Artykuł metodologiczny

Badanie przepuszczalności nabłonka w enteroidach pochodzących z tkanek płodowych

DOI:

10.3791/64108

⸱

16 czerwca 2022

 ,  ,  ,  , 
1Morsani College of Medicine, University of South Florida, 2Department of Pediatrics, Morsani College of Medicine, University of South Florida, 3Department of Molecular Pharmacology and Physiology, Morsani College of Medicine, University of South Florida

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół szczegółowo opisuje tworzenie enteroidów, trójwymiarowego modelu jelitowego, z tkanki jelitowej płodu. Do charakterystyki modelu wykorzystano obrazowanie immunofluorescencyjne biomarkerów nabłonkowych. Wierzchołkowa ekspozycja lipopolisacharydów, endotoksyny bakteryjnej, przy użyciu techniki mikroiniekcji indukowała przepuszczalność nabłonka w sposób zależny od dawki, mierzoną przez wyciek dekstranu fluorescencyjnego.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Enteroidy pochodzące z ludzkich tkanek płodowych stają się obiecującym modelem in vitro do badania urazów jelit u wcześniaków. Enteroidy wykazują polarność, składającą się ze światła z wierzchołkową obwódką, ścisłych połączeń i podstawno-bocznej warstwy zewnętrznej wystawionej na działanie pożywki wzrostowej. Konsekwencjami urazów jelit są zapalenie błony śluzowej i zwiększona przepuszczalność. Badanie przepuszczalności jelit u wrażliwych wcześniaków często nie jest wykonalne. W związku z tym do badania urazów jelit u wcześniaków potrzebny jest model jelitowy in vitro pochodzący z tkanek płodowych. Enteroidy mogą być używane do badania zmian w przepuszczalności nabłonka regulowanej przez białka połączeń ścisłych. W enteroidach jelitowe komórki macierzyste różnicują się we wszystkie typy komórek nabłonkowych i tworzą trójwymiarową strukturę na macierzy błony podstawnej wydzielanej przez komórki mięsaka myszy. W artykule opisano metody stosowane do tworzenia enteroidów z tkanki jelitowej płodu, charakterystyki białek ścisłego połączenia enteroidalnego za pomocą obrazowania immunofluorescencyjnego oraz badania przepuszczalności nabłonka. Ponieważ dysbioza bakteryjna z dominacją Gram-ujemnych jest znanym czynnikiem ryzyka uszkodzenia jelit, zastosowaliśmy lipopolisacharyd (LPS), endotoksynę wytwarzaną przez bakterie Gram-ujemne, w celu wywołania przepuszczalności w enteroidach. Dekstran znakowany fluoresceiną poddano mikroiniekcji do światła enteroidu, a następnie zmierzono seryjne stężenia dekstranu, które wyciekły do pożywki hodowlanej, w celu ilościowego określenia zmian przepuszczalności parakomórkowej. Eksperyment wykazał, że wierzchołkowa ekspozycja na LPS indukuje przepuszczalność nabłonka w sposób zależny od stężenia. Wyniki te potwierdzają hipotezę, że dominująca dysbioza Gram-ujemna przyczynia się do mechanizmu uszkodzenia jelit u wcześniaków.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wcześniaki są narażone na częste i długotrwałe stany zapalne, które narażają je na zwiększone ryzyko uszkodzenia jelit skutkującego długotrwałym kalectwem lub śmiercią1. Badania w tej dziedzinie są wyzwaniem ze względu na ograniczoną możliwość przeprowadzania eksperymentów na wrażliwych wcześniakach. Co więcej, brak odpowiednich modeli utrudnił kompleksowe badanie przedwczesnego środowiska jelitowego2. Istniejące modele in vitro i in vivo nie są w stanie w pełni odwzorować przedwczesnego środowiska jelitowego człowieka. W szczególności pojedyncze nabłonkowe linie komórkowe płodu mogą nie tworzyć ścisłych połączeń, a modele zwierzęce wykazują inne reakcje zapalne i immunologiczne niż wcześniaki. Wraz z odkryciem sygnalizacji Wnt jako głównego szlaku proliferacji i różnicowania jelitowych krypt komórek macierzystych oraz nowych tkankowych komórek macierzystych Lgr5+, organoidy pochodzące z tkanek jelitowych, takie jak enteroidy i kolonoidy, zostały ustalone jako modele in vitro3,4,5. Korzystając z tej technologii, możliwe jest tworzenie i wykorzystywanie trójwymiarowych (3D) modeli enteroidalnych, które są opracowywane z całej tkanki lub biopsji jelita w celu zbadania odpowiedzi nabłonka na środowisko jelitowe6,7.

W przeciwieństwie do typowych linii komórkowych jelit hodowanych w hodowli, enteroidy wykazują polarność ze światłem połączonym białkami o ścisłym połączeniu8. Pozwala to na ekspozycję na granicę podstawno-boczną w pożywce wzrostowej, a także na mikroiniekcję światła w celu oceny granicy wierzchołkowej. Co więcej, enteroidy wykazują podobne cechy genetyczne, fizjologiczne i immunologiczne jak ludzki nabłonek9,10. Enteroidy pochodzące z tkanek płodowych pozwalają na zbadanie roli wcześniaka w funkcjonowaniu nabłonka. Unikalne cechy enteroidów mogą bardziej przypominać środowisko jelitowe wcześniaka9. Enteroidy pochodzenia tkankowego mogą być używane do testowania integralności połączeń ścisłych jako forma jednowarstwowa lub jako struktury 3D osadzone w zestalonej mieszaninie białek błony podstawnej. W przypadku tej ostatniej formy wymagana jest technika mikroiniekcji, jeśli pożądane jest odsłonięcie wierzchołkowe. Pomiar odpowiedzi nabłonkowych w modelach enteroidalnych obejmuje ekspresję genów za pomocą sekwencjonowania RNA, biomarkery za pomocą testu immunologicznego sprzężonego z enzymami (ELISA) lub zaawansowane techniki obrazowania. Przedstawiona tutaj technika zapewnia kolejną możliwą opcję pomiaru przepuszczalności brutto za pomocą fluorometrii.

Uszkodzenie jelit u wcześniaków ma wieloczynnikową patogenezę, która obejmuje brak równowagi społeczności mikrobiologicznej jelit. Enteroidy mogą stanowić doskonałe modele do badania niektórych aspektów chorób wcześniaków jelit, takich jak martwicze zapalenie jelit, które obejmują funkcje nabłonka11. Enteroidy wykazują podobne cechy jak ludzkie jelito płodowe 10. Wystawienie enteroidów na działanie lipopolisacharydu (LPS), endotoksyny wytwarzanej przez bakterie Gram-ujemne, w pożywce hodowlanej jako ekspozycja podstawno-boczna indukuje ekspresję genów, która może prowadzić do zwiększonego stanu zapalnego i przepuszczalności jelit7. Badanie to ma na celu ocenę zmian w przepuszczalności nabłonka po ekspozycji wierzchołkowej na produkty bakteryjne, takie jak LPS. Wyniki mogą dostarczyć informacji na temat interakcji między drobnoustrojami a nabłonkiem zaangażowanych w patogenezę uszkodzenia jelit. Metoda przeznaczona do badania przepuszczalności brutto wymaga konfiguracji i umiejętności mikroiniekcji.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pobranie tkanek ludzkich zostało zatwierdzone przez Institutional Review Board Uniwersytetu Waszyngtońskiego (ID badania: STUDY380 i ID CR: CR3603) i przeprowadzone przez Laboratorium Badań nad Wadami Wrodzonymi. Laboratorium Badań nad Wadami Wrodzonymi było wspierane przez nagrodę NIH o numerze 5R24HD000836 z Narodowego Instytutu Zdrowia Dziecka i Rozwoju Człowieka Eunice Kennedy Shriver. Próbki zostały pobrane od uczestników, którzy wyrazili na to zgodę, i wysłane jako pozbawione elementów pozwalających na identyfikację i bez żadnych informacji o stanie zdrowia. Próbki jelita cienkiego przechowywano w lodowatym roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (DPBS) firmy Dulbecco i wysyłano w nocy do laboratorium odbiorczego.

1. Przygotowanie odczynnika

UWAGA: Zobacz Tabelę Materiałów, aby uzyskać listę odczynników i numery katalogowe; zalecane objętości dotyczą płytki 6-dołkowej, chyba że zaznaczono inaczej.

  1. Przygotować 0,1% albuminę surowicy bydlęcej (BSA), rozpuszczając 50 mg proszku BSA w 50 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) ze 100 μg/ml prymocyny antybiotykowej o szerokim spektrum działania, aby pokryć wszystkie plastikowe naczynia i końcówki, które mają kontakt z tkankami lub enteroidami.
    1. Aby pokryć BSA, umieść niefiltrowane końcówki pipet w stożkowej probówce o pojemności 50 ml z wystarczającą ilością BSA do pokrycia końcówek, dodaj 1-2 ml BSA, aby pokryć powierzchnię szalki Petriego, lub napełnij 15 ml stożkowe probówki BSA przez co najmniej 20-30 minut w temperaturze pokojowej przed użyciem.
  2. Przygotować pożywkę DPBS, mieszając 50 ml DPBS ze 100 μg/ml primocyny i 50 μg/ml gentamycyny. Przygotować tę pożywkę z 2,5 μg/ml amfoterycyny i bez niej.
  3. Przygotować enteroidalną pożywkę wzrostową, mieszając 2 ml organoidowej pożywki wzrostowej, 100 μg/ml primocyny, 10 μM Y27632 i 2,5 μM CHIR99021. Codziennie sporządzaj świeże podłoża i ogrzewaj je w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C.
    UWAGA: Współczynnik rozcieńczenia dla Y27632 wynosi 1:250. W CHIR99021 należy rozcieńczyć roztwór podstawowy CHIR w stosunku 1:100 w ciepłym podłożu, a następnie w stosunku 1:40 w pożywce wzrostowej enteroidalnej, aby uzyskać rozcieńczenie w stosunku 1:4000.
  4. Przygotować mieszankę matrycy membrany podstawnej, dodając do niej matrycę membrany podstawnej 10 μM Y27632 i 2,5 μM CHIR99021. Przygotować łącznie 285 μl końcowej mieszanki macierzy błony podstawnej o stężeniu białka 8 mg/ml na jedno zagłębienie płytki 6-dołkowej.
    UWAGA: Matryca membrany podstawnej musi być lodowata, aby pozostać w postaci ciekłej i zestalać się w cieplejszych temperaturach. Stężenie białka w podstawowej matrycy błony podstawnej określa objętość wymaganą do uzyskania końcowego stężenia białka 8 mg/ml za pomocą równania:
    Objętość 1 × Stężenie 1 = Objętość 2 × Stężenie 2
  5. Przygotuj 4% paraformaldehydu (PFA), rozcieńczając 32% podstawowy PFA w PBS w stosunku 1:8 i przechowuj w temperaturze pokojowej. Przygotować 0,5 ml na każdą studzienkę enteroidów, które mają być naprawione.
  6. Przygotować bufor blokujący, dodając 5% surowicy koziej i 0,5% Triton X-100 w PBS. Przygotować 1 ml dla pierwszego przeciwciała na basenik i 0,5 ml dla dodatkowego przeciwciała na basenik.
    UWAGA: Należy użyć surowicy tego samego gatunku, co gospodarz przeciwciał drugorzędowych
  7. Przygotować przeciwciała pierwszorzędowe i drugorzędowe, rozcieńczone w buforze blokującym w stężeniu zalecanym przez producenta dla każdego przeciwciała.
  8. Przygotować 5 μg/ml dmidino-2-fenyloindolu (DAPI), rozcieńczając do 1:200 z 1 mg/ml roztworu podstawowego w PBS. Przygotuj 0,5 ml na studzienkę barwionych enteroidów.
  9. Przygotować 70% glicerolu w PBS i przygotować 0,5 ml do zamontowania enteroidów na szkiełkach mikroskopowych.
  10. Przygotować 5 mg/ml dekstranu-FITC (izotiocyjanian fluoresceiny), rozcieńczając roztwór podstawowy o stężeniu 25 mg/ml w PBS w stosunku 1:5. Przygotuj 20 μl do mikroiniekcji.
  11. Przygotować lipopolisacharydy (LPS) i dekstran-FITC, rozpuszczając proszek LPS w PBS do roztworu podstawowego o stężeniu 5 mg/ml. Rozcieńczyć roztwory podstawowe LPS i dekstranu w PBS do 0,1 mg/ml i 0,5 mg/ml LPS i 5 mg/ml dekstranu-FITC. Przygotuj 20 μl do mikroiniekcji.
  12. Przygotować kwas bis(β-aminoetylowy) glikolu etylenowego-N,N,N',N'-tetraoctowego (EGTA), sporządzając roztwór podstawowy 0,2 M, rozpuszczając proszek EGTA w wodzie destylowanej i dostosowując pH do około 8 za pomocą kwasu solnego (HCl). Przygotować stężenie testowe 2 mM w pożywkach hodowlanych, przeprowadzając rozcieńczenie w stosunku 1:100.

2. Pobieranie próbek

  1. Po otrzymaniu próbek należy przeprowadzić izolację i posiew komórek nabłonka w ciągu 24 godzin od pobrania próbki.

3. Posiewanie komórek nabłonka jelitowego w macierzy błony podstawnej z całych próbek

UWAGA: Ta procedura jest zgodna ze zmodyfikowanymi protokołami z Laboratorium Modelowania Tkanek Translacyjnych na Uniwersytecie Michigan12,13,14. Stosowanie pożywek wzrostowych o wysokim czynniku Wnt daje spójne wyniki tworzenia enteroidów. Po ustaleniu enteroidów należy użyć tej samej pożywki o wysokim współczynniku Wnt, aby skierować enteroidy do sferycznych kształtów do mikrowstrzyknięcia.

  1. Przenieść segmenty jelita na szalkę Petriego o wymiarach 60 mm x 15 mm z lodowatym DPBS z amfoterycyną i moczyć przez 20 minut na lodzie. Podczas gdy tkanka nasiąka, zidentyfikuj obszary (dwunastnicę, jelito czcze lub jelito kręte) jelita cienkiego i usuń tkankę łączną i naczynia krwionośne za pomocą kleszczy i nożyczek. W razie potrzeby wypłukać zawartość światła za pomocą małej igły o pojemności 23-25 G i strzykawki o pojemności 3 ml bez naruszania nabłonka.
  2. Pokrój segmenty jelita na kawałki o średnicy 3-5 mm za pomocą skalpela i umieść 1-2 kawałki (do posiewu w jednym dołku płytki 6-dołkowej) na szalce Petriego o wymiarach 35 mm x 15 mm, która zawiera 0,5-1 ml organoidowej pożywki wzrostowej na lodzie.
  3. Za pomocą mikronożyczek preparacyjnych i kleszczy przeciąć rurkę jelitową wzdłużnie. Użyj końcówki kleszczy, aby zeskrobać komórki nabłonkowe z powięzi pod 10-krotnym mikroskopem stereoskopowym. Usuń powięź i zakręć naczyniem, aby rozbić grudki komórek.
  4. Za pomocą końcówki do pipet o pojemności 20 μl przenieś komórki i pożywkę z dokładnością 5-10 μl do mieszanki macierzy błony podstawnej, aby uzyskać roztwór o stężeniu 285 μl przy stężeniu białka matrycowego 8 mg/ml. Pipetuj powoli w górę i w dół 20x, aby wymieszać komórki w matrycy błony podstawnej na lodzie za pomocą końcówki o pojemności 200 μl.
  5. Umieścić pięć 50 μl pasków mieszanki matrycy błony podstawnej komórki w jednym dołku wstępnie podgrzanej 6-dołkowej płytki trzymanej na ciepłej cegle piankowej. Inkubować płytkę w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 10 minut, aby umożliwić polimeryzację i stwardnienie macierzy błony podstawnej.
  6. Dodać 2 ml enteroidalnej pożywki wzrostowej do studzienki zestalonych pasków macierzy błony podstawnej i umieścić z powrotem w inkubatorze do hodowli komórkowych. Zmieniaj pożywkę codziennie, aby przyspieszyć wzrost enteroidów. Sprawdzaj różnicowanie jelitowych komórek macierzystych pod 10-krotnym odwróconym mikroskopem dziennie.
  7. Po 10-14 dniach przełóż enteroidy do jednego dołka 12-dołkowej lub 6-dołkowej płytki, w zależności od gęstości enteroidów. Zacznij zmieniać pożywkę co drugi dzień i podawaj w stosunku 1:2 co 5-7 dni, gdy enteroidy zaczną się rozwijać.
    1. Usuń komórki, które nie różnicują się w enteroidy, za pomocą warstwy macierzy błony podstawnej podczas pasaży. Stwórz zamrożony zapas enteroidów o niskim pasażu, zamrażając je w 80% pożywce wzrostowej, 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 10% dimetylosulfotlenku (DMSO), jeśli to konieczne.

4. Barwienie immunofluorescencyjne enteroidów

UWAGA: Proces utrwalania i barwienia trwa 3 dni. W tym protokole utrwaliliśmy i wybarwiliśmy jądra (DAPI), markery nabłonkowe (villin, CDX2), lizozym, mucynę i białka ścisłego połączenia (klaudyna 2, klaudyna 3, okludyna, zonula occluden-1) przy użyciu zmodyfikowanego protokołu15. Obrazy fluorescencyjne wykonano za pomocą mikroskopu konfokalnego.

  1. Fixing
    UWAGA: Proces ten jest zwykle wykonywany w tym samym czasie, co przejście enteroidalne lub procedura zamrażania.
    1. Umieść płytkę enteroidalną na lodzie. Usuń pożywkę wzrostową i delikatnie umyj 2x zimnym DPBS.
    2. Zidentyfikuj enteroidy, które mają zostać naprawione i wybarwione. Przenieść je na płytkę 12-dołkową, ostrożnie pipetując je końcówką o pojemności 200 μl lub używając pętli do zaszczepiania o pojemności 1 μl. Enteroidy należy umieścić w oddzielnych studzienkach, jeśli ma być wykonane barwienie różnymi przeciwciałami.
    3. Usuń jak najwięcej płynu za pomocą końcówki o pojemności 200 μl, nie naruszając enteroidów. Dodać 0,5 ml 4% PFA i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Od czasu do czasu obracaj płytką, aby ułatwić oderwanie enteroidów od macierzy błony podstawnej.
    4. Zbadaj grubo, aby określić oderwanie enteroidów od macierzy błony podstawnej. Ostrożnie odessać i wyrzucić płynny PFA, nie naruszając enteroidów. Przemyć PBS 3x, aby usunąć PFA i wszelkie resztki macierzy membrany podstawnej
      UWAGA: Zasysanie cieczy pod mikroskopem stereoskopowym może być pomocne w unikaniu enteroidów. Utrwalone enteroidy mogą być przechowywane w PBS w temperaturze 4 °C przez okres do 1 miesiąca.
  2. Blokowanie
    1. Ostrożnie usunąć resztki PBS za pomocą pipety o pojemności 200 μl, nie naruszając enteroidów. Dodać 0,5 ml buforu blokującego i inkubować przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.
    2. Usunąć i wyrzucić bufor blokujący za pomocą pipety o pojemności 200 μl, uważając, aby nie uszkodzić enteroidów.
  3. Barwienie przeciwciałami
    1. Dodać 500 μl pierwszorzędowego przeciwciała w buforze blokującym do każdej studzienki z enteroidami. Dla przeciwciał pierwszorzędowych i lizozymu współczynnik rozcieńczenia wynosi 1:100, dla CDX2 współczynnik rozcieńczenia wynosi 1:100, a dla villiny współczynnik rozcieńczenia wynosi 1:50. Inkubować w temperaturze 4 °C przez noc.
    2. Następnego dnia usunąć roztwór przeciwciał i przemyć 3x PBS. Odczekaj 10-15 minut czasu inkubacji na każde pranie.
    3. Powtórzyć kroki 4.3.1-4.3.2 dla przeciwciała drugorzędowego o współczynniku rozcieńczenia 1:400.
    4. Dodać 500 μl DAPI w stężeniu 5 μg/ml w PBS i inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Po inkubacji przemyć 3x PBS i pozostawić 10-15 minut czasu inkubacji na każde mycie
  4. Montażu
    1. Usuń jak najwięcej PBS. Przemyć poplamione enteroidy 70% glicerolem 1x.
    2. Wyjmij enteroidy z płytki za pomocą pętli do zaszczepiania o pojemności 1 μl lub końcówki o nacięciu 200 μl i zamontuj z 70% glicerolem na szklanym szkiełku mikroskopowym.
    3. Aby zachować strukturę 3D enteroidów, należy zapewnić odstęp 0,5-1 mm między szkiełkiem podstawowym a szkiełkiem nakrywkowym. Użyj wycięć z cienkiego arkusza gumy silikonowej lub szklanego szkiełka nakrywkowego, aby stworzyć przestrzeń między szkiełkiem podstawowym a szkiełkiem nakrywkowym. Enteroidy można teraz obrazować za pomocą mikroskopu konfokalnego.

5. Przygotowanie do mikroiniekcji enteroidów

UWAGA: Protokół mikroiniekcji jest zmodyfikowanym protokołem od Hill et al.16 w celu dopasowania do zasobów i otoczenia. Niektóre z etapów przygotowań należy wykonać z kilkudniowym wyprzedzeniem.

  1. Konfiguracja konfiguracji mikroiniekcji
    1. Aparat do mikroiniekcji należy ustawić w komorze bezpieczeństwa biologicznego lub na czystym ladzie, w zależności od celu eksperymentów, w następujący sposób: mikroskop stereoskopowy do oglądania, mikromanipulator z końcówkami sterującymi osi X, Y i Z zamontowany na ciężkim stojaku obok mikroskopu, uchwyt do mikropipet zamontowany na ramieniu mikromanipulatora, rurka do mikroiniekcji łącząca uchwyt mikropipety i strzykawka z trójdrożnym kurkiem, następnie do pompy pneumatycznej i ściennego źródła powietrza podłączonego do pompy (Rysunek 1).
    2. Zdezynfekować aparat do mikroiniekcji 70% etanolem przed użyciem eksperymentalnym i po nim. Przetestuj ustawienie mikroskopu i mikromanipulatora w celu dopasowania do pożądanych parametrów fizycznych, w tym przesuwanie pokręteł osi, aby upewnić się, że mikropipeta może dotrzeć do docelowej próbki.
  2. Przygotowanie mikropipety
    UWAGA: Wykonaj te kroki z wyprzedzeniem.
    1. Za pomocą ściągacza do mikropipet wciągnij szklane rurki kapilarne do mikropipet.
    2. Pod mikroskopem stereoskopowym umieść mikropipetę na poziomym uchwycie do mikropipet (Rysunek 2), skup się na końcówkach i odetnij końcówki za pomocą mikronożyczek, patrząc przez okulary mikroskopu. Do każdego eksperymentu przygotuj około 10-15 mikropipet o podobnym rozmiarze końcówki.
    3. Przetestuj rozmiar końcówki, pobierając 0,5-1 μl płynu i policz, ile pompek jest potrzebnych do opróżnienia objętości. Przetestuj kilka rozmiarów końcówek, aby znaleźć odpowiedni rozmiar do eksperymentu. Odpowiedni rozmiar końcówki wyrzuca około 10-30 nL objętości na pompę.
    4. Mikropipety z ciętego szkła należy przechowywać w czystym pudełku lub tubce, nie uszkadzając końcówek.
      UWAGA: Wstępnie przycięte mikropipety są dostępne w sprzedaży.
  3. Preparat enteroidowy
    1. Umieść na lodzie płytkę z przeważnie dużymi i kulistymi enteroidami. Zastąp stare podłoże świeżym podłożem.
    2. Delikatnie odłącz kropki macierzy błony podstawnej od płytki za pomocą podnośnika komórek. Obracaj kropki żelu z boku na bok na lodzie, aby rozbić macierz błony podstawnej bez naruszania enteroidów.
    3. Wybrać około 10-15 sferycznych enteroidów z wyciętą końcówką pipety o pojemności 20 μl pod mikroskopem stereoskopowym i dodać do matrycy błony podstawnej, aby uzyskać 285 μl mieszaniny o stężeniu białka 8 mg/mL.
    4. Delikatnie pipetować w górę i w dół za pomocą przeciętej końcówki o pojemności 200 μl, aby wymieszać enteroidy bez ich łamania. Umieść pięć 50 μl żelowych kropek w środku okrągłej szalki Petriego o wymiarach 35 mm x 10 mm lub o podobnych wymiarach.
    5. Inkubować kropki żelu enteroidalnego w temperaturze 37 °C przez 10 minut do zestalenia. Następnie dodaj 1 ml świeżej pożywki do naczynia. Inkubować enteroidy przez co najmniej 2-3 dni w celu stabilizacji i do momentu, gdy enteroidy osiągną odpowiednią wielkość 0,5-1 μL.
      UWAGA: Ważne jest, aby mieć naczynie o niskiej ściance dla łatwiejszego dostępu do enteroidów i małej średnicy dla mniejszej objętości pożywki wzrostowej.
  4. Mikroiniekcja dekstranu-FITC i badanego materiału
    1. Wyłącz trójdrogowy zawór odcinający pompy pneumatycznej. Napełnić mikropipetę wstrzykniętym materiałem, w tym przypadku dektran-FITC z LPS lub bez.
    2. Przygotuj szalkę Petriego pokrytą paskiem przezroczystej folii. Umieść od dwóch do czterech kropek 1 μl wstrzykniętego materiału na folii.
    3. Za pomocą mikromanipulatora skieruj końcówkę mikropipety tuż do wnętrza cieczy, ale powyżej folii pod wizualizacją mikroskopu stereoskopowego. Delikatnie pociągnąć za strzykawkę, aby pobrać wstrzyknięty materiał do mikropipety.
    4. Napełnij mikropipetę 2-4 μl wstrzykniętego materiału i naciśnij strzykawkę, aby usunąć powietrze z końcówki mikropipety. Sprawdź kolumnę wstrzykiwanego materiału w mikropipecie, aby upewnić się, że nie ma kieszeni powietrznej. Zapisać objętość wstrzykniętego materiału, który wycofał się do wnętrza mikropipety.
      UWAGA: Ciecz jest widoczna w zielonkawym kolorze dzięki dektran-FITC.
    5. Włącz źródło powietrza podłączone do pompy pneumatycznej, które zapewnia ciśnienie powietrza około 60 psi. Włącz pompę i ustaw czas trwania pompy na 10-15 ms. Przekręcić kran na strzykawce, aby otworzyć przewód od pompy do mikropipety.
      UWAGA: Dłuższy czas pracy pompy pozwala na uwolnienie większej ilości materiału na pompę. Zaleca się stosowanie tego samego czasu działania pompy i mikropipet o podobnych rozmiarach końcówek w całym eksperymencie w celu oszacowania wstrzykiwanej objętości.
    6. Usuń enteroidy z inkubatora do hodowli komórkowych i umieść naczynia na ciepłej cegle piankowej w przykrytym pojemniku, aby ograniczyć ekspozycję na światło po mikrowstrzyknięciu.
    7. Umieść szalkę Petriego z enteroidami pod mikroskopem stereoskopowym i przesuń pokrętła mikromanipulatora, aby umieścić końcówkę mikropipety pod kątem około 35°-45° do powierzchni poziomej (Rysunek 3). Wymaga to pewnej wprawy.
    8. Zwizualizuj i zmapuj enteroidy na każdej szalce Petriego pod mikroskopem, aby stworzyć plan wstrzykiwania około 3-5 kulistych enteroidów na szalkę.
    9. Gdy końcówka mikropipety znajdzie się blisko powierzchni cieczy, spójrz w okulary mikroskopu, aby przesunąć końcówkę w kierunku docelowego enteroidu.
    10. Nakłuć enteroid końcówką mikropipety, przesuwając pokrętło osi Z precyzyjnym, powolnym ruchem. Ściana enteroidu wciśnie się i odskoczy z powrotem, gdy końcówka przejdzie przez powierzchnię enteroidu, w którym to momencie postęp powinien się zatrzymać.
    11. Postukaj jedną nogą w pedał pompy i napełnij enteroid zielonkawym roztworem dekstranu-FITC, aż lekko się rozszerzy. Zapisz liczbę pomp, aby obliczyć pompowaną objętość i stężenie dekstranu.
    12. Po zakończeniu mikroiniekcji należy wyjąć końcówkę mikropipety i przejść do następnego enteroidu. Przy nabraniu wprawy proces ten może przebiegać bezproblemowo.
      1. Jeśli końcówka pęknie, wymień ją na inną mikropipetę o podobnym rozmiarze końcówki. Pobrać wystarczającą objętość wstrzykniętego materiału dla wszystkich enteroidów w tej samej grupie narażenia i wymieniać mikropipetę między wstrzykiwanymi materiałami, aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego.
    13. Umieścić wstrzykniętą miskę enteroidalną pod przykryciem, aby uniknąć ekspozycji na światło.
  5. Pobieranie i pomiar Dextran-FITC
    1. Po zabiegu mikroiniekcji należy natychmiast usunąć pożywkę hodowlaną. Przemyć świeżą pożywką wzrostową 2x, aby usunąć wszelkie pozostałości dekstranu-FITC. Dodaj świeże podłoże i zapisz czas jako czas 0 po mikrowstrzyknięciu.
      UWAGA: Może być potrzebna druga osoba, aby wykonać ten krok bez przerywania procesu mikroiniekcji.
    2. Zebrać 200 μl pożywki hodowlanej w nieprzezroczystej probówce do mikrofugi o pojemności 0,5 ml, a następnie zastąpić usuniętą pożywkę hodowlaną taką samą objętością świeżej pożywki wzrostowej po 1 godzinie, 2 godzinach, 4 godzinach, 6 godzinach, 8 godzinach, 10 godzinach i 12 godzinach po mikroiniekcjach.
      UWAGA: Przedział czasowy może się różnić w zależności od eksperymentu. W przypadku ekspozycji podstawno-bocznej pożywka zastępcza powinna zawierać ekspozycję w tym samym stężeniu.
    3. Zebrać pożywkę przechowywać w temperaturze 4 °C i zmierzyć stężenie dekstranu w ciągu 24 godzin. Pozostałe pożywki przechowywać w temperaturze -80 °C do innych analiz. Pod koniec zbierania pożywek hodowlanych należy zebrać enteroidy w celu ekstrakcji RNA lub obrazowania, jeśli to konieczne.
    4. Zmierzyć stężenia dekstranu-FITC za pomocą czytnika mikropłytek fluorescencyjnych. Skonstruuj krzywą standardową dla każdej płytki, używając rozcieńczeń szeregowych i dopasowując linię regresji liniowej, jak pokazano na rysunku Rysunek 4.
    5. Skorygować absorbancję usuniętej objętości pożywki hodowlanej zawierającej dekstran, która została zastąpiona świeżą pożywką wzrostową bez dekstranu w następujący sposób: usunięcie 200 μl z 2 ml pożywki hodowlanej wynosi 10% objętości.
      Skorygowana absorbancja po 2 h = (absorbancja przy 1 h x 10%) + zmierzona absorbancja przy 2 h
      Absorbancja pierwszego skorygowanego podłoża nie wymaga korekty. Następnie należy obliczyć stężenie dekstranu na podstawie skorygowanej wartości absorbancji, korzystając z równania krzywej standardowej.
    6. W celu normalizacji podziel stężenie dekstranu przez całkowitą liczbę pomp na każdą szalkę Petriego, a następnie pomnóż przez największą całkowitą liczbę pomp na szalkę.
      UWAGA: Wszystkie ekspozycje wykonuje się w trzech próbkach (trzy szalki Petriego na ekspozycję z 3-5 mikrowstrzykniętymi enteroidami na szalkę). Średnie wartości trzech prób są porównywane między ekspozycjami za pomocą testu t-Studenta.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Stworzyliśmy linię komórek enteroidalnych z pobranej tkanki płodu jelita krętego zgodnie ze zmodyfikowanymi protokołami dostarczonymi przez naszych współpracowników z University of Michigan Translational Tissue Modeling Laboratory12. Linia komórkowa enteroidów uzyskała wynik ujemny pod kątem zakażenia Mycoplasma. Enteroidy wybarwione dodatnio na obecność villin, CDX2, lizozymu, mucyny, klaudyny, okludyny i zonula-okludenu 1 (Ryc. 5), potwierdzając ich pochodzenie z nabłonka jelita cienkiego. Enteroidy zostały mikrowstrzyknięte 4 kDa dextran-FITC w dawce 5 mg / ml w PBS (Ryc. 6). Badane narażenie wynosiło LPS w różnych stężeniach, 0,1 mg/ml i 0,5 mg/ml, zmieszane z dektranem-FITC w celu narażenia wierzchołkowego. Jako kontrolę pozytywną użyliśmy 2 mM EGTA i dodaliśmy go do pożywki hodowlanej po 4 godzinach od mikroiniekcji dekstranu. EGTA jest chelatatorem wapnia, który zwiększa przepuszczalność połączeń ścisłych. Kontrole ujemne poddano mikroiniekcjom dekstranu-FITC w samym PBS. W przypadku ekspozycji podstawno-bocznej pożywka zastępcza do seryjnego zbierania pożywek hodowlanych miała takie samo stężenie ekspozycji (tj. 2 mM EGTA). Wyniki wskazują na wyraźny wzrost stężenia dekstranu w pożywkach hodowlanych po dodaniu EGTA w porównaniu z kontrolą ujemną, PBS. Wierzchołkowa ekspozycja LPS indukowała wyższą przepuszczalność dekstranu od około 8 godzin po ekspozycji w sposób zależny od stężenia (Rysunek 7).

figure-results-1
Rysunek 1: Konfiguracja mikrowtryskiwacza. W skład zestawu wchodzi mikroskop stereoskopowy, mikromanipulator zamontowany na magnetycznym stojaku na ciężkiej stalowej płycie podstawy, uchwyt do mikropipet połączony ze strzykawką z trójdrogowym zaworem odcinającym oraz pompa pneumatyczna. Ścienny dopływ powietrza zapewnia ciśnienie powietrza, które jest regulowane przez pompę w celu wytworzenia stałej objętości pompy. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Poziomy uchwyt na mikropipety. Ta plastikowa platforma jest przeznaczona do przytrzymywania mikropipety po wyciągnięciu szklanej rurki kapilarnej w celu przecięcia końcówki. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Ustawianie mikropipet. Kąt 35°-45° jest idealny do wstrzykiwania enteroidów znajdujących się w środku szalki Petriego. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Krzywa standardowa dekstranu. Krzywą skonstruowano z absorbancją fluorescencyjną 10 seryjnych rozcieńczeń dekstranu w duplikatach. Linia regresji liniowej została dopasowana do wygenerowania równania regresji. Słupki błędów to SEM. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-5
Rysunek 5: Biomarkery fluorescencyjne enteroidów. DAPI dla plamy jądra jest niebieska. Pokazane są następujące biomarkery: (A) willina, (B) CDX2, (C) lizozym, (D) mucyna, (E) klaudyna, (F) okluzja i (G) zonula-occluden 1. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-6
Rysunek 6: Enteroidy w różnych stadiach. (A) Enteroid w wieku 7-10 dni jest mały i ma grubą ściankę. (B) Enteroid gotowy do mikroiniekcji o dużym rozmiarze, świetle i ścianie myślenia oraz (C) fluorescencyjny dekstran-FITC wewnątrz enteroidu 2 dni po mikrowstrzyknięciu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-7
Rysunek 7: Przepuszczalność dekstranu-FITC po mikroiniekcji. (A) Zmierzone poziomy dekstranu w pożywce były wyższe po dodaniu EGTA w porównaniu do PBS. (B) Mikrowstrzyknięta 0,5 mg / ml LPS spowodowała większy wyciek dekstranu ze światła jelita do pożywki niż mikroiniekcja 0,1 mg / ml LPS rozpoczynająca się 8 godzin po wstrzyknięciu. *wartość p < 0,05, słupki błędów to SEM, n = 3, do obliczenia istotności użyto testu t-Studenta. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten szczegółowo opisuje tworzenie enteroidów z tkanki jelitowej płodu, a także charakterystykę modelu za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego i badania przepuszczalności nabłonka. Przepuszczalność enteroidów badano za pomocą techniki mikroiniekcji i seryjnych pomiarów w czasie stężenia nieszczelnego dekstranu-FITC w pożywce hodowlanej. Nowością tego protokołu jest ekspozycja wierzchołkowa, która bardziej przypomina fizjologię jelit człowieka w porównaniu z ekspozycją podstawno-boczną w pożywkach hodowlanych7. W poprzednich badaniach Hill i in. wykorzystali obrazowanie seryjne i obliczenie intensywności fluorescencji w czasie16. Ares i wsp. wystawili błonę podstawno-boczną modelu nabłonkowego na LPS, a następnie porównali komórkowy wzorzec ekspresji genów7. Dla porównania, wykorzystujemy ekspozycję wierzchołkową badanych odczynników, a następnie badamy potencjalne zmiany przepuszczalności brutto, mierząc seryjne stężenia wyciekającego dekstranu w pożywkach hodowlanych. Nasza metoda pozwala również na seryjną analizę porównawczą cytokin wytwarzanych przez komórki nabłonkowe w pożywkach hodowlanych oraz ekspresję genów poprzez pobieranie komórkowego mRNA. LPS jest powszechnie stosowany do badania uszkodzeń jelit w modelach zwierzęcych i in vitro ze względu na jego zdolność do wywoływania przepuszczalności i stanu zapalnego 7,17. Gdy LPS był testowany w tym modelu, przepuszczalność nabłonka była zróżnicowana w zależności od stężenia ekspozycji. Protokół ten można rozszerzyć w celu zbadania innych patologii chorobowych przy użyciu różnych materiałów mikroiniekcyjnych i pomiarów wyników.

Kluczowe kroki w tym protokole obejmują ustalenie enteroidów z tkanek jelitowych płodu, charakterystykę enteroidów i technikę mikroiniekcji. Rzetelność tego badania zależy od dokładnego pobierania próbek komórek. Korzystanie z anatomicznych punktów orientacyjnych i naczyń krwionośnych jest pomocne w zapewnieniu selekcji komórek jelita cienkiego. Ze względu na silny wzrost i różnicowanie komórek macierzystych jelita płodu, nie jest konieczna rozległa procedura izolacji komórek macierzystych od innych komórek nabłonka. Po ustaleniu enteroidów ważne jest, aby potwierdzić charakterystykę modelu poprzez barwienie białek i markerów komórkowych. W tym protokole enteroidy wybarwiono pod kątem enterocytów za pomocą villiny i CDX2, komórek Panetha za pomocą lizozymu oraz komórek kubkowych za pomocą mucyny, czyli wszystkich komórek znajdujących się w nabłonku jelita cienkiego 18,19,20. W przeciwieństwie do tradycyjnych pojedynczych linii komórkowych, które wykazują jeden typ komórek, enteroidy ustalają wszystkie typy komórek z jelitowych progenitorowych komórek macierzystych8. Część barwiąca tego protokołu może być modyfikowana pod kątem określonych markerów komórkowych będących przedmiotem zainteresowania. Kluczowe znaczenie dla niezawodności tego protokołu ma technika mikroiniekcji. Konsystencję końcówek do mikropipet można sprawdzić, mierząc objętość na pompę za pomocą roztworu dextran-FITC i wizualizując średnicę końcówek pod mikroskopem. Ze względu na ryzyko zanieczyszczenia, ta sama mikropipeta nie może być używana do więcej niż jednej ekspozycji. Dodatkowo na kształt i wzrost enteroidów może mieć wpływ zawartość ich pożywki wzrostowej. Odkryliśmy, że enteroidy w kształcie kulistego, a nie kalafiora, stanowiły lepsze modele do mikroiniekcji. Kulisty kształt może być indukowany przez większy współczynnik Wnt w ośrodku21.

Protokół ten w dużej mierze zależy od umiejętności wykonawcy w zakresie mikroiniekcji w celu zmniejszenia różnic, zwłaszcza w pomiarach wrażliwych na czas. Różnice można zminimalizować poprzez posiadanie tego samego doświadczonego wykonawcy ze spójnymi technikami, użycie tego samego pochodzenia komórek w celu uniknięcia zmienności genetycznej, testowanie w tym samym pasażu w celu usunięcia błędu dojrzałości i hodowanie komórek w tym samym typie pożywki w celu podobnego różnicowania komórek. Składniki pożywki wzrostowej mogą indukować zróżnicowane różnicowanie komórek macierzystych in vitro , a nie w środowisku in vivo . Na przykład in vivo lizozym ulega ekspresji dopiero w 22-24 tygodniu rozwoju ciąży, kiedy tworzą się komórki Panetha i stają się funkcjonalne22. Udało nam się jednak wykryć lizozym w naszych enteroidach powstałych z 10-tygodniowych jelit płodowych. Metoda ta może ograniczyć liczbę badanych ekspozycji w tym samym czasie ze względu na wysokie umiejętności techniczne wymagane do mikroiniekcji. Wyciek dekstranu z otworu do nakłuwania mikroiniekcji może mieć wpływ na ocenę przepuszczalności. Aby zniwelować ten efekt, zaleca się trzykrotne mycie bezpośrednio po mikroiniekcji w celu usunięcia resztek dekstranu z zabiegu. Stężenie dekstranu w pożywce należy mierzyć co godzinę przez 4-6 godzin po mikroiniekcji. Eksperymenty, w których stwierdzono znaczny wzrost stężenia dekstranu w ciągu 2-4 godzin po wstrzyknięciu, powinny być wyłączone z analizy końcowej.

Ta metoda ma kilka zalet. Wymaga to niższych kosztów i mniej zasobów w porównaniu z monowarstwami pochodzącymi z enteroidów w transwell. Dodatkowo można go rozszerzyć na inne ekspozycje, takie jak żywe bakterie lub wirusy, aby zbadać początkową interakcję między drobnoustrojami jelitowymi a nabłonkiem. Zamknięte światło enteroidu może utrzymać stabilny wzrost żywych bakterii z mikrowstrzyknięciami bez zanieczyszczenia pożywki wzrostowej13. W przeciwieństwie do monowarstwy wystawionej na działanie pożywki wzrostowej i tlenu inkubacyjnego, zamknięte światło jest ciasną, odizolowaną przestrzenią. Zamknięty strumień świetlny nie pozwala na komunikację z pożywką wzrostową i zawartość tlenu w świetle, która jest niższa w czasie przy żywym wzroście bakterii13.

Wykorzystanie tkanki jelitowej płodu dokładniej oddaje nabłonek jelitowy wcześniaków w porównaniu z dorosłymi jelitowymi komórkami macierzystymi lub modelami zwierzęcymi7. Co więcej, polaryzacja enteroidów pozwala na ekspozycję i pomiary zarówno wierzchołkowe, jak i podstawno-boczne23. Enteroidy tworzą zamknięte światło o niższym stężeniu natlenienia, które bardziej naśladuje stężenie natlenienia jelit24. W przeciwieństwie do bardziej zaawansowanych technologicznie protokołów16, zastosowanie pomiarów brutto mediów pozwala na większą dostępność tej techniki. Eksperyment wykazał, że przeciek nabłonkowy może być wywołany przez wierzchołkową ekspozycję na LPS i jest zależny od stężenia. Ponieważ metoda ta bada zmiany w nieszczelnym stężeniu dekstranu, jest przydatna do wykrywania dużych zmian funkcjonalnych w ścisłych połączeniach. Zbieranie i sekwencjonowanie informacyjnego RNA odsłoniętych enteroidów oraz analiza western blot mogą uzupełniać analizę poważnych zmian funkcjonalnych. Model ten bada integralność nabłonka jelitowego w systemie, który bardzo przypomina środowisko wcześniaka, a zatem może być wykorzystany do lepszego zrozumienia wcześniaków i innych patologii chorobowych.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszyscy autorzy oświadczają, że nie mają żadnych konfliktów interesów, które mogliby ujawnić.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy doktorowi Ianowi Glassowi i personelowi Laboratorium Badań nad Wadami Wrodzonymi na Uniwersytecie Waszyngtońskim za udostępnienie tkanek płodu. Dziękujemy również dr Michaelowi Dame'owi i dr Jasonowi Spence'owi z Laboratorium Translacyjnego Modelowania Tkanek na Uniwersytecie Michigan za ich niekończące się wsparcie i wskazówki w całym procesie.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Amfoterycyna 250 μL/mlGibco15-290-026
Anty-CDX-2 [CDX2-88] 0,5 ml skoncentrowana mysz, IgG, monoklonalnaBiogenexMU392A-5UC
Przeciwciało anty-klaudynowe 2 (ab53032)abcamab53032
Przeciwciało anty-Claudin 3 (ab15102)abcamab15102
Przeciwciało anty-LYZ wytwarzane u królikaMillipore SigmaHPA066182-100UL
Przeciwciało antymucynowe 2/MUC2 (F-2): sc-515032Santa Cruzsc-515032
Anti-Villin, klon VIL1/4107R 0,5 ml skoncentrowany królik, IgG, monoklonalnyBiogenexNUA42-5UC
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)Millipore SigmaA8806
Płytki do hodowli komórkowych, CytoOne 12-dołkowe płytki niepoddane obróbce USA Scientific Inc50-754-1395
Płytki do hodowli komórkowych, CytoOne 6-dołkowe płytki niepoddane obróbce USA Scientific Inc50-754-1560
Wirówka z wiadrami z probówkami 15 mlEppendorf 05-413-110
CHIR 99021Tocris Bioscience4423
Mikroskop konfokalny Olympus FV1200N/ALub podobny mikroskop
Stożkowe probówki wirówkowe, 15 mlFalcon05-527-90
Szkło nakrywkowe do szkiełek mikroskopowychFisher Scientific12-544-DP
Skalpele jednorazoweMopec22-444-272
Roztwór dmidino-2-fenyloindolu (DAPI) (1 mg / ml)Fisher Scientific62248
Sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco (DPBS, 1X)Fisher ScientificAAJ67802K2
Glikol etylenowy-bis(β-aminoetylowy eter)-N,N,N′,N′-tetraoctowy (EGTA)Millipore SigmaE8145-10G
Izotiocyjanian fluoresceiny dekstran (Dextran-FITC) 4 kDaMillipore Sigma46944
Czytnikmikropłytek FuorescenceAgilent BioTekSynergy HTX
Gentamycyna 50 mg/mlGibco15-750-060
Szklane rurki kapilarne, borokrzemian jednobębnowy, 1x0,5mm, 6" (przecięte na pół przed pociągnięciem)Systemy AM626500
Kozie przeciwciało anty-mysie IgG (H+L) o wysokiej adsorbcji krzyżowej, Alexa Fluor Plus 594Fisher ScientificA32742
Kozie przeciwciało anty-królicze IgG (H + L) o wysokiej adsorpcji krzyżowej, Alexa Fluor Plus 488Fisher ScientificA32731
Surowica koziaFisher Scientific16210064
oprogramowanie ImageJNIHNie dotyczyhttps://imagej.nih.gov/ij/download.html
IntestiCult Organoid Growth Medium (ludzkie)Komórka macierzysta  Technologie  06010
Lipopolisacharydy z  Escherichia coli  O111:B4Millipore SigmaL4391-1MG
Stojak magnetycznyWorld Precision Instruments M10
Matrigel Matryca membrany podstawnej, bez LDEV, 10 mL Corning354234  stężenie białka > 9 mg/ml najlepiej
MikrokleszczeFisher Scientific13-820-078
MikronożyczkiFisher Scientific08-953-1B
MikromanipulatorŚwiatowe instrumenty precyzyjne Ściągacz do mikropipet M3301
World Precision Instruments SU-P1000Lub podobny sprzęt
Szkiełka mikroskopoweFisher Scientific22-034486
Przeciwciało poliklonalne okludynyFisher Scientific  71-1500
Paraformaldehyd 32% roztwór wodnyELEKTRON  MICROSCOPY SCIENCESRT 15714
Szalki Petriego, 35x10 mmFisher Scientific150318
Szalki Petriego, 60x15 mmFisher Scientific12-565-94
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)Fisher Scientific10010031
Przełącznik nożny PicoPumpWorld Precision Instruments3260
Końcówki do pipet, niefiltrowane, 1000 uLFisher Scientific21-402-47
Końcówki do pipet, niefiltrowane, 20 uLFisher Scientific21-402-41
Końcówki do pipet, niefiltrowane, 200 uLFisher Scientific21-236-54
Pneumatyczny system PicoPumpWorld Precision InstrumentsSYS-PV820lub podobny system pikopompy
Primocin 50 mg/mL, fiolka 10x1 mlInvivoGenant-pm-1
Stalowa płyta podstawyWorld Precision Instruments5052
Mikroskop stereoskopowyZeiss stemi 350Lub podobny mikroskop
ThermoSafe PolarPack Foam BricksSonoco03-531-53
Triton X-100Millipore SigmaT8787
Ścienny dopływ powietrzaN/A/A
Y-27632 dichlorowodorekTocris Bioscience1254
ZO-1 Przeciwciało poliklonalneFisher Scientific61-7300
N

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Humberg, A., et al. Preterm birth and sustained inflammation: Consequences for the neonate. Seminars in Immunopathology. 42 (4), 451-468 (2020).
  2. Kim, J., Koo, B. K., Knoblich, J. A. Human organoids: Model systems for human biology and medicine. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (10), 571-584 (2020).
  3. Pinto, D., Gregorieff, A., Begthel, H., Clevers, H. Canonical Wnt signals are essential for homeostasis of the intestinal epithelium. Genes & Development. 17 (14), 1709-1713 (2003).
  4. Barker, N., et al. Identification of stem cells in small intestine and colon by marker gene Lgr5. Nature. 449 (7165), 1003-1007 (2007).
  5. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  6. Mahe, M. M., Sundaram, N., Watson, C. L., Shroyer, N. F., Helmrath, M. A. Establishment of human epithelial enteroids and colonoids from whole tissue and biopsy. Journal of Visualized Experiments. (97), e52483(2015).
  7. Ares, G. J., Buonpane, C., Yuan, C., Wood, D., Hunter, C. J. A novel human epithelial enteroid model of necrotizing enterocolitis. Journal of Visualized Experiments. (146), e59194(2019).
  8. Stewart, C. J., Estes, M. K., Ramani, S. Establishing human intestinal enteroid/organoid lines from preterm infant and adult tissue. Methods in Molecular Biology. 2121, 185-198 (2020).
  9. Finkbeiner, S. R., et al. Transcriptome-wide analysis reveals hallmarks of human intestine development and maturation in vitro and in vivo. Stem Cell Reports. 4 (6), 1140-1155 (2015).
  10. Senger, S., et al. Human fetal-derived enterospheres provide insights on intestinal development and a novel model to study necrotizing enterocolitis (NEC). Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 5 (4), 549-568 (2018).
  11. Alganabi, M., Lee, C., Bindi, E., Li, B., Pierro, A. Recent advances in understanding necrotizing enterocolitis. F1000 Research. 8, (2019).
  12. Dame, M. K., et al. Human colonic crypts in culture: Segregation of immunochemical markers in normal versus adenoma-derived. Laboratory Investigation. 94 (2), 222-234 (2014).
  13. Hill, D. R., et al. Bacterial colonization stimulates a complex physiological response in the immature human intestinal epithelium. eLife. 6, 29132(2017).
  14. Tsai, Y. H., et al. A method for cryogenic preservation of human biopsy specimens and subsequent organoid culture. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 6 (2), 218-222 (2018).
  15. Su, K., Asbrock, N., Chu, V., Hoffmann, S., Hewitt, P. In Vitro Differentiation of Human iPS Cells Into Colon Organoids in Serum-Free Cell Culture Conditions. Technology Networks. , https://www.technologynetworks.com/cell-science/white-papers/in-vitro-differentiation-of-human-ips-cells-into-colon-organoids-in-serum-free-cell-culture-328450 (2019).
  16. Hill, D. R., Huang, S., Tsai, Y. H., Spence, J. R., Young, V. B. Real-time measurement of epithelial barrier permeability in human intestinal organoids. Journal of Visualized Experiments. (130), e56960(2017).
  17. Schoultz, I., Keita, A. V. The Intestinal Barrier and Current Techniques for the Assessment of Gut Permeability. Cells. 9 (8), 1909(2020).
  18. Kumar, N., et al. The lineage-specific transcription factor CDX2 navigates dynamic chromatin to control distinct stages of intestine development. Development. 146 (5), (2019).
  19. Walker, R. W., Clemente, J. C., Peter, I., Loos, R. J. F. The prenatal gut microbiome: Are we colonized with bacteria in utero. Pediatric Obesity. 12, Suppl 1 3-17 (2017).
  20. Spence, J. R., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissue in vitro. Nature. 470 (7332), 105-109 (2011).
  21. Shin, W., et al. Spatiotemporal gradient and instability of Wnt induce heterogeneous growth and differentiation of human intestinal organoids. iScience. 23 (8), 101372(2020).
  22. Lueschow, S. R., McElroy, S. J. The Paneth cell: The curator and defender of the immature small intestine. Frontiers in Immunology. 11, 587(2020).
  23. In, J. G., Foulke-Abel, J., Clarke, E., Kovbasnjuk, O. Human colonoid monolayers to study interactions between pathogens, commensals, and host intestinal epithelium. Journal of Visualized Experiments. (146), e59357(2019).
  24. Dheer, R., Young, V. B. Stem-cell-derived models: Tools for studying role of microbiota in intestinal homeostasis and disease. Current Opinion in Gastroenterology. 37 (1), 15-22 (2021).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Enteroidy p odoweuszkodzenie jelitpo czenia cis eobrazowanie immunofluorescencyjnemikroiniekcja dekstranuprzepuszczalno parakom rkowamacierz b ony podstawnejindukcja LPSmodel przedwczesnych jelit

Powiązane artykuły