowych, powiązanego kompleksu białkowego i cytoszkieletu. Ostatnie postępy w mechanobiologii pokazują, że jądro komórkowe w cytoplazmie samo w sobie może niezależnie odczuwać bodźce mechaniczne jednocześnie. Brakuje jednak mechanistycznego zrozumienia, w jaki sposób jądro komórkowe wyczuwa, przekształca i reaguje na bodźce mechaniczne, głównie z powodu wyzwań technicznych związanych z dostępem i ilościowym określeniem mechaniki jądra za pomocą konwencjonalnych narzędzi. W artykule opisano projekt, produkcję i wdrożenie nowego siłownika siły magnetycznej, który stosuje precyzyjne i nieinwazyjne bodźce mechaniczne 3D do bezpośredniego deformowania jądra komórkowego. Wykorzystując komórki zmodyfikowane za pomocą CRISPR/Cas9, badanie to pokazuje, że narzędzie to, w połączeniu z konfokalnym obrazowaniem fluorescencyjnym o wysokiej rozdzielczości, umożliwia ujawnienie w czasie rzeczywistym dynamiki mechano-wrażliwego białka związanego z tak (YAP) w pojedynczych komórkach w funkcji deformacji jądra. Ta prosta metoda ma potencjał, aby wypełnić obecną lukę technologiczną w społeczności mechanobiologii i dostarczyć odpowiedzi na lukę w wiedzy, która istnieje w związku między mechanotransdukcją jądra a funkcją komórki.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie ma na celu opracowanie i zastosowanie nowej techniki do wyjaśnienia mechanobiologii jądra poprzez połączenie magnetycznych siłowników, które przykładają siłę mechaniczną bezpośrednio do jądra komórkowego i konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej, która jednocześnie obrazuje strukturalne i funkcjonalne zmiany subkomórkowe. Komórki wyczuwają zewnątrzkomórkowe sygnały biofizyczne, w tym sztywność tkanki1,2,3,4, ciśnienie płynu śródmiąższowego i naprężenie ścinające5,6,7, topologia powierzchni/geometria8,9,10,11,12, oraz naprężenie rozciągające/ściskające13,14,15,16. Sygnały biofizyczne są przekształcane w sygnały biochemiczne i wywołują potencjalne zmiany w ekspresji genów i zachowaniu komórek - proces znany jako mechanotransdukcja17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27. Aby badać procesy mechanotransdukcji, opracowano niezliczone techniki wywierania siły mechanicznej na komórki, takie jak mikroskopia sił atomowych28, urządzenie do rozciągania komórek29, bio-MEMS (systemy mikroelektromechaniczne) czujnik siły15,30,31, reologia ścinania32 i Stereo Vision System33. Niedawny przegląd podsumowuje podejścia do stosowania zewnątrzkomórkowych sygnałów mechanicznych i zakłócania mechanosensingu34. Do tej pory większość tych metod wywiera siłę na błonę plazmatyczną komórki, a komórki bezpośrednio odbierają te zewnątrzkomórkowe sygnały biofizyczne za pośrednictwem receptorów błonowych, takich jak integryna, kadheryna, kanały jonowe i receptory sprzężone z białkiem G. Następnie przekazują sygnał do wewnątrzkomórkowego cytoszkieletu i jądra. Na przykład, wykorzystując translokację białka związanego z tak (YAP) jako wskaźnik wykrywania mechanicznego, wykazano, że komórki wyczuwają mechaniczne sygnały sztywności substratu i napięcia zewnątrzkomórkowego z błony komórkowej i przekazują je przez cytoszkielet do jądra w celu wywołania translokacji cytoplazmy YAP do jądra28,35.

Ostatnie dowody sugerują, że jądro komórkowe samo w sobie jest niezależnym czujnikiem mechanicznym8,36,37. Dowodzi tego eksperymenty przeprowadzone na wyizolowanym jądrze pobranym z komórek, w których wykazano, że jądra adaptacyjnie zmieniają swoją sztywność w odpowiedzi na siłę mechaniczną przyłożoną bezpośrednio do nich36. W wielu stanach fizjologicznych jądra zarówno w komórkach nowotworowych, jak i zdrowych wyczuwają zewnątrzkomórkowe sygnały biofizyczne i zmieniają swoje właściwości mechaniczne i złożenia38,39,40. Na przykład po wynaczynieniu sztywność jądrowa komórek nowotworowych zmniejsza się i utrzymuje miękkość przez ponad 24 h38. Podczas migracji przez ograniczoną przestrzeń śródmiąższową jądra komórek nowotworowych często tracą i odzyskują swoją integralność strukturalną39. Jednak sposób, w jaki jądro wyczuwa sygnał biofizyczny, jest nieznany, chociaż stwierdzono, że zaangażowanych jest kilka białek otoczki jądrowej i rodzin białek, takich jak Lamin A/C i łącznik nukleoszkieletu i cytoszkieletu (LINC) complex38,41. W związku z tym nowe nieinwazyjne metody, które mogą bezpośrednio przyłożyć siłę do jądra, rozprzęgną efekt przenoszenia siły z błony komórkowej i cytoszkieletu plazmatycznego oraz pomogą wyjaśnić wcześniej niedostępne mechanizmy molekularne mechanodetekcji jądrowej.

Badania, które wykorzystywały pęsetę optyczną do manipulowania organellami42 i mikrogranulki wstrzyknięte do komórek43 wykazały technologiczną zdolność bezpośredniego oddziaływania siły na jądro. Jednak technika pęsety optycznej ma kilka ograniczeń: (1) pęseta optyczna o niskiej przepustowości często manipuluje tylko jedną komórką lub mikrokulką na raz; oraz (2) potencjalne fotouszkodzenia i deformacje artefaktów temperaturowych jądra wymagają dziesiątek pN36, a odpowiednia niezbędna moc lasera wynosi około 10 mW na pN44,45. Taka intensywność lasera jest wystarczająca, aby wywołać fotouszkodzenia w komórkach i zakłócić funkcje komórek podczas eksperymentu46.

Siła magnetyczna przyłożona przez mikrogranulki w żywych komórkach pokazuje potencjał do bezpośredniego przyłożenia siły do jądra i pokonuje ograniczenia pęsety optycznej. Gdy mikrogranulki zostaną dostarczone do cytoplazmy, pole magnetyczne może wywierać siłę magnetyczną na wiele mikrokulek jednocześnie w sposób wysokoprzepustowy. Pole magnetyczne nie wpływa na funkcje komórki47, ale generuje siłę od pN do nN, która wystarcza do wywołania deformacji jądrowej36,48,49. Do tej pory manipulacja mikrogranulkami magnetycznymi była stosowana na błonie komórkowej plazmatycznej48, wewnątrz cytoplazmy50, na F-aktynie51, wewnątrz jądra47, a na izolowanym jądrze36. Jednak manipulacja magnetyczna mikrokulkami nigdy nie została wykorzystana do przyłożenia bezpośredniej siły mechanicznej do otoczki jądrowej w celu zbadania mechanotransdukcji w jądrze.

W tym artykule opracowano prostą technikę nieinwazyjnego dostarczania mikrokulek magnetycznych do cytoplazmy i używania tych mikrokulek do wywierania siły mechanicznej na jądro (Rysunek 1). W tym przypadku do walidacji metody wykorzystano zmodyfikowane przez CRISPR/Cas9 ludzkie normalne linie komórkowe B2B, które endogennie eksprymują mNeonGreen21-10/11-taged YAP. YAP jest białkiem wrażliwym na mechano, a translokacja YAP jest regulowana przez mechano-sensing jądrowy14,28. Podejście knock-in regulowane przez CRISPR/Cas9 zostało wybrane do oznaczania endogennego YAP białkiem fluorescencyjnym (FP) mNeonGreen21-10/11. Chociaż wiadomo, że edycja CRISPR ma niepełną wydajność i efekt niezamierzony, protokoły w poprzednich publikacjach integrowały sortowanie fluorescencyjne w celu wybrania prawidłowego wstawiania ramki odczytu otwartego52,53,54. Dzięki tej dodatkowej warstwie selekcji nie zaobserwowano żadnego zdarzenia tagowania poza celem w 20+ wcześniej wygenerowanych liniach komórkowych52,53,54,55. Jest to rozszczepiony konstrukt białka fluorescencyjnego, ale w zasadzie każdy wyrażalny znacznik fluorescencyjny może być użyteczny. Takie podejście do znakowania jest lepsze od metod transgenowych lub przeciwciał. Po pierwsze, w przeciwieństwie do ekspresji transgenu, znakowane białko utrzymuje dawkę pojedynczej kopii genu i ulega ekspresji w fizjologicznym kontekście natywnej sieci regulacyjnej genów, ograniczając odchylenia w stężeniu, lokalizacji i interakcji białka. Metoda tagowania zastosowana w tym badaniu osiąga o ponad rząd wielkości wyższą przepustowość i wydajność niż pełne znakowanie FP. Pozwala to również uniknąć wyzwań związanych z immunofluorescencją spowodowanych artefaktami wiązania i ograniczoną dostępnością wysokiej jakości przeciwciał o wysokiej swoistości. Po drugie, podejście zastosowane w tym artykule minimalizuje zakłócenia w fizjologii komórki i umożliwia autentyczne ujawnienie w czasie rzeczywistym wszystkich endogennych YAP. W przeciwieństwie do tego, inne popularne metody transgenowe często prowadzą do nadekspresji YAP. Wynikająca z tego sztuczna dystrybucja może potencjalnie powodować cytotoksyczność i wpływać na mechano-wykrywanie komórek56,57,58.

To badanie przedstawia protokół bezpośredniego przykładania siły do jądra za pomocą magnetycznych mikrokulek dostarczanych do cytoplazmy i jednoczesnego przeprowadzania obrazowania fluorescencyjnego żywych komórek. Podsumowując, przedstawione tutaj protokoły pokazują, jak (1) dostarczać mikrogranulki magnetyczne do komórki na zewnątrz jądra, (2) manipulować mikrokulkami w celu przyłożenia siły magnetycznej do jądra, (3) wykonywać konfokalne obrazowanie fluorescencyjne komórek podczas manipulacji oraz (4) ilościowo analizować stosunek jądra YAP do cytoplazmy (N / C) w całym procesie przyłożenia siły. Wyniki sugerują, że (1) poprzez endocytozę mikrogranulki magnetyczne mogą być nieinwazyjnie dostarczane do cytoplazmy komórek B2B w ciągu 7 godzin (Rysunek 2 i Rysunek 3); oraz (2) sama w sobie określona ilościowo siła magnetyczna przyłożona bezpośrednio do jądra ( Rysunek 4, Rysunek 5 i Rysunek 6) mogą wywołać różne zmiany stosunku YAP N/C w komórkach B2B zaprojektowanych przez CRISPR/Cas9 (Rysunek 7 i Rysunek 8).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Konserwacja komórek B2B zaprojektowanych przez CRISPR/Cas9

  1. Hodowla komórek B2B w kolbie T25 z RPMI-1640 uzupełniona 10% płodową surowicą bydlęcą i 1% penicyliną-streptomycyną.
  2. Utrzymuj komórki B2B w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .
  3. Subkulturuj komórki B2B, gdy zbieg osiąga 70% do 80%.
  4. Przechowuj linię komórkową B2B w pożywce hodowlanej RPMI-1640 z 10% (v/v) DMSO w zamrażarce o temperaturze -80 °C.
  5. W eksperymentach należy używać komórek B2B o numerze przejścia mniejszym niż 10.

2. Hodowla komórkowa

  1. Wysiewaj komórki na szalce Petriego ze szklanym dnem.
    1. Przenieś kolbę zawierającą komórki B2B z inkubatora do komory bezpieczeństwa biologicznego.
    2. Usunąć pożywkę hodowlaną z kolby za pomocą pipety zasysającej z podłączoną pompą próżniową.
    3. Przemyć kolbę 2 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).
    4. Usunąć PBS za pomocą pipety zasysającej.
    5. Dodać 0,5 ml 0,05% roztworu trypsyny, aby oderwać komórki od dna podłoża kolby.
    6. Umieścić kolbę w inkubatorze na 5 minut.
    7. Przenieść kolbę do szafy bezpieczeństwa biologicznego. Dodać 5 ml nowej pożywki hodowlanej do kolby i pipetować roztwór w górę i w dół.
    8. Umieścić 50 μl pożywki z komórkami (300 komórek/μl) na szalce Petriego ze szklanym dnem. Dodać 2 ml pożywki hodowlanej do szalki Petriego.
    9. Umieścić szalkę Petriego w inkubatorze. Poczekaj 12 godzin, aż ogniwa się przyczepią.
  2. Hoduj komórki za pomocą mikrokulek magnetycznych.
    1. Odważyć 0,2 g mikrokulek karbonylożelaza o średniej średnicy 7 μm (zwanych dalej mikrogranulkami 7 μm, patrz tabela materiałów).
    2. Za pomocą pipety zawiesić mikrogranulki w 1 ml pożywki hodowlanej RPMI-1640.
    3. Zanieś szalkę Petriego z komórkami B2B do szafy bezpieczeństwa biologicznego.
    4. Dodać 200 μl pożywki zawierającej mikrogranulki do szalki Petriego.
      UWAGA: Szybko dodaj pożywkę, aby uniknąć wytrącania się mikrogranulek.
    5. Umieść szalkę Petriego z powrotem w inkubatorze, aż mikrogranulki zostaną zinternalizowane przez komórki. Sprawdzaj internalizację co 6 godzin, aby określić optymalny czas internalizacji dla różnych linii komórkowych.
    6. Aby sprawdzić internalizację, wykonaj konfokalne obrazowanie fluorescencyjne, aby uwidocznić granicę mikrokulki, jądra i komórki. Jeśli mikrokulka zostanie zinternalizowana przez komórkę, znajdzie się w granicach komórki.

3. Wizualizacja jądra

  1. Ogrzewać 1,5 ml pożywki hodowlanej w inkubatorze przez 15 minut.
  2. Wyłącz światło w szafie bezpieczeństwa biologicznego. Weź szalkę Petriego, która zawiera komórkę, podgrzaną pożywkę hodowlaną, barwienie jądrowe i HCl werapamilu do szafki bezpieczeństwa biologicznego.
    UWAGA: Elementy do barwienia jądrowego są wrażliwe na światło. Unikaj ekspozycji na światło podczas pracy.
  3. Rozcieńczyć 1000x barwienie jądrowe przez DMSO do 100x.
  4. Rozcieńczyć 100 mM Verapamil HCl przez DMSO do 10 mM.
  5. Dodaj 15 μl 100x barwienia jądrowego i 15 μl 10 mM HCl werapamilu do 1,5 ml pożywki hodowlanej. Dobrze wymieszaj, pipetując w górę i w dół.
  6. Usunąć pożywkę hodowlaną z szalki Petriego. Dodać pożywkę zawierającą barwienie jądrowe do szalki Petriego.
  7. Umieść komórki z powrotem w inkubatorze na ponad 2 godziny.

4. Przygotowanie sprzętu do przyłożenia siły magnetycznej

  1. Wydrukuj wszystkie części w 3D za pomocą akrylonitrylu-butadienu i styrenu (ABS) i zmontuj je zgodnie z projektem CAD (Rysunek 1A). Projekt CAD znajduje się w Tabeli Materiałów.
  2. Użyj taśmy dwustronnej, aby przymocować magnes do urządzenia poruszającego magnesem (Rysunek 1A).
  3. Ustaw urządzenie poruszające magnesem obok stolika mikroskopu. Użyj trzech pokręteł, aby dostosować przestrzenne położenie magnesu, aż będzie mógł poruszać się nad szalką Petriego w zakresie od 13 mm do 120 mm.
    UWAGA: Upewnij się, że górna granica odległości między magnesem a szalką Petriego jest jak największa, aby uniknąć niepożądanego przyłożenia siły do mikrokulek magnetycznych. 120 mm to maksymalna wartość w tej eksperymentalnej konfiguracji. Upewnij się, że magnes nie koliduje z częściami mikroskopu, w tym obiektywami i zmotoryzowanymi stolikami.
  4. Ustaw magnes w najwyższym położeniu z (na 120 mm).

5. Zastosowanie siły i obrazowanie żywych komórek

  1. Konfiguracja komory środowiskowej do obrazowania długoterminowego
    1. Zastosuj 75% roztwór etanolu, aby dokładnie wysterylizować i wyczyścić komorę środowiskową.
    2. Umieść komorę środowiskową na zmotoryzowanym stoliku mikroskopu odwróconego.
    3. Otwórz zbiornik CO2 i ustaw natężenie dopływu CO2 na 160 ml/min.
    4. Dostosuj temperaturę komory do 44 °C (góra), 42 °C (kąpiel) i 40 °C (Stage).
    5. Dodaj 20 ml oczyszczonej wody do kąpieli w komorze środowiskowej, aby utrzymać wilgotność 90%.
    6. Wyjąć szalkę Petriego ze szklanym dnem, która zawiera komórki docelowe, z inkubatora do hodowli tkankowych i umieścić ją w komorze
      7. .
    7. Zastosuj metalowy zacisk komory środowiskowej, aby ustalić pozycję szalki Petriego.
      UWAGA: Szalka Petriego musi być mocno zaciśnięta w komorze, ponieważ siła magnetyczna może przesunąć szalkę, jeśli nie jest ona zaciśnięta.
    8. Zamknij pokrywę komory.
  2. Optymalizacja parametrów obrazowania
    1. Zoptymalizuj rozmiar otworka: Otwór blokuje nieostre fotony. Większy rozmiar otworka daje więcej nieostrych fotonów, ale jaśniejszy obraz. Mniejszy rozmiar otworka zapewnia bardziej ostry i ciemniejszy obraz. Upewnij się, że zoptymalizujesz rozmiar otworka, aby uzyskać ostre obrazy konfokalne z odpowiednim stosunkiem sygnału do szumu.
    2. Zoptymalizuj intensywność lasera: Intensywność lasera określa intensywność wzbudzenia, a tym samym emisji światła. Niska intensywność lasera zapewnia niski stosunek sygnału do szumu. Zbyt duże natężenie lasera spowoduje fotowybielanie. Dostosuj odpowiednio intensywność lasera.
    3. Zoptymalizuj rozmiar kroku i kroki: Kroki i rozmiar kroku określają, ile obrazów zajmie stos Z. Mniejsze rozmiary kroków i więcej kroków zwiększą rozdzielczość stosu Z, ale także zwiększą fotowybielanie. W tym eksperymencie zastosowano rozmiar kroku 1 μm dla komórek o wysokości komórki ~15 μm.
    4. Zoptymalizuj czas ekspozycji: Czas ekspozycji określa, jak długo komórka będzie wystawiona na działanie lasera wzbudzającego. Krótki czas ekspozycji zmniejszy stosunek sygnału do szumu. Długi czas naświetlania spowoduje fotowybielanie. W tym eksperymencie zastosowano czas naświetlania wynoszący 1 klatkę na 4 s.
    5. Optymalizacja parametrów obrazowania: Zmieniaj jeden z czterech parametrów iteracyjnie i utrzymuj spójność pozostałych parametrów. Za każdym razem zmierz współczynnik YAP N/C każdego obrazu i porównaj zmianę współczynnika YAP N/C, aby określić poziom fotowybielania. Powtarzaj proces optymalizacji, aż do uzyskania równowagi między stosunkiem sygnału do szumu, szybkością obrazowania i fotowybielaniem.
    6. Zdefiniuj konfiguracje obrazowania przy użyciu zoptymalizowanych parametrów obrazowania, aby przyspieszyć ustawienia obrazowania podczas eksperymentów.
      UWAGA: Konfiguracje zastosowane w tym badaniu opisano w punkcie 5.3 parametrów obrazowania. Aby zoptymalizować parametry obrazowania konfiguracji w sekcji 5.3, należy zastosować tę samą metodę, co w kroku 5.2.5.
  3. Przyłożenie małej siły i obrazowanie konfokalne
    UWAGA: W tym badaniu do obrazowania użyto mikroskopu Nikon Ti2-E, a szczegółowe kroki pozyskiwania obrazu podano poniżej.
    1. Otwórz odwrócony mikroskop. Otwórz aplikację Elements.
    2. Zdefiniuj konfigurację magnetic_find. Sprawdź tylko kanał FITC. Ustaw PMT HV = 70, Przesunięcie = 0, Natężenie lasera = 10. Ustaw szybkość skanowania na 1 klatkę na 2 s, klikając przycisk 1/2. Ustaw rozmiar otworka na 1.2 AU, klikając przycisk 1.2 AU. Ta konfiguracja zostanie użyta w kroku 5.3.5.
    3. Zdefiniuj konfigurację magnetic_YAP_Nucleus. Sprawdź kanał FITC. Ustaw PMT HV = 70, Przesunięcie = 0, Natężenie lasera = 10. Ustaw prędkość skanowania na 1 klatkę na 4 s, klikając przycisk 1/2. Ustaw rozmiar otworka na 1.2 AU, klikając przycisk 1.2 AU. Aby zobrazować granicę jądra i intensywność barwienia jądrowego, sprawdź kanał Cy5. Ustaw PMT HV = 70, Przesunięcie = 0, Natężenie lasera = 10. Rozmiar otworka jest zoptymalizowany pod kątem obrazowania 3D YAP. Nie klikaj ponownie przycisku 1.2 AU po sprawdzeniu kanału Cy5. Ta konfiguracja zostanie użyta w kroku 5.3.7.
    4. W razie potrzeby włącz DIA za pomocą Elements. Otwórz aplikację SpinView, użyj jasnego pola i dostosuj ostrość obiektu, aby uzyskać wyraźny obraz komórek z ostrością. Użyj obiektywu 10x, aby znaleźć odpowiednie wiele pojedynczych komórek w trzech warunkach: z pojedynczą mikrokulką w środku, z wieloma mikrokulkami w środku i bez żadnej mikrokulki w środku. Przełącz się na obiektyw 40x. Nazwij to stanowisko, podając odpowiedni numer stanowiska.
    5. Otwórz Elementy. Kliknij magnetic_find. Kliknij przycisk Usuń blokadę.
    6. Kliknij przycisk Skanuj i dostosuj pozycję Z płaszczyzny ogniskowej. Kliknij przyciski Góra i Dół, aby ustawić dolny i górny limit stosu Z zaznaczonych komórek. Zatrzymaj skanowanie, klikając ponownie przycisk Skanuj.
    7. Przełącz się na konfigurację magnetic_YAP_Nucleus. Ustaw nazwę pliku na before_small_force.nd2. Kliknij przycisk Uruchom z nagranym stosem Z.
    8. Przełącz się na właściwą ścieżkę światła i włącz DIA. Otwórz SpinView i kliknij przycisk Nagrywanie. W międzyczasie przekręć pokrętło urządzenia poruszającego magnes, aby przesunąć magnes w dół do 46 mm nad dnem szalki Petriego. Zapisz sekwencję obrazów lub wideo w jasnym polu. Sprawdź wideo, aby potwierdzić, że mikrokulki wykazują przemieszczenie wywołane siłą magnetyczną.
    9. Powtórz kroki 5.3.5-5.3.7; ustaw nazwę pliku na after_small_force.nd2.
    10. Przełącz się na właściwą ścieżkę światła i włącz DIA. Następnie otwórz SpinView i kliknij przycisk Nagrywanie. W międzyczasie obróć pokrętło urządzenia poruszającego magnes, aby przesunąć magnes do 120 mm nad dnem szalki Petriego. Zapisz sekwencję obrazów lub wideo w jasnym polu.
    11. Powtórz kroki 5.3.5-5.3.7 i ustaw nazwę pliku na before_large_force.nd2.
  4. Przyłożenie dużej siły i obrazowanie konfokalne
    1. Zdejmij pokrywę komory środowiskowej, aby magnes sięgał 13 mm ponad dno szalki Petriego.
    2. Przełącz się na właściwą ścieżkę światła i włącz DIA. Otwórz SpinView i kliknij przycisk Nagrywanie. W międzyczasie obróć pokrętło urządzenia poruszającego magnes, aby przesunąć magnes w dół do 13 mm nad dnem szalki Petriego. Zapisz sekwencję obrazów lub wideo w jasnym polu. Sprawdź wideo, aby potwierdzić, że mikrokulki wykazują przemieszczenie wywołane siłą magnetyczną.
    3. Powtórz kroki 5.3.5-5.3.7 i ustaw nazwę pliku na after_large_force.nd2.
    4. Przełącz się na właściwą ścieżkę światła i włącz DIA. Następnie otwórz SpinView i kliknij przycisk Nagrywanie. W międzyczasie obróć pokrętło urządzenia poruszającego magnes, aby przesunąć magnes do 120 mm nad dnem szalki Petriego. Zapisz sekwencję obrazów lub wideo w jasnym polu.
    5. Powtórz kroki 5.3.5-5.3.7 i ustaw nazwę pliku na retract_large_force.nd2.
    6. Zamknij pokrywę komory środowiskowej.
  5. Powtórz kroki 5.2 i 5.3 dla wielu pól widoku, aby w razie potrzeby uzyskać więcej danych.

6. Przetwarzanie obrazów i analiza danych

  1. Kwantyfikacja wskaźnika YAP N/C
    1. Otwórz Fiji ImageJ. Otwórz obrazy .nd2 zrobione w kroku 5.
    2. Kliknij Analizuj > ustaw pomiary. Sprawdź obszar, zintegrowaną gęstość, średnią wartość szarości i deskryptory kształtu.
    3. Użyj kanału Cy5, aby zidentyfikować jądro. Kliknij Zaznaczanie odręczne, aby użyć narzędzia do swobodnego zaznaczania w celu obrysowania jądra. Sprawdź również makro automatycznej maski nuklearnej w ImageJ (patrz Tabela materiałów).
    4. Kliknij opcję Analizuj > Mierz w kanale FITC. Zmierzona wartość średniej jest średnią intensywnością jądrową YAP DN.
    5. Użyj kanału Cy5, aby zidentyfikować jądro. Użyj kanału FITC, aby zidentyfikować komórkę. Kliknij opcję Zaznaczanie odręczne, aby użyć narzędzia do swobodnego zaznaczania w celu wybrania interesującego obszaru w cytoplazmie i uniknięcia mikrokulki magnetycznej. Ten obszar zainteresowania nie może obejmować jądra.
    6. Kliknij opcję Analizuj > Mierz w kanale FITC. Zmierzona wartość średniej to średnia intensywność cytoplazmatycznego YAP DC.
    7. Obliczyć stosunek YAP N/C = DN / DC.
  2. Kwantyfikacja kształtu jądra i znormalizowana intensywność barwienia jądrowego
    1. Otwórz Fiji ImageJ. Otwórz obrazy .nd2 zrobione w kroku 5.
    2. Kliknij Analizuj > ustaw pomiary. Sprawdź obszar, zintegrowaną gęstość, średnią wartość szarości i deskryptory kształtu.
    3. Użyj kanału Cy5, aby zidentyfikować jądro. Kliknij Zaznaczanie odręczne, aby użyć narzędzia do swobodnego zaznaczania w celu obrysowania jądra.
    4. Kliknij Analizuj > mierz w kanale Cy5. Zmierzona wartość średniej to intensywność barwienia jądrowego. Zmierzona wartość Circ. jest jądrowy obieg zamknięty.
    5. Aby porównać intensywność plamy jądrowej w różnych stanach siły, cała intensywność plamy jądrowej jest dzielona przez intensywność plamy jądrowej w "before_small_force.nd2", aby wygenerować znormalizowaną intensywność plamy jądrowej.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Projekt urządzenia poruszającego magnes i zastosowanie siły magnetycznej
Aby przyłożyć siłę do jądra za pomocą mikrokulek magnetycznych, zaprojektowano i zbudowano urządzenie poruszające się magnesem, aby kontrolować położenie przestrzenne magnesu. Urządzenie do poruszania magnesem zawiera centralną ramę, trzy pokrętła i szyny do niezależnego przesuwania dołączonego magnesu w kierunkach x, y i z z rozdzielczością przestrzenną 1,59 mm na cykl (Rysunek 1A). Gdy magnes zbliży się do ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Internalizacja mikrokulek magnetycznych (sekcja 2.2) ma kluczowe znaczenie, ponieważ mikrogranulki zewnątrzkomórkowe nie mogą wywierać siły bezpośrednio na jądro. Przyłożenie siły i obrazowanie (sekcja 5.3) są krytycznymi etapami tego eksperymentu, a siła potrzebna do deformacji jądra i wywołania znaczących konsekwencji biologicznych może być zależna od próbki. Wielkość siły w tym eksperymencie (0,8 nN i 1,4 nN) może być jeszcze większa, aby uruchomić mechano-wykrywanie jądra w mniej wrażliwych komórkach.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie ma żadnych konfliktów interesów, które można by zadeklarować.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten projekt jest finansowany przez UF Gatorade Award Start-up Package (X. T.), UFHCC Pilot Award (X. T. i Dr. Dietmar Siemann), UF Opportunity Seed Fund (X. T.) oraz UFHCC University Scholars Program (H. Y. Wang). Serdecznie dziękujemy za intelektualne dyskusje i wsparcie techniczne ze strony dr Jonathana Lichta (UFHCC), dr Rolfa Renne (UFHCC), dr Christophera Vulpe (UFHCC), dr Blanki Sharmy (BME), dr Marka Sheplaka (MAE i ECE), dr Daniela Ferrisa (BME), dr Malisy Sarntinoranont (MAE), dr Ashoka Kumara (MAE), dr Benjamina Keselowsky'ego (BME), dr Brenta Gila (RSC), dr Philipa Fenga (ECE), dr Gregory A. Hudalla (BME), dr Steven Ghivizzani (OSSM), dr Yenisel Cruz-Almeida (CDBS), dr Roger Fillingim (CD-BS), dr Robert Caudle (OMS), dr John Neubert (DN-OR), dr Justin Hiliard (neurochirurgia), dr Tian He (Uniwersytet Harvarda), dr Youhua Tan (Politechnika w Hongkongu), dr Jessie L-S Au (Instytut Farmakologii Systemów Ilościowych), dr David Hahn (Uniwersytet Arizony), oraz zespół wsparcia firmy Nikon (dr Jose Serrano-Velez, dr Larry Kordon i dr Jon Ekman). Jesteśmy głęboko wdzięczni za skuteczne wsparcie ze strony wszystkich członków laboratoriów badawczych Tang, Yamaguchi, Sharma, Au, Siemann i Guan oraz wszystkich pracowników Wydziału UF MAE.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0,05 % TrypsynaCorning25-051-CI
25 cm2 kolbaCorning156340
7-µ m mikrokulki karbonylowo-żelazowe o średniej średnicynie
Nie dotyczy A1R System konfokalnyNikon
Karbonylowo-żelazowy w proszku CMBASF30042253Mikrokulki magnetyczne
Pożywka hodowlana (RPMI-1640)Komputer
z systemem operacyjnym Windows 10
Tokai HitTIZB
Płodowa surowica bydlęca (FBS)Gibco26140
Fiji ImageJNarodowe Instytuty Zdrowia i Laboratorium Oprzyrządowania
Szalka Petriego ze szklanym dnemMatTekP35G-1.5-14-C
MagnesK& J Magnetics, Inc.D99-N52
Monochromatyczny  AparatFLIR BFS-U3-70S7M-C
PLATFORMA OPROGRAMOWANIA NIS-ElementsPlatforma oprogramowaniaNikon
Maska Nucleus Maska makrohttps://github.com/KOLIUG/Nuclear
ImageJ NucSpot Live 650Biotium#40082Barwnik jądrowy
Penicylina-streptomycynaGibco15140122
Buforowany fosforanem sól fizjologiczna (PBS)Gibco10010023
Ti2-ENikon
XYZ mover (pliki CAD)https://github.com/KOLIUG/XYZ-mover
: dotyczy stacjonarny Gibco 11875093 Dell Komora środowiskowa TIZB Optycznego i ObliczeniowegoMikroskop odwrócony

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. Tissue cells feel and respond to the stiffness of their substrate. Science. 310 (5751), 1139-1143 (2005).
  2. Janmey, P. A., Fletcher, D. A., Reinhart-King, C. A. Stiffness sensing by cells. Physiological Reviews. 100 (2), 695-724 (2020).
  3. Bajaj, P., Tang, X., Saif, T. A., Bashir, R. Stiffness of the substrate influences the phenotype of embryonic chicken cardiac myocytes. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 95 (4), 1261-1269 (2020).
  4. Tang, X., et al. Mechanical force affects expression of an in vitro metastasis-like phenotype in HCT-8 cells. Biophysical Journal. 99 (8), 2460-2469 (2010).
  5. Hofmann, M., et al. Lowering of tumor interstitial fluid pressure reduces tumor cell proliferation in a xenograft tumor model. Neoplasia. 8 (2), 89-95 (2006).
  6. Yankaskas, C. L., et al. The fluid shear stress sensor TRPM7 regulates tumor cell intravasation. Science Advances. 7 (28), (2021).
  7. Kim, E., et al. A biosynthetic hybrid spidroin-amyloid-mussel foot protein for underwater adhesion on diverse surfaces. ACS Applied Materials and Interfaces. 13 (41), 48457-48468 (2021).
  8. Tajik, A., et al. Transcription upregulation via force-induced direct stretching of chromatin. Nature Materials. 15 (12), 1287-1296 (2016).
  9. Lee, J., Abdeen, A. A., Tang, X., Saif, T. A., Kilian, K. A. Matrix directed adipogenesis and neurogenesis of mesenchymal stem cells derived from adipose tissue and bone marrow. Acta Biomaterialia. 42, 46-55 (2016).
  10. Lee, J., Abdeen, A. A., Tang, X., Saif, T. A., Kilian, K. A. Geometric guidance of integrin mediated traction stress during stem cell differentiation. Biomaterials. 69, 174-183 (2015).
  11. Ren, B., et al. Study of sacrificial ink-assisted embedded printing for 3D perfusable channel creation for biomedical applications. Applied Physics Reviews. 9 (1), 011408(2022).
  12. Coyle, S., et al. Cell alignment modulated by surface nano-topography-Roles of cell-matrix and cell-cell interactions. Acta Biomaterialia. 142, 149-159 (2022).
  13. Sawada, Y., et al. Force sensing by mechanical extension of the Src family kinase substrate p130Cas. Cell. 127 (5), 1015-1026 (2006).
  14. Aragona, M., et al. A mechanical checkpoint controls multicellular growth through YAP/TAZ regulation by actin-processing factors. Cell. 154 (5), 1047-1059 (2013).
  15. Tang, X., et al. Specific and non-specific adhesion in cancer cells with various metastatic potentials. Mechanobiology of Cell-Cell and Cell-Matrix Interactions. , Springer. Boston, MA. 105-122 (2011).
  16. Tang, X., Saif, T. A. Adhesivity of colon cancer cells during in vitro metastasis. International Journal of Applied Mechanics. 5 (03), 1350025(2013).
  17. Chaudhuri, O., et al. Effects of extracellular matrix viscoelasticity on cellular behaviour. Nature. 584 (7822), 535-546 (2020).
  18. Ohashi, K., Fujiwara, S., Mizuno, K. Roles of the cytoskeleton, cell adhesion and rho signalling in mechanosensing and mechanotransduction. The Journal of Biochemistry. 161 (3), 245-254 (2017).
  19. Hamill, O. P., Martinac, B. Molecular basis of mechanotransduction in living cells. Physiological Reviews. 81 (2), 685-740 (2001).
  20. Liang, C., et al. Towards an integrative understanding of cancer mechanobiology: Calcium, YAP, and microRNA under biophysical Forces. Soft Matter. 18, 1112-1148 (2022).
  21. Tan, Y., et al. Matrix softness regulates plasticity of tumour-repopulating cells via H3K9 demethylation and Sox2 expression. Nature Communications. 5 (1), 1-12 (2014).
  22. Poh, Y., et al. Dynamic force-induced direct dissociation of protein complexes in a nuclear body in living cells. Nature Communications. 3 (1), 1-10 (2012).
  23. Tang, X., et al. A mechanically-induced colon cancer cell population shows increased metastatic potential. Molecular Cancer. 13 (1), 1-15 (2014).
  24. Wu, J., et al. Effects of dynein on microtubule mechanics and centrosome positioning. Molecular Biology of the Cell. 22 (24), 4834-4841 (2011).
  25. Tang, X., Ali, M. Y., Saif, M. T. A novel technique for micro-patterning proteins and cells on polyacrylamide gels. Soft Matter. 8 (27), 7197-7206 (2011).
  26. Tang, X., Bajaj, P., Bashir, R., Saif, T. A. How far cardiac cells can see each other mechanically. Soft Matter. 7 (13), 6151-6158 (2011).
  27. Tang, X., et al. Mechanical force affects expression of an in vitro metastasis-like phenotype in HCT-8 cells. Biophysical Journal. 99 (8), 2460-2469 (2010).
  28. Elosegui-Artola, A., et al. Force triggers YAP nuclear entry by regulating transport across nuclear pores. Cell. 171 (6), 1397-1410 (2017).
  29. Gudipaty, S. A., et al. Mechanical stretch triggers rapid epithelial cell division through Piezo1. Nature. 543 (7643), 118-121 (2017).
  30. Tang, X., et al. Attenuation of cell mechanosensitivity in colon cancer cells during in vitro metastasis. PLoS One. 7 (11), 50443(2012).
  31. Cha, C., et al. Top-down synthesis of versatile polyaspartamide linkers for single-step protein conjugation to materials. Bioconjugate Chemistry. 22 (12), 2377-2382 (2012).
  32. Chen, X., et al. Glycosaminoglycans modulate long-range mechanical communication between cells in collagen networks. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 119 (15), (2022).
  33. Boyle, J. J., Pless, R. B., Thomopoulos, S., Genin, G. M. Direct estimation of surface strain fields from a stereo vision system. Journal of Biomechanical Engineering. 142 (7), 074503(2020).
  34. Kim, S., Uroz, M., Bays, J. L., Chen, C. S. Harnessing mechanobiology for tissue engineering. Developmental Cell. 56 (2), 180-191 (2021).
  35. Driscoll, T. P., et al. Cytoskeletal to nuclear strain transfer regulates YAP signaling in mesenchymal stem cells. Biophysical Journal. 108 (12), 2783-2793 (2015).
  36. Guilluy, C., et al. Isolated nuclei adapt to force and reveal a mechanotransduction pathway in the nucleus. Nature Cell Biology. 16 (4), 376-381 (2014).
  37. Vashisth, M. Scaling concepts in 'omics: Nuclear lamin-B scales with tumor growth and often predicts poor prognosis, unlike fibrosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (48), (2021).
  38. Roberts, A. B., et al. Tumor cell nuclei soften during transendothelial migration. Journal of Biomechanics. 121, 110400(2021).
  39. Denais, C. M., et al. Nuclear envelope rupture and repair during cancer cell migration. Science. 352 (6283), 353-358 (2016).
  40. Raab, M., et al. ESCRT III repairs nuclear envelope ruptures during cell migration to limit DNA damage and cell death. Science. 352 (6283), 359-362 (2016).
  41. Lammerding, J., et al. Lamin A/C deficiency causes defective nuclear mechanics and mechanotransduction. The Journal of Clinical Investigation. 113 (3), 370-378 (2004).
  42. Shelby, J., Patrick, J., Edgar, S., Chiu, D. T. Monitoring cell survival after extraction of a single subcellular organelle using optical trapping and pulsed-nitrogen laser ablation. Photochemistry and Photobiology. 81 (4), 994-1001 (2005).
  43. Caspi, A., Granek, R., Elbaum, M. Diffusion and directed motion in cellular transport. Physical Review E. 66 (1), 011916(2002).
  44. Svoboda, K., Block, S. M. Biological applications of optical forces. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 23 (1), 247-285 (1994).
  45. Rohrbach, A. Stiffness of optical traps: quantitative agreement between experiment and electromagnetic theory. Physical Review Letters. 95 (16), 168102(2005).
  46. Neuman, K. C., et al. Characterization of photodamage to Escherichia coli in optical traps. Biophysical Journal. 77 (5), 2856-2863 (1999).
  47. Kanger, J. S., Subramaniam, V., Driel, R. V. Intracellular manipulation of chromatin using magnetic microbeads. Chromosome Research. 16 (3), 511-522 (2008).
  48. Bausch, A. R., et al. Local measurements of viscoelastic parameters of adherent cell surfaces by magnetic microbead microrheometry. Biophysical Journal. 75 (4), 2038-2049 (1998).
  49. Fisher, J. K., et al. Three-dimensional force microscope: a nanometric optical tracking and magnetic manipulation system for the biomedical sciences. Review of Scientific Instruments. 76 (5), 053711(2005).
  50. Berret, J. -F. Local viscoelasticity of living cells measured by rotational magnetic spectroscopy. Nature Communications. 7, 10134(2016).
  51. Hu, B., Dobson, J., El Haj, A. J. Control of smooth muscle α-actin (SMA) up-regulation in HBMSCs using remote magnetic microbead mechano-activation. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine. 10 (1), 45-55 (2014).
  52. Kamiyama, D., et al. Versatile protein tagging in cells with split fluorescent protein. Nature Communications. 7, 11046(2016).
  53. Feng, S., et al. Improved split fluorescent proteins for endogenous protein labeling. Nature Communications. 8, 370(2017).
  54. Leonetti, M. D., Sekine, S., Kamiyama, D., Weissman, J. S., Huang, B. A scalable strategy for high-throughput GFP tagging of endogenous human proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (25), 3501-3508 (2016).
  55. Tulpule, A., et al. Kinase-mediated RAS signaling via membraneless cytoplasmic protein granules. Cell. 184 (10), 2649-2664 (2021).
  56. Ansari, A. M., et al. Cellular GFP toxicity and immunogenicity: potential confounders in in vivo cell tracking experiments. Stem Cell Reviews and Reports. 12 (5), 553-559 (2016).
  57. Gibson, T. J., Seiler, M., Veitia, R. A. The transience of transient overexpression. Nature Methods. 10 (8), 715-721 (2013).
  58. Ratz, M., et al. CRISPR/Cas9-mediated endogenous protein tagging for RESOLFT super-resolution microscopy of living human cells. Scientific Reports. 5, 9592(2015).
  59. Suzuki, H., Ho, C., Kasagi, N. A chaotic mixer for magnetic microbead-based micro cell sorter. Journal of Microelectromechanical Systems. 13 (5), 779-790 (2004).
  60. Luo, Q., et al. All-optical mechanobiology interrogation of yes-associated protein in human cancer and normal cells using a multi-functional system. Journal of Visualized Experiments. (178), e62934(2021).
  61. Koushki, N., et al. Lamin A redistribution mediated by nuclear deformation determines dynamic localization of YAP. BioRxiv. , (2020).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Nucleus MechanobiologyMagnetic Force ActuatorFluorescence ImagingConfocal MicroscopyNuclear MechanosensingYAP TranslocationMagnetic MicrobeadsNucleus DeformationCytoskeleton MechanicsLive Cell Imaging

Related Articles