Artykuł metodologiczny

Szybkie oczyszczanie optyczne do półwysokoprzepustowej analizy sferoidów nowotworowych

DOI:

10.3791/64103

⸱

23 sierpnia 2022

 ,  , 
1The University of Queensland Diamantina Institute, The University of Queensland, 2School of Mathematical Sciences, Queensland University of Technology

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sferoidy nowotworowe są coraz częściej wykorzystywane do oceny interakcji komórek nowotworowych z mikrośrodowiskiem i odpowiedzi na terapię. Niniejszy protokół opisuje solidną, ale prostą metodę pół-wysokoprzepustowego obrazowania sferoid guza 3D przy użyciu szybkiego usuwania optycznego.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sferoidy nowotworowe szybko stają się powszechne w podstawowych badaniach nad rakiem i opracowywaniu leków. Uzyskanie danych dotyczących ekspresji białek w sferoidzie na poziomie komórkowym jest ważne dla analizy, jednak istniejące techniki są często drogie, pracochłonne, wykorzystują niestandardowy sprzęt, powodują znaczne zniekształcenia rozmiaru lub są ograniczone do stosunkowo małych sferoid. Protokół ten przedstawia nową metodę montażu i czyszczenia sferoid, która rozwiązuje te problemy, umożliwiając jednocześnie konfokalną analizę wewnętrznej struktury sferoid. W przeciwieństwie do istniejących podejść, protokół ten przewiduje szybki montaż i usunięcie dużej liczby sferoid przy użyciu standardowego sprzętu i materiałów laboratoryjnych. Umieszczenie sferoid w roztworze żelu agarozy-PBS o neutralnym pH przed wprowadzeniem roztworu czyszczącego o dopasowanym współczynniku załamania światła minimalizuje zniekształcenia wielkości typowe dla innych podobnych technik. Pozwala to na szczegółową analizę ilościową i statystyczną, w której dokładność pomiarów wielkości jest najważniejsza. Ponadto, w porównaniu z płynnymi roztworami do oczyszczania, technika żelu agarozowego utrzymuje sferoidy na miejscu, co pozwala na gromadzenie trójwymiarowych (3D) obrazów konfokalnych. W niniejszym artykule omówiono, w jaki sposób metoda ta pozwala uzyskać wysokiej jakości obrazy dwu- i trójwymiarowe, które dostarczają informacji o zmienności międzykomórkowej i wewnętrznej strukturze sferoidalnej.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Trójwymiarowe (3D) hodowle komórek, takie jak sferoidy, dostarczają biologicznie realistycznych i powtarzalnych modeli zagregowanego wzrostu komórek1,2. Modele te szybko stają się powszechne zarówno w badaniach podstawowych, jak i w opracowywaniu leków, gdzie różnice w wielkości i strukturze sferoidów są badane między terapiami w celu ustalenia skuteczności leku3,4. W tych kontekstach możliwość zbierania szczegółowych informacji z dużej liczby sferoid jest bardzo korzystna, zarówno z perspektywy mocy statystycznej, jak i umożliwia szybką ocenę zachowania komórek w kilku terapiach.

Powszechnie stosowane techniki uzyskiwania szczegółowych obrazów mikroskopowych struktury sferoidów są albo czasochłonne, drogie, albo dają obrazy niskiej jakości, które nie zachowują kluczowych cech ilościowych, takich jak rozmiar sferoidy4,5. Na przykład techniki histologiczne oparte na kriosekcji mogą zapewnić wysokiej jakości obrazy, ale często są czasochłonne, wymagają wykwalifikowanej siły roboczej i często tworzą artefakty przekrojowe6,7, podczas gdy eleganckie technologie, takie jak mikroskopia oświetlenia jednopłaszczyznowego (SPIM)8 i mikroskopia wielofotonowa9 wymagają specjalistycznych mikroskopów, które nie są łatwo dostępne. Nowoczesne technologie mikroskopowe umożliwiły ostatnio tak zwane cięcie optyczne, w którym sferoidy są umieszczane w roztworze oczyszczającym o dopasowanym współczynniku załamania światła, a obrazy uzyskuje się za pomocą mikroskopii konfokalnej4,5. Chociaż techniki te mają potencjał do uzyskania wysokiej wydajności, typowe problemy obejmują ruch sferoidalny podczas obrazowania, zniekształcenie rozmiaru podczas oczyszczania oraz wysokie koszty zastrzeżonych rozwiązań czyszczących. Co więcej, wiele istniejących protokołów ma zastosowanie tylko do stosunkowo małych sferoid o średnicy mniejszej niż 300 μm lub głębokości do 100 μm, ograniczając technologię do wczesnych etapów wzrostu guza5,10,11.

Obecny protokół pozwala na średnio wysokoprzepustowe, wysokowydajne zbieranie szczegółowych obrazów sferoidów przy użyciu taniego rozwiązania do oczyszczania o dopasowanym współczynniku załamania światła, pochodzącego z procedur oczyszczania całego narządu12,13. Aby zapobiec ruchom sferoidów podczas obrazowania i zapewnić wsparcie strukturalne w celu zmniejszenia zniekształceń rozmiaru, sferoidy są zamontowane w żelu agaroza-PBS w 24-dołkowej szklanej płycie dolnej #1,5. Ponieważ technika ta pozwala na zamontowanie wielu sferoid w każdym dołku na 24-dołkowej płytce, można szybko zamontować i zobrazować do 360 sferoid (15 sferoid na studzienkę) w różnych warunkach eksperymentalnych. Dopasowane do współczynnika załamania światła rozwiązanie czyszczące, zbudowane z łatwo dostępnych materiałów eksploatacyjnych, służy do optycznego usuwania zamontowanych sferoid i otaczającego je żelu. Po okresie ustabilizowania się wynoszącym 24 godziny, protokół ten zapewnia wysokiej jakości obrazy 2D i 3D struktury sferoidalnej, nawet dla stosunkowo dużych sferoid (o średnicy około 700 μm), z mniej niż 2% zniekształceniem rozmiaru.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół opisuje przygotowanie wystarczającej ilości sferoid nowotworowych do zamontowania jednej płytki 24-dołkowej (około 240-360 sferoid lub 10-15 sferoidów/studzienkę) przy 200 μl żelu agarozowego na studzience i 500 μL roztworu oczyszczającego na studzienkę. Cała procedura jest zilustrowana w Rysunek 1.

1. 2% preparat w żelu agaroza-PBS

  1. Odważyć 0,5 g niskotopliwej agarozy (patrz Tabela Materiałów) w szklanej butelce i dodać 25 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).
  2. Rozpuść agarozę, gotując roztwór w kuchence mikrofalowej przez 30-60 s z zamkniętą, ale nie uszczelnioną pokrywką i ciągłym wirowaniem. Upewnij się, że agaroza jest całkowicie rozpuszczona, a roztwór nie wykipi.
    UWAGA: Żel można przechowywać w temperaturze pokojowej; Sprawdź objętość przed użyciem, aby uwzględnić parowanie. Doprowadzić do stanu ciekłego (kuchenka mikrofalowa; 20-60 s z wirowaniem) przed użyciem.

2. Przygotowanie roztworu oczyszczającego

  1. Odważyć 9 g N,N,N′,N′-tetrakis(2-hydroksypropylo)etylenodiaminy, 22 g mocznika, 44 g sacharozy, 0,1 g Tritona X-100 i 24,9 g wody dejonizowanej (patrz tabela materiałów).
    UWAGA: Łatwiej jest zważyć przybliżoną ilość N,N,N′,N′-Tetrakis(2-Hydroksypropylo)etylenodiaminy i dostosować wagę pozostałych składników, aby uzyskać pożądane stężenie.
  2. Podgrzewać roztwór w łaźni wodnej o temperaturze 56 °C z ciągłym mieszaniem i kontynuować, aż wszystkie kryształy się rozpuszczą.
  3. Roztwór należy odstawić w temperaturze pokojowej, aby pęcherzyki powstałe podczas mieszania wypłynęły na powierzchnię. Roztwór jest stabilny w temperaturze pokojowej do 2 miesięcy.

3. Przygotowanie sferoidy

  1. Generuj sferoidy za pomocą metody nakładki agarozowej, jak opisano wcześniej1,3,14.
    UWAGA: Sferoidy generowane innymi metodami są również kompatybilne z tym protokołem obrazowania.
  2. Odetnij końcówkę końcówki pipety o pojemności 1 ml za pomocą skalpela, aby powiększyć otwór.
    UWAGA: Wszystkie sferoidy były obsługiwane za pomocą pipet o pojemności 1 ml lub 200 μl z naciętymi końcówkami.
  3. Za pomocą pipety odessać sferoidy z dołków i przenieść je do przezroczystej stożkowej probówki o pojemności 1,5 ml. Wiele sferoid z tych samych warunków może być połączonych w tej samej rurze.
    UWAGA: Zawsze pozwól, aby sferoidy osiadły na dnie rurki, aby zassać medium.
  4. Umyć sferoidy w 1 ml PBS dwukrotnie, dodać obojętny 4% wstępnie podgrzany roztwór paraformaldehydu (PFA) i inkubować sferoidy w temperaturze 37 °C przez 20 minut.
  5. Usunąć roztwór PFA i dwukrotnie przemyć sferoidy 1 ml PBS.

4. Barwienie sferoidów

  1. Za pomocą pipety przenieś do 15 sferoid do probówki PCR o pojemności 200 μl.
    UWAGA: W przypadku sferoid delikatnych zamontuj sferoidy w żelu (kroki 5.1-5.4) przed kontynuowaniem.
  2. Przepuszczalność komórek za pomocą 200 μl 0,5% Triton X-100 w PBS. Umieść probówki PCR w probówkach z nakrętką o pojemności 50 ml i inkubuj sferoidy przez 2 godziny w temperaturze pokojowej z łagodnym mieszaniem.
    UWAGA: Wszystkie inkubacje wykonuje się z mieszaniem na wirniku, walcu lub wytrząsarce (patrz Tabela materiałów), chyba że określono inaczej. Jest to ważne, aby uzyskać jednolite barwienie. Stałe sferoidy w PBS mogą czasami przyklejać się do boków końcówki pipety. Przepłukanie końcówki w 0,5% Triton X-100 minimalizuje przywieranie sferoid do końcówek.
  3. Zastąp roztwór (krok 4.2) 200 μl buforu do rozcieńczania przeciwciał (ABDIL)15 i inkubuj przez noc w temperaturze pokojowej.
  4. Usunąć ABDIL, dodać 75 μl pierwszorzędowego przeciwciała do ABDIL i inkubować w temperaturze 4 °C przez 2,5 dnia.
  5. Usunąć supernatant i przemyć 200 μl PBS z 0,1% Tween i 0,1% Triton X-100 (PBS-TT) dwukrotnie i inkubować z 200 μl PBS-TT przez 4 godziny w temperaturze pokojowej.
  6. Usunąć PBS-TT, dodać 100 μl przeciwciała drugorzędowego do ABDIL i inkubować w temperaturze 4 °C przez 2,5 dnia.
    UWAGA: Na tym etapie można dodać DAPI lub inny barwnik jądrowy. Większość barwników wymaga krótszego czasu inkubacji niż przeciwciała.
  7. Usunąć supernatant i przemyć dwukrotnie 200 μl PBS-TT i inkubować z 200 μl PBS-TT przez 4 godziny. Sferoidy są gotowe do montażu.

5. Montaż

  1. Za pomocą pipety o pojemności 200 μl przenieś utrwalone i wybarwione sferoidy do probówek PCR o pojemności 500 μl po jednej probówce na warunek (około 10-15 sferoid).
  2. Zastąp roztwór 200 μl 2% (w/v) płynnego żelu agarozowego i odwiruj na szybkim wirowaniu (z ustaloną maksymalną prędkością, patrz Tabela Materiałów) w temperaturze pokojowej przez 30 s.
    UWAGA: W przypadku natychmiastowego montażu należy umieścić w bloku grzewczym w temperaturze 50 °C, aby uniknąć stwardnienia żelu.
  3. Zassać sferoidy w ~ 50 μl płynnego żelu agarozowego i dozować do dołka 24-dołkowej płytki ze szklanym dnem.
  4. Zanim żel stwardnieje, oddziel sferoidy za pomocą końcówki pipety w otaczającym żelu i upewnij się, że sferoidy są pokryte żelem. Opcjonalnie umieść płytkę na lodzie, aby szybko stężał żel.
    UWAGA: Liczba sferoid w studzience zależy od wielkości sferoid. Sferoidy są umieszczone daleko od siebie, tak że tylko jedna sferoida wchodzi w pole widzenia podczas obrazowania. Jest to ważne dla zautomatyzowanego przetwarzania obrazu.
  5. Dodaj 500 μl roztworu czyszczącego (krok 2) do dołka, upewniając się, że żel jest zanurzony. Inkubować w temperaturze pokojowej przez co najmniej 24 godziny i zobrazować sferoidy w roztworze oczyszczającym. Sferoidy są stabilne w tym roztworze do miesiąca w temperaturze pokojowej i gdy są chronione przed parowaniem.

6. Obrazowanie

  1. Wybierz obiektyw, którego odległość robocza jest wystarczająco duża, aby objąć całą sferoidę, w tym wysokość montażu sferoidy w zbiorniku.
    UWAGA: Obiektywy o odległości roboczej 3 mm lub większej są wymagane do obrazowania płaszczyzny równikowej sferoid. Obiektywy o większym powiększeniu i wyższym NA mogą pozwolić na lepszą rozdzielczość, ale ograniczą maksymalną głębokość, na której można obrazować sferoidy.
  2. Aby zidentyfikować płaszczyznę równikową, dostosuj ostrość, aż zostanie osiągnięta największa powierzchnia w płaszczyźnie XY i zobrazuj z wymaganym procentem mocy lasera, napięciem detektora, wzmocnieniem i ustawieniami przesunięcia.
    UWAGA: Procent mocy lasera, napięcie detektora, wzmocnienie i przesunięcie będą się znacznie różnić w zależności od fluoroforu, intensywności barwienia, intensywności lasera, czułości detektora itp.
  3. W przypadku obrazów 3D ustaw początek i koniec sferoid i wybierz odpowiednią intensywność sygnału przy różnych głębokościach z, korzystając z ustawień korekcji intensywności z przed obrazowaniem.
    UWAGA: Aby uzyskać najlepszą rozdzielczość obrazu, użyj częstotliwości próbkowania Nyquist dla x, y i z (aby uzyskać szczegółowe informacje, zobacz reference16).

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby zademonstrować zdolność tej metody oczyszczania do dostarczania wysokiej jakości dwu- i trójwymiarowych obrazów, sferoidy o średnicach 300-600 μm zostały wyhodowane z fluorescencyjnego Ubikwitynacji Cell Cycle Indicator (FUCCI) transdukowanych liniami komórkowymi czerniaka FUCCI-WM164 i FUCCI-WM983b9,17, które wyrażają monomeryczne białko Kusabira Orange2 (mKO2) i monomeryczne białko Azami Green (mAG) w fazie Gap1 i wczesnej fazie S/Gap2/mitozie cyklu komórkowego, odpowiednio, zgodnie z procedurami przedstawionymi w kroku 31,3,14. Sferoidy zostały następnie utrwalone 4% roztworem formaldehydu w temperaturze 37 °C, przeniknięte i wybarwione anty-p27kip1/anty-króliczym Alexa Fluor 647 anty-pimonidazolem/anty-mysim Alexa Fluor 647, DAPI lub DRAQ7 (patrz Tabela Materiałów) (Rysunek 2). Wszystkie pliki mikroskopowe są przesyłane do repozytorium GitHub (https://github.com/ap-browning/SpheroidMounting). W porównaniu ze sferoidami montowanymi na PBS, rozwiązanie czyszczące zapewnia obrazy o wysokiej czystości z minimalnymi zniekształceniami rozmiaru (Rysunek 2A). Protokół pozwala na obrazowanie w wysokiej rozdzielczości szczegółów na poziomie komórkowym w głębszych sferoidach bez przekroju histologicznego, a obraz przekroju poprzecznego uzyskano z obiektywu pneumatycznego 20x (0,7 NA) w rozdzielczości 4096 x 4096 px bez szwów (Rysunek 2B). Korzystając z obiektywu o mniejszym powiększeniu i mniejszej aperturze numerycznej przy większej odległości roboczej, można uzyskać obrazy konfokalne 3D, które zapewniają szczegółowość na poziomie komórkowym na głębokości co najmniej 200 μm (Rysunek 2C). Sferoidy zostały również poddane kriosekcji i wybarwieniu zgodnie z protokołem Spoerri et al.4 i porównane z barwieniem całych sferoidów (Rysunek 2D,E). Rysunek 2D pokazuje niedotleniony obszar sferoidy zabarwiony przez pimonidazol, a Rysunek 2E pokazuje zabarwieniep27 kip1, które oznacza zatrzymanie cyklu komórkowego (żółty) i plamę jądrową DAPI (szary). Lokalizacja białek i wzór barwienia są podobne między kriosekcją a oczyszczaniem, a zatem ta metoda oczyszczania nie ma na nie wpływu.

Korekcja intensywności sygnału w z pozwala na obrazowanie całej sferoidy. Jednak rozpraszanie światła przez nekrotyczne jądro ogranicza możliwość zobrazowania niewidocznej strony sferoidy. Głębsza penetracja i mniejsze rozproszenie dalekiej czerwieni fluoroforu, takiego jak barwienie jądrowe DRAQ7, pozwala na jeszcze lepsze odwzorowanie struktury sferoidalnej 3D (Rysunek 3). Film 1 pokazuje renderowanie 3D sferoid FUCCI barwionych DRAQ7. Cieńszy plasterek Z może pozwolić na lepszą rozdzielczość Z, ale znacznie wydłuża to czas obrazowania i fotowybielania fluoroforów.

Aby ustalić, czy roztwór oczyszczający powoduje zniekształcenie rozmiaru, dwanaście sferoid w żelu 2% agaroza-PBS zostało zobrazowanych po 6 godzinach, 12 godzinach, 24 godzinach, 72 godzinach i 168 godzinach po wprowadzeniu roztworu oczyszczającego. Obrazy podsumowano poprzez wyznaczenie średnicy sferoidy, zdefiniowanej na podstawie kuli o takim samym polu przekroju poprzecznego jak sferoida (Rysunek 4A). Podczas gdy obserwuje się, że sferoidy nieznacznie zwiększają swój rozmiar w ciągu pierwszych 6 godzin, na co wskazuje zmiana średnicy między 2% a 6% (Rysunek 4B), po 24 godzinach do 72 godzin, sferoidy wracają do rozmiaru w przybliżeniu równego odpowiadającemu rozmiarowi w PBS po utrwaleniu PFA (Rysunek 4C).

figure-results-1
Rysunek 1: Ilustracja protokołu montażu i czyszczenia sferoidów. Utrwalone i wybarwione sferoidy przenosi się do probówki o pojemności 500 μl; nadmiar płynu zastępuje się 200 μl żelu agaroza-PBS i odwirowuje. Sferoidy są następnie przenoszone do studzienki ze szklanym dnem w 24-dołkowej płytce. Po pozostawieniu żelu do zestalenia się dodaje się 500 μl roztworu czyszczącego i pozostawia się sferoidy do zrównoważenia. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Porównanie oczyszczonych i nieoczyszczonych sferoid ludzkiego czerniaka FUCCI. Kolorowanie wskazuje jądra komórkowe dodatnie dla mKO2 (czerwony), co oznacza komórki w luce 1; i jądra komórkowe dodatnie dla mAG (kolor zielony), który wskazuje komórki w luce 2. (A) Sferoidy wyhodowane z 5000 komórek FUCCI-WM983b, zebrane w 10 dniu i zobrazowane w żelu agaroza-PBS i 24 godziny po dodaniu roztworu klarującego. Porównanie obrazów w jasnym polu i obrazów konfokalnych przed i po oczyszczeniu roztworu pokazuje minimalne zniekształcenia rozmiaru i duży wzrost klarowności. Obrazy uzyskuje się przy użyciu obiektywu 10x. (B) Sferoidy wyhodowane z komórek FUCCI-WM164 przesiąkniętych za pomocą Triton X-100 i wybarwionych DRAQ7, barwiąc wszystkie jądra komórkowe. Obraz uzyskuje się przy użyciu obiektywu 20x (0,75 NA), co pokazuje, że rozwiązanie czyszczące umożliwia obrazowanie szczegółów na poziomie komórek w wysokiej rozdzielczości. (C) Obrazy 3D (10x, 0,4 NA) uzyskano sferoidy FUCCI-WM164 w PBS i 24 godziny po dodaniu roztworu czyszczącego. Regulacja mocy, napięcia i przesunięcia lasera w różnych płaszczyznach Z umożliwia obrazowanie głębiej wewnątrz sferoidy. (D,E) Porównanie kriosekcji i oczyszczonej całej sferoidy wybarwionej na obecność pimonidazolu i p27kip1. (D) Barwienie pimonidazolem w kolorze magenta pokazuje obszar niedotlenienia w sferoidach. Czerwony i zielony oznaczają FUCCI. (E) Kriosekcje i oczyszczone sferoidy pokazujące DAPI (szary) i p27kip1 (żółty). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Oczyszczanie pozwala na obrazowanie w głąb sferoidy przy minimalnej utracie światła. Obrazy z mikroskopii konfokalnej sferoidy ludzkiego czerniaka FUCCI przy 10-krotnym powiększeniu i niższym NA (0,4), umożliwiające obrazowanie na większej głębokości z przy minimalnych stratach sygnału. (A) 3,88 μm warstwy jąder sferoidalnych barwionych DRAQ7. (B-D) rozdzielczość y/z odpowiednio w kanałach 488 (mAG), 568 (mKO2) i 647 nm (DRAQ7). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Roztwór czyszczący ma minimalny wpływ na rozmiar sferoidy. (A) Rozkład początkowej wielkości sferoidy (równoważna średnica) w żelu PBS (n = 12 sferoid). (B) Zmiana średnicy fałdy w czasie od dodania roztworu czyszczącego. Po 0 h sferoidy są tylko w żelu PBS. (C) Rozkład zmian średnicy po 12 godzinach, 24 godzinach i 72 godzinach. Kliknij tutaj aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Film 1: Renderowanie 3D sferoidy FUCCI barwionej DRAQ7. Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiono tutaj protokół uzyskiwania wysokiej jakości dwu- i trójwymiarowych obrazów sferoid guza. Istniejące metody, takie jak CLARITY, See deep brain (SeeDB) i ScaleS, często powodują zniekształcenia rozmiaru nawet o 30%, podczas gdy techniki takie jak alkohol benzylowy / benzoesan benzylu (BABB) i obrazowanie 3D narządów oczyszczonych rozpuszczalnikiem (3DISCO) mogą wygasić białko fluorescencyjne18. Wiele z tych metod ma na celu oczyszczanie tkanek z integralności strukturalnej i zniekształcanie rozmiaru i struktury po zastosowaniu do sferoid18. W przeciwieństwie do innych protokołów, które wykorzystują dostępne na rynku drogie rozwiązania clearingowe, ten protokół wykorzystuje łatwo dostępne materiały eksploatacyjne przy zachowaniu przejrzystości optycznej i endogennej fluorescencji oraz zminimalizowaniu zniekształceń rozmiaru. Osadzanie sferoid w żelu agaroza-PBS zapewnia strukturalne wsparcie dla sferoid i minimalizuje szok osmotyczny po dodaniu roztworu klarującego. Ma to kluczowe znaczenie podczas obrazowania kruchych sferoid po leczeniu farmakologicznym. Zakłada się, że ta metoda optycznego oczyszczania jest odpowiednia dla sferoid utworzonych dowolną metodą, ponieważ protokół ten jest dostosowany do oczyszczania całych tkanek. Założenie opiera się na podobieństwie sferoid uzyskanych różnymi metodami tworzenia sferoid. Wybór utrwalacza może mieć wpływ na wielkość sferoidy, a także na fluorescencję endogenną. Ta metoda oczyszczania jest odpowiednia dla sferoid utrwalonych neutralnym 4% roztworem PFA. Wymagane są dalsze badania w celu sprawdzenia jego kompatybilności z innymi utrwalaczami.

Biorąc pod uwagę, że technika ta pozwala na jednoczesne montowanie wielu sferoid w płytce wielodołkowej, dobrze nadaje się do potoków analizy ilościowej, które wymagają informacji o strukturze sferoidów z maksymalnie 360 sferoid na płytkę 24-dołkową. Mikroskopy z funkcjami automatycznego mapowania stolika i płytki mogą sprawić, że obrazowanie będzie mniej ręczne. Mimo że ta metoda jest szybsza i łatwiejsza niż cięcie, obecnie nie nadaje się do pełnej automatyzacji. Jednak obrazy uzyskane tą metodą nadają się do automatycznego przetwarzania obrazów 4,19, a szybkość, z jaką sferoidy mogą być montowane za pomocą tego protokołu, nadaje się do ilościowej analizy wewnętrznej struktury sferoidalnej 20,21,22.

W przypadku barwienia całych sferoid stężenie, objętość i czas inkubacji przeciwciał muszą być zoptymalizowane dla każdego przeciwciała. Jako wskazówkę należy stosować 2,5x zalecanego stężenia przeciwciał immunofluorescencyjnych 2D i 100-200 μl przeciwciała, w zależności od liczby sferoid w probówce. Upewnij się, że wszystkie sferoidy są pokryte roztworem barwiącym, gdy znajdują się na wirniku. Czas inkubacji zależy od wielu czynników, w tym wielkości i gęstości sferoid oraz przeciwciała, i może wynosić od 16 do 72 godzin. Pomimo metody pozwalającej na detekcję sygnału w głębszych warstwach sferoidy, fluorofory wzbudzone promieniowaniem UV powodują znaczne rozpraszanie światła, co prowadzi do niskiego stosunku sygnału do szumu. Należy zachować ostrożność przy wyborze fluoroforów do wizualizacji docelowego białka. Na przykład barwienie mniej obfitych i strukturalnych białek za pomocą fluoroforów o dłuższej długości fali i bardziej obfitych białek lub barwień jądrowych za pomocą fluoroforów o krótszej długości fali pozwoli osiągnąć najlepszy wynik. Wreszcie, oczyszczone sferoidy nadal wykazują utratę światła z powodu rozpraszania w nekrotycznym jądrze, co jest widoczne w wymiarze y/z obrazów uzyskanych ze sferoid o średnicy 600 μm (Rysunek 2C).

Obrazowanie w większym powiększeniu przy wyższych obiektywach NA jest możliwe przy sferoidach zamontowanych i oczyszczonych przy użyciu tego protokołu, ale odległość robocza obiektywu ogranicza głębokość obrazowania. W przypadku soczewek olejowych ważne jest, aby używać oleju o RI 1,51, aby uzyskać najlepszy wynik.

Podsumowując, metoda oczyszczania z wbudowanym żelem agarozy-PBS pozwala na wizualizację komórek głęboko wewnątrz sferoid przy użyciu powszechnie dostępnych materiałów eksploatacyjnych. Sferoidy zamontowane i oczyszczone przy użyciu tej metody ulegają minimalnym zniekształceniom rozmiaru i zachowują swoją integralność strukturalną, co pozwala na gromadzenie wysokiej jakości danych dotyczących wewnętrznej struktury sferoidalnej, a następnie automatyczną kwantyfikację.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Firma Olympus partycypowała w kosztach publikacji.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie zostało przeprowadzone w Instytucie Badań Translacyjnych (TRI), Woolloongabba, QLD. TRI jest wspierany przez grant rządu australijskiego. Dziękujemy personelowi centrum mikroskopii w TRI za ich wyjątkowe wsparcie techniczne. Dziękujemy prof. Atsushi Miyawaki, RIKEN, Wako-city, Japonia, za dostarczenie konstruktów FUCCI, prof. Meenhardowi Herlynowi i pani Patricii Brafford z The Wistar Institute, Philadelphia, PA, za dostarczenie linii komórkowych. Dziękujemy dr Loredany Spoerri za dostarczenie zdjęć kriosekcji C8161.

Ta praca była wspierana przez granty projektowe dla N.K.H.: Australian Research Council (DP200100177) i Meehan Project Grant (021174 2017002565).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
#1.5 płytka 24-dołkowa ze szklanym dnemCelvisP24-1.5H-N
500 µ L przezroczyste probówki do PCRSigmaHS4422
Alexa Fluor 647 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)Jackson Immuno research715-605-151Stosowane rozcieńczenie 1:500
Albumina surowicy bydlęcejSigmaA7906Stężenie końcowe 2% w/v
DAPISigmaD9542-10MGStężenie końcowe 5 &mikro; g / ml
Woda dejonizowanaMILLI Q
Osioł anty-króliczy IgG (H + L) Wysoce zaadsorbowane krzyżowo przeciwciało wtórne, Alexa Fluor 647ThermofisherA-31573Zastosowane rozcieńczenie 1:500
DRAQ7ThermofisherD15106Użyte rozcieńczenie 1:250
Blok grzewczyRatekDBH10lub podobny sprzęt
Zestawy sond hipoksySonda hipoksyHP1-1000KitZastosowano rozcieńczenie przeciwciał 1:500
Niskotopliwy proszek agarozowySigmaA9414Stężenie końcowe 2% w/v
MikrofalówkaOstra
N,N,N′,N′-tetrakis(2-hydroksypropylo)etylenodiaminaSigma122262Stężenie końcowe 9% w/w
NaClSigmaS9888Stężenie końcowe 150 mM
NaN3SigmaS2002Stężenie końcowe 0,10% w/v
p27 Kip1 (D69C12)XP Technologia sygnalizacji komórkowej3686SZastosowane rozcieńczenie 1:500
Roztwór paraformaldehyduProscitechC004Stężenie końcowe 4% w/v
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)Thermofisher18912014Stężenie końcowe 1x
PipetaEppendorf
Quickspin minifugelub podobny sprzęt
WałekRatekBTR10-12Vlub podobny sprzęt
RotorRatekRSM7DClub podobny sprzęt
ShakerRatekEOM5lub podobny sprzęt
SacharozaSigmaS9378Stężenie końcowe 44% w/w
Tris-HCl pH 7,4SigmaT5941Stężenie końcowe 20 mM
Triton X-100SigmaX100Stężenie końcowe 0,10% v/v
Triton X-100SigmaX100Stężenie końcowe 0,1% v/v
Tween 20SigmaP1379Stężenie końcowe 0,1% v/v
MocznikSigmaU5379Stężenie końcowe 22% w/w

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Beaumont, K. A., Anfosso, A., Ahmed, F., Weninger, W., Haass, N. K. Imaging- and flow cytometry-based analysis of cell position and the cell cycle in 3D melanoma spheroids. Journal of Visualized Experiments. (106), e53486(2015).
  2. Hirschhaeuser, F., et al. Multicellular tumor spheroids: an underestimated tool is catching up again. Journal of Biotechnology. 148 (1), 3-15 (2010).
  3. Smalley, K. S., Lioni, M., Noma, K., Haass, N. K., Herlyn, M. In vitro three-dimensional tumor microenvironment models for anticancer drug discovery. Expert Opinion on Drug Discovery. 3 (1), 1-10 (2008).
  4. Spoerri, L., Gunasingh, G., Haass, N. K. Fluorescence-based quantitative and spatial analysis of tumour spheroids: A proposed tool to predict patient-specific therapy response. Frontiers in Digital Health. 3, 668390(2021).
  5. Nürnberg, E., et al. Routine optical clearing of 3D-cell cultures: Simplicity forward. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 20(2020).
  6. Kabadi, P. K., et al. Into the depths: Techniques for in vitro three-dimensional microtissue visualization. BioTechniques. 59 (5), 279-286 (2015).
  7. Ivanov, D. P., Grabowska, A. M. Spheroid arrays for high-throughput single-cell analysis of spatial patterns and biomarker expression in 3D. Scientific Reports. 7, 41160(2017).
  8. Spoerri, L., et al. Phenotypic melanoma heterogeneity is regulated through cell-matrix interaction-dependent changes in tumor microarchitecture. bioRxiv. , (2021).
  9. Haass, N. K., et al. Real-time cell cycle imaging during melanoma growth, invasion, and drug response. Pigment Cell & Melanoma Research. 27 (5), 764-776 (2014).
  10. Ahmad, A., et al. Clearing spheroids for 3D fluorescent microscopy: combining safe and soft chemicals with deep convolutional neural network. bioRxiv. , 428996(2021).
  11. Villani, T., Rossi, A. E., Sherman, H. Image-based characterization of 3-D cell culture models grown in spheroid microplates. American Laboratory. 50 (6), 12(2018).
  12. Lloyd-Lewis, B., et al. Imaging the mammary gland and mammary tumours in 3D: optical tissue clearing and immunofluorescence methods. Breast Cancer Research. 18 (1), 127(2016).
  13. Tainaka, K., et al. Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization. Cell. 159 (4), 911-924 (2014).
  14. Spoerri, L., Beaumont, K. A., Anfosso, A., Haass, N. K. Real-time cell cycle imaging in a 3D cell culture model of melanoma. Methods in Molecular Biology. 1612, 401-416 (2017).
  15. Cold Spring Harbor. Antibody Dilution Buffer (Abdil). Cold Spring Harbor Protocols. , (2018).
  16. Pawley, J. B. Handbook Of Biological Confocal Microscopy. Pawley, J. B. , Springer. US. 20-42 (2006).
  17. Sakaue-Sawano, A., et al. Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell-cycle progression. Cell. 132 (3), 487-498 (2008).
  18. Tian, T., Yang, Z., Li, X. Tissue clearing technique: Recent progress and biomedical applications. Journal of Anatomy. 238 (2), 489-507 (2021).
  19. Browning, A. P., Murphy, R. J. Zenodo. , (2021).
  20. Browning, A. P., et al. Quantitative analysis of tumour spheroid structure. eLife. 10, 73020(2021).
  21. Klowss, J. J., et al. A stochastic mathematical model of 4D tumour spheroids with real-time fluorescent cell cycle labelling. Journal of The Royal Society Interface. 19 (189), 20210903(2022).
  22. Murphy, R. J., Browning, A. P., Gunasingh, G., Haass, N. K., Simpson, M. J. Designing and interpreting 4D tumour spheroid experiments. Communications Biology. 5 (1), 91(2022).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Obrazowanie konfokalnemonta w elu agarozowymroztw r klaruj cyanaliza ekspresji bia ekobrazowanie tr jwymiarowebarwienie sferoid wdetekcja obszar w hipoksycznychobrazowanie o wysokiej rozdzielczo ci

Powiązane artykuły