Artykuł metodologiczny

Prosta metoda filtracji laboratoryjnej do izolowania małych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych

DOI:

10.3791/64106

⸱

23 czerwca 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Centre for Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Universiti Kebangsaan Malaysia Medical Centre, 2My CytoHealth Sdn. Bhd., 3School of Biosciences, Faculty of Health and Medical Sciences, Taylor's University, 4School of Pharmacy, Monash University Malaysia, 5Haematology Unit, Cancer Research Centre, Institute for Medical Research (IMR), National Institutes of Health (NIH), Ministry of Health Malaysia, 6School of Pharmacy, Faculty of Health & Medical Sciences, Taylor's University, 7Centre for Drug Discovery and Molecular Pharmacology (CDDMP), Faculty of Health and Medical Sciences, Taylor's University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół pokazuje, jak izolować małe pęcherzyki zewnątrzkomórkowe ludzkich komórek macierzystych pochodzących z pępowiny (hUC-MSC-sEVs) za pomocą prostego laboratoryjnego ustawienia. Rozkład wielkości, stężenie białka, markery sEVs i morfologia izolowanych hUC-MSC-sEVs są charakteryzowane odpowiednio za pomocą analizy śledzenia nanocząstek, testu białka BCA, western blot i transmisyjnego mikroskopu elektronowego.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Proces oparty na ultrawirowaniu jest uważany za powszechną metodę izolacji małych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (sEVs). Jednak wydajność tej metody izolacji jest stosunkowo niższa, a metody te są nieefektywne w rozdzielaniu podtypów sEV. Badanie to demonstruje prostą metodę filtracji laboratoryjnej w celu wyizolowania małych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych MSC pochodzących z ludzkiej pępowiny (hUC-MSC-sEVs), z powodzeniem oddzielonych przez ultrafiltrację od kondycjonowanego podłoża hUC-MSC. Rozkład wielkości, stężenie białka, markery egzosomalne (CD9, CD81, TSG101) i morfologię izolowanych hUC-MSC-sEV scharakteryzowano odpowiednio za pomocą analizy śledzenia nanocząstek, testu białka BCA, western blot i transmisyjnego mikroskopu elektronowego. Izolowane hUC-MSC-sEV miały wielkość 30-200 nm, przy stężeniu cząstek 7,75 ×10 10 cząstkach/ml i stężeniu białka 80 μg/ml. Zaobserwowano dodatnie prążki dla markerów egzosomalnych CD9, CD81 i TSG101. Badanie to wykazało, że hUC-MSC-sEV zostały z powodzeniem wyizolowane z pożywki kondycjonowanej hUC-MSCs, a charakterystyka wykazała, że wyizolowany produkt spełniał kryteria wymienione w Minimal Information for Studies of Extracellular Vesicles 2018 (MISEV 2018).

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Według MISEV 2018, sEVs to niereplikujące się cząstki dwuwarstwowe lipidów bez funkcjonalnego jądra, o rozmiarach 30-200 nm1. SEV pochodzące z MSC zawierają ważne cząsteczki sygnałowe, które odgrywają ważną rolę w regeneracji tkanek, takie jak mikroRNA, cytokiny lub białka. Coraz częściej stają się one "gorącym punktem" badań w medycynie regeneracyjnej i terapii bezkomórkowej. Wiele badań wykazało, że sEV pochodzące z MSC są tak samo skuteczne jak MSC w leczeniu różnych schorzeń, takich jak immunomodulacja2,3,4,5, zwiększając osteogenezę6, diabetes mellitus7,8, or regenerationular regeneration9,10. Wraz z postępem badań wczesnej fazy, zwrócono uwagę na trzy główne kluczowe kwestie związane z klinicznym translacją MSCs-EV: wydajność EV, czystość EV (wolna od resztek komórkowych i innych zanieczyszczeń biologicznych, takich jak białka i cytokiny) oraz integralność dwuwarstwowej błony fosfolipidowej EV po izolacji.

Opracowano różne metody izolowania sEVs, wykorzystując gęstość, kształt, rozmiar i powierzchnię białka sEVs11. Dwie najczęstsze metody izolacji sEV to techniki oparte na ultrawirowaniu i ultrafiltracji.

Metody oparte na ultrawirowaniu są uważane za złote standardy w izolacji sEVs. Dwa rodzaje technik ultrawirowania, które są zwykle stosowane, to ultrawirowanie różnicowe i ultrawirowanie w gradiencie gęstości. Jednak metody ultrawirowania często skutkują niską wydajnością i wymagają drogiego sprzętu do ultrawirówki o dużej prędkości (100 000-200 000 × g)11. Co więcej, same techniki ultrawirowania są nieefektywne w oddzielaniu podtypów EV (sEV i dużych EV), co skutkuje zanieczyszczoną warstwą osadu11. Wreszcie, ultrawirowanie w gradiencie gęstości może być również czasochłonne i wymagać dodatkowych środków ostrożności, takich jak dodanie buforu sacharozy w celu zahamowania uszkodzeń gradientu podczas etapów przyspieszania i zwalniania12. W związku z tym ultrawirowanie zwykle prowadzi do stosunkowo niskiej wydajności i nie jest w stanie rozróżnić różnych populacji EVs13, co ogranicza jego zastosowanie do przygotowania EV na dużą skalę11.

Drugą metodą izolacji EV jest ultrafiltracja, która opiera się na filtracji rozmiarowej. Ultrafiltracja jest stosunkowo efektywna czasowo i kosztowo w porównaniu do ultrawirowania, ponieważ nie wymaga drogiego sprzętu ani długiego czasu przetwarzania14. W związku z tym ultrafiltracja wydaje się być skuteczniejszą techniką izolacji niż obie wyżej wymienione metody ultrawirowania. Wyizolowane produkty mogą być bardziej szczegółowe w oparciu o rozmiary porów i wyższą wydajność15. Jednak dodatkowa siła powstająca podczas procesu filtracji może spowodować deformację lub erupcję EVs16.

Obecny artykuł zaproponował efektywny kosztowo i czasowo protokół laboratoryjny do izolowania sEV pochodzących z MSC do dalszej analizy i celów terapeutycznych. Metoda opisana w tym artykule łączyła prostą metodę filtracji z wirowaniem laboratoryjnym w celu wyizolowania wysokowydajnych i dobrej jakości pojazdów elektrycznych z hUC-MSC do dalszej analizy, w tym analizy wielkości cząstek, oznaczania biomarkerów i obrazowania pod mikroskopem elektronowym.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Zobacz Tabelę Materiałów, aby uzyskać szczegółowe informacje na temat wszystkich materiałów, sprzętu i oprogramowania używanego w tym protokole.

1. Mezenchymalne komórki macierzyste i hodowla ludzkiej pępowiny

  1. Hoduj hUC-MSC przy gęstości wysiewu 5 × 103/cm2 w DMEM, uzupełnionym 8% ludzkim lizatem płytkowym i 1% paciorkowcem. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C w 5% CO2 . Wymieniaj pożywkę do hodowli komórkowych co 3 dni, aby zapewnić prawidłowy wzrost komórek.
  2. Rozwiń komórki do przejścia 5 w kolbach T175 w celu izolacji sEV.
    UWAGA: Do zebrania wysokiej wydajności sEV potrzeba wielu kolb (wydajność wzrasta wraz z liczbą komórek).

2. Izolacja małych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych od hUC - MSCs

  1. Zastąp pożywkę hodowlaną świeżym DMEM wolnym od czerwieni fenolowej uzupełnionym 1% Pen-Strep [Pożywka kondycjonowana (CM)], gdy kultura osiągnie 70%-80% konfluencji przy pasażu 5,
    UWAGA: Używaj tylko pożywek podstawowych; unikaj FBS i suplementu ludzkiego lizatu płytkowego, aby uniknąć zanieczyszczenia zewnętrznymi sEV.
  2. Po 24 godzinach odwirować CM przy 200 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C w celu usunięcia resztek komórek. Zebrać i przefiltrować supernatant przez filtr 0,22 μm w celu usunięcia cząstek większych niż 220 nm.
  3. Napełnij filtr odśrodkowy 30 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) przefiltrowanej przez filtr 0,2 μm. Odwirować filtr odśrodkowy o masie 3 500 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
  4. Napełnij przefiltrowany CM do filtra odśrodkowego (maksymalna objętość każdej jednostki to 70 ml). Odwirować CM w temperaturze 3 500 × g w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Czas wirowania należy od czasu do czasu monitorować, aż roztwór dotrze do powierzchni filtra.
  5. Wylać roztwór do kubka z roztworem filtratu. Odwirować odwirować kubek filtra próbki z kubkiem na koncentrat o temperaturze 1 000 x g w temperaturze 4 °C przez 2 minuty.
  6. Przenieś skoncentrowany CM z powrotem do odśrodkowej jednostki filtracyjnej. Dodać 30 ml przefiltrowanego PBS do filtra odśrodkowego i odwirować urządzenie w temperaturze 3 500 × g w temperaturze 4 °C.
  7. Wylać roztwór do kubka z roztworem filtratu. Zainstalować kubek na koncentrat na jednostce filtrującej i odwirować w odwróconej temperaturze 1 000 × g przez 2 minuty w temperaturze 4 °C, aby uzyskać oczyszczone sEV.
  8. Przefiltruj sEV przez filtr strzykawkowy 0,22 μm.
  9. Przenieść próbki do nowych probówek i przechowywać je w temperaturze -80 °C do dalszej analizy.

3. Charakterystyka hUC-MSC-sEVs

  1. Analiza śledzenia nanocząstek
    1. Rozcieńczyć izolowane hUC-MSC-sEV w przefiltrowanym PBS do 20-100 cząstek/ramkę.
    2. Wprowadzić 1 ml rozcieńczonej próbki do komory NTA za pomocą jednorazowych strzykawek o pojemności 1 ml.
    3. Ustaw odpowiednio ustawienia pomiaru: ustaw poziom kamery na poziom 14, określ próg wykrywania, aby objąć jak najwięcej cząstek, z ograniczeniem, że zliczanych jest 10-100 czerwonych krzyżyków, a liczba niebieskich krzyżyków jest ograniczona do pięciu.
    4. Dla każdego pomiaru nagraj pięć 1-minutowych filmów i przeanalizuj je za pomocą oprogramowania NanoSight z progiem wykrywania wynoszącym pięć.
    5. Pomiary należy wykonać w trzech egzemplarzach dla każdej próbki.
  2. Analiza Western blot
    1. Poddać lis hUC-MSC-sEV lodowato zimnemu buforowi do lizy testu radioimmunoprecypitacji (RIPA), inkubować przez 30 minut w temperaturze 4 °C i odwirować w temperaturze 200 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Zebrać supernatant.
    2. Określ ilościowo białko za pomocą zestawu do oznaczania białek kwasu bicynchoninowego (BCA). Zmontuj odpowiednio zestaw do elektroforezy żelowej i wykonuj elektroforezę żelową pod napięciem 90 V, aż białko dotrze do końca żelu do układania. Zmień napięcie na 200 V, aby oddzielić białka do końca żelu rozdzielczego.
    3. Przeprowadzić transfer półsuchy w celu przeniesienia białek z żelu do membrany z polifluorku winylidenu (PVDF) pod napięciem 15 V przez 1 godzinę.
    4. Zablokuj błonę PVDF 3% albuminą surowicy bydlęcej (BSA)/solą fizjologiczną buforowaną Tris-0,1% v/v Tween 20 (TBS-T) przez 1 godzinę na wytrząsarce w temperaturze pokojowej. Inkubować błonę PVDF z przeciwciałami pierwszorzędowymi w następujący sposób: mysie przeciwciało monoklonalne anty-CD 9 (1:500), mysie przeciwciało monoklonalne anty-CD 81 (1:500), mysie przeciwciało monoklonalne anty-GRP 94 monoklonalne anty-TSG 101 (1:500) w temperaturze 4 °C przez noc przy ciągłym wstrząsaniu.
    5. Następnego dnia przemyć membranę PVDF 5 x 5 min TBS-T i dalej inkubować z przeciwciałem drugorzędowym: mysim białkiem wiążącym IgG kappa sprzężonym z peroksydazą chrzanową (m-IgGκ BP-HRP) (1:5 000) przez 1 godzinę z mieszaniem w temperaturze pokojowej.
    6. Ponownie umyj membranę PVDF pięciokrotnym TBS-T i zwizualizuj membranę w obrazie ze sprzężeniem ładunkowym (CCD) przy użyciu odczynnika do wykrywania chemiluminescencji. Przeanalizuj poziom ekspresji białek za pomocą oprogramowania ImageJ. Najpierw otwórz plik obrazu w ImageJ (Plik | Otwórz...). Popraw jakość obrazu, dostosowując jasność i kontrast (punkt menu Obraz | Dostosuj | Jasność/Kontrast). Dostosuj obraz, aż plamy będą wyraźnie widoczne, kliknij przycisk Zastosuj, a następnie zapisz obrazy w formacie TIFF (punkt menu Plik | Zapisz jako | TIFF...).
  3. Transmisyjny mikroskop elektronowy
    1. Rozcieńczyć jedną część próbki hUC-MSC-sEVs czterema częściami przefiltrowanego PBS do całkowitej objętości 10 μl i inkubować na siatce miedzianej pokrytej węglem przez 15 minut.
    2. Usunąć nadmiar próbki za pomocą chusteczki laboratoryjnej i pozostawić do wyschnięcia na powietrzu przez 3 minuty.
    3. Inkubować 10 μl 1% roztworu kwasu fosfowolframowego (PTA) w celu barwienia próbki przez 3 minuty.
    4. Usuń nadmiar 1% roztworu PTA za pomocą chusteczki laboratoryjnej i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu przez 3 minuty.
    5. Użyj próbki do obrazowania transmisyjnego mikroskopu elektronowego.
      UWAGA: Zapoznaj się z Rysunek 1, aby zapoznać się z podsumowanymi krokami eksperymentu schematycznego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rysunek 2 pokazuje, że hUC-MSC-sEVs mają tryb wielkości cząstek przy 53 nm, podczas gdy inne znaczące piki wielkości cząstek to 96 i 115 nm. Stężenie hUC-MSC-sEV mierzone za pomocą NTA wynosiło 7,75 × 1010 cząstek/ml. Stężenie białka w hUC-MSC-sEVs mierzone testem BCA wynosiło około 80 μg/ml.

W analizie western blot, hUC-MSC-sEVs wykazały dodatnie pasma dla markerów egzosomalnych CD9, CD81 i TSG101, ale były ujemne dla GRP94 (Rysunek...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

EV są jednym z ważnych podzbiorów sekretomu w MSC, który odgrywa kluczową rolę podczas normalnych i patologicznych procesów. Jednak w ciągu ostatniej dekady sEV o zakresie wielkości od 30 do 200 nm stały się potencjalnym narzędziem terapii bezkomórkowej. Opracowano różne techniki izolowania sEV od MSC. Jednak ultrawirowanie różnicowe, ultrafiltracja, wytrącanie na bazie polimerów, wychwytywanie powinowactwa immunologicznego i wytrącanie oparte na mikrofluidyce mają różne zalety i wady17. Żadna z t...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Publikacja tego filmu była wspierana przez My CytoHealth Sdn. Bhd.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
40% akryloamidNacalai Tesque06121-95Western blot
95% etanolNacalai Tesque14710-25Środki dezynfekujące
Absolute MethanolChemiz45081Do aktywacji membrany PVDF (Western blot)
AccutaseSTEMCELL Technologies7920Enzym dysocjacji komórek
nadsiarczan amonuChemiz14475katalizować polimeryzację żelu (Elektroforeza żelowa
anty-CD 81 (B-11)Santa Cruz Biotechnologysc-166029Przeciwciało dla markera sEVs
anty-TSG 101 (C-2)Santa Cruz Biotechnologysc-7964Przeciwciało dla markera sEVs
Albumina surowicy bydlęcejNacalai Tesque00653-31Błona PVDF blokująca
błękit bromofenolowyNacalai Tesque05808-61elektroforetyczny marker kolorowy
Centricon Plus-70 (100 kDa NMWL)Izolacja miliporowaUFC710008sEVs
ChemiLumi One LNacalai Tesque7880odczynnik do wykrywania chemiluminescencji
CryoStorSigma-AldrichC3124-100MLKriokonserwacja komórek
Dulbecco' s zmodyfikowany Orzeł" s mediumNacalai Tesque08458-45Pożywka do hodowli komórkowych
ExcelBand Enhanced 3-kolorowy marker białkowy wysokiego zakresuSMOBIOPM2610Markery masy cząsteczkowej białka
Bardzo gruba bibuła buforowarezerwa bufora ATTO(Western blot)
GlicerolMerckG5516Chemikalia do western blot
Glicyna1. bazaBIO-2085-500gChemikalia do buforowego (Western Blot)
mysiego białka wiążącego IgG kappa sprzężonego z peroksydazą chrzanową (m-IgGκ BP-HRP)Santa Cruz Biotechnologysc-516102Przeciwciało wtórne (Western Blot)
Ludzki Wharton' s Mezenchymalne komórki macierzyste (MSC) pochodzące z galaretowatości,Centrum Inżynierii Tkankowej i Medycyny Regeneracyjnej, Wydział Lekarski, The National University Malaysia
Mysie przeciwciała anty-CD9 (C-4)Santa Cruz Biotechnology  sc-13118Przeciwciało do markera sEVs
Nanosight NS300 wyposażony w kamerę CMOS, 20-krotną soczewkę obiektywową, moduł niebieskiego lasera (488  nm) oraz oprogramowanie NTA v3.2Malvern Panalytical, UK
paraformaldehydNacalai Tesque02890-45Utrwalanie próbki podczas
penicyliny TEM– streptomycynaNacalai Tesque26253-84Antybiotyk do pożywek
fluorek fenylometylosulfonyluNacalai Tesque27327-81Hamowanie proteaz w próbkach sEVs po dodaniu buforu do lizy
bufora soli fizjologicznej buforowanej fosforanemGibco10010023Mycie, rozcieńczanie próbki
membrana z polifluorku winylidenu (PVDF) z
0,45 mm wielkość porów		ATTODo zatrzymywania białka podczas przenoszenia białka (Western blot)
koktajl inhibitora proteazyNacalai Tesque25955-11Hamuje proteazy w próbkach sEVs po dodaniu buforu do lizy
Test białkowy Zestaw bicinchoninateNacalai Tesque06385-00do pomiaru białka
z 2-MENacalai Tesque30566-22Środek redukujący do sodu western blot
chlorekNacalai Tesque15266-64Chemikalia do western blot
dodecylosiarczan soduNacalai Tesque31606-62jonowy środek powierzchniowo czynny podczas elektroforezy żelowej
Transmisyjny mikroskop elektronowy Tecnai G2 F20 S-TWINFEI, USA
tetrametyloetylenodiaminaNacalai Tesque33401-72chemikalia do przygotowania żelu
tris-base1st BaseBIO-1400-500gChemikalia do buforu (Western Blot)
  Tween 20GeneTexGTX30962Chemicals do Western Blot
UVP (Ultra Vision Product) KameraCCD Kamera CCD do wykrywania sygnału Western Blot
Roztwór buforowy próbki

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).
  2. Jayabalan, N., et al. Cross talk between adipose tissue and placenta in obese and gestational diabetes mellitus pregnancies via exosomes. Frontiers in Endocrinology. 8, 239(2017).
  3. Li, T., et al. Exosomes derived from human umbilical cord mesenchymal stem cells alleviate liver fibrosis. Stem Cells and Development. 22 (6), 845-854 (2013).
  4. Wang, C., et al. Mesenchymal stromal cell-derived small extracellular vesicles induce ischemic neuroprotection by modulating leukocytes and specifically neutrophils. Stroke. 51 (6), 1825-1834 (2020).
  5. Wei, Y., et al. MSC-derived sEVs enhance patency and inhibit calcification of synthetic vascular grafts by immunomodulation in a rat model of hyperlipidemia. Biomaterials. 204, 13-24 (2019).
  6. Liu, W., et al. MSC-derived small extracellular vesicles overexpressing miR-20a promoted the osteointegration of porous titanium alloy by enhancing osteogenesis via targeting BAMBI. Stem Cell Research and Therapy. 12 (1), 1-16 (2021).
  7. Li, F. X. Z., et al. The role of mesenchymal stromal cells-derived small extracellular vesicles in diabetes and its chronic complications. Frontiers in Endocrinology. 12, 1741(2021).
  8. Jayabalan, N., et al. Frontiers in Endocrinology. 8, Front Endocrinol. Lausanne. (2017).
  9. Wei, Y., et al. Biomaterials. 204, Biomaterials. 13-24 (2019).
  10. Du, W., et al. Enhanced proangiogenic potential of mesenchymal stem cell-derived exosomes stimulated by a nitric oxide releasing polymer. Biomaterials. 133, 70-81 (2017).
  11. Li, P., Kaslan, M., Lee, S. H., Yao, J., Gao, Z. Progress in exosome isolation techniques. Theranostics. 7 (3), 789-804 (2017).
  12. Nicolas, R. H., Goodwin, G. H. Overview of extracellular vesicles, their origin, composition, purpose, and methods for exosome isolation and analysis. Cells. 8 (7), 727(2019).
  13. Kowal, J., et al. Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (8), 968-977 (2016).
  14. Zeringer, E., Barta, T., Li, M., Vlassov, A. V. Strategies for isolation of exosomes. Cold Spring Harbor Protocol. 2015 (4), 319-323 (2015).
  15. Kırbaş, O. K., et al. Optimized isolation of extracellular vesicles from various organic sources using aqueous two-phase system. Scientific Reports. 9 (1), 1-11 (2019).
  16. Ev, B., Ms, K. Using exosomes, naturally-equipped nanocarriers, for drug delivery. Journal of Controlled Release: Official Journal of the Controlled Release Society. 219, 396-405 (2015).
  17. Dragovic, R. A., et al. Isolation of syncytiotrophoblast microvesicles and exosomes and their characterisation by multicolour flow cytometry and fluorescence Nanoparticle Tracking Analysis. Methods. 87, San Diego, Calif. 64-74 (2015).
  18. Tan, K. L., et al. Benchtop isolation and characterisation of small extracellular vesicles from human mesenchymal stem cells. Molecular Biotechnology. 63 (9), 780-791 (2021).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Ultrafiltration MethodConditioned MediumNanoparticle TrackingBCA Protein AssayWestern BlotTransmission Electron MicroscopeExosomal Markers

Powiązane artykuły