Artykuł metodologiczny

Utrwalanie zarodkowej tkanki myszy do analizy cytonemu

3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/64100

⸱

16 czerwca 2022

 ,  ,  ,  , 
1Department of Cell and Molecular Biology, St. Jude Children’s Research Hospital, 2St. Jude Graduate School of Biomedical Sciences

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj dostępny jest zoptymalizowany protokół krok po kroku do utrwalania, barwienia immunologicznego i sekcji zarodków w celu wykrycia wyspecjalizowanych filopodiów sygnałowych zwanych cytonemami w rozwijających się tkankach myszy.

Streszczenie

Rozwojowe wzorce tkanek i porozwojowa homeostaza tkanek zależą od kontrolowanego dostarczania sygnałów komórkowych zwanych morfogenami. Morfogany działają w sposób zależny od stężenia i czasu, aby określić odrębne programy transkrypcyjne, które instruują i wzmacniają los komórki. Jednym z mechanizmów, dzięki którym zapewnione są odpowiednie progi sygnalizacji morfogenu, jest dostarczanie białek sygnałowych przez wyspecjalizowane filopodia zwane cytonemami. Cytonemy są bardzo cienkie (≤200 nm średnicy) i mogą osiągać długości kilkuset mikronów, co sprawia, że ich zachowanie do analizy obrazu o stałym obrazie jest trudne. W artykule opisano udoskonaloną metodę delikatnego obchodzenia się z zarodkami myszy w celu utrwalenia, barwienia immunologicznego i grubego cięcia, aby umożliwić wizualizację cytonemów przy użyciu standardowej mikroskopii konfokalnej. Protokół ten został z powodzeniem wykorzystany do wizualizacji cytonemów, które łączą różne przedziały sygnalizacji komórkowej podczas rozwoju cewy nerwowej myszy. Technikę tę można również dostosować do wykrywania cytonemów w różnych typach tkanek, aby ułatwić badanie sygnalizacji rozwojowej w niespotykanej dotąd rozdzielczości.

Wprowadzenie

Rozwój embrionalny jest zarządzany poprzez skoordynowaną aktywację szlaków sygnałowych morfogenu. Morfignogeny to małe, wydzielane białka, które są podzielone na rodziny Sonic Hedgehog (SHH), transformującego czynnika wzrostu β (TGF-β) / białka morfogennego kości (BMP), miejsca integracji związanego ze skrzydłami (WNT) oraz rodzin fibroblastów i naskórkowego czynnika wzrostu (FGF / EGF). Morgeny są wytwarzane i uwalniane z komórkowych centrów organizacyjnych podczas rozwoju tkanek i ustanawiają gradienty sygnałowe w organizujących się polach komórek, aby informować o morfogenezie tkanek1,2,3,4,5. Jedną z reprezentacji gradientów morfogenu znajduje się w rozwijającym się układzie nerwowym, w którym przypuszczalny ośrodkowy układ nerwowy jest wzorowany na aktywacji szlaku morfogenu. Ta tkanka, określana jako cewa nerwowa, składa się z przeciwstawnych gradientów SHH wydzielanych przez najbardziej brzuszną strunę grzbietową i płytkę podłogową oraz WNT / BMP wydzielanych z grzbietowej płyty dachowej, w celu ukształtowania odrębnych neuronowych regionów progenitorowych6. Cewa nerwowa jest powszechnie używana do badania integralności gradientu morfogenu w badaniach rozwojowych.

Tworzenie gradientu morfogenu opiera się na ścisłej regulacji dyspersji sygnału7. Jednym z mechanizmów komórkowych, dzięki któremu tak się dzieje, jest tworzenie długich filopodiów sygnałowych zwanych cytonemami, które ułatwiają bezpośrednie dostarczanie morfogenów z komórek wytwarzających sygnał do określonych populacji komórek docelowych. Zaobserwowano, że cytonemy rozciągają się na setki mikrometrów, aby osadzić morfogeny na błonach komórkowych odbierających sygnały8,9. Zakłócenie transportu morfogenu za pośrednictwem cytonemu prowadzi do anomalii rozwojowych zarówno u much, jak i kręgowców, podkreślając ich znaczenie podczas tworzenia wzorców tkankowych10,11,12,13,14.

Do tej pory cytonemy zostały udokumentowane w modelach Drosophila, piskląt i danio pręgowanego, ale obrazowanie struktur w rozwijających się zarodkach ssaków pozostaje wyzwaniem8,9,15. Przeszkodą w skutecznym obrazowaniu cytonemów w złożonych tkankach ssaków in situ jest ich cienka i delikatna natura, która sprawia, że są one podatne na uszkodzenia konwencjonalnymi metodami utrwalania8. Wcześniej opracowaliśmy i zoptymalizowaliśmy protokoły dla modyfikowanego utrwalacza mikroskopii elektronowej (MEM-fix) w celu zachowania cytonemów w hodowanych komórkach i umożliwienia ich badania za pomocą mikroskopii konfokalnej16,17.

Użycie techniki MEM-fix pozwoliło na identyfikację niektórych cząsteczek zaangażowanych w tworzenie i funkcjonowanie cytonemu indukowanego przez SHH11,16,17. Jednak potwierdzenie tych odkryć w fizjologicznie istotnym kontekście wzorca cewy nerwowej wymagało opracowania nowych technik utrwalania i obrazowania tkanki embrionalnej myszy. Przedstawiono tutaj protokół mocowania zarodków myszy w sposób, który zachowuje integralność cytonemu i umożliwia barwienie immunologiczne, a następnie cięcie tkanki embrionalnej do analizy konfokalnej. Protokół ten został opracowany przy użyciu zielonego białka fluorescencyjnego (GFP) na uwięzi błonowej do znakowania rozszerzeń błony z komórek wytwarzających SHH w rozwijającej się cewie neuronowej. Wdrożenie tego protokołu odpowie na pytania bez odpowiedzi dotyczące rozpowszechnienia i znaczenia cytonemów w rozwijających się systemach ssaków.

Protokół

Ten protokół jest zgodny z zatwierdzonymi wytycznymi Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) oraz St. Jude Children's Research Hospital. Wszystkie szczepy zostały skrzyżowane wstecznie pięć generacji ze szczepem C57BL/6J.

1. Izolacja zarodków i barwienie całego wierzchowca

  1. Hoduj 6-tygodniowe samice i monitoruj obecność czopa pochwowego.
  2. Poddanie ciężarnej matki eutanazji poprzez wdychanie CO2 w komorze CO2 , a następnie zwichnięcie szyjki macicy zgodnie z wytycznymi AVMA18. Wykonaj nacięcie w kształcie litery Y w jamie otrzewnej za pomocą nożyczek preparacyjnych i kleszczy. Wyciąć macicę zawierającą zarodki E9.5 zgodnie z zatwierdzonymi wytycznymi instytucjonalnymi.
  3. Rozbioruj zarodki na kompletnym pożywce wzrostowej (zmodyfikowane podłoże Dulbecco's Eagle Medium, uzupełnione nieistotnymi aminokwasami, Na-pirogronianem, L-glutaminą i 10% płodową surowicą bydlęcą). Użyj kleszczyków, aby usunąć woreczek żółtkowy, łożysko i otaczające błony.
    UWAGA: W razie potrzeby zachowaj każdy woreczek żółtkowy do genotypowania zarodków.
  4. Wypłucz izolowane zarodki w zrównoważonym roztworze soli Hanka (HBSS), aby usunąć resztki tkanki owodniowej i krwi.
  5. Przygotuj utrwalacz. Dodaj paraformaldehyd (PFA) do HBSS, aby uzyskać końcowe stężenie robocze 4% PFA.
    UWAGA: PFA jest toksyczną substancją chemiczną, dlatego należy unikać wdychania lub bezpośredniego narażenia skóry. Przygotowanie roztworu utrwalającego odbywa się pod wyciągiem z użyciem odpowiednich środków ochrony indywidualnej w postaci rękawic i fartucha laboratoryjnego.
  6. Dodać 1 ml utrwalacza do każdego dołka 24-dołkowej płytki i umieścić każdy zarodek w osobnym dołku. Inkubować zarodki w utrwalaczu przez 45 minut, delikatnie mieszając na bujaku.
    UWAGA: Krytyczne: Wszystkie płukania i inkubacje muszą być wykonywane z delikatnym mieszaniem (maksymalnie 20 obr./min) na kołysce lub wytrząsarce okrągłej, ponieważ nagłe obchodzenie się lub ruch zarodków zniszczy utrwalone cytonemy. Użyj pipety, aby delikatnie usunąć wszystkie roztwory.
  7. Usunąć utrwalacz i umyć zarodki 3 x 30 minut w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) z Ca2+ i Mg2+ z dodatkiem 0,1% Trytonu.
  8. Po umyciu inkubować zarodki w roztworze blokującym (PBS z Ca2+ i Mg2+, 0,1% Tritonem i 5% surowicą kozią) z delikatnym mieszaniem. Blok 2 x 1 h. Po drugiej inkubacji blokującej należy wykonać jedno szybkie płukanie zarodków świeżym roztworem blokującym.
  9. Na drugim etapie blokowania przygotuj roztwór przeciwciała pierwszorzędowego11. Rozcieńczyć przeciwciała do optymalnego stężenia w PBS za pomocą Ca2+ i Mg2+, 0,1% Tween-20 i 5% surowicy koziej.
    UWAGA: W celu lepszej wizualizacji GFP membranowego można zastosować anty-GFP kurczaka (1:250).
  10. Usuń roztwór blokujący i dodaj 1 ml roztworu przeciwciała pierwszorzędowego do każdej studzienki. Inkubować w temperaturze 4 °C z delikatnymi rotacjami przez 3 dni.
  11. Po inkubacji przeciwciał pierwotnych umyj zarodki 5 x 1 h z prędkością 20 obr./min na bujaczku w PBS z Ca2+ i Mg2+, 0,1% Tween-20 i 5% surowicą kozią.
  12. Przygotować roztwór przeciwciała drugorzędowego przy użyciu wtórnych fragmentów F(ab')2 w rozcieńczeniu 1:1,000 w PBS z Ca2+ i Mg2+, 0,1% Tween-20 i 5% surowicy koziej.
    UWAGA: Zastosowanie fragmentów F(ab')2 znacznie zwiększa penetrację przeciwciał do próbki.
  13. Dodać 1 ml roztworu przeciwciał drugorzędowych do każdej studzienki. Inkubować z delikatnym kołysaniem w temperaturze 4 °C w ciemności przez 3 dni.
    UWAGA: Ważne: Od tego momentu zminimalizuj ekspozycję zarodka na bezpośrednie światło. Opcjonalnie: Aby zapobiec rozwojowi bakterii, dodaj 0,2% azydku sodu do roztworu przeciwciał drugorzędowych.
  14. Usunąć drugorzędowy roztwór przeciwciał i umyć zarodki 3 x 30 minut w PBS z Ca2 + i Mg2 +, 0,1% Tween-20 i 5% kozią surowicą. Jeśli nie wykonujesz barwienia aktyny falloidyną lub innymi barwnikami aktyny, po pierwszym myciu dodaj 4′,6-diamidino-2-fenyloindol (DAPI) do PBS z Ca2+ i Mg2+, 0,1% Tween-20 i 5% surowicy koziej i inkubuj przez 1 godzinę, a następnie 3 x 30 min płukania, jak opisano powyżej.
    UWAGA: W tym momencie zarodki mogą być przechowywane przez noc w temperaturze 4 °C w PBS lub HBSS w ciemności aż do etapu osadzania następnego dnia. Zaleca się jednak, aby zarodki zostały natychmiast osadzone i poddane sekcji.

2. Osadzanie, cięcie i montowanie zarodków

  1. Przygotować 4% w/v roztwór agarozy o niskiej temperaturze topnienia (LMP) rozpuszczony w HBSS lub PBS z Ca2+ i Mg2+ do końcowej objętości ~ 3 ml na zarodek. Dodać odpowiednią masę agarozy LMP do HBSS lub PBS z Ca2+ i Mg2+ i podgrzewać w kuchence mikrofalowej, aż agaroza LMP się rozpuści.
    UWAGA: Po rozpuszczeniu agarozy LMP należy przechowywać roztwór w kąpieli perełkowej, inkubatorze lub łaźni wodnej ustawionej na 55 °C, aby zapobiec zestaleniu się roztworu agarozy LMP.
  2. Użyj 12-dołkowej płytki jako formy do osadzania zarodków. Umieścić 12-dołkową płytkę w kąpieli perełkowej o temperaturze 55 °C. Dodaj 2,5-3 ml 4% agarozy LMP do każdej studzienki, w której znajdzie się zarodek.
    UWAGA: Chociaż można stosować inne formy, objętości płytek 12-dołkowych są optymalne do przygotowania bloku agarozy na późniejszych etapach do krojenia.
  3. Za pomocą perforowanej łyżki przenieś zarodki do indywidualnych studzienek zawierających 4% roztwór agarozy LMP (Ryc. 1A).
    1. Przenieś 12-dołkową płytkę z wanny perełkowej na blat. Użyj końcówek pipet, aby delikatnie osadzić i ustawić zarodek tak, aby był wyśrodkowany w roztworze. Po ustawieniu zarodków należy umieścić płytkę w temperaturze -20 °C na 10 minut, aby umożliwić szybkie zestalenie bloku.
      KRYTYCZNE: Upewnij się, że zarodek jest umieszczony w środku bloku. Zarodki, które opadają na dno lub znajdują się zbyt blisko krawędzi formy, prawdopodobnie zostaną usunięte z bloku agarozy podczas cięcia.
  4. Usuń cały blok agarozy ze studzienki za pomocą skalpela i przetnij prostokątny blok wokół zarodka, pozostawiając ~0,3 cm bloku z każdej strony. Pozostaw dodatkową długość wzdłuż ogonowego końca zarodka. Po zamontowaniu na wibratomie ustaw zarodek w pozycji pionowej w górnej części bloku (Ryc. 1B).
  5. Przyłóż pasek taśmy do uchwytu próbki wibratomu i przyklej blok agarozy do taśmy, zorientowany tak, aby ostrze wygenerowało osiowe sekcje zarodka w sekwencji od przodu (czaszki) do tyłu.
  6. Napełnij komorę wibratomu zimnym HBSS, aby upewnić się, że próbka jest całkowicie zanurzona, a następnie otocz komorę lodem.
  7. Ustaw prędkość wibratomu na 0,2 mm/s i częstotliwość od 5 do 7 (50-70 Hz) przy grubości cięcia ustawionej na 100 μm. Wykonaj seryjne cięcie osiowe zarodka.
    UWAGA: Do cięcia używaj niskiej prędkości. Jeśli prędkość cięcia zostanie zwiększona powyżej 0,25 mm/s, cięcie może rozerwać zarodek lub usunąć zarodek z bloku.
    1. Podczas serii krojenia za pomocą kleszczyków delikatnie przełóż poszczególne sekcje do osobnego naczynia o średnicy 60 mm wypełnionego HBSS. Użyj kleszczy, aby chwycić blok, a nie tkankę, aby uniknąć uszkodzenia tkanek i zniszczenia cytonemu.
      UWAGA: Wycinki tkanek powinny pozostać w obrębie bloku agarozowego. Jeśli tkanka wypadnie z bloku do komory wibratomowej, delikatnie przenieś, podnosząc wycinek. Nie chwytaj ani nie ściskaj chusteczki. KRYTYCZNE: Każde fałdowanie skrawków tkanek lub nagłe obchodzenie się z nimi spowoduje zniszczenie utrwalonych cytonemów w skrawkach tkanki.
  8. Jeśli nie wykonujesz barwienia F-aktyną, przejdź do kroku 2.10.
    1. Aby wykonać barwienie F-aktyną, usuń HBSS i inkubuj skrawki przez 40 minut z roztworem Actin-Red i DAPI rozcieńczonym w PBS z Ca2+ i Mg2+, 0,1% Tween-20 i 5% surowicą kozią w temperaturze pokojowej.
  9. Przemyć sekcje 3 x 20 min w PBS z Ca2+ i Mg2+ oraz 0,1% Tween-20.
  10. Za pomocą markera hydrofobowego narysuj hydrofobową barierę wokół krawędzi naładowanego szkiełka mikroskopowego i dodaj niewielką objętość HBSS, aby wypełnić obszar.
  11. Użyj kleszczyków lub perforowanej łyżki, aby przenieść sekcje na szkiełko.
    UWAGA: Wszelkie skrawki tkanek, które nie są otoczone agarozą, można przenieść za pomocą pipety transferowej.
  12. Usuń nadmiar bloku agarozy za pomocą kleszczy.
  13. Po przeniesieniu wszystkich sekcji na szkiełko, usuń nadmiar płynu za pomocą pipetowania i rogu chusteczki chłonnej, a następnie dodaj kilka kropli podłoża mocującego do szkiełka. Użyj wystarczającej ilości podłoża montażowego, aby pokryć cały obszar szkiełka nakrywkowego po utwardzeniu. Zamontuj szkiełko nakrywkowe, delikatnie umieszczając je na szkiełku.
    UWAGA: Unikaj wywierania nacisku lub przeszkadzania szkiełku nakrywkowego, dopóki medium montażowe nie utwardzi się.

3. Obrazowanie

  1. Wykonaj obrazowanie skrawków tkanek pod dowolnym mikroskopem konfokalnym lub mikroskopem o wyższej rozdzielczości11. Przeanalizuj co najmniej trzy zarodki na genotyp.
    UWAGA: Obrazy skrawków tkanek uzyskano za pomocą mikroskopu konfokalnego TCS SP8 STED 3x, a następnie przeprowadzono dekonwolucję LIGHTNING.

Wyniki

Do osadzania i zawieszenia kilku zarodków w krótkim czasie idealne okazało się zastosowanie większej formy w postaci płytki 12-dołkowej z 2,5-3 mL roztworu agarozy na dołek (Rycina 1A). Nadmiar powierzchni pozwala na prawidłową orientację podczas wycinania bloku agarozy do sekcjonowania. Podczas wycinania bloku agarozy ważne jest, aby pozostawić nadmiar agarozy wzdłuż dna bloku, w miejscu, w którym zostanie on przyklejony taśmą do uchwytu szkiełek. Zarodek powinien znajdować się w górnej połowie bloku (Rycina 1B). Jednakże dolna sekcja nie powinna być zbyt duża, ponieważ nadmierna grubość bloku zwiększa ryzyko zmiany kąta cięcia w momencie wbijania ostrza w blok podczas sekcjonowania. Przykłady prawidłowo zorientowanych przekrojów przedstawiono na (Rycina 1C,D).

Podczas opracowywania niniejszego protokołu porównano krojenie w wibratomie z krojeniem w kriotomie. Krojenie tkanek w kriotomie rzadko pozwalało na zachowanie wypustek komórkowych (Rysunek 2 kriotom oraz Rysunek 3A,B wibratom). Przekroje kriotomowe umożliwiły wykrycie niektórych fragmentów błony dodatnich względem GFP pomiędzy komórkami notochordu i rurki neuralnej (Rysunek 2A grot strzałki) oraz pomiędzy sąsiadującymi komórkami rurki neuralnej (Rysunek 2B,B' groty strzałek). Jednak barwienie F-aktyny wypustek komórkowych w silnie nitkowatych komórkach mezenchymalnych otaczających rurkę neuralną było zaburzone w przekrojach kriotomowych (Rysunek 2C,C' strzałka, w porównaniu do Rysunku 3C,D). Wyniki uzyskane za pomocą kriotomu wskazują, że po zastosowaniu tej metody pozostają jedynie niektóre ślady przerwanych wypustek komórkowych. Z tego powodu krojenie w wibratomie jest preferowane, aby efektywnie zachować te delikatne wypustki do późniejszych analiz.

Minimalne naruszenie całego embrionu oraz poszczególnych przekrojów tkanek jest niezbędne dla wysokiej jakości obrazowania wypustek komórkowych. Przekroje tkanek, które uległy jakimkolwiek zagięciom lub wypiętrzeniom, będą widoczne poprzez brak notochordu lub dużą przerwę (>30 µm) między notochordem a brzuszna płytką dna rurki nerwowej (Rysunek 3B). Zazwyczaj towarzyszy temu utrata komórek mezenchymalnych, które normalnie otaczają rurkę nerwą (Rysunek 3A, strzałka). Uszkodzone przekroje spowodują również utratę widocznych wypustek błony komórkowej migrujących między komórkami nabłonkowymi (Rysunek 3B w porównaniu do Rysunku 3A, groty strzałek). Nawet niewielkie zniekształcenia przekrojów mogą spowodować fragmentację wypustek opartych na aktynie i powstanie dużych przerw między komórkami (Rysunek 3D, groty strzałek, w porównaniu do dobrze zachowanego Rysunku 3C), co podkreśla konieczność delikatnego obchodzenia się z próbkami na wszystkich etapach.

Etapy rozwoju zarodka: naczynie hodowlane, preparat do przekroju, mikroskopia fluorescencyjna, barwienie tkanek.
Rysunek 1: Przykład zabarwionego, zatopionego i pociętego na sekcje zarodka E9.5 Shh-Cre; Rosa26 mTmG. (A) Pojedynczy zarodek w płytce 12-dołkowej, zatopiony w 4% agarozie LMP. (B) Przykład prawidłowo zorientowanego zarodka w bloku agarozy dociętym do rozmiaru odpowiedniego do montażu w wibrotomie. Nadmiar bloku agarozy znajduje się u dołu. (C) Obraz w polu jasnym przekroju zarodka o grubości 100 µm zatopionego w agarozie LMP. (D) Obrazowanie immunofluorescencyjne przekroju po usunięciu agarozy. mGFP (zielony) zabarwione przeciwciałem anty-GFP reprezentuje komórki wykazujące ekspresję Shh- w tkance, podczas gdy inne linie komórkowe wykazują ekspresję membranowego Tomato (czerwony), DAPI w kolorze niebieskim. Rura nerwowa (nawias) i notochorda mGFP-dodatnia (strzałka) są wyraźnie widoczne. Paski skali = 1 cm (A), 5 mm (B) i 100 µm (C,D). Skróty: LMP = niska temperatura topnienia; mGFP = membranowe zielone białko fluorescencyjne; Shh = Sonic Hedgehog; DAPI = 4',6-diamidyno-2-fenyloindol. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Obraz z mikroskopii wielofotonowej, mGFP, F-aktyna, DAPI, analiza struktury komórkowej.
Rycina 2: Przykład płyty dna rurki neuralnej i notochordu w przekroju kriostatycznym z fragmentacją wypustek błoniastych. (A) Przekrój o grubości 20 µm zarodka E9.5 Shh-Cre; Rosa26 mTmG19,20,21 barwiony na GFP (zielony), F-aktynę (czerwony) i DAPI (niebieski). Punkty mGFP są widoczne pomiędzy notochordem a płytą dna (grot strzałki) oraz (B,B') migrujące pomiędzy sąsiednimi komórkami rurki neuralnej. (C,C') Barwienie na F-aktynę nie wykazało wyraźnych cytonem na komórkach mezenchymalnych otaczających rurkę neuralną (strzałka). Paski skali = 20 µm. Skróty: mGFP = błoniasty zielony białko fluorescencyjne; Shh = Sonic Hedgehog; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenyloindol. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

Wzrost neuronów, wizualizacja mGFP; obrazy z mikroskopii konfokalnej, F-aktyna, analiza struktury komórkowej.
Rycina 3: Przykłady optymalnych i suboptymalnych przekrojów tkankowych wykonanych wibratomem oraz barwienia płytki dna rurki nerwowej, notochordu i komórek otaczających. Przykłady przekrojów poddanych delikatnej obróbce (A,C) w porównaniu do (B) złożonego przekroju tkankowego oraz (D) przekroju poddanego niewłaściwej obróbce z zarodka Shh-Cre; Rosa26 mTmG oraz ShhGFP/+ 19,20,21. Przekroje poddane optymalnej obróbce umożliwiają wykrycie cytonemów pomiędzy sąsiadującymi komórkami nabłonka neuronalnego płytki dna (A, groty strzałek). Powinny być widoczne sąsiedni rurkę nerwową notochord (A, wykazujący ekspresję mGFP) oraz komórki mezenchymalne (A, strzałka). (C,D) Przekroje barwione na F-aktynę i DAPI powinny wykazywać jednorodne rozmieszczenie komórek mezenchymalnych oraz cytonemów opartych na F-aktynie (strzałki) otaczających rurkę nerwową i notochord (C). Każde niewielkie złożenie lub uszkodzenie przekrojów może spowodować powstanie luk i przerwanie fragmentów F-aktyny (D, groty strzałek). Paski skali = 10 µm. Skróty: mGFP = błonowe zielone białko fluorescencyjne; Shh = Sonic Hedgehog; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenyloindol. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

Dyskusja

Protokół ten został opracowany w celu zachowania delikatnych cytonemów w skrawkach tkanki embrionalnej do mikroskopii fluorescencyjnej o wysokiej rozdzielczości. Do tej pory wizualizacja cytonemów w tkankach różnych organizmów modelowych opierała się w dużej mierze na ektopowej ekspresji białek znakowanych fluorescencyjnie za pomocą obrazowania żywych tkanek. Niestety, stosowanie znakowanego fluorescencyjnie obrazowania na żywo rzadko sprzyja analizie białek o endogennej ekspresji, może wprowadzać ograniczenia czasowe i wymaga specjalistycznych etapów obrazowania i mikroskopów. Opisana tutaj metoda barwienia i cięcia zachowuje cytonemy i inne rozszerzenia komórkowe, aby umożliwić immunohistochemię w celu ostatecznego wykrycia białek o ekspresji endogennej. Technologia ta umożliwi uzyskanie nowych informacji na temat tego, w jaki sposób morfogeny są transportowane przez różne tkanki in vivo , i rozszerzy zakres systemów modelowych, w których można badać cytonemy.

Protokół ten wykorzystuje barwienie całościowe i grube przekroje wibratomowe, co pozwala uniknąć stosowania roztworu równoważącego, takiego jak glicerol lub roztworów krioprotekcyjnych, takich jak sacharoza. Ma na celu zminimalizowanie obsługi tkanek podciętych, aby umożliwić maksymalne zachowanie rozszerzeń komórkowych. Zmniejszone obchodzenie się z tkanką po przekroju zapewniło konsekwentnie lepsze wyniki w ogólnym zachowaniu cytonemu. Tak więc sekcja zarodka jest jednym z ostatnich etapów przed obrazowaniem.

MEM-fix, technika utrwalania opracowana w celu zachowania cytonemów hodowanych komórek, składa się z połączenia aldehydu glutarowego i PFA, które pozwala na lepsze zachowanie 3D wrodzonej architektury komórek porównywalnej z ich żywymi wymiarami16,17. Niestety, MEM-fix nie był przydatny do utrwalania zarodków, ponieważ aldehyd glutarowy może ulegać autofluorescencji i poważnie ogranicza penetrację przeciwciał i wiązanie epitopów w komórkach ze względu na wysoką aktywność sieciowania białek22,23. W związku z tym zoptymalizowano protokoły sekcji po utrwaleniu PFA, aby umożliwić zachowanie rozszerzeń komórkowych w tkance embrionalnej. Chociaż PFA może zachowywać rozszerzenia podobne do cytonemu w tkance embrionalnej, analizę obrazu należy przeprowadzać z ostrożnością. PFA może powodować częściowe odwodnienie pojedynczych komórek i tkanek, co prowadzi do niewielkiego zmniejszenia objętości i tworzenia się małych przestrzeni zewnątrzkomórkowych w utrwalonej tkance.

Protokół ten pozwala uniknąć dodatkowych etapów nasycania sacharozy w celu krioprotekcji i oczyszczania tkanek, ponieważ roztwory sacharozy lub glicerolu mogą powodować niewielkie ponowne nasycenie tkanki24. Powstały niewielki obrzęk może zniszczyć stałe rozszerzenia komórkowe i cytonemy migrujące między komórkami i przez tkanki. Było to widoczne przy porównaniu grubościennych wibratomów z kriostatami. Chociaż zwiększenie grubości tkanki poprawiło zachowanie nienaruszonych cytonemów, skrawki kriostatu ponownie nasycone sacharozą konsekwentnie miały mniejszą częstość występowania wykrywalnych cytonemów.

Optymalizacja tego protokołu wykazała, że skrawki o grubości 100 μm były najlepsze dla zapewnienia zachowania nienaruszonych cytonemów. Cieńsze skrawki są zwykle używane do obrazowania, ponieważ większość mikroskopów konfokalnych jest w stanie obrazować tylko w wystarczającej rozdzielczości, aby uwidocznić rozszerzenia komórkowe na głębokość ~20-40 μm bez usuwania25. Jednak siły mechaniczne i zniekształcenia wywierane na komórki embrionalne z ostrza podczas cięcia cienkich odcinków niszczą cytonemy. Grubsze sekcje pozwalają na uzyskanie większego obszaru głębokości w przekroju, przy jednoczesnym zachowaniu nienaruszonych wyciągów w tkance. Dodatkowo zastosowanie grubszych odcinków pozwala na łatwość obsługi, aby zapobiec nadmiernemu fałdowaniu lub wyboczeniu skrawków tkanki.

Protokół ten został zoptymalizowany pod kątem maksymalnego zachowania cytonemów w tkance zarodków myszy E8-10,5. Minimalna manipulacja tkanką po przekroju zapewniła konsekwentną poprawę ogólnego zachowania cytonemu. Jest prawdopodobne, że konieczna będzie dalsza optymalizacja, aby dostosować technikę do późniejszych etapów rozwoju i wycinków tkanek dorosłych ze względu na zwiększony rozmiar i złożoność tkanki. Będzie to wymagało cięcia, a następnie barwienia immunofluorescencyjnego. Taka tkanka może wymagać dodatkowych etapów oczyszczania i dostosowania obchodzenia się z tkanką podczas sekcjonowania, aby zachować rozszerzenia podobne do cytonemu. Te dodatkowe kroki będą musiały zostać rozważone i podjęte w odniesieniu do przyszłych zastosowań tego protokołu.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do zadeklarowania żadnych sprzecznych interesów.

Podziękowania

Obrazy zostały uzyskane za pomocą mikroskopów utrzymywanych przez Cell and Molecular Biology Imaging Core w St. Jude Children's Research Hospital. Szczepy myszy uzyskano z JAX. Prace te były wspierane przez National Institutes of Health grant R35GM122546 (SKO) oraz przez ALSAC z St. Jude Children's Research Hospital.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
płytka 12-dołkowa; Hodowla komórek młopakowych poddana zabiegowi Thermo Scientific 150628 (Fisher Scientific 12-565-321)
Płytka 24-dołkowa, okrągła NuncThermo Fisher Scientific142475
talerz 60 mm Corning, Falcon353004 (Fisher Scientific 08772F)
Ręczniki chłonne (Professional Kimtech Science Kimwipes)Kimberly-Clark KIMTECH34155 (Fisher Scientific 06666A)
Actin Red 555 ReadyProbes Odczynnik Invitrogen R37112
Alexa Fluor 488 AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Chicken IgY (IgG) (H+L)Jackson Immunoresearch Lab Inc703-546-1551:1,000 stężenie robocze
Bead Bath 6L 230VLab ArmorPozycja #12L048 (Mfr. Model #74220-706)ustawiony na 55 & deg; C
kurczak anty-GFPAves LabsSKU GFP-10201:250 stężenie robocze
komora CO2 zpleksiglasu podłączona do linii emitującej CO2. 
Konfokalny laserowo-skaningowyLeica Microsystemsmodel: Leica TCS SP8
DAPI Solution (1 mg / ml)Thermo Fisher Scientific62248
Nożyczki preparacyjne (Vannas Scissors)World Precision Instruments14003
Dulbecco's Modified Eagle Medium, wysoka glukoza, bez glutaminyThermo Fisher Scientific, Gibco11960044
Pipeta jednokanałowa Eppendorf Research Plus, 0,1-2,5 i mikro; LEppendorf3123000012
Pipeta jednokanałowa Eppendorf Research Plus, 0,5-10 &mikro; LEppendorf3123000020
Pipeta jednokanałowa Eppendorf Research Plus, 100-1 000 &mikro; LEppendorf3123000063
Pipeta jednokanałowa Eppendorf Research Plus, 20-200 &mikro; LEppendorf3123000055
Jednorazowy skalpel z piór #10Fisher Scientific Nr katalogowy NC9999403
Surowica bydlęca płodu, certyfikowana, Stany ZjednoczoneThermo Fisher Scientific, Gibco16000044
Kleszcze precyzyjne Fisherbrand Fine PointFisher Scientific 22-327379
Taśma etykietująca FisherbrandFisher Scientific 15-954
Formaldehyd, 16%, bez metanolu, Ultra Pure EM GradePolysciences18814-10
Zrównoważony roztwór soli Hanka (HBSS)Thermo Fisher Scientific, Gibco14025
Długopis do pap z hydrofobową barierą ImmEdge Vector laboratoriesH-4000
Leica Application Suite X (LAS X) z LIGHTNINGOprogramowanie Leica MicrosystemsMicroscope
L-Glutamina (200 mM)Thermo Fisher Scientific, Gibco25030081
Agaroza o niskiej temperaturze topnienia - UltraPureInvitrogen 16520
MEM Roztwór aminokwasów endogennych (100x)Thermo Fisher Scientific, Gibco11140050
Moria MC 17 BIS Perforowana łyżkaFine Science Tools 
Nośniki montażowe (ProLong Diamond Antifade Mountant) Thermo Fisher Scientific, InvitrogenP36961 
Mysz: B6.129X1(Cg)-Shhtm6Amc/J (ShhGFP/+)Szczep laboratoryjny Jackson#:008466
Mysz: B6. Cg-Shhtm1(EGFP/cre)Cjt/J (Shh-Cre)Mysz Jackson LaboratoryStrain #:005622
: C57BL/6J (B6)Mysz Jackson LaboratoryStrain #:000664
: Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdPomidor,-EGFP)Luo/J (Rosa26 mTmG)Szczep laboratoryjny Jackson#:007576
Normalna surowica kozia Jackson ImmunoResearch005-000-121 (Fisher Scientific NC9660079)
PBS + Ca2+ + Mg2+ Thermo Fisher Scientific, Gibco14040133
Premium: 1,5 mlFisher Scientific 05-408-129
Końcówki SHARP Precision Barrier, bardzo długie do P-10 i Eppendorf 10 µ LDenville ScientificP1096-FR
SHARP Precyzyjne końcówki barierowe, do P-1000 i Eppendorf 1,000, 1,250 i mikro; LDenville ScientificP1126
SHARP Precyzyjne końcówki barierowe, do P-20 i Eppendorf 20 & LDenville ScientificP1121
SHARP Precyzyjne końcówki barierowe, do P-200 i Eppendorf 200 µ LDenville ScientificP1122
Azydek soduSigma-AldrichS8032
Pirogronian sodu (100 mM) (100x)Thermo Fisher Scientific, Gibco11360070
Super GlueGorilla
SuperFrost Plus Fisher Naukowy 12-550-15
Probówki wirówkowe TPP, pojemność 15 mL, polipropylenTPP Techno Plastic Products91015
Probówki wirówkowe TPP, pojemność 50 mL, polipropylenTPP Techno Plastic Products91050
Pipeta transferowa, polietylenMillipore SigmaZ135003
Triton X-100 Sigma-AldrichT9284
Tween-20 Sigma-AldrichP1379
Vari-Mix Platform RockerThermo Fisher Scientific09-047-113Qustawiony na 20 obr./min
VibratomeLeica BiosytemsVT1000 S
mikroskop 1037018Probówki do mikrowirówek Szkiełka mikroskopowe

Bibliografia

  1. Crick, F. Diffusion in embryogenesis. Nature. 225 (5231), 420-422 (1970).
  2. Zeng, X., et al. A freely diffusible form of Sonic hedgehog mediates long-range signalling. Nature. 411 (6838), 716-720 (2001).
  3. Yu, S. R., et al. Fgf8 morphogen gradient forms by a source-sink mechanism with freely diffusing molecules. Nature. 461 (7263), 533-536 (2009).
  4. Zhou, S., et al. Free extracellular diffusion creates the Dpp morphogen gradient of the Drosophila wing disc. Current Biology. 22 (8), 668-675 (2012).
  5. Ribes, V., Briscoe, J. Establishing and interpreting graded Sonic Hedgehog signaling during vertebrate neural tube patterning: the role of negative feedback. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 1 (2), 002014(2009).
  6. Le Dréau, G., Martí, E. Dorsal-ventral patterning of the neural tube: a tale of three signals. Developmental Neurobiology. 72 (12), 1471-1481 (2012).
  7. Kornberg, T. B., Guha, A. Understanding morphogen gradients: a problem of dispersion and containment. Current Opinion in Genetics & Development. 17 (4), 264-271 (2007).
  8. Ramirez-Weber, F. A., Kornberg, T. B. Cytonemes: cellular processes that project to the principal signaling center in Drosophila imaginal discs. Cell. 97 (5), 599-607 (1999).
  9. Sanders, T. A., Llagostera, E., Barna, M. Specialized filopodia direct long-range transport of SHH during vertebrate tissue patterning. Nature. 497 (7451), 628-632 (2013).
  10. Bischoff, M., et al. Cytonemes are required for the establishment of a normal Hedgehog morphogen gradient in Drosophila epithelia. Nature Cell Biology. 15 (11), 1269-1281 (2013).
  11. Hall, E. T., et al. Cytoneme delivery of sonic hedgehog from ligand-producing cells requires Myosin 10 and a dispatched-BOC/CDON co-receptor complex. eLife. 10, 61432(2021).
  12. Huang, H., Kornberg, T. B. Cells must express components of the planar cell polarity system and extracellular matrix to support cytonemes. eLife. 5, 18979(2016).
  13. Brunt, L., et al. Vangl2 promotes the formation of long cytonemes to enable distant Wnt/β-catenin signaling. Nature Communications. 12 (1), 2058(2021).
  14. Roy, S., Huang, H., Liu, S., Kornberg, T. B. Cytoneme-mediated contact-dependent transport of the Drosophila decapentaplegic signaling protein. Science. 343 (6173), 1244624(2014).
  15. Mattes, B., et al. Wnt/PCP controls spreading of Wnt/β-catenin signals by cytonemes in vertebrates. eLife. 7, 36953(2018).
  16. Bodeen, W. J., Marada, S., Truong, A., Ogden, S. K. A fixation method to preserve cultured cell cytonemes facilitates mechanistic interrogation of morphogen transport. Development. 144 (19), 3612-3624 (2017).
  17. Hall, E. T., Ogden, S. K. Preserve cultured cell cytonemes through a modified electron microscopy fixation. Bio-protocol. 8 (13), (2018).
  18. American Veterinary Medical Association. AVMA guidelines for the euthanasia of animals. American Veterinary Medical Association. , (2020).
  19. Harfe, B. D., et al. Evidence for an expansion-based temporal Shh gradient in specifying vertebrate digit identities. Cell. 118 (4), 517-528 (2004).
  20. Chamberlain, C. E., Jeong, J., Guo, C., Allen, B. L., McMahon, A. P. Notochord-derived Shh concentrates in close association with the apically positioned basal body in neural target cells and forms a dynamic gradient during neural patterning. Development. 135 (6), 1097-1106 (2008).
  21. Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).
  22. Bacallao, R., Sohrab, S., Phillips, C. Handbook Of Biological Confocal Microscopy. Pawley, J. B. , Springer US. 368-380 (2006).
  23. Tagliaferro, P., Tandler, C. J., Ramos, A. J., Pecci Saavedra, J., Brusco, A. Immunofluorescence and glutaraldehyde fixation. A new procedure based on the Schiff-quenching method. Journal of Neuroscience Methods. 77 (2), 191-197 (1997).
  24. Neckel, P. H., Mattheus, U., Hirt, B., Just, L., Mack, A. F. Large-scale tissue clearing (PACT): Technical evaluation and new perspectives in immunofluorescence, histology, and ultrastructure. Scientific Reports. 6 (1), 1-13 (2016).
  25. Clendenon, S. G., Young, P. A., Ferkowicz, M., Phillips, C., Dunn, K. W. Deep tissue fluorescent imaging in scattering specimens using confocal microscopy. Microscopy and Microanalysis. 17 (4), 614-617 (2011).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Sygnalizacja morfogen wutrwalanie tkanekprotok immunobarwieniasekcjonowanie w wibratomiemikroskopia konfokalnabarwienie F aktynyrozw j cewy nerwowejwypustki kom rkowe
Utrwalanie zarodkowej tkanki myszy do analizy cytonemu
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.