Sferoidy nowotworowe są coraz częściej wykorzystywane do oceny interakcji komórek nowotworowych z mikrośrodowiskiem i odpowiedzi na terapię. Niniejszy protokół opisuje solidną, ale prostą metodę pół-wysokoprzepustowego obrazowania sferoid guza 3D przy użyciu szybkiego usuwania optycznego.
Artykuł metodologiczny
Szybkie oczyszczanie optyczne do półwysokoprzepustowej analizy sferoidów nowotworowych
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Sferoidy nowotworowe szybko stają się powszechne w podstawowych badaniach nad rakiem i opracowywaniu leków. Uzyskanie danych dotyczących ekspresji białek w sferoidzie na poziomie komórkowym jest ważne dla analizy, jednak istniejące techniki są często drogie, pracochłonne, wykorzystują niestandardowy sprzęt, powodują znaczne zniekształcenia rozmiaru lub są ograniczone do stosunkowo małych sferoid. Protokół ten przedstawia nową metodę montażu i czyszczenia sferoid, która rozwiązuje te problemy, umożliwiając jednocześnie konfokalną analizę wewnętrznej struktury sferoid. W przeciwieństwie do istniejących podejść, protokół ten przewiduje szybki montaż i usunięcie dużej liczby sferoid przy użyciu standardowego sprzętu i materiałów laboratoryjnych. Umieszczenie sferoid w roztworze żelu agarozy-PBS o neutralnym pH przed wprowadzeniem roztworu czyszczącego o dopasowanym współczynniku załamania światła minimalizuje zniekształcenia wielkości typowe dla innych podobnych technik. Pozwala to na szczegółową analizę ilościową i statystyczną, w której dokładność pomiarów wielkości jest najważniejsza. Ponadto, w porównaniu z płynnymi roztworami do oczyszczania, technika żelu agarozowego utrzymuje sferoidy na miejscu, co pozwala na gromadzenie trójwymiarowych (3D) obrazów konfokalnych. W niniejszym artykule omówiono, w jaki sposób metoda ta pozwala uzyskać wysokiej jakości obrazy dwu- i trójwymiarowe, które dostarczają informacji o zmienności międzykomórkowej i wewnętrznej strukturze sferoidalnej.
Wprowadzenie
Trójwymiarowe (3D) hodowle komórek, takie jak sferoidy, dostarczają biologicznie realistycznych i powtarzalnych modeli zagregowanego wzrostu komórek1,2. Modele te szybko stają się powszechne zarówno w badaniach podstawowych, jak i w opracowywaniu leków, gdzie różnice w wielkości i strukturze sferoidów są badane między terapiami w celu ustalenia skuteczności leku3,4. W tych kontekstach możliwość zbierania szczegółowych informacji z dużej liczby sferoid jest bardzo korzystna, zarówno z perspektywy mocy statystycznej, jak i umożliwia szybką ocenę zachowania komórek w kilku terapiach.
Powszechnie stosowane techniki uzyskiwania szczegółowych obrazów mikroskopowych struktury sferoidów są albo czasochłonne, drogie, albo dają obrazy niskiej jakości, które nie zachowują kluczowych cech ilościowych, takich jak rozmiar sferoidy4,5. Na przykład techniki histologiczne oparte na kriosekcji mogą zapewnić wysokiej jakości obrazy, ale często są czasochłonne, wymagają wykwalifikowanej siły roboczej i często tworzą artefakty przekrojowe6,7, podczas gdy eleganckie technologie, takie jak mikroskopia oświetlenia jednopłaszczyznowego (SPIM)8 i mikroskopia wielofotonowa9 wymagają specjalistycznych mikroskopów, które nie są łatwo dostępne. Nowoczesne technologie mikroskopowe umożliwiły ostatnio tak zwane cięcie optyczne, w którym sferoidy są umieszczane w roztworze oczyszczającym o dopasowanym współczynniku załamania światła, a obrazy uzyskuje się za pomocą mikroskopii konfokalnej4,5. Chociaż techniki te mają potencjał do uzyskania wysokiej wydajności, typowe problemy obejmują ruch sferoidalny podczas obrazowania, zniekształcenie rozmiaru podczas oczyszczania oraz wysokie koszty zastrzeżonych rozwiązań czyszczących. Co więcej, wiele istniejących protokołów ma zastosowanie tylko do stosunkowo małych sferoid o średnicy mniejszej niż 300 μm lub głębokości do 100 μm, ograniczając technologię do wczesnych etapów wzrostu guza5,10,11.
Obecny protokół pozwala na średnio wysokoprzepustowe, wysokowydajne zbieranie szczegółowych obrazów sferoidów przy użyciu taniego rozwiązania do oczyszczania o dopasowanym współczynniku załamania światła, pochodzącego z procedur oczyszczania całego narządu12,13. Aby zapobiec ruchom sferoidów podczas obrazowania i zapewnić wsparcie strukturalne w celu zmniejszenia zniekształceń rozmiaru, sferoidy są zamontowane w żelu agaroza-PBS w 24-dołkowej szklanej płycie dolnej #1,5. Ponieważ technika ta pozwala na zamontowanie wielu sferoid w każdym dołku na 24-dołkowej płytce, można szybko zamontować i zobrazować do 360 sferoid (15 sferoid na studzienkę) w różnych warunkach eksperymentalnych. Dopasowane do współczynnika załamania światła rozwiązanie czyszczące, zbudowane z łatwo dostępnych materiałów eksploatacyjnych, służy do optycznego usuwania zamontowanych sferoid i otaczającego je żelu. Po okresie ustabilizowania się wynoszącym 24 godziny, protokół ten zapewnia wysokiej jakości obrazy 2D i 3D struktury sferoidalnej, nawet dla stosunkowo dużych sferoid (o średnicy około 700 μm), z mniej niż 2% zniekształceniem rozmiaru.
Protokół
Protokół opisuje przygotowanie wystarczającej ilości sferoid nowotworowych do zamontowania jednej płytki 24-dołkowej (około 240-360 sferoid lub 10-15 sferoidów/studzienkę) przy 200 μl żelu agarozowego na studzience i 500 μL roztworu oczyszczającego na studzienkę. Cała procedura jest zilustrowana w Rysunek 1.
1. 2% preparat w żelu agaroza-PBS
- Odważyć 0,5 g niskotopliwej agarozy (patrz Tabela Materiałów) w szklanej butelce i dodać 25 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).
- Rozpuść agarozę, gotując roztwór w kuchence mikrofalowej przez 30-60 s z zamkniętą, ale nie uszczelnioną pokrywką i ciągłym wirowaniem. Upewnij się, że agaroza jest całkowicie rozpuszczona, a roztwór nie wykipi.
UWAGA: Żel można przechowywać w temperaturze pokojowej; Sprawdź objętość przed użyciem, aby uwzględnić parowanie. Doprowadzić do stanu ciekłego (kuchenka mikrofalowa; 20-60 s z wirowaniem) przed użyciem.
2. Przygotowanie roztworu oczyszczającego
- Odważyć 9 g N,N,N′,N′-tetrakis(2-hydroksypropylo)etylenodiaminy, 22 g mocznika, 44 g sacharozy, 0,1 g Tritona X-100 i 24,9 g wody dejonizowanej (patrz tabela materiałów).
UWAGA: Łatwiej jest zważyć przybliżoną ilość N,N,N′,N′-Tetrakis(2-Hydroksypropylo)etylenodiaminy i dostosować wagę pozostałych składników, aby uzyskać pożądane stężenie. - Podgrzewać roztwór w łaźni wodnej o temperaturze 56 °C z ciągłym mieszaniem i kontynuować, aż wszystkie kryształy się rozpuszczą.
- Roztwór należy odstawić w temperaturze pokojowej, aby pęcherzyki powstałe podczas mieszania wypłynęły na powierzchnię. Roztwór jest stabilny w temperaturze pokojowej do 2 miesięcy.
3. Przygotowanie sferoidy
- Generuj sferoidy za pomocą metody nakładki agarozowej, jak opisano wcześniej1,3,14.
UWAGA: Sferoidy generowane innymi metodami są również kompatybilne z tym protokołem obrazowania. - Odetnij końcówkę końcówki pipety o pojemności 1 ml za pomocą skalpela, aby powiększyć otwór.
UWAGA: Wszystkie sferoidy były obsługiwane za pomocą pipet o pojemności 1 ml lub 200 μl z naciętymi końcówkami. - Za pomocą pipety odessać sferoidy z dołków i przenieść je do przezroczystej stożkowej probówki o pojemności 1,5 ml. Wiele sferoid z tych samych warunków może być połączonych w tej samej rurze.
UWAGA: Zawsze pozwól, aby sferoidy osiadły na dnie rurki, aby zassać medium. - Umyć sferoidy w 1 ml PBS dwukrotnie, dodać obojętny 4% wstępnie podgrzany roztwór paraformaldehydu (PFA) i inkubować sferoidy w temperaturze 37 °C przez 20 minut.
- Usunąć roztwór PFA i dwukrotnie przemyć sferoidy 1 ml PBS.
4. Barwienie sferoidów
- Za pomocą pipety przenieś do 15 sferoid do probówki PCR o pojemności 200 μl.
UWAGA: W przypadku sferoid delikatnych zamontuj sferoidy w żelu (kroki 5.1-5.4) przed kontynuowaniem. - Przepuszczalność komórek za pomocą 200 μl 0,5% Triton X-100 w PBS. Umieść probówki PCR w probówkach z nakrętką o pojemności 50 ml i inkubuj sferoidy przez 2 godziny w temperaturze pokojowej z łagodnym mieszaniem.
UWAGA: Wszystkie inkubacje wykonuje się z mieszaniem na wirniku, walcu lub wytrząsarce (patrz Tabela materiałów), chyba że określono inaczej. Jest to ważne, aby uzyskać jednolite barwienie. Stałe sferoidy w PBS mogą czasami przyklejać się do boków końcówki pipety. Przepłukanie końcówki w 0,5% Triton X-100 minimalizuje przywieranie sferoid do końcówek. - Zastąp roztwór (krok 4.2) 200 μl buforu do rozcieńczania przeciwciał (ABDIL)15 i inkubuj przez noc w temperaturze pokojowej.
- Usunąć ABDIL, dodać 75 μl pierwszorzędowego przeciwciała do ABDIL i inkubować w temperaturze 4 °C przez 2,5 dnia.
- Usunąć supernatant i przemyć 200 μl PBS z 0,1% Tween i 0,1% Triton X-100 (PBS-TT) dwukrotnie i inkubować z 200 μl PBS-TT przez 4 godziny w temperaturze pokojowej.
- Usunąć PBS-TT, dodać 100 μl przeciwciała drugorzędowego do ABDIL i inkubować w temperaturze 4 °C przez 2,5 dnia.
UWAGA: Na tym etapie można dodać DAPI lub inny barwnik jądrowy. Większość barwników wymaga krótszego czasu inkubacji niż przeciwciała. - Usunąć supernatant i przemyć dwukrotnie 200 μl PBS-TT i inkubować z 200 μl PBS-TT przez 4 godziny. Sferoidy są gotowe do montażu.
5. Montaż
- Za pomocą pipety o pojemności 200 μl przenieś utrwalone i wybarwione sferoidy do probówek PCR o pojemności 500 μl po jednej probówce na warunek (około 10-15 sferoid).
- Zastąp roztwór 200 μl 2% (w/v) płynnego żelu agarozowego i odwiruj na szybkim wirowaniu (z ustaloną maksymalną prędkością, patrz Tabela Materiałów) w temperaturze pokojowej przez 30 s.
UWAGA: W przypadku natychmiastowego montażu należy umieścić w bloku grzewczym w temperaturze 50 °C, aby uniknąć stwardnienia żelu. - Zassać sferoidy w ~ 50 μl płynnego żelu agarozowego i dozować do dołka 24-dołkowej płytki ze szklanym dnem.
- Zanim żel stwardnieje, oddziel sferoidy za pomocą końcówki pipety w otaczającym żelu i upewnij się, że sferoidy są pokryte żelem. Opcjonalnie umieść płytkę na lodzie, aby szybko stężał żel.
UWAGA: Liczba sferoid w studzience zależy od wielkości sferoid. Sferoidy są umieszczone daleko od siebie, tak że tylko jedna sferoida wchodzi w pole widzenia podczas obrazowania. Jest to ważne dla zautomatyzowanego przetwarzania obrazu. - Dodaj 500 μl roztworu czyszczącego (krok 2) do dołka, upewniając się, że żel jest zanurzony. Inkubować w temperaturze pokojowej przez co najmniej 24 godziny i zobrazować sferoidy w roztworze oczyszczającym. Sferoidy są stabilne w tym roztworze do miesiąca w temperaturze pokojowej i gdy są chronione przed parowaniem.
6. Obrazowanie
- Wybierz obiektyw, którego odległość robocza jest wystarczająco duża, aby objąć całą sferoidę, w tym wysokość montażu sferoidy w zbiorniku.
UWAGA: Obiektywy o odległości roboczej 3 mm lub większej są wymagane do obrazowania płaszczyzny równikowej sferoid. Obiektywy o większym powiększeniu i wyższym NA mogą pozwolić na lepszą rozdzielczość, ale ograniczą maksymalną głębokość, na której można obrazować sferoidy. - Aby zidentyfikować płaszczyznę równikową, dostosuj ostrość, aż zostanie osiągnięta największa powierzchnia w płaszczyźnie XY i zobrazuj z wymaganym procentem mocy lasera, napięciem detektora, wzmocnieniem i ustawieniami przesunięcia.
UWAGA: Procent mocy lasera, napięcie detektora, wzmocnienie i przesunięcie będą się znacznie różnić w zależności od fluoroforu, intensywności barwienia, intensywności lasera, czułości detektora itp. - W przypadku obrazów 3D ustaw początek i koniec sferoid i wybierz odpowiednią intensywność sygnału przy różnych głębokościach z, korzystając z ustawień korekcji intensywności z przed obrazowaniem.
UWAGA: Aby uzyskać najlepszą rozdzielczość obrazu, użyj częstotliwości próbkowania Nyquist dla x, y i z (aby uzyskać szczegółowe informacje, zobacz reference16).
Wyniki
Aby zademonstrować zdolność tej metody klarowania do uzyskiwania wysokiej jakości obrazów dwu- i trójwymiarowych, z linii komórkowych czerniaka FUCCI-WM164 i FUCCI-WM983b9,17, przetransdukowanych wskaźnikiem cyklu komórkowego opartym na fluorescencyjnej ubikwitynacji (Fluorescent Ubiquitination-based Cell Cycle Indicator – FUCCI), wyhodowano sferoidy o średnicach 300-600 µm zgodnie z procedurami opisanymi w kroku 31,3,14. Linie te wykazują ekspresję białka monomeric Kusabira Orange2 (mKO2) w fazie Gap1 oraz monomeric Azami Green (mAG) odpowiednio we wczesnej fazie S/fazie Gap2/mitozie cyklu komórkowego. Sferoidy utrwalono następnie 4% roztworem formaldehydu w 37 °C, poddano permeabilizacji i zabarwiono przeciwciałami anti-p27kip1/anti-rabbit Alexa Fluor 647 anti-pimonidazole/anti-mouse Alexa Fluor 647, DAPI lub DRAQ7 (patrz Tabela Materiałów) (Rysunek 2). Wszystkie pliki z mikroskopii zostały przesłane do repozytorium GitHub (https://github.com/ap-browning/SpheroidMounting). W porównaniu z sferoidami zamontowanymi w PBS, roztwór klarujący zapewnia obrazy o wysokiej przejrzystości przy minimalnym zniekształceniu rozmiaru (Rysunek 2A). Protokół umożliwia obrazowanie o wysokiej rozdzielczości detali na poziomie komórkowym w głębszych warstwach sferoidów bez konieczności wykonywania sekcji histologicznych; obraz przekroju uzyskano przy użyciu obiektywu powietrznego 20x (0.7 NA) przy rozdzielczości 4096 x 4096 px bez szycia obrazu (Rysunek 2B). Przy użyciu obiektywu o mniejszym powiększeniu i niższej aperturze numerycznej z dłuższą odległością roboczą można uzyskać konfokalne obrazy 3D, które zapewniają szczegóły na poziomie komórkowym na głębokości co najmniej 200 µm (Rysunek 2C). Sferoidy poddano również kriosekcjonowaniu i barwieniu zgodnie z protokołem Spoerri i wsp.4, a następnie porównano je z barwieniem całych sferoidów (Rysunek 2D,E). Rysunek 2D przedstawia region hipoksyczny sferoidu zabarwiony pimonidazolem, a Rysunek 2E pokazuje barwienie p27kip1 wyznaczające zatrzymanie cyklu komórkowego (kolor żółty) oraz barwienie jąder DAPI (kolor szary). Lokalizacja białek i wzór barwienia są podobne w przypadku kriosekcjonowania i klarowania, co oznacza, że nie wpływa na nie zastosowana metoda klarowania.
Korekcja intensywności sygnału w osi z umożliwia obrazowanie całego sferoidu. Jednak rozpraszanie światła spowodowane martwiczym rdzeniem ogranicza możliwość obrazowania dalszej strony sferoidu. Głębsza penetracja i mniejsze rozpraszanie fluoroforu dalekiej czerwieni, takiego jak barwnik jądrowy DRAQ7, pozwala na jeszcze lepszą reprezentację struktury 3D sferoidu (Rycina 3). Film 1 przedstawia rendering 3D sferoidów FUCCI zabarwionych DRAQ7. Cieńszy przekrój w osi z może zapewnić lepszą rozdzielczość w osi z, ale znacząco zwiększa to czas obrazowania oraz fotoblaknięcie fluoroforów.
Aby określić, czy roztwór przejaśniający powoduje zniekształcenie rozmiaru, dwanaście sferoidów w 2% żelu agaroza-PBS obrazowano po 6 h, 12 h, 24 h, 72 h i 168 h od wprowadzenia roztworu przejaśniającego. Obrazy podsumowano poprzez wyznaczenie średnicy sferoidu, zdefiniowanej na podstawie sfery o polu przekroju równym polu przekroju sferoidu (Ryc. 4A). Chociaż zaobserwowano niewielki wzrost rozmiaru sferoidów w ciągu pierwszych 6 h, co wskazuje zmiana średnicy o 2% do 6% (Ryc. 4B), po 24 h do 72 h sferoidy wracają do rozmiaru w przybliżeniu równego rozmiarowi w PBS po fiksacji PFA (Ryc. 4C).
Rysunek 1: Ilustracja protokołu montowania i klarowania sferoidów. Utrwalone i barwione sferoidy są przenoszone do probówki 500 µL; nadmiar płynu zastępuje się 200 µL żelu agarozowo-PBS, a następnie próbkę poddaje się wirowaniu. Sferoidy są następnie przenoszone do dołka z szklanym dnem w płytce 24-dołkowej. Po zestaleniu żelu dodaje się 500 µL roztworu klarującego i pozwala sferoidom na equilibrację. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rysunek 2: Porównanie sklarowanych i niesklarowanych sferoidów ludzkiego czerniaka FUCCI. Kolorowanie wskazuje jądra komórkowe dodatnie dla mKO2 (czerwony), co oznacza komórki w fazie G1; oraz jądra komórkowe dodatnie dla mAG (zielony), co oznacza komórki w fazie G2. (A) Sferoidy hodowane z 5000 komórek FUCCI-WM983b, zebrane w 10. dniu i obrazowane w żelu agaroza-PBS oraz 24 h po dodaniu roztworu klarującego. Porównanie obrazów w polu jasnym i konfokalnych przed i po zastosowaniu roztworu klarującego wykazuje minimalne zniekształcenie rozmiarów i znaczny wzrost przejrzystości. Obrazy uzyskano przy użyciu obiektywu 10x. (B) Sferoidy hodowane z komórek FUCCI-WM164, permeabilizowane przy użyciu Triton X-100 i barwione DRAQ7, barwiącym wszystkie jądra komórkowe. Obraz uzyskano przy użyciu obiektywu 20x (0,75 NA), co demonstruje, że roztwór klarujący umożliwia obrazowanie z wysoką rozdzielczością szczegółów na poziomie komórkowym. (C) Obrazy 3D (10x, 0,4 NA) sferoidów FUCCI-WM164 w PBS oraz 24 h po dodaniu roztworu klarującego. Regulacja mocy lasera, napięcia i przesunięcia (offset) na różnych płaszczyznach z umożliwia obrazowanie głębszych warstw sferoidu. (D,E) Porównanie krioprzekroju i sklarowanego całego sferoidu barwionego na pimonidazol i p27kip1. (D) Barwienie pimonidazolem w kolorze purpurowym pokazuje obszar hipoksyczny w sferoidach. Kolor czerwony i zielony wskazują FUCCI. (E) Krioprzekroje i sklarowany sferoid wykazujące DAPI (szary) i p27kip1 (żółty). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rycina 3: Przejaśnianie umożliwia obrazowanie głębszych warstw sferoidu przy minimalnej utracie światła. Obrazy z mikroskopii konfokalnej sferoidu ludzkiego czerniaka FUCCI przy powiększeniu 10x i niższej aperturze numerycznej (NA 0,4), co pozwala na obrazowanie na większej głębokości z minimalną utratą sygnału. (A) Przekroje o grubości 3,88 µm jąder sferoidu barwionych DRAQ7. (B-D) Rozdzielczość y/z odpowiednio w kanałach 488 nm (mAG), 568 nm (mKO2) i 647 nm (DRAQ7). Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.
Rysunek 4: Roztwór klarujący ma minimalny wpływ na wielkość sferoidów.(A) Rozkład początkowej wielkości sferoidów (średnica równoważna) w żelu PBS (n = 12 sferoidów). (B) Zmiana krotności średnicy w czasie od momentu dodania roztworu klarującego. W 0 h sferoidy znajdują się wyłącznie w żelu PBS. (C) Rozkład zmian krotności średnicy w 12 h, 24 h i 72 h. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.
Film 1: Rendering 3D sferoidu FUCCI barwionego DRAQ7. Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.
Dyskusja
Przedstawiono tutaj protokół uzyskiwania wysokiej jakości dwu- i trójwymiarowych obrazów sferoid guza. Istniejące metody, takie jak CLARITY, See deep brain (SeeDB) i ScaleS, często powodują zniekształcenia rozmiaru nawet o 30%, podczas gdy techniki takie jak alkohol benzylowy / benzoesan benzylu (BABB) i obrazowanie 3D narządów oczyszczonych rozpuszczalnikiem (3DISCO) mogą wygasić białko fluorescencyjne18. Wiele z tych metod ma na celu oczyszczanie tkanek z integralności strukturalnej i zniekształcanie rozmiaru i struktury po zastosowaniu do sferoid18. W przeciwieństwie do innych protokołów, które wykorzystują dostępne na rynku drogie rozwiązania clearingowe, ten protokół wykorzystuje łatwo dostępne materiały eksploatacyjne przy zachowaniu przejrzystości optycznej i endogennej fluorescencji oraz zminimalizowaniu zniekształceń rozmiaru. Osadzanie sferoid w żelu agaroza-PBS zapewnia strukturalne wsparcie dla sferoid i minimalizuje szok osmotyczny po dodaniu roztworu klarującego. Ma to kluczowe znaczenie podczas obrazowania kruchych sferoid po leczeniu farmakologicznym. Zakłada się, że ta metoda optycznego oczyszczania jest odpowiednia dla sferoid utworzonych dowolną metodą, ponieważ protokół ten jest dostosowany do oczyszczania całych tkanek. Założenie opiera się na podobieństwie sferoid uzyskanych różnymi metodami tworzenia sferoid. Wybór utrwalacza może mieć wpływ na wielkość sferoidy, a także na fluorescencję endogenną. Ta metoda oczyszczania jest odpowiednia dla sferoid utrwalonych neutralnym 4% roztworem PFA. Wymagane są dalsze badania w celu sprawdzenia jego kompatybilności z innymi utrwalaczami.
Biorąc pod uwagę, że technika ta pozwala na jednoczesne montowanie wielu sferoid w płytce wielodołkowej, dobrze nadaje się do potoków analizy ilościowej, które wymagają informacji o strukturze sferoidów z maksymalnie 360 sferoid na płytkę 24-dołkową. Mikroskopy z funkcjami automatycznego mapowania stolika i płytki mogą sprawić, że obrazowanie będzie mniej ręczne. Mimo że ta metoda jest szybsza i łatwiejsza niż cięcie, obecnie nie nadaje się do pełnej automatyzacji. Jednak obrazy uzyskane tą metodą nadają się do automatycznego przetwarzania obrazów 4,19, a szybkość, z jaką sferoidy mogą być montowane za pomocą tego protokołu, nadaje się do ilościowej analizy wewnętrznej struktury sferoidalnej 20,21,22.
W przypadku barwienia całych sferoid stężenie, objętość i czas inkubacji przeciwciał muszą być zoptymalizowane dla każdego przeciwciała. Jako wskazówkę należy stosować 2,5x zalecanego stężenia przeciwciał immunofluorescencyjnych 2D i 100-200 μl przeciwciała, w zależności od liczby sferoid w probówce. Upewnij się, że wszystkie sferoidy są pokryte roztworem barwiącym, gdy znajdują się na wirniku. Czas inkubacji zależy od wielu czynników, w tym wielkości i gęstości sferoid oraz przeciwciała, i może wynosić od 16 do 72 godzin. Pomimo metody pozwalającej na detekcję sygnału w głębszych warstwach sferoidy, fluorofory wzbudzone promieniowaniem UV powodują znaczne rozpraszanie światła, co prowadzi do niskiego stosunku sygnału do szumu. Należy zachować ostrożność przy wyborze fluoroforów do wizualizacji docelowego białka. Na przykład barwienie mniej obfitych i strukturalnych białek za pomocą fluoroforów o dłuższej długości fali i bardziej obfitych białek lub barwień jądrowych za pomocą fluoroforów o krótszej długości fali pozwoli osiągnąć najlepszy wynik. Wreszcie, oczyszczone sferoidy nadal wykazują utratę światła z powodu rozpraszania w nekrotycznym jądrze, co jest widoczne w wymiarze y/z obrazów uzyskanych ze sferoid o średnicy 600 μm (Rysunek 2C).
Obrazowanie w większym powiększeniu przy wyższych obiektywach NA jest możliwe przy sferoidach zamontowanych i oczyszczonych przy użyciu tego protokołu, ale odległość robocza obiektywu ogranicza głębokość obrazowania. W przypadku soczewek olejowych ważne jest, aby używać oleju o RI 1,51, aby uzyskać najlepszy wynik.
Podsumowując, metoda oczyszczania z wbudowanym żelem agarozy-PBS pozwala na wizualizację komórek głęboko wewnątrz sferoid przy użyciu powszechnie dostępnych materiałów eksploatacyjnych. Sferoidy zamontowane i oczyszczone przy użyciu tej metody ulegają minimalnym zniekształceniom rozmiaru i zachowują swoją integralność strukturalną, co pozwala na gromadzenie wysokiej jakości danych dotyczących wewnętrznej struktury sferoidalnej, a następnie automatyczną kwantyfikację.
Oświadczenia
Firma Olympus partycypowała w kosztach publikacji.
Podziękowania
To badanie zostało przeprowadzone w Instytucie Badań Translacyjnych (TRI), Woolloongabba, QLD. TRI jest wspierany przez grant rządu australijskiego. Dziękujemy personelowi centrum mikroskopii w TRI za ich wyjątkowe wsparcie techniczne. Dziękujemy prof. Atsushi Miyawaki, RIKEN, Wako-city, Japonia, za dostarczenie konstruktów FUCCI, prof. Meenhardowi Herlynowi i pani Patricii Brafford z The Wistar Institute, Philadelphia, PA, za dostarczenie linii komórkowych. Dziękujemy dr Loredany Spoerri za dostarczenie zdjęć kriosekcji C8161.
Ta praca była wspierana przez granty projektowe dla N.K.H.: Australian Research Council (DP200100177) i Meehan Project Grant (021174 2017002565).
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| #1.5 płytka 24-dołkowa ze szklanym dnem | Celvis | P24-1.5H-N | |
| 500 µ L przezroczyste probówki do PCR | Sigma | HS4422 | |
| Alexa Fluor 647 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson Immuno research | 715-605-151 | Stosowane rozcieńczenie 1:500 |
| Albumina surowicy bydlęcej | Sigma | A7906 | Stężenie końcowe 2% w/v |
| DAPI | Sigma | D9542-10MG | Stężenie końcowe 5 &mikro; g / ml |
| Woda dejonizowana | MILLI Q | ||
| Osioł anty-króliczy IgG (H + L) Wysoce zaadsorbowane krzyżowo przeciwciało wtórne, Alexa Fluor 647 | Thermofisher | A-31573 | Zastosowane rozcieńczenie 1:500 |
| DRAQ7 | Thermofisher | D15106 | Użyte rozcieńczenie 1:250 |
| Blok grzewczy | Ratek | DBH10 | lub podobny sprzęt |
| Zestawy sond hipoksy | Sonda hipoksy | HP1-1000Kit | Zastosowano rozcieńczenie przeciwciał 1:500 |
| Niskotopliwy proszek agarozowy | Sigma | A9414 | Stężenie końcowe 2% w/v |
| Mikrofalówka | Ostra | ||
| N,N,N′,N′-tetrakis(2-hydroksypropylo)etylenodiamina | Sigma | 122262 | Stężenie końcowe 9% w/w |
| NaCl | Sigma | S9888 | Stężenie końcowe 150 mM |
| NaN3 | Sigma | S2002 | Stężenie końcowe 0,10% w/v |
| p27 Kip1 (D69C12) | XP Technologia sygnalizacji komórkowej | 3686S | Zastosowane rozcieńczenie 1:500 |
| Roztwór paraformaldehydu | Proscitech | C004 | Stężenie końcowe 4% w/v |
| Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) | Thermofisher | 18912014 | Stężenie końcowe 1x |
| Pipeta | Eppendorf | ||
| Quickspin minifuge | lub podobny sprzęt | ||
| Wałek | Ratek | BTR10-12V | lub podobny sprzęt |
| Rotor | Ratek | RSM7DC | lub podobny sprzęt |
| Shaker | Ratek | EOM5 | lub podobny sprzęt |
| Sacharoza | Sigma | S9378 | Stężenie końcowe 44% w/w |
| Tris-HCl pH 7,4 | Sigma | T5941 | Stężenie końcowe 20 mM |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | Stężenie końcowe 0,10% v/v |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | Stężenie końcowe 0,1% v/v |
| Tween 20 | Sigma | P1379 | Stężenie końcowe 0,1% v/v |
| Mocznik | Sigma | U5379 | Stężenie końcowe 22% w/w |
Bibliografia
- Beaumont, K. A., Anfosso, A., Ahmed, F., Weninger, W., Haass, N. K. Imaging- and flow cytometry-based analysis of cell position and the cell cycle in 3D melanoma spheroids. Journal of Visualized Experiments. (106), e53486(2015).
- Hirschhaeuser, F., et al. Multicellular tumor spheroids: an underestimated tool is catching up again. Journal of Biotechnology. 148 (1), 3-15 (2010).
- Smalley, K. S., Lioni, M., Noma, K., Haass, N. K., Herlyn, M. In vitro three-dimensional tumor microenvironment models for anticancer drug discovery. Expert Opinion on Drug Discovery. 3 (1), 1-10 (2008).
- Spoerri, L., Gunasingh, G., Haass, N. K. Fluorescence-based quantitative and spatial analysis of tumour spheroids: A proposed tool to predict patient-specific therapy response. Frontiers in Digital Health. 3, 668390(2021).
- Nürnberg, E., et al. Routine optical clearing of 3D-cell cultures: Simplicity forward. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 20(2020).
- Kabadi, P. K., et al. Into the depths: Techniques for in vitro three-dimensional microtissue visualization. BioTechniques. 59 (5), 279-286 (2015).
- Ivanov, D. P., Grabowska, A. M. Spheroid arrays for high-throughput single-cell analysis of spatial patterns and biomarker expression in 3D. Scientific Reports. 7, 41160(2017).
- Spoerri, L., et al. Phenotypic melanoma heterogeneity is regulated through cell-matrix interaction-dependent changes in tumor microarchitecture. bioRxiv. , (2021).
- Haass, N. K., et al. Real-time cell cycle imaging during melanoma growth, invasion, and drug response. Pigment Cell & Melanoma Research. 27 (5), 764-776 (2014).
- Ahmad, A., et al. Clearing spheroids for 3D fluorescent microscopy: combining safe and soft chemicals with deep convolutional neural network. bioRxiv. , 428996(2021).
- Villani, T., Rossi, A. E., Sherman, H. Image-based characterization of 3-D cell culture models grown in spheroid microplates. American Laboratory. 50 (6), 12(2018).
- Lloyd-Lewis, B., et al. Imaging the mammary gland and mammary tumours in 3D: optical tissue clearing and immunofluorescence methods. Breast Cancer Research. 18 (1), 127(2016).
- Tainaka, K., et al. Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization. Cell. 159 (4), 911-924 (2014).
- Spoerri, L., Beaumont, K. A., Anfosso, A., Haass, N. K. Real-time cell cycle imaging in a 3D cell culture model of melanoma. Methods in Molecular Biology. 1612, 401-416 (2017).
- Cold Spring Harbor. Antibody Dilution Buffer (Abdil). Cold Spring Harbor Protocols. , (2018).
- Pawley, J. B. Handbook Of Biological Confocal Microscopy. Pawley, J. B. , Springer. US. 20-42 (2006).
- Sakaue-Sawano, A., et al. Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell-cycle progression. Cell. 132 (3), 487-498 (2008).
- Tian, T., Yang, Z., Li, X. Tissue clearing technique: Recent progress and biomedical applications. Journal of Anatomy. 238 (2), 489-507 (2021).
- Browning, A. P., Murphy, R. J. Zenodo. , (2021).
- Browning, A. P., et al. Quantitative analysis of tumour spheroid structure. eLife. 10, 73020(2021).
- Klowss, J. J., et al. A stochastic mathematical model of 4D tumour spheroids with real-time fluorescent cell cycle labelling. Journal of The Royal Society Interface. 19 (189), 20210903(2022).
- Murphy, R. J., Browning, A. P., Gunasingh, G., Haass, N. K., Simpson, M. J. Designing and interpreting 4D tumour spheroid experiments. Communications Biology. 5 (1), 91(2022).
Przedruki i uprawnienia
