In vivo (in vivo) Przewlekłe dwufotonowe obrazowanie mikrogleju w hipokampie myszy

Podsumowanie

Ten artykuł opisuje metodę przewlekłej obserwacji in vivo spoczynkowego mikrogleju w mysim hipokampie CA1 przy użyciu precyzyjnie kontrolowanej chirurgii i mikroskopii dwufotonowej.

Streszczenie

Mikroglej, jedyne komórki odpornościowe rezydujące w mózgu, aktywnie uczestniczą w utrzymaniu obwodów nerwowych poprzez modyfikację synaps i pobudliwości neuronów. Ostatnie badania ujawniły zróżnicowaną ekspresję genów i funkcjonalną heterogeniczność mikrogleju w różnych regionach mózgu. Unikalne funkcje sieci neuronowej hipokampa w uczeniu się i pamięci mogą być związane z aktywną rolą mikrogleju w przebudowie synaps. Jednak reakcje zapalne wywołane zabiegami chirurgicznymi były problematyczne w dwufotonowej analizie mikroskopowej mikrogleju hipokampa. W tym miejscu przedstawiono metodę, która umożliwia przewlekłą obserwację mikrogleju we wszystkich warstwach hipokampa CA1 przez okno obrazowania. Metoda ta pozwala na analizę zmian morfologicznych w procesach mikrogleju przez okres dłuższy niż 1 miesiąc. Długotrwałe obrazowanie spoczynkowego mikrogleju w wysokiej rozdzielczości wymaga minimalnie inwazyjnych zabiegów chirurgicznych, odpowiedniego doboru obiektywu i zoptymalizowanych technik obrazowania. Przemijająca reakcja zapalna mikrogleju hipokampa może uniemożliwić obrazowanie bezpośrednio po operacji, ale mikroglej przywraca swoją spokojną morfologię w ciągu kilku tygodni. Co więcej, obrazowanie neuronów jednocześnie z mikroglejem pozwala nam analizować interakcje wielu typów komórek w hipokampie. Technika ta może dostarczyć istotnych informacji na temat funkcji mikrogleju w hipokampie.

Wprowadzenie

Mikroglej to jedyne komórki odpornościowe i makrofagi tkankowe rezydujące w mózgu. Oprócz funkcji komórek odpornościowych, takich jak szybka reakcja na stan zapalny, wykazano, że odgrywają one różne role fizjologiczne w utrzymaniu i przebudowie obwodów nerwowych, takich jak przycinanie synaptyczne, regulacja plastyczności synaptycznej i kontrola aktywności neuronów^1,2,3,4,5. Fizjologiczne interakcje między mikroglejem a neuronami cieszą się coraz większym zainteresowaniem zarówno w rozwoju obwodów neuronalnych, jak i w neurobiologii chorób. Analiza fizjologii mikrogleju in vivo wymaga metod obserwacji mikrogleju bez uszkodzenia tkanek i reakcji zapalnych. Jednak mikroglej jest wrażliwy na stany zapalne i radykalnie zmienia swoje kształty i funkcje w odpowiedzi na uszkodzenie tkanek^6,7.

Obrazowanie dwufotonowe in vivo jest idealnym narzędziem do uchwycenia fizjologicznej dynamiki mikrogleju⁸. Początkowe zastosowania obrazowania dwufotonowego in vivo ujawniły dynamiczny ruch procesów mikrogleju do nadzoru środowiskowego w korze dorosłej myszy ^9,10. Poniższe badania obrazowania dwufotonowego jeszcze bardziej rozszerzyły monitorowanie mikrogleju in vivo w celu analizy funkcjonalnych i strukturalnych interakcji z neuronami^{5,11,12,13,14}. Jednak głębokość obrazowania w konwencjonalnej mikroskopii dwufotonowej została ograniczona do mniej niż 1 mm od powierzchni mózgu^15,16. To ograniczenie wyjaśnia niedobór wcześniejszych badań opisujących zachowanie mikrogleju w głębokich obszarach mózgu, takich jak hipokamp.

Ostatnie badania sekwencjonowania RNA wykazały znaczną regionalną heterogeniczność mikrogleju, co zwiększa możliwość istnienia odrębnych ról funkcjonalnych^{17,18,19,20,21}. W związku z tym konieczne jest rejestrowanie interakcji mikrogleju z neuronami w różnych obszarach mózgu, ale trudności techniczne utrudniają takie badania. W szczególności stwierdzono, że aktywny udział mikrogleju w przebudowie synaps ma kluczowe znaczenie dla rozwoju sieci neuronowej hipokampa i jej funkcji związanych z pamięcią^22,23. Nie są jednak dostępne skuteczne metody obserwacji niekwestionowanego mikrogleju hipokampa in vivo.

Ten protokół wyjaśnia procedury przewlekłej obserwacji in vivo spoczynkowego mikrogleju w CA1 grzbietowego hipokampa przy użyciu precyzyjnie kontrolowanych technik chirurgicznych. Obrazowanie dwufotonowe obszaru CA1 u myszy CX3CR1-GFP (CX3CR1^+/GFP), które wyrażają GFP w microglia²⁴, umożliwiło obserwację rozgałęzionego mikrogleju we wszystkich warstwach CA1 z wystarczającą rozdzielczością. Protokół zawiera kilka wskazówek dotyczących udanego implantacji okna obserwacyjnego i odpowiednich warunków obrazowania. Ponadto jako przykład zastosowania przedstawiono jednoczesną wizualizację neuronów piramidowych i mikrogleju w CA1. Omówiono również zalety, ograniczenia i potencjał tej techniki.

Protokół

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone i przeprowadzone zgodnie z zasadami Komitetu Etyki Zwierząt i Komitetu Bezpieczeństwa Eksperymentów z Rekombinacją Genetycznej na Uniwersytecie Tokijskim. W eksperymentach wykorzystano zarówno samce, jak i samice myszy CX3CR1-GFP w wieku 2-4 miesięcy. Ze względu na bezpieczeństwo eksperymentatorów i utrzymanie sterylnych warunków, wszystkie procedury były wykonywane w białych fartuchach, maskach i sterylnych rękawiczkach. Wszystkie narzędzia zostały wysterylizowane przed użyciem.

1. Przygotowanie instrumentów i zwierząt

1. Zamontuj metalową rurkę ze szklanym dnem (Rysunek 1A).
   1. Nałóż niewielką kroplę kleju optycznego utwardzanego promieniami UV na jeden koniec wykonanej na zamówienie rurki ze stali nierdzewnej (średnica zewnętrzna 3,0 mm, średnica wewnętrzna 2,8 mm, wysokość 1,7 mm). Rozprowadź klej równomiernie na okrągłej krawędzi tuby.
      UWAGA: Należy użyć wystarczającej ilości kleju, aby pokryć całą krawędź tuby.
   2. Umieść okrągłe szklane szkiełko nakrywkowe (o średnicy 3,0 mm, grubości 0,15 ± 0,02 mm) do pokrytego klejem końca metalowej rurki i lekko dociśnij szkiełko nakrywkowe do tuby, tak aby szczelina między rurką a szkłem została wypełniona klejem. Następnie dostosuj położenie szkła tak, aby pasowało do zewnętrznej krawędzi metalowej rurki.
   3. Naświetlić szkło światłem UV przez wystarczająco długi czas, aby utwardzić klej.
      UWAGA: Upewnij się, że szklanka i rurka są całkowicie przymocowane. Jeśli adhezja jest niewystarczająca, szkło może odpaść po operacji, co spowoduje nieudane obrazowanie lub wyciek płynu mózgowo-rdzeniowego (CSF).
   4. Zdezynfekuj zmontowaną metalową rurkę ze szklanym dnem 70% etanolem i umyj sterylną solą fizjologiczną, aby usunąć zanieczyszczenia.
2. Wysterylizuj wszystkie narzędzia chirurgiczne za pomocą sterylizatora na sucho.
3. Przygotuj myszy do operacji implantacji okiennej.
   UWAGA: Myszy powinny być w odpowiednim wieku. Zaleca się, aby były one genetycznie modyfikowane w celu ekspresji białek fluorescencyjnych w CA1 i zakręcie zębatym (DG). Punkty te są bardziej szczegółowo wyjaśnione w sekcji Dyskusja.

2. Znieczulenie i unieruchomienie głowy

1. Znieczulić mysz przez dootrzewnowe wstrzyknięcie ketaminy-ksylazyny (100 mg/kg ketaminy i 10 mg/kg ksylazyny). Meloksykam (2 mg/kg) należy podawać we wstrzyknięciu podskórnym w celu znieczulenia przedoperacyjnego. Potwierdź zanik reakcji na bolesne bodźce, takie jak szczypanie ogona, aby zapewnić odpowiednią głębokość znieczulenia. Dodaj połowę dawki ketaminy-ksylazyny za każdym razem, gdy znieczulenie ustąpi podczas zabiegu, zwykle 1 godzinę po pierwszym podaniu i co 30 minut po nim. Użyj poduszki grzewczej pod ciałem, aby zapewnić wsparcie termiczne i nałóż maść okulistyczną na oczy, aby zapobiec wysuszeniu w znieczuleniu.
   UWAGA: Wybór znieczulenia do zabiegu chirurgicznego jest niezbędny. Ten punkt jest szczegółowo omówiony w sekcji Dyskusja.
2. Nałóż krem do depilacji, aby usunąć włosy ze skóry głowy. Zdezynfekuj skórę głowy kilka razy okrężnymi ruchami za pomocą peelingu powidonowo-jodowego, a następnie alkoholem. Umieść mysz na platformie operacyjnej przygotowanej ze sterylną wodoodporną podkładką i nałóż sterylne serwety, aby zabezpieczyć pole operacyjne. Następnie należy przeciąć i usunąć skórę głowy okrężnie za pomocą skalpela, tak aby kości ciemieniowe i potyliczne były całkowicie odsłonięte po stronie operacyjnej.
3. Usuń podskórną tkankę łączną, pocierając ją bawełnianym wacikiem, jednocześnie nakładając sterylną sól fizjologiczną w celu usunięcia krwawienia. Delikatnie zeskrobać powierzchnię czaszki miniaturowym nożem z okrągłą końcówką, aby usunąć okostną, co pomaga wzmocnić przyczepność między cementem a kością (patrz krok 2.6).
4. Nałóż materiał do trawienia zębów na całą powierzchnię, odczekaj kilkadziesiąt sekund i spłucz wystarczającą ilością sterylnego soli fizjologicznej.
5. Za pomocą wodoodpornego tuszu zaznacz obszar kości do usunięcia (okrągły obszar o średnicy 3,0 mm, wyśrodkowany około 2,5 mm z tyłu i 2,5 mm z boku bregmy). Po znakowaniu dokładnie osusz powierzchnię czaszki.
   UWAGA: Pozycja kraniotomii zależy od wielkości hipokampa i powinna być zoptymalizowana dla różnych grup wiekowych. Przydatne wskaźniki dotyczące pozycji kraniotomii zostaną przedstawione poniżej (patrz krok 3.4.5, UWAGA).
6. Przymocuj prostokątną aluminiową płytkę o grubości 1,0 mm i z otworem o średnicy 5,0 mm pośrodku do czaszki za pomocą cementu z żywicy dentystycznej zgodnie z instrukcjami producenta.
   1. Ostrożnie wyrównaj otwór w środku płytki z okrągłym obszarem zaznaczonym długopisem (patrz krok 2.5) tak, aby aluminiowa płytka była równoległa do zaznaczonej powierzchni czaszki (Rysunek 1B). Upewnij się, że cement szczelnie uszczelnia wszystkie szczeliny między płytką a kością. Odczekaj około 5 minut, aż cement wystarczająco stwardnieje.
7. Umieść mysz na urządzeniu trzymającym głowę z regulatorami kąta za pomocą dołączonej płytki.

3. Implantacja okna obserwacyjnego

UWAGA: Następujące zabiegi chirurgiczne powinny być wykonywane pod mikroskopem stereoskopowym.

1. Wykonaj okrągły rowek na czaszce za pomocą stempla skórnego o średnicy 3.0 mm. Wyrównaj okrągły rowek i obszar zaznaczony długopisem w kroku 2.5. Przekręć stempel skórny z delikatnym naciskiem, aby głębokość rowka stopniowo się zwiększała. Często sprawdzaj, czy głębokość rowka jest stała na całym obwodzie.
2. Gdy stempel skórny dotrze do najbardziej wewnętrznej warstwy czaszki, przed dotknięciem leżącej poniżej opony twardej, delikatnie unieś centralną wyspę kostną za pomocą igły 30 G.
   UWAGA: Niewielki wyciek cieczy z dna rowka wskazuje, że rowek znajduje się blisko opony twardej.
3. Usuń oponę twardą za pomocą selektora opony twardej.
   UWAGA: Całkowite usunięcie opony twardej w oknie czaszki jest konieczne i będzie wymagało starannego wycięcia pozostałej opony twardej na obwodzie za pomocą cienkich kleszczy.
4. Delikatnie odessać tkankę, aby odsłonić zębodoł hipokampa, za pomocą igieł 23 G lub 25 G podłączonych do aspiratora.
   UWAGA: Ten krok jest najbardziej krytyczny dla pomyślnego obrazowania. Kluczowe kwestie techniczne dotyczące aspiracji tkanek są szczegółowo opisane w sekcji Dyskusja.
   1. Odessać naczynia pia i pial.
   2. Odessać tkankę korową z powierzchni. Utrzymuj jednorodną głębokość odsłoniętej powierzchni tkanki na całej długości okna czaszki. Stopniowo pogłębiaj aspirację, aż do odsłonięcia włókien kapsułki zewnętrznej.
   3. Ostrożnie przyłóż końcówkę ssącą do torebki zewnętrznej w pobliżu komory bocznej (LV) znajdującej się na rostrobocznym końcu okna czaszki. Usuń warstwę powierzchniową torebki zewnętrznej biegnącą w kierunku ogoniastym do rostrolateralnego, a następnie warstwę wewnętrzną biegnącą w kierunku przyśrodkowo-bocznym.
      UWAGA: Zewnętrzną kapsułę w pobliżu lewej wysokości można łatwo usunąć z leżącej poniżej konstrukcji.
   4. Potwierdzić usunięcie całej torebki zewnętrznej, sprawdzając pełne odsłonięcie powierzchni pęcherzyka i spoidła grzbietowego hipokampa (DHC).
      UWAGA: DHC obejmuje przyczynowo-przyśrodkową część CA1. Wyrostek zębodynowy i DHC można odróżnić od kapsułki zewnętrznej po ich orientacji włókien. Mianowicie, włókna w zębole i DHC biegną w kierunku rostroprzyśrodkowym do ogoniastego i można je odróżnić od włókien w torebce zewnętrznej. Wyrostek zębodynowy i DHC są ściśle przymocowane do CA1 i nie powinny być uszkodzone. Wszystkie fragmenty torebki zewnętrznej należy usunąć, ponieważ wszelkie pozostałe fragmenty zapobiegną bezpośredniemu kontaktowi szkiełka nakrywkowego ze szkiełkiem nakrywkowym.
   5. Upewnij się, że krwawienie dokładnie się zatrzymało i wypełnij otwór sterylnym roztworem soli fizjologicznej do poziomu powierzchni czaszki.
      UWAGA: Pole widzenia w tym miejscu pomaga ocenić, czy otwór znajduje się w odpowiednim położeniu dla określonego wieku myszy. Idealnie byłoby, gdyby zębodół zębodołowy i leżący pod nim CA1 zajmowały większość obszaru centralnego. Część DHC jest widoczna w obszarze ogoniastym. Otwór LV jest wykrywalny na krawędzi ostrobocznej (Rysunek 3A).
5. Włóż metalową rurkę ze szklanym dnem (patrz krok 1.1) pionowo do otworu, jednocześnie zasysając nadmiar wody, która przelewa się z boków rurki, aż szklane dno lekko dociśnie do pęcherzyka i częściowo spłaszczy leżący pod spodem CA1.
   UWAGA: To ciśnienie należy odpowiednio wyregulować. Jeśli jest zbyt mocny, CA1 zostanie uszkodzony. Jeśli jest zbyt słaby, aberracja sferyczna spowodowana krzywizną CA1 pogorszy rozdzielczość obrazowania w głębokich strukturach.
6. Używając cementu z żywicy dentystycznej, przymocuj ściankę włożonej rurki do otaczającej czaszki (Rysunek 1C). Upewnij się, że cały obwód jest szczelnie uszczelniony i że nie ma wycieku powietrza lub płynu mózgowo-rdzeniowego. Odczekaj około 5 minut, aż cement stwardnieje.
   UWAGA: Jeśli cement zostanie umieszczony, gdy jego lepkość jest niska, może przedostać się do miąższu mózgu przez szczelinę między rurką a czaszką i uszkodzić mózg. Dlatego cement należy nakładać po rozpoczęciu polimeryzacji, co zwiększa lepkość i zmniejsza przeciek przez szczelinę.
7. Umyj całą płytkę, czaszkę i wnętrze probówki sterylnym roztworem soli fizjologicznej, aby usunąć zanieczyszczenia.

4. Mikroskopia dwufotonowa bezpośrednio po operacji w celu sprawdzenia jakości operacji

1. Umieść mysz w urządzeniu trzymającym głowę pod soczewką obiektywu mikroskopu dwufotonowego i na zmotoryzowanym stoliku skanującym XY. Użyj poduszki grzewczej do wsparcia termicznego. Monitoruj i dostosuj głębokość znieczulenia zgodnie z opisem w kroku 2.1, ponieważ kontrola jakości może potrwać do 30 minut.
   UWAGA: Zalecana jest soczewka obiektywowa zanurzająca się w wodzie o odległości roboczej (WD) większej niż 3 mm i dużej przysłonie numerycznej (NA). Kołnierz korekcyjny soczewki obiektywu może poprawić rozdzielczość, kompensując niedopasowanie współczynnika załamania światła między szkłem a biomateriałami.
2. Wypełnij przestrzeń między szkłem a soczewką obiektywu wodą, zwracając szczególną uwagę, aby uniknąć pęcherzyków powietrza. W razie potrzeby rozszerz obszar metalowej płytki za pomocą folii z tworzywa sztucznego, która zatrzymuje więcej wody, aby pokryć całą przednią soczewkę obiektywu.
3. Włącz femtosekundowy laser impulsowy o długości fali 920 nm w celu wzbudzenia sond fluorescencyjnych wyrażonych w mózgu i uruchom oprogramowanie do akwizycji obrazu.
4. Dostosuj ostrość do CA1 za pomocą zmotoryzowanego stolika i zmotoryzowanego systemu ustawiania ostrości. Ustaw strukturę docelową pod kierunkiem fluorescencji emitowanej przez miąższ mózgu i światła odbitego od krawędzi metalowej rurki pod ciągłym oświetleniem lasera impulsowego.
5. Zmierz głębokość miąższu mózgu dotykającego szklanego dna, regulując ostrość za pomocą zmotoryzowanego systemu ustawiania ostrości. Porównaj głębokości w różnych miejscach poziomych, aby ocenić wyrównanie szklanego dna i płaszczyzny obrazowania.
   1. Dostosuj kąt nachylenia głowicy myszy, przechylając urządzenie przytrzymujące głowicę, aż szklane dno zostanie ustawione tak, aby było równoległe do płaszczyzny obrazowania.
6. Dostosuj kołnierz korekcyjny obiektywu, aby uzyskać najwyższą rozdzielczość na głębokości struktury docelowej w CA1.
7. Upewnij się, że komórki fluorescencyjne w warstwie molekularnej (ML) górnej łopatki DG na głębokości 500 μm od szklanego dna mogą być obrazowane w całym polu widzenia.
   UWAGA: Ten krok jest ważny w ocenie jakości operacji. Jeśli CA1 jest uszkodzony, ogniskowy obrzęk mózgu uniemożliwia wykrycie fluorescencji na głębokości większej niż 200 μm od powierzchni. Tylko wtedy, gdy nie ma uszkodzenia CA1, a krzywizna warstw CA1 jest odpowiednio spłaszczona przez leżące nad nią szkiełko nakrywkowe, sygnały DG mogą być wykryte natychmiast po operacji (Rysunek 2A-D). Sekcja "Reprezentatywne wyniki" umożliwia proste określenie granicy między CA1 a DG.

5. Opieka pooperacyjna

1. Zassaj wodę do wnętrza rurki i przykryj ją plastikową uszczelką, aby zapobiec przedostawaniu się zanieczyszczeń.
2. Utrzymuj mysz w cieple i poczekaj na powrót do zdrowia po znieczuleniu.
3. Meloksykam (2 mg/kg) należy podawać podskórnie co 24 godziny, dopóki mysz wykazuje zachowania związane z bólem.
4. Hoduj mysz pooperacyjną w indywidualnym pomieszczeniu przez kilka tygodni.

6. Przewlekłe obrazowanie dwufotonowe mikrogleju in vivo przy użyciu myszy CX3CR1-GFP

1. Po indukcji znieczulenia umyj wnętrze metalowej rurki sterylną solą fizjologiczną, aby usunąć zanieczyszczenia. Upewnij się, że biały pęcherzyk hipokampa jest widoczny przez szkło (Rysunek 3A) i nie ma żadnych komplikacji, takich jak krwawienie pooperacyjne.
2. Umieść mysz pod mikroskopem dwufotonowym, wykonując kroki od 4.1 do 4.6.
3. Sprawdź jakość i intensywność obrazów uzyskanych przez wzbudzenie dwufotonowe hipokampa (Rysunek 3B). Upewnij się, że zdjęcia wykonane po zmniejszeniu obrzęku pooperacyjnego są porównywalne lub lepsze niż te wykonane w dniu operacji (Rysunek 2A, patrz krok 4.5).
   UWAGA: Pogorszenie obrazu wskazuje na obecność uszkodzenia tkanek wewnątrz mózgu.
4. Upewnij się, że mikroglej odzyskał już swoją rozgałęzioną morfologię (Rysunek 3C).
   UWAGA: Dane obrazowe mikrogleju wskazują, że potrzeba co najmniej 3-4 tygodni, aby mikroglej powrócił do stanu podstawowego.
5. Wykonaj obrazowanie in vivo w dowolnych warstwach CA1 dla określonego celu eksperymentu.

Wyniki

Korzystając z tej techniki, rozgałęziony i spokojny mikroglej może być chronicznie obserwowany we wszystkich warstwach grzbietowej CA1, w tym w warstwie grzbietowej (SO), warstwie piramidalnej (SP), warstwie promienistej (SR) i warstwie lacunosum-moleculare (SLM), szczególnie 3-4 tygodnie po operacji, gdy stan zapalny ustępuje. Jeśli zabieg zostanie wykonany prawidłowo, obrazowanie można wykonać nawet do kilku miesięcy po zabiegu. Ta sekcja zawiera trzy tematy przydatne do oceny obrazowania przyżyciowego. Po pierwsze, przykładowe obrazy bezpośrednio po operacji i w fazie przewlekłej są dostarczane jako odniesienie do odpowiednich procedur chirurgicznych i obrazowych. Po drugie, opisano odrębną morfologię mikrogleju, jego intensywność fluorescencji i rozmieszczenie naczyń krwionośnych w określonych warstwach hipokampa, aby pomóc czytelnikom oszacować głębokość obrazowania w zakresie od pęcherzyka do DG. Po trzecie, podano przykład zastosowania, który ilustruje jednoczesne obrazowanie neuronów i mikrogleju.

Reprezentatywne obrazy mikrogleju u myszy CX3CR1-GFP bezpośrednio po operacji są pokazane w Rysunek 2. Jeśli nie ma widocznego uszkodzenia CA1, a krzywizna warstw CA1 jest odpowiednio spłaszczona przez leżące nad nią szkiełko nakrywkowe, dwufotonowe głębokości obrazowania mikrogleju przekraczają całe warstwy CA1 i osiągają 500 μm od powierzchni operacyjnej, gdzie istnieje ML lub warstwa komórek ziarnistych (GCL) DG (Rysunek 2A; patrz krok 4.7 i Rysunek 4E). Mikroglej jest nieco mniej rozgałęziony, zwłaszcza w warstwie blisko powierzchni operacyjnej w porównaniu z tymi w nienaruszonym hipokampie. Niemniej jednak nie wykazują one wyraźnej aktywacji, co sugeruje prawidłowe procedury chirurgiczne (Ryc. 2B). Z drugiej strony, obrzęk w CA1 wywołany uszkodzeniem tkanki ograniczy głębokość obrazowania do 200 μm (Rysunek 2C). Uszkodzenie tkanek wywołuje również nieprawidłową aktywację mikrogleju, taką jak akumulacja procesów wybrzuszania w kierunku powierzchni wolnej tkanki ( Rysunek 2D; porównaj z górnym obrazem Rysunek 2B). Są to oznaki niewłaściwej operacji.

Reprezentatywne obrazy mikrogleju w fazie przewlekłej ponad 3 tygodnie po operacji są pokazane w Rysunek 3. Mikroglej może być ponownie zobrazowany poza CA1 do głębszych warstw DG z większą intensywnością i rozdzielczością fluorescencyjną oraz z bardziej jednorodnym rozkładem (patrz krok 6.3, Rysunek 3B). Jakość obrazowania jest lepsza niż bezpośrednio po operacji (Ryc. 2A). Różnicę tę można wytłumaczyć zmniejszonym obrzękiem i stanem zapalnym. Mikroglej we wszystkich warstwach przywrócił już swoją rozgałęzioną morfologię (Ryc. 3C), różniącą się od ich wyglądu pooperacyjnego ( Ryc. 2B). Obrazowanie poklatkowe mikrogleju w CA1 ujawnia nieruchome ciała komórkowe i wysoce ruchliwe procesy do nadzoru (Wideo 1-2). Ich ruchliwe zachowanie jest podobne do poprzedniego raportu o dynamice procesów mikrogleju w korze⁹.

Łatwo jest określić obrazowane warstwy hipokampa na podstawie rozmieszczenia i głębokości ciał komórek neuronalnych, używając myszy wyrażających sondy fluorescencyjne w neuronach hipokampa^25,26,27. Bez pomocy informacji o położeniu ciał komórek neuronów, same sygnały z fluorescencyjnego mikrogleju dostarczają pewnych wskazówek do identyfikacji warstw hipokampa (Ryc. 3B). Mikroglej w zębole ma wydłużone ciała komórkowe i procesy, które mają tendencję do rozciągania się wzdłuż dróg aksonalnych (Ryc. 4A). Mikroglej w innych warstwach można odróżnić po okrągłych ciałach komórkowych i procesach promieniujących bez preferowanych kierunków. Mikroglej w SP należy do gęsto upakowanych neuronów piramidowych i można go odróżnić po mniejszej gęstości procesów mikroglejowych. Warstwy powyżej i poniżej SP są oznaczone odpowiednio jako SO i SR (Rysunek 4B). Niemożliwe jest rozróżnienie między SR i SLM na podstawie samych właściwości mikrogleju. Granicę między CA1 a DG rozpoznaje się po grubych naczyniach krwionośnych biegnących wzdłuż granicy (Rysunek 4C). Naczynia te można lepiej rozpoznać, oznaczając naczynia barwnikami, takimi jak sulforodamina 101 (SR101; 5 mM, 4 μl / g masy ciała) wstrzykiwana dootrzewnowo (Ryc. 4D). Sygnał fluorescencyjny z mikrogleju gwałtownie spada w DG w porównaniu z leżącym nad nim CA1, prawdopodobnie z powodu różnicy w współczynniku załamania światła tych struktur. Ta różnica w intensywności fluorescencji może również pomóc w określeniu granicy między DG a CA1. Jako przykład zastosowania pokazano jednoczesne obrazowanie mikrogleju GFP-dodatniego i neuronów piramidowych znakowanych tdTomato (Rysunek 4E). W tym eksperymencie myszy CX3CR1-GFP otrzymały wstrzyknięcie wirusa związanego z adenowirusem (AAV) w celu ekspresji tdTomato w neuronach piramidowych hipokampa. Znakowanie neuronalne pomoże zrozumieć dokładne struktury warstw CA1.

Rysunek 1: Schematyczne rysunki do implantacji okna obserwacyjnego. (A) Przekrój poprzeczny zmontowanej metalowej rurki ze szklanym dnem. Okrągłe szklane szkiełko nakrywkowe przylega do jednego końca cylindrycznej rurki ze stali nierdzewnej. (B) Przekrój poprzeczny aluminiowej płytki przymocowanej do czaszki. Płytka powinna być równoległa do zaznaczonej powierzchni czaszki, aby nie kolidować z soczewką obiektywu, umieszczoną blisko płytki w celu ustawiania ostrości. (C) Przekrój poprzeczny wszczepionej rurki. Szklane dno powinno być ściśle przymocowane do pęcherzyka hipokampa, aby delikatnie docisnąć i spłaszczyć powierzchnię CA1. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Obrazowanie in vivo mikrogleju u myszy CX3CR1-GFP bezpośrednio po operacji. (A) Reprezentatywna rekonstrukcja 3D z obrazowania CA1 in vivo myszy CX3CR1-GFP w dniu pooperacyjnym (POD) 0 (szerokość: 511 μm, wysokość: 511 μm, głębokość: 550 μm). Fluorescencyjny mikroglej w ML DG na głębokości 500 μm od szklanego dna może być obrazowany przez cały CA1. (B) Typowy mikroglej wypełniony GFP uzyskany w (A) przedstawiono jako projekcje o maksymalnej intensywności (MIP) stosów obrazów o grubości 20 μm na głębokości 100, 300 i 520 μm od szklanego dna. Morfologia mikrogleju jest wykrywalna od powierzchownego CA1 do ML DG, chociaż z widocznym pogorszeniem obrazu w DG. Mikroglej, zwłaszcza w warstwie blisko powierzchni operacyjnej, jest mniej rozgałęziony, ale nie wykazuje wyraźnej aktywacji. Podziałka liniowa, 50 μm. (C) Reprezentatywna rekonstrukcja obrazu 3D chirurgicznie uszkodzonego CA1. Dane zostały pozyskane z myszy CX3CR1-GFP na POD 0 (szerokość: 399 μm, wysokość: 399 μm, głębokość: 450 μm). Fluorescencja mikrogleju jest wykrywalna tylko do głębokości 200 μm, w przeciwieństwie do nieuszkodzonego CA1 (A) z fluorescencyjnym mikroglejem wykrytym na głębokości 500 μm. (D) Typowy obraz nieprawidłowo aktywowanego mikrogleju w (C). MIP stosów obrazów GFP o grubości 20 μm na głębokości 60 μm pokazuje procesy wybrzuszania mikrogleju rozciągające się w kierunku chirurgicznie odsłoniętej powierzchni tkanki. Ogólna morfologia mikrogleju różni się od obrazu pokazanego na (B). Podziałka liniowa, 100 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Obrazowanie in vivo mikrogleju u myszy CX3CR1-GFP w fazie przewlekłej. (A) Reprezentatywny wygląd wszczepionego okna na prawym grzbietowym CA1 w fazie przewlekłej. Przez szklane dno wyraźnie widać białe włókna zębodołu bez krwawienia pooperacyjnego. DHC i LV są częściowo widoczne odpowiednio w obszarze ogoniastym i na krawędzi grzbietowo-bocznej. Podziałka, 1 mm. (B) Reprezentatywna rekonstrukcja 3D na podstawie przewlekłego obrazowania CA1 in vivo myszy CX3CR1-GFP na POD 24 (szerokość: 511 μm, wysokość: 511 μm, głębokość: 670 μm). W porównaniu z obrazami bezpośrednio po operacji (Ryc. 2A), mikroglej wykazuje bardziej jednorodny rozkład i można go wyraźniej zaobserwować w głębszych warstwach DG ze względu na zmniejszenie obrzęku i stanu zapalnego. (C) Typowe obrazy mikrogleju z (B) z w pełni przywróconą rozgałęzioną morfologią są pokazane jako MIP stosów obrazów GFP o grubości 20 μm na głębokości 100, 280 i 500 μm od powierzchni operacyjnej. Podziałka skali, 50 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Wskazówki do identyfikacji każdej warstwy hipokampa podczas obrazowania in vivo oraz przykład zastosowania tej metody. (A) Typowy obraz mikrogleju w pęcherzyku zębodołowym myszy CX3CR1-GFP w fazie przewlekłej. Ciała i procesy komórkowe mikrogleju przebiegające wzdłuż dróg aksonalnych są pokazane w MIP stosów obrazów GFP o grubości 10 μm na głębokości 15 μm. Pasek skali, 50 μm. (B) Reprezentatywne obrazy mikrogleju w SO, SP i SR w fazie przewlekłej pokazane jako MIP stosów obrazów GFP o grubości 5 μm. Lokalna gęstość procesów mikrogleju jest niższa w SP niż w otaczającym SO lub SR ze względu na gęsto upakowane neurony piramidalne w SP. Paski skali, 100 μm. (C) Grube naczynia krwionośne biegnące wzdłuż granicy między CA1 i DG można rozpoznać tylko na podstawie fluorescencji mikrogleju. Pokazano średnią projekcję intensywności kafelkowych stosów obrazów GFP o grubości 90 μm w fazie przewlekłej na głębokości około 500 μm. Pustka sygnału GFP odpowiada grubym zbiornikom. Podziałka, 500 μm. (D) (górna) Obraz tego samego pola widzenia co C po dootrzewnowym wstrzyknięciu SR101. Podziałka, 500 μm. (dolna) Rekonstrukcja 3D obrazów kafelków po iniekcji SR101 (szerokość: 2,60 mm, wysokość: 1,73 mm, głębokość: 0,69 mm). Grube naczynia biegnące wzdłuż granicy między CA1 i DG można łatwo rozpoznać po wewnątrznaczyniowej fluorescencji SR101. (E) (po lewej) rekonstrukcja 3D CA1 i DG (szerokość: 255 μm, wysokość: 255 μm, głębokość: 730 μm) oraz (po prawej) MIP fluorescencji GFP i tdTomato w SP wykonane ze stosów obrazów o grubości 20 μm. Na 1 tydzień przed zabiegiem 1,5 μl mieszaniny AAV1-CAG-FLEX-tdTomato (5,0 x 10¹² vg/mL) i AAV1-hSyn-Cre (1,0 x 10⁹ vg/mL) wstrzyknięto do hipokampa myszy CX3CR1-GFP w celu rzadkiego znakowania neuronów. Obrazowanie wykonano na POD 0. SP i GCL są łatwo rozpoznawalne po położeniu ciał komórek neuronalnych. Podziałka skali, 50 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Wideo 1: Obrazowanie poklatkowe mikrogleju SO w fazie przewlekłej. MIP obrazu GFP kumuluje się z grubością 20 μm w obrazowaniu poklatkowym mikrogleju SO, animowanym tak, że 28 minut odtwarzania w 1 sekundę. Podziałka, 50 μm. Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.

Wideo 2: Obrazowanie poklatkowe mikrogleju SR w fazie przewlekłej. MIP obrazu GFP nakłada się na grubość 20 μm w obrazowaniu poklatkowym mikrogleju SR, animowany tak, że 28 minut odtwarzania w 1 sekundę. Podziałka liniowa, 50 μm. Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.

Dyskusja

Metoda ta obejmuje skomplikowane zabiegi chirurgiczne, ale może zapewnić obrazy o wysokiej rozdzielczości na całym CA1 przez dłuższy czas, jeśli zostanie odpowiednio przygotowana. Eksperymenty na kilku myszach potwierdziły, że jakość obrazu w przewlekłej fazie pooperacyjnej jest lepsza niż w przypadku ostrego obrazowania pooperacyjnego. Lepsza jakość obrazu utrzymywała się przez ponad 2 miesiące. Najczęstszą przyczyną niepowodzenia jest niezamierzone uszkodzenie CA1 podczas operacji, które jest identyfikowane podczas pooperacyjnej kontroli jakości (patrz krok 4). Może to być spowodowane bezpośrednim uszkodzeniem przez aspirację, wysuszeniem mózgu, nadmiernym naciskiem szkła lub toksycznością cementu dentystycznego na ostatnim etapie. Inną przyczyną niepowodzenia jest krwawienie pooperacyjne, które można potwierdzić przez okienko ze szklanym dnem w ciągu 1 tygodnia po zabiegu (patrz krok 6.1). Przeczytaj uważnie protokół i podejmij wszelkie środki ostrożności, aby uniknąć takich problemów.

Nawet przy obecnej konfiguracji mikroskopu dwufotonowego z detektorami GaAsP w laboratorium, próba zobrazowania grzbietowego CA1 przez korę powoduje znaczną utratę rozdzielczości z powodu niebagatelnego rozpraszania światła. Dlatego, aby uzyskać rozdzielczość wystarczającą do obserwacji ruchu procesów mikrogleju lub tworzenia się kolców dendrytycznych neuronów w CA1, usunięcie części leżącej nad nim kory jest nieuniknione, tak jak w obecnej metodzie. Jedynym alternatywnym sposobem na zmniejszenie zakresu usuwania kory mózgowej przy zachowaniu wysokiej rozdzielczości obrazu jest osadzenie soczewki przekaźnikowej, takiej jak soczewka z gradientowym współczynnikiem załamania światła (GRIN). W tym podejściu soczewka GRIN została umieszczona w rurce prowadzącej wszczepionej bezpośrednio nad CA1 w celu przewlekłego obrazowania CA1^28,29. Zewnętrzna średnica rurki prowadzącej wynosiła 1,8 mm, czyli mniej niż 3,0 mm urządzenia w tym artykule, przy jednoczesnym wytwarzaniu wysokiej rozdzielczości (NA; 0,82) porównywalnej z systemem tutaj (efektywna NA; 0,88). Jednak podejście wykorzystujące soczewkę GRIN ma wąskie pole widzenia do obserwacji w wysokiej rozdzielczości i krótką głębokość obrazowania ograniczoną przez WD soczewki GRIN. Dlatego obrazowanie wszystkich warstw hipokampa w szerokim polu widzenia z wysoką rozdzielczością jest szczególną zaletą metody opisanej w tym artykule.

Ograniczeniem tej procedury jest to, że częściowe usunięcie kory i stan zapalny mogą mieć pewien szkodliwy wpływ na hipokamp. Ponieważ jednak usunięta kora nie ma bezpośredniego wpływu na hipokamp, kora śródwęchowa nie jest uszkodzona, a sam hipokamp nie jest bezpośrednio uszkodzony, ogólna ocena jest taka, że funkcjonalne upośledzenie hipokampa nie jest znaczące. Kilka wcześniejszych badań potwierdziło, że funkcje hipokampa, w tym uczenie się i pamięć, są zachowane po implantacji okna hipokampa 25,26,27,30,31,32,33,34. W związku z tym oczekuje się, że opisane tutaj podejście do obrazowania wiernie odnotuje funkcje hipokampa po wystarczającym okresie pooperacyjnym.

Przyszłe kierunki badań opartych na tej technice obrazowania mogą obejmować przycinanie synaps wykrywane przez jednoczesne obrazowanie mikrogleju i^neuronów5, interakcję mikrogleju związaną z uczeniem się z synapsami³⁵, ruchliwość mikrogleju regulowaną przez aktywność neuronalną hipokampa³⁶ oraz reakcje mikrogleju na zapalenie obwodowe lub uszkodzenie tkanek⁷. Metoda ta pomoże również wyjaśnić postęp chorób neurodegeneracyjnych. Na przykład w chorobie Alzheimera (AD) β amyloidowe i białka tau gromadzą się równolegle ze śmiercią komórek neuronalnych i zanikiem hipokampa, co prowadzi do dysfunkcji poznawczych; Doniesiono, że mikroglej jest zaangażowany w ten proces^37,38. Przewlekłe obrazowanie in vivo mikrogleju i neuronów przy użyciu mysich modeli AD umożliwi nam monitorowanie korelacji między funkcjami mikrogleju a patologią neuronalną w hipokampie mysich modeli AD.

Niniejsza praca koncentruje się na obrazowaniu mikrogleju, ale ta sama procedura obrazowania ma zastosowanie do innych typów komórek neuronalnych i glejowych w CA1. Ponadto protokół ogranicza się do obrazowania znieczulonych myszy, ale technikę można również rozszerzyć o monitorowanie mikrogleju hipokampa u obudzonych myszy. Artefakty ruchu wywołane oddychaniem, biciem serca i ruchami ciała, zwłaszcza w głębokich warstwach hipokampa z dala od szklanego okna, mogą istnieć w eksperymentach z przebudzonymi myszami. W związku z tym może być wymagany odpowiedni system korekcji ruchu w celu uchwycenia morfologii i dynamiki mikrogleju.

Dyskusja na temat protokołu
Zaleca się wybór myszy w odpowiednim wieku i z odpowiednimi modyfikacjami genetycznymi do ekspresji sond fluorescencyjnych o swoistości czasowej i przestrzennej (patrz krok 1.3). Myszy w wieku 1 miesiąca mogą być wykorzystywane do eksperymentów, ale myszy starsze niż 2 miesiące są łatwiejsze w obsłudze, dzięki większym rozmiarom ciała i odporności na stres chirurgiczny. Ponadto torebka zewnętrzna i pęcherzyk hipokampa są trudniejsze do oddzielenia u młodszych myszy. Dlatego usunięcie zewnętrznej torebki u młodych myszy wymaga umiejętności chirurgicznych (patrz kroki 3.4.3-4). Ocena operacji i późniejsze obrazowanie będą prostsze w przypadku myszy z ekspresją białek fluorescencyjnych w sposób powtarzalny i jednolity w CA1 i DG (patrz krok 4.7). Dlatego we wstępnych próbach chirurgii zaleca się użycie myszy transgenicznych ze słabo znakowanymi neuronami, takich jak myszy Thy1-YFP lub Thy1-GFP³⁹, lub myszy z znakowanym mikroglejem, takich jak myszy CX3CR1-GFP²⁴.

Dla powodzenia operacji ważny jest wybór znieczulenia (patrz krok 2.1). Różne rodzaje znieczulenia mogą powodować różne stopnie śródoperacyjnego obrzęku mózgu, co wpływa na trudność operacji, względne położenie wszczepionej metalowej rurki i stopień ucisku mózgu przez szklane okienko. Czynniki te mogą również wpływać na przeżycie neuronów hipokampa po operacji.

W procesie aspiracji do odsłonięcia hipokampa (patrz krok 3.4) należy zwrócić uwagę na następujące punkty, aby zminimalizować uszkodzenia mózgu i zapewnić skuteczne obrazowanie. Stale dostarczaj sterylną sól fizjologiczną na powierzchnię tkanki, umieszczając ujście z boku okna czaszki. Zapobiegaj wystawieniu powierzchni tkanki na działanie powietrza podczas aspiracji. Podstawową zasadą aspiracji tkanek jest usunięcie powierzchni tkanki poprzez przepływ cieczy do końcówki ssącej. Należy unikać bezpośredniego kontaktu końcówki ssącej z tkanką. Dostosuj podciśnienie przyłożone do rury ssącej na minimum. Odsysaj tkankę krok po kroku i upewnij się, że krwawienie jest kontrolowane na każdym kroku. Gdy krwawienie się przedłuża, należy poczekać, aż krwawienie ustanie samoistnie. Utrzymuj aspirację z niewielkiej odległości od miejsca krwawienia przy stałym przepływie sterylnego roztworu soli fizjologicznej. Odessać tkankę, aby utworzyć cylindryczną przestrzeń, której rozmiar pasuje do metalowej rurki ze szklanym dnem (patrz krok 1.1). Wybierz igły 23 G do zasysania grubych naczynek lub dużych fragmentów tkanek oraz igły 25 G do zasysania małych resztek tkanek.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
igły 23 G	NIPRO	02-166	Końcówki ssące do aspiracji.
igły 25 G	NIPRO	02-167	Końcówki ssące do aspiracji.
Stemple skórne 3 mm (DermaPunch)Maruho		213001610	Narzędzia do kraniotomii.
Igły 30 G	Dentronics	Igła jednorazowa nr 30	Narzędzia do kraniotomii.
Femtosekundowy laser impulsowy	Spectra-Physics	MaiTai Deep See	A Ti:Sapphire laser używany na długości fali 920 nm.
Mikroskop dwufotonowy	Nikon	A1R MP+	Microscope do obrazowania CA1.
AAV1-CAG-FLEX-tdTomato	Penn Vector Core		AAV do znakowania neuronów.
AAV1-hSyn-Cre	Penn Vector Core		AAV do znakowania neuronów.
Soczewka obiektywowa do obrazowania dwufotonowego	Olympus	XLPLN25XSVMP	25-krotny obiektyw o dużej odległości roboczej, dużej aperturze numerycznej i kołnierzu korekcyjnym
Aspiratory	Shin-ei Industries	KS-500	Narzędzia do aspiracji.
Płyty aluminiowe	Narishige	CP-1	Płytki wykonane z aluminium do mocowania głowy.
Chemiczny krem do depilacji	YANAGIYA		Krem do depilacji wokół pola operacyjnego.
Szkiełka nakrywkowe okrągłe	Matsunami Glass	3φ Nr 1	Szkiełka nakrywkowe przyklejone do rur ze stali nierdzewnej.
Myszy CX3CR1-GFP	Laboratorium Jacksona	008451	Myszy transgeniczne do obrazowania mikrogleju.
Cylindryczne rurki ze stali nierdzewnej	MORISHITA	Wykonane na zamówienie	rurki metalowe do implantacji. Średnica zewnętrzna 3,0 mm, średnica wewnętrzna 2,8 mm, wysokość 1,7 mm.
Materiał do trawienia zębów	Sun Medical	204610461	Służy do wytrawiania kości czaszki.
Cement z żywicy dentystycznej (Super-Bond C& B)	Sun Medical	204610555	Cement dentystyczny.
Zbieracze opony twardej (Micro Points)	Fine Science Tools	10063-15	Narzędzia do usuwania opony twardej.
Drobne kleszcze (Dumont #5)	Narzędzia do nauki	11252-20	Narzędzia chirurgiczne.
Kleszcze	Bio Research Center	PRI13-3374	Służy do dezynfekcji miejsca operowanego.
Urządzenie do trzymania głowy	Narishige	MAG-2	Urządzenie do trzymania głowy myszy z regulatorami kąta
Poduszka grzewcza	Bio Research Center	BWT-100A i HB-10	Narzędzia zapewniające wsparcie termiczne myszy podczas operacji.
Poduszka grzewcza	ALA Scientific	HEATINGPAD-1 i Hot-1	Tools zapewniające termiczne wsparcie myszy na urządzeniu trzymającym głowę.
Ketamina (Ketalar)	Daiichi Sankyo Company	S9-001665	Znieczulenie podczas operacji.
Meloksykam	Tokyo Chemical Industry	M1959	Analgezja podczas operacji.
Maść okulistyczna	Sato Pharmaceutical		Stosowana w celu zapobiegania suchości oczu podczas zabiegu chirurgicznego.
Roztwór peelingujący powidonu i jodu	Meiji Seika Pharma	2612701Q1137	Służy do dezynfekcji miejsca operowanego.
Noże miniaturowe z okrągłymi końcówkami	Surgistar	4769	Narzędzia chirurgiczne.
Skalpel	MURANAKA MEDICAL INSTRUMENTS	450-098-67	Jednorazowe narzędzie chirurgiczne.
Mikroskopy stereoskopowe	Leica Microsystems	S8 APO	Mikroskopy do chirurgii.
Sterylna sól fizjologiczna	Fabryka Farmaceutyczna Otsuka	3311401A2026	Roztwór myjący podczas operacji.
Sterylna wodoodporna podkładka	AS ONE	8-5945-01	Platforma chirurgiczna.
Sulforodamina 101	Sigma-Aldrich	S7635	Barwnik do obrazowania naczyń krwionośnych in vivo.
Serweta chirurgiczna	Medline Industries	MP-0606F6T	Perforowana serweta do operacji.
Światło UV	Toshiba	GL15	Służy do utwardzania klejów.
Kleje optyczne utwardzane promieniami UV	Thorlabs	NOA81	Kleje do klejenia szkiełek nakrywkowych do rur ze stali nierdzewnej.
Ksylazyna (Celactal 2%)	Znieczulenie	Bayera