Utrwalanie zarodkowej tkanki myszy do analizy cytonemu

Rozwój embrionalny jest zarządzany poprzez skoordynowaną aktywację szlaków sygnałowych morfogenu. Morfignogeny to małe, wydzielane białka, które są podzielone na rodziny Sonic Hedgehog (SHH), transformującego czynnika wzrostu β (TGF-β) / białka morfogennego kości (BMP), miejsca integracji związanego ze skrzydłami (WNT) oraz rodzin fibroblastów i naskórkowego czynnika wzrostu (FGF / EGF). Morgeny są wytwarzane i uwalniane z komórkowych centrów organizacyjnych podczas rozwoju tkanek i ustanawiają gradienty sygnałowe w organizujących się polach komórek, aby informować o morfogenezie tkanek^1,2,3,4,5. Jedną z reprezentacji gradientów morfogenu znajduje się w rozwijającym się układzie nerwowym, w którym przypuszczalny ośrodkowy układ nerwowy jest wzorowany na aktywacji szlaku morfogenu. Ta tkanka, określana jako cewa nerwowa, składa się z przeciwstawnych gradientów SHH wydzielanych przez najbardziej brzuszną strunę grzbietową i płytkę podłogową oraz WNT / BMP wydzielanych z grzbietowej płyty dachowej, w celu ukształtowania odrębnych neuronowych regionów progenitorowych⁶. Cewa nerwowa jest powszechnie używana do badania integralności gradientu morfogenu w badaniach rozwojowych.

Tworzenie gradientu morfogenu opiera się na ścisłej regulacji dyspersji sygnału⁷. Jednym z mechanizmów komórkowych, dzięki któremu tak się dzieje, jest tworzenie długich filopodiów sygnałowych zwanych cytonemami, które ułatwiają bezpośrednie dostarczanie morfogenów z komórek wytwarzających sygnał do określonych populacji komórek docelowych. Zaobserwowano, że cytonemy rozciągają się na setki mikrometrów, aby osadzić morfogeny na błonach komórkowych odbierających sygnały^8,9. Zakłócenie transportu morfogenu za pośrednictwem cytonemu prowadzi do anomalii rozwojowych zarówno u much, jak i kręgowców, podkreślając ich znaczenie podczas tworzenia wzorców tkankowych^{10,11,12,13,14}.

Do tej pory cytonemy zostały udokumentowane w modelach Drosophila, piskląt i danio pręgowanego, ale obrazowanie struktur w rozwijających się zarodkach ssaków pozostaje wyzwaniem^8,9^,15. Przeszkodą w skutecznym obrazowaniu cytonemów w złożonych tkankach ssaków in situ jest ich cienka i delikatna natura, która sprawia, że są one podatne na uszkodzenia konwencjonalnymi metodami utrwalania⁸. Wcześniej opracowaliśmy i zoptymalizowaliśmy protokoły dla modyfikowanego utrwalacza mikroskopii elektronowej (MEM-fix) w celu zachowania cytonemów w hodowanych komórkach i umożliwienia ich badania za pomocą mikroskopii konfokalnej^16,17.

Użycie techniki MEM-fix pozwoliło na identyfikację niektórych cząsteczek zaangażowanych w tworzenie i funkcjonowanie cytonemu indukowanego przez SHH^11,16,17. Jednak potwierdzenie tych odkryć w fizjologicznie istotnym kontekście wzorca cewy nerwowej wymagało opracowania nowych technik utrwalania i obrazowania tkanki embrionalnej myszy. Przedstawiono tutaj protokół mocowania zarodków myszy w sposób, który zachowuje integralność cytonemu i umożliwia barwienie immunologiczne, a następnie cięcie tkanki embrionalnej do analizy konfokalnej. Protokół ten został opracowany przy użyciu zielonego białka fluorescencyjnego (GFP) na uwięzi błonowej do znakowania rozszerzeń błony z komórek wytwarzających SHH w rozwijającej się cewie neuronowej. Wdrożenie tego protokołu odpowie na pytania bez odpowiedzi dotyczące rozpowszechnienia i znaczenia cytonemów w rozwijających się systemach ssaków.

Ten protokół jest zgodny z zatwierdzonymi wytycznymi Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) oraz St. Jude Children's Research Hospital. Wszystkie szczepy zostały skrzyżowane wstecznie pięć generacji ze szczepem C57BL/6J.

1. Izolacja zarodków i barwienie całego wierzchowca

1. Hoduj 6-tygodniowe samice i monitoruj obecność czopa pochwowego.
2. Poddanie ciężarnej matki eutanazji poprzez wdychanie CO₂ w komorze CO₂ , a następnie zwichnięcie szyjki macicy zgodnie z wytycznymi AVMA¹⁸. Wykonaj nacięcie w kształcie litery Y w jamie otrzewnej za pomocą nożyczek preparacyjnych i kleszczy. Wyciąć macicę zawierającą zarodki E9.5 zgodnie z zatwierdzonymi wytycznymi instytucjonalnymi.
3. Rozbioruj zarodki na kompletnym pożywce wzrostowej (zmodyfikowane podłoże Dulbecco's Eagle Medium, uzupełnione nieistotnymi aminokwasami, Na-pirogronianem, L-glutaminą i 10% płodową surowicą bydlęcą). Użyj kleszczyków, aby usunąć woreczek żółtkowy, łożysko i otaczające błony.
   UWAGA: W razie potrzeby zachowaj każdy woreczek żółtkowy do genotypowania zarodków.
4. Wypłucz izolowane zarodki w zrównoważonym roztworze soli Hanka (HBSS), aby usunąć resztki tkanki owodniowej i krwi.
5. Przygotuj utrwalacz. Dodaj paraformaldehyd (PFA) do HBSS, aby uzyskać końcowe stężenie robocze 4% PFA.
   UWAGA: PFA jest toksyczną substancją chemiczną, dlatego należy unikać wdychania lub bezpośredniego narażenia skóry. Przygotowanie roztworu utrwalającego odbywa się pod wyciągiem z użyciem odpowiednich środków ochrony indywidualnej w postaci rękawic i fartucha laboratoryjnego.
6. Dodać 1 ml utrwalacza do każdego dołka 24-dołkowej płytki i umieścić każdy zarodek w osobnym dołku. Inkubować zarodki w utrwalaczu przez 45 minut, delikatnie mieszając na bujaku.
   UWAGA: Krytyczne: Wszystkie płukania i inkubacje muszą być wykonywane z delikatnym mieszaniem (maksymalnie 20 obr./min) na kołysce lub wytrząsarce okrągłej, ponieważ nagłe obchodzenie się lub ruch zarodków zniszczy utrwalone cytonemy. Użyj pipety, aby delikatnie usunąć wszystkie roztwory.
7. Usunąć utrwalacz i umyć zarodki 3 x 30 minut w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) z Ca²⁺ i Mg²⁺ z dodatkiem 0,1% Trytonu.
8. Po umyciu inkubować zarodki w roztworze blokującym (PBS z Ca²⁺ i Mg²⁺, 0,1% Tritonem i 5% surowicą kozią) z delikatnym mieszaniem. Blok 2 x 1 h. Po drugiej inkubacji blokującej należy wykonać jedno szybkie płukanie zarodków świeżym roztworem blokującym.
9. Na drugim etapie blokowania przygotuj roztwór przeciwciała pierwszorzędowego¹¹. Rozcieńczyć przeciwciała do optymalnego stężenia w PBS za pomocą Ca²⁺ i Mg²⁺, 0,1% Tween-20 i 5% surowicy koziej.
   UWAGA: W celu lepszej wizualizacji GFP membranowego można zastosować anty-GFP kurczaka (1:250).
10. Usuń roztwór blokujący i dodaj 1 ml roztworu przeciwciała pierwszorzędowego do każdej studzienki. Inkubować w temperaturze 4 °C z delikatnymi rotacjami przez 3 dni.
11. Po inkubacji przeciwciał pierwotnych umyj zarodki 5 x 1 h z prędkością 20 obr./min na bujaczku w PBS z Ca²⁺ i Mg²⁺, 0,1% Tween-20 i 5% surowicą kozią.
12. Przygotować roztwór przeciwciała drugorzędowego przy użyciu wtórnych fragmentów F(ab')₂ w rozcieńczeniu 1:1,000 w PBS z Ca²⁺ i Mg²⁺, 0,1% Tween-20 i 5% surowicy koziej.
    UWAGA: Zastosowanie fragmentów F(ab')₂ znacznie zwiększa penetrację przeciwciał do próbki.
13. Dodać 1 ml roztworu przeciwciał drugorzędowych do każdej studzienki. Inkubować z delikatnym kołysaniem w temperaturze 4 °C w ciemności przez 3 dni.
    UWAGA: Ważne: Od tego momentu zminimalizuj ekspozycję zarodka na bezpośrednie światło. Opcjonalnie: Aby zapobiec rozwojowi bakterii, dodaj 0,2% azydku sodu do roztworu przeciwciał drugorzędowych.
14. Usunąć drugorzędowy roztwór przeciwciał i umyć zarodki 3 x 30 minut w PBS z Ca^{2 +} i Mg^{2 +}, 0,1% Tween-20 i 5% kozią surowicą. Jeśli nie wykonujesz barwienia aktyny falloidyną lub innymi barwnikami aktyny, po pierwszym myciu dodaj 4′,6-diamidino-2-fenyloindol (DAPI) do PBS z Ca²⁺ i Mg²⁺, 0,1% Tween-20 i 5% surowicy koziej i inkubuj przez 1 godzinę, a następnie 3 x 30 min płukania, jak opisano powyżej.
    UWAGA: W tym momencie zarodki mogą być przechowywane przez noc w temperaturze 4 °C w PBS lub HBSS w ciemności aż do etapu osadzania następnego dnia. Zaleca się jednak, aby zarodki zostały natychmiast osadzone i poddane sekcji.

2. Osadzanie, cięcie i montowanie zarodków

1. Przygotować 4% w/v roztwór agarozy o niskiej temperaturze topnienia (LMP) rozpuszczony w HBSS lub PBS z Ca²⁺ i Mg²⁺ do końcowej objętości ~ 3 ml na zarodek. Dodać odpowiednią masę agarozy LMP do HBSS lub PBS z Ca²⁺ i Mg²⁺ i podgrzewać w kuchence mikrofalowej, aż agaroza LMP się rozpuści.
   UWAGA: Po rozpuszczeniu agarozy LMP należy przechowywać roztwór w kąpieli perełkowej, inkubatorze lub łaźni wodnej ustawionej na 55 °C, aby zapobiec zestaleniu się roztworu agarozy LMP.
2. Użyj 12-dołkowej płytki jako formy do osadzania zarodków. Umieścić 12-dołkową płytkę w kąpieli perełkowej o temperaturze 55 °C. Dodaj 2,5-3 ml 4% agarozy LMP do każdej studzienki, w której znajdzie się zarodek.
   UWAGA: Chociaż można stosować inne formy, objętości płytek 12-dołkowych są optymalne do przygotowania bloku agarozy na późniejszych etapach do krojenia.
3. Za pomocą perforowanej łyżki przenieś zarodki do indywidualnych studzienek zawierających 4% roztwór agarozy LMP (Ryc. 1A).
   1. Przenieś 12-dołkową płytkę z wanny perełkowej na blat. Użyj końcówek pipet, aby delikatnie osadzić i ustawić zarodek tak, aby był wyśrodkowany w roztworze. Po ustawieniu zarodków należy umieścić płytkę w temperaturze -20 °C na 10 minut, aby umożliwić szybkie zestalenie bloku.
      KRYTYCZNE: Upewnij się, że zarodek jest umieszczony w środku bloku. Zarodki, które opadają na dno lub znajdują się zbyt blisko krawędzi formy, prawdopodobnie zostaną usunięte z bloku agarozy podczas cięcia.
4. Usuń cały blok agarozy ze studzienki za pomocą skalpela i przetnij prostokątny blok wokół zarodka, pozostawiając ~0,3 cm bloku z każdej strony. Pozostaw dodatkową długość wzdłuż ogonowego końca zarodka. Po zamontowaniu na wibratomie ustaw zarodek w pozycji pionowej w górnej części bloku (Ryc. 1B).
5. Przyłóż pasek taśmy do uchwytu próbki wibratomu i przyklej blok agarozy do taśmy, zorientowany tak, aby ostrze wygenerowało osiowe sekcje zarodka w sekwencji od przodu (czaszki) do tyłu.
6. Napełnij komorę wibratomu zimnym HBSS, aby upewnić się, że próbka jest całkowicie zanurzona, a następnie otocz komorę lodem.
7. Ustaw prędkość wibratomu na 0,2 mm/s i częstotliwość od 5 do 7 (50-70 Hz) przy grubości cięcia ustawionej na 100 μm. Wykonaj seryjne cięcie osiowe zarodka.
   UWAGA: Do cięcia używaj niskiej prędkości. Jeśli prędkość cięcia zostanie zwiększona powyżej 0,25 mm/s, cięcie może rozerwać zarodek lub usunąć zarodek z bloku.
   1. Podczas serii krojenia za pomocą kleszczyków delikatnie przełóż poszczególne sekcje do osobnego naczynia o średnicy 60 mm wypełnionego HBSS. Użyj kleszczy, aby chwycić blok, a nie tkankę, aby uniknąć uszkodzenia tkanek i zniszczenia cytonemu.
      UWAGA: Wycinki tkanek powinny pozostać w obrębie bloku agarozowego. Jeśli tkanka wypadnie z bloku do komory wibratomowej, delikatnie przenieś, podnosząc wycinek. Nie chwytaj ani nie ściskaj chusteczki. KRYTYCZNE: Każde fałdowanie skrawków tkanek lub nagłe obchodzenie się z nimi spowoduje zniszczenie utrwalonych cytonemów w skrawkach tkanki.
8. Jeśli nie wykonujesz barwienia F-aktyną, przejdź do kroku 2.10.
   1. Aby wykonać barwienie F-aktyną, usuń HBSS i inkubuj skrawki przez 40 minut z roztworem Actin-Red i DAPI rozcieńczonym w PBS z Ca²⁺ i Mg²⁺, 0,1% Tween-20 i 5% surowicą kozią w temperaturze pokojowej.
9. Przemyć sekcje 3 x 20 min w PBS z Ca²⁺ i Mg²⁺ oraz 0,1% Tween-20.
10. Za pomocą markera hydrofobowego narysuj hydrofobową barierę wokół krawędzi naładowanego szkiełka mikroskopowego i dodaj niewielką objętość HBSS, aby wypełnić obszar.
11. Użyj kleszczyków lub perforowanej łyżki, aby przenieść sekcje na szkiełko.
    UWAGA: Wszelkie skrawki tkanek, które nie są otoczone agarozą, można przenieść za pomocą pipety transferowej.
12. Usuń nadmiar bloku agarozy za pomocą kleszczy.
13. Po przeniesieniu wszystkich sekcji na szkiełko, usuń nadmiar płynu za pomocą pipetowania i rogu chusteczki chłonnej, a następnie dodaj kilka kropli podłoża mocującego do szkiełka. Użyj wystarczającej ilości podłoża montażowego, aby pokryć cały obszar szkiełka nakrywkowego po utwardzeniu. Zamontuj szkiełko nakrywkowe, delikatnie umieszczając je na szkiełku.
    UWAGA: Unikaj wywierania nacisku lub przeszkadzania szkiełku nakrywkowego, dopóki medium montażowe nie utwardzi się.

3. Obrazowanie

1. Wykonaj obrazowanie skrawków tkanek pod dowolnym mikroskopem konfokalnym lub mikroskopem o wyższej rozdzielczości¹¹. Przeanalizuj co najmniej trzy zarodki na genotyp.
   UWAGA: Obrazy skrawków tkanek uzyskano za pomocą mikroskopu konfokalnego TCS SP8 STED 3x, a następnie przeprowadzono dekonwolucję LIGHTNING.

Użycie większej formy 12-dołkowej płytki z 2,5-3 ml roztworu agarozy na dołek było idealne do osadzania i zawieszania kilku zarodków przez krótki okres czasu (Rysunek 1A). Nadmiar powierzchni pozwala na prawidłową orientację podczas cięcia bloku agarozy do cięcia. Podczas cięcia bloku agarozy ważne jest, aby utrzymać nadmiar agarozy wzdłuż dolnej części bloku, gdzie zostanie przyklejony do taśmy na uchwycie przedmiotu. Zarodek powinien znajdować się w górnej połowie bloku (Ryc. 1B). Jednak dolna część nie powinna być zbyt duża, ponieważ nadmiar bloku zwiększa szanse na zmianę kąta cięcia, gdy ostrze wciska się w blok podczas cięcia. Przykłady poprawnie zorientowanych sekcji są pokazane (Rysunek 1C,D).

Podczas opracowywania tego protokołu, sekcja wibratomu została porównana do sekcji kriostatu. Cięcie kriostatu tkanki rzadko zachowanych rozszerzeń komórkowych ( Rysunek 2 kriostat i Rysunek 3Wibratom A,B). Wycinki kriostatu pozwoliły na wykrycie niektórych fragmentów błony GFP-dodatniej między komórkami struny grzbietowej i cewy nerwowej (Rysunek 2A grot strzałki) oraz między sąsiednimi komórkami cewy nerwowej ( groty strzałek 2B,B'). Jednak barwienie F-aktyną rozszerzeń komórkowych w wysoce nitkowatych komórkach mezenchymalnych otaczających cewę nerwową było upośledzone w sekcjach kriostatu ( strzałka 2C, C', w porównaniu z Figura 3C, D). Wyniki kriostatu wskazują, że po tej metodzie pozostają tylko pewne ślady uszkodzonych rozszerzeń komórkowych. W związku z tym preferowane jest cięcie wibratomem, aby skutecznie zachować te delikatne przedłużenia do późniejszej analizy.

Minimalne uszkodzenie całego zarodka i poszczególnych odcinków tkanek jest niezbędne do wysokiej jakości obrazowania rozszerzeń komórkowych. Skrawki tkanki, które uległy jakiemukolwiek fałdowaniu lub wyboczeniu, będą widoczne po braku struny grzbietowej lub dużej separacji (>30 μm) między struną grzbietową a brzuszną płytką podłogową cewy nerwowej (Rysunek 3B). Zwykle towarzyszy temu utrata komórek mezenchymalnych, które normalnie otaczają cewę nerwową (Rysunek 3A, strzałka). Uszkodzone odcinki spowodują również utratę widocznych rozszerzeń błony komórkowej migrujących między komórkami nabłonkowymi (Rysunek 3B w porównaniu do Rysunek 3A, groty strzałek). Nawet niewielkie zniekształcenia sekcji mogą powodować fragmentację rozszerzeń opartych na aktynie i tworzenie się dużych przerw między komórkami (Rycina 3D, groty strzałek, w porównaniu do dobrze zachowanych Rysunek 3C), podkreślając potrzebę delikatnego obchodzenia się na wszystkich etapach.

Rysunek 1: Przykład E9.5 Shh-Cre; Rosa26 mTmG barwiony, osadzony i podzielony na sekcje zarodek. (A) Pojedynczy zarodek w 12-dołkowej płytce, osadzony w 4% agarozie LMP. (B) Przykład prawidłowo zorientowanego zarodka w bloku agarozy, przyciętego do rozmiaru w celu zamontowania wibratomem. Nadmiar bloku agarozy jest obecny wzdłuż dna. (C) Obraz w jasnym polu wycinka zarodka o grubości 100 μm osadzonego w agarozie LMP. (D) Obrazowanie immunofluorescencyjne wycinka po usunięciu agarozy. MGFP barwiony anty-GFP (zielony) reprezentuje komórki wyrażające Shh w tkance, przy czym inne linie komórkowe wyrażają błonę pomidorową (czerwoną), DAPI na niebiesko. Cewa nerwowa (nawias) i struna grzbietowa mGFP-dodatnia (strzałka) są wyraźnie widoczne. Podziałka = 1 cm (A), 5 mm (B) i 100 μm (C,D). Skróty: LMP = niska temperatura topnienia; mGFP = błonowe białko zielonej fluorescencji; Shh = Jeż Soniczny; DAPI = 4',6-diamidyn-2-fenyloindol. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Przykład płytki podłogowej rurki nerwowej i struny grzbietowej z rozdrobnionymi przedłużeniami membrany. (A) E9.5 Shh-Cre o grubości 20 μm; Rosa26 mTmG19,20,21 sekcja barwiona dla GFP (na zielono), F-aktyny (na czerwono) i DAPI (na niebiesko). Punkty mGFP są widoczne między struną grzbietową a płytką podłogową (grot strzałki) i (B,B') migrując między sąsiednimi komórkami cewy nerwowej. (C,C') Barwienie F-aktyną nie wykrywa żadnych wyraźnych cytonemów na komórkach mezenchymalnych otaczających cewę nerwową (strzałka). Podziałka = 20 μm. Skróty: mGFP = błonowe zielone białko fluorescencyjne; Shh = Jeż Soniczny; DAPI = 4',6-diamidyn-2-fenyloindol. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Przykłady optymalnych i nieoptymalnych przekrojów tkanki wibratomu oraz barwienia płytki dna cewy nerwowej, struny grzbietowej i otaczających komórek. Przykłady delikatnie obsługiwanych odcinków (A,C) w porównaniu z (B) złożonym odcinkiem tkanki i (D) źle obsługiwanym odcinkiem z Shh-Cre; Rosa26 mTmG i ShhGFP/+ embrion19,20,21. Optymalnie obsługiwane sekcje umożliwiają wykrywanie cytonemów między sąsiadująco zlokalizowanymi komórkami nabłonka nerwowego płytki podłogowej (A, groty strzałek). Powinna być widoczna rura grzbietowa przylegająca do cewy nerwowej (A, ekspresja mGFP) i komórki mezenchymalne (A, strzałka). (C,D) Skrawki barwione F-aktyną i DAPI powinny mieć spójne odstępy między komórkami mezenchymalnymi i cytonemami na bazie F-aktyny (strzałki) otaczającymi cewę nerwową i strunę grzbietową (C). Każde drobne zagięcie lub przerwanie sekcji może spowodować przerwy i połamane fragmenty F-aktyny (D, groty strzałek). Podziałka = 10 μm. Skróty: mGFP = błonowe zielone białko fluorescencyjne; Shh = Jeż Soniczny; DAPI = 4',6-diamidyn-2-fenyloindol. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Autorzy nie mają do zadeklarowania żadnych sprzecznych interesów.