Method Article

Jednoczesne obrazowanie dynamiki mikrogleju i aktywności neuronalnej u obudzonych myszy

DOI:

10.3791/64111

⸱

August 23rd, 2022

 ,  ,  ,  , 
1Department of Cellular Neurobiology, Graduate School of Medicine and Faculty of Medicine, The University of Tokyo

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj opisujemy protokół łączący wstrzyknięcie wirusa związanego z adenowirusem z implantacją okna czaszkowego w celu jednoczesnego obrazowania dynamiki mikrogleju i aktywności neuronalnej u obudzonych myszy.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ponieważ funkcje mózgu są pod ciągłym wpływem sygnałów pochodzących z tkanek obwodowych, kluczowe jest wyjaśnienie, w jaki sposób komórki glejowe w mózgu wykrywają różne warunki biologiczne na peryferiach i przekazują sygnały do neuronów. Mikroglej, komórki odpornościowe w mózgu, biorą udział w rozwoju synaps i plastyczności. W związku z tym udział mikrogleju w budowie obwodów nerwowych w odpowiedzi na wewnętrzny stan organizmu powinien być krytycznie przetestowany za pomocą przyżyciowego obrazowania związku między dynamiką mikrogleju a aktywnością neuronalną.

Tutaj opisujemy technikę jednoczesnego obrazowania dynamiki mikrogleju i aktywności neuronalnej u obudzonych myszy. Wirus związany z adenowirusem kodującym R-CaMP, kodowany przez gen wskaźnik wapnia białka czerwonej fluorescencji, został wstrzyknięty do warstwy 2/3 pierwszorzędowej kory wzrokowej u transgenicznych myszy CX3CR1-EGFP wykazujących ekspresję EGFP w mikrogleju. Po wstrzyknięciu wirusa na powierzchni mózgu wstrzykniętego obszaru zainstalowano okno czaszkowe. Obrazowanie dwufotonowe in vivo u obudzonych myszy 4 tygodnie po operacji wykazało, że aktywność neuronalna i dynamika mikrogleju mogą być rejestrowane jednocześnie w rozdzielczości czasowej poniżej sekundy. Technika ta może odkryć koordynację między dynamiką mikrogleju a aktywnością neuronalną, przy czym te pierwsze reagują na obwodowe stany immunologiczne, a drugie kodują wewnętrzne stany mózgu.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Istnieje coraz więcej dowodów na to, że wewnętrzny stan ciała stale wpływa na funkcje mózgu u zwierząt1,2,3,4,5. W związku z tym, aby lepiej zrozumieć funkcje mózgu, kluczowe jest wyjaśnienie, w jaki sposób komórki glejowe w mózgu monitorują warunki biologiczne na peryferiach i przekazują informacje do neuronów.

Mikroglej, komórki odpornościowe w mózgu, biorą udział w rozwoju synaps i plastyczności, które kształtują cechy obwodów nerwowych w mózgu6,7,8,9. Na przykład pionierska praca Wake'a i wsp. wykazała, że procesy mikrogleju kontaktują się z synapsami w sposób zależny od aktywności neuronalnej w korze nowej myszy i że sztuczne niedokrwienie indukuje utratę synaps po długotrwałym kontakcie z mikroglejem10. Tremblay i wsp. odkryli, że zmiana doświadczenia wzrokowego zmienia modalność interakcji mikrogleju z synapsami. W krytycznym okresie, gdy obrót kolców dendrytycznych w pierwszorzędowej korze wzrokowej (V1) jest zwiększony przez deprywację obuoczną, adaptacja do ciemności zmniejsza ruchliwość procesów mikrogleju i zwiększa zarówno częstotliwość ich kontaktu ze szczelinami synaptycznymi, jak i liczbę inkluzji komórkowych w mikrogleju11. Wyniki te sugerują, że procesy mikrogleju wyczuwają aktywność neuronalną i otaczające je środowisko w celu przebudowy obwodów neuronalnych. Co więcej, niedawne badanie wykazało, że nadzór mikrogleju różni się między stanami czuwania a znieczulenia, co sugeruje znaczenie eksperymentów z wykorzystaniem obudzonych myszy do badania komunikacji neuron-mikroglej w warunkach fizjologicznych12.

Obrazowanie dwufotonowe wapnia in vivo jest potężnym narzędziem do rejestrowania dynamiki wapnia, odzwierciedlającej trwające odpalanie neuronów, w setkach neuronów jednocześnie u żywego zwierzęcia13,14,15. Obrazowanie wapnia w neuronach na ogół wymaga rozdzielczości czasowej większej niż kilka Hz, aby śledzić szybkie reakcje neuronalne16,17. W przeciwieństwie do tego, poprzednie badania śledzące dynamikę mikrogleju próbkowały struktury mikrogleju w stosunkowo niskiej rozdzielczości czasowej mniejszej niż 0,1 Hz18,19,20. W jednym z ostatnich badań zastosowano jednoczesne obrazowanie dwufotonowe, aby zrozumieć komunikację między neuronami a mikroglejem21. Jednak nadal nie jest jasne, w jaki sposób dynamiczne procesy mikrogleju reagują na otaczającą aktywność neuronalną w rozdzielczości czasowej większej niż kilka Hz u obudzonych myszy. Aby rozwiązać ten problem, opisujemy metodę jednoczesnego obrazowania dwufotonowego in vivo aktywności neuronalnej i dynamiki mikrogleju z rozdzielczością czasową wyższą niż 1 Hz u wybudzonych myszy. Ta metoda pozwala nam osiągnąć stabilne obrazowanie u obudzonych myszy przy wyższej liczbie klatek na sekundę (maksymalnie, 30 Hz przy rozmiarze klatki piksela 512 x 512 pikseli) i zapewnia korzystniejszy sposób badania zachowania nadzoru mikrogleju lub jego interakcji z aktywnością neuronalną u obudzonych myszy.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie eksperymenty zostały zatwierdzone przez Komitet Etyki Zwierząt oraz Komitet Bezpieczeństwa Eksperymentów z Rekombinantami Genetycznymi Wyższej Szkoły Medycznej i Wydziału Medycyny Uniwersytetu Tokijskiego i przeprowadzone zgodnie z ich wytycznymi.

1. Przygotowanie

  1. Wysterylizuj wszystkie narzędzia i aparaty niezbędne do operacji za pomocą autoklawu lub 70% etanolu.
  2. Przygotowanie pipet szklanych.
    1. Mocno przymocuj skalibrowaną kapilę o pojemności 75 μl do uchwytu ściągacza do mikropipet. Ustaw ściągacz na program z zalecanymi parametrami jako P (ciśnienie) = 500, HEAT = 680, PULL = 30, VEL = 60, TIME = 180.
    2. Po zakończeniu programu (zwykle od 4,5 do 5 s) kapilara jest dzielona na dwie szklane pipety ze zwężającymi się końcówkami. Następnie przełam dystalną część ogonów pęsetą, aby utrzymać średnicę końcówki w granicach 30-50 μm. W tym celu złam ogony 1 cm dystalnie do końca fazowanej części.
  3. Do kraniotomii przygotuj okienko czaszkowe, przyklejając większy zewnętrzny szklany krążek o średnicy 4 mm, grubości 0,15 ± 0,02 mm do mniejszego wewnętrznego szklanego krążka o średnicy 2 mm, grubości 0,525 ± 0,075 mm, używając odczynnika utwardzanego światłem UV (Rysunek 2A).

2. Wstrzyknięcie AAV

  1. Przygotowanie aparatu iniekcyjnego
    1. Umieść szklaną pipetę podłączoną do strzykawki Hamiltona 26 G przez rurkę na uchwycie pipety przyrządu stereotaktycznego, a następnie przechyl uchwyt na pipetę o 60° do przodu od osi pionowej (Rysunek 1A,B).
    2. Napełnij szklaną pipetę, strzykawkę i rurkę łączącą ciekłą parafiną. Umieścić strzykawkę na mikrowstrzykiwaczu.
  2. Zabieg chirurgiczny
    UWAGA: Następująca operacja została wykonana w wysterylizowanej kabinie. W razie potrzeby do operacji użyto mikroskopu stereoskopowego.
    1. Znieczulenie samca myszy CX3CR1-EGFP (szczegółowe informacje w Tabeli Materiałów) w wieku od 7 do 8 tygodni (masa ciała 22-26 g) 3% izofluranu w gazoszczelnej komorze. Po 3 minutach wyjmij mysz z komory, gdy straci ona dobrowolny ruch z wyjątkiem oddychania, a następnie przełącz się na ciągłe znieczulenie przez rurkę donosową z 2% izofluranem.
      UWAGA: Wiadomo, że izofluran aktywuje mikroglej. Ponieważ jednak obrazowanie wykonuje się 4 tygodnie po operacji, nie ma wpływu izofluranu na myszy podczas obrazowania. Chociaż znieczulenie izofluranem stosuje się przez kilka minut, gdy myszy są umieszczane w instrumencie stereotaktycznym przed obrazowaniem (krok 4.2.1), stwierdziliśmy, że efekt tego krótkiego znieczulenia jest znikomy
      2. .
    2. Podczas zabiegu utrzymuj mysz w cieple za pomocą poduszki grzewczej o temperaturze 37 °C, aby zapobiec hipotermii. Nałóż maść na oczy na oba oczy, aby zapobiec suchości rogówki i wstrzyknąć meloksykam podskórnie (5 mg/kg). Przymocuj mysz do pomocniczego paska na ucho, a następnie przymocuj mysz do instrumentu stereotaktycznego grzbietem do góry.
    3. Dostosuj stężenie izofluranu do odpowiedniego procentu (1%-2%) podczas zabiegu, monitorując oddech i częstość akcji serca. Usuń włosy za pomocą kremu do depilacji i kilkakrotnie zdezynfekuj głowę okrężnymi ruchami zarówno peelingiem na bazie jodu, jak i chlorheksydyny i alkoholem. Następnie wstrzyknij podskórnie 0,1 ml 1% lidokainy i nałóż sterylne serwety, aby zabezpieczyć miejsce operacji.
    4. Naciąć nożyczkami skórę głowy wzdłuż linii środkowej i wykonać nacięcie o długości około 2 cm, aby zapewnić dobrą ekspozycję czaszki powyżej prawej pierwszorzędowej kory wzrokowej. Po nacięciu skóry głowy należy przepłukać głowę solą fizjologiczną przez cały czas trwania zabiegu, aby zapobiec wysuszeniu odsłoniętej czaszki i mózgu.
    5. Usuń okostną na odsłoniętej czaszce za pomocą kleszczy. Wywierć czaszkę na współrzędnych stereotaktycznych: 3 mm w bok od linii środkowej, 0,5 mm przed linią lambda, aby utworzyć mały otwór o średnicy około 0,5 mm. W razie potrzeby spłucz krew i resztki tkanek z wiertła.
    6. Napełnij szklaną pipetę 1 μl rAAV2/1-hSyn-R-CaMP1.07, postępując zgodnie z następującą procedurą przy mianie 8,3 x 1012 wektorowych genomów/ml22.
      1. Przesunąć strzykawkę, aby wysunąć 1 μl ciekłej parafiny ze szklanej pipety. Umieścić kawałek przezroczystej folii o wymiarach około 2 cm x 2 cm na odsłoniętej czaszce myszy i usunąć kroplę 1 μl roztworu AAV z folii za pomocą pipetora.
      2. Umieść szklaną końcówkę pipety w kropli roztworu AAV na folii i delikatnie pociągnij strzykawkę, aby zassać roztwór AAV. Po wyrzuceniu przekręć zawór odcinający w kształcie litery T, aby uwolnić ciśnienie wewnątrz rurki i szklanej pipety.
    7. Włóż szklaną pipetę na głębokość 500 μm od powierzchni mózgu przez otwór utworzony w kroku 2.2.5, a następnie wstrzyknij 0,5 μl roztworu AAV za pomocą mikrowstrzykiwacza (Rysunek 1C). Stosować objętościowe natężenie przepływu wtrysku wynoszące 2,0 μl/h; wstrzyknięcie 0,5 μl trwa 15 minut, a następnie należy odczekać 5 minut.
    8. Po wstrzyknięciu delikatnie wyjmij szklaną pipetę i przepłucz powierzchnię mózgu solą fizjologiczną.

3. Implantacja okna czaszkowego

UWAGA: Implantacja okna czaszkowego następuje po wstrzyknięciu AAV tego samego dnia.

  1. Zaznacz na czaszce okrąg o średnicy 2,5 mm, wyśrodkowany 3 mm z boku od lambdy. Utwórz okrągły rowek wzdłuż znaku na czaszce, wiercąc. Oczyść zanieczyszczenia, ponieważ mogą one niekorzystnie wpłynąć na widoczność czaszki i nałóż sól fizjologiczną podczas wiercenia, aby zapobiec nagrzewaniu się.
  2. Aby sprawdzić, czy głębokość wiercenia w okrągłym rowku jest wystarczająca do usunięcia centralnego fragmentu czaszki, delikatnie dociśnij środkową czaszkę kleszczami. Jeśli porusza się pionowo z niewielkim oporem, głębokość wiercenia jest wystarczająca.
  3. Gdy rowek osiągnie wystarczającą głębokość, włóż końcówkę kleszczy w dno centralnego fragmentu czaszki i delikatnie podnieś i wyjmij go, aby odsłonić powierzchnię mózgu (Rysunek 1D).
  4. Za pomocą igły 27 G nakłuj i rozerwij oponę twardą na krawędzi odsłoniętej powierzchni mózgu. Włóż końcówkę kleszczy przez otwór wykonany na krawędzi opony twardej. Przytrzymaj oponę twardą i oderwij ją, aby odsłonić powierzchnię mózgu.
    UWAGA: Jeśli wystąpi krwawienie, przepłucz powierzchnię mózgu solą fizjologiczną, aż krwawienie ustanie.
  5. Za pomocą kleszczy rozprowadź włókna hemostatyczne jeden po drugim w soli fizjologicznej w naczyniu o średnicy 3,5 mm, a następnie umieść włókna hemostatyczne wzdłuż brzegów otworu, w którym znajduje się przecięta opona twarda.
  6. Umieść okienko czaszkowe przygotowane w kroku 1.3 na odsłoniętej powierzchni mózgu, a następnie przyklej je do czaszki za pomocą kleju błyskawicznego, delikatnie naciskając okienko, tak aby okienko było w bliskim kontakcie z czaszką.
  7. Następnie nałóż natychmiastowy klej na całą odsłoniętą czaszkę, a następnie ostrożnie przymocuj płytkę na głowę do czaszki tak, aby okienko znajdowało się w środku kwadratowego otworu płyty głowy (Rysunek 2C). Upewnij się, że powierzchnia płyty czołowej jest równoległa do powierzchni szklanego okna.
  8. Po wystarczającym stwardnieniu kleju nałóż cement dentystyczny na odsłoniętą czaszkę, aby wzmocnić mocowanie między głową a płytą głowy (Rysunek 2).
    UWAGA: Jeśli eksperymenty obejmują prezentację bodźców wzrokowych myszom, należy unikać światła rozproszonego do obszaru obrazowania. Wskazane jest zaczernienie cementu poprzez zmieszanie go z węglem aktywnym w celu zmniejszenia odbicia światła.
  9. Wyjmij mysz ze znieczulenia po wystarczającym stwardnieniu cementu (około 20 min). Następnie umieść mysz w nowej klatce, aby sama się zregenerowała.
  10. Po potwierdzeniu przytomności i dobrowolnym ruchu, wskazującym na pełne wyzdrowienie, umieść mysz z powrotem w klatce domowej. Podczas rekonwalescencji należy podać drugą lub więcej, jeśli to konieczne, dawkę meloksykamu (raz na 24 godziny przez 1-3 dni), jeśli wystąpią oczywiste zachowania wskazujące na ból.

4. Dwufotonowe obrazowanie in vivo mikrogleju i dynamiki wapnia neuronów

  1. Przyzwyczajenie myszy do aparatu mikroskopowego
    1. Trzy tygodnie po operacji wywołaj znieczulenie u myszy 3% izofluranem i umieść mysz pod soczewką obiektywową 25x mikroskopu dwufotonowego za pomocą specjalnie wykonanego instrumentu stereotaktycznego (Ryc. 3C). W przypadku konfiguracji tutaj mysz jest ustawiona na szczycie bieżni i może swobodnie działać.
    2. Około 10 minut później wyjmij mysz ze stolika mikroskopu i włóż ją z powrotem do klatki domowej. Powtarzaj habituację co najmniej 3 razy co drugi dzień przed akwizycją obrazu dwufotonowego.
  2. Akwizycja obrazu dwufotonowego
    UWAGA: Zalecamy wykonanie akwizycji obrazu później niż 4 tygodnie po zabiegu, ponieważ aktywacja mikrogleju stopniowo powraca do poziomu podstawowego.
    1. Podobnie jak w kroku 4.1, wywołaj znieczulenie u myszy za pomocą 3% izofluranu i umieść mysz pod soczewką obiektywu mikroskopu dwufotonowego za pomocą specjalnie wykonanego przyrządu stereotaktycznego.
    2. Zainstaluj wykonane na zamówienie urządzenie zacieniające i monitor LCD do stymulacji wizualnej, jak opisano poniżej (Rysunek 3D).
      1. Ustaw soczewkę tak, aby ustawiła ostrość na powierzchni mózgu, a następnie ustaw tę pozycję soczewki jako oryginalną pozycję Z. Utrzymuj stałe współrzędne x-y i podnieś soczewkę obiektywu; Zdejmij mysz i instrument stereotaktyczny z soczewki obiektywu i bieżni.
      2. Przymocuj urządzenie zacieniające na górze płyty głowicy za pomocą silikonu, który jest czerniony przez zmieszanie z proszkiem węgla drzewnego, i upewnij się, że przestrzeń między płytą głowicy a urządzeniem zacieniającym jest dobrze uszczelniona.
      3. Napełnij urządzenie zacieniające wodą destylowaną, a następnie ponownie zamocuj mysz i ramkę stereotaktyczną pod obiektywem i na bieżni. Ostrożnie zresetuj płaszczyznę ogniskowej na powierzchni mózgu, sprawdzając głębokość soczewki obiektywu.
        UWAGA: Aby uniknąć ryzyka uszkodzenia soczewki obiektywu, najpierw ustaw współrzędne xyz, a następnie zastosuj urządzenie zacieniające soczewki obiektywu. Rozsądne jest również zainstalowanie najpierw pokrywy, a następnie dostosowanie współrzędnych, ale w przypadku tej opcji konieczne jest ostrożne obchodzenie się z nią.
      4. Przykryj soczewkę obiektywu czarną folią aluminiową, aby uniknąć zanieczyszczenia światłem z monitora LCD używanego do stymulacji wizualnej przez soczewkę obiektywu (Rysunek 3D). Ustaw 10-calowy monitor LCD na 12,5 cm przed oczami myszy, aby prezentować bodźce wizualne (Rysunek 3D).
    3. Skonfiguruj filtry zbierające emisję fluorescencji na fluorescencję EGFP (filtr emisyjny 525/50 nm) i fluorescencję R-CaMP (filtr emisji 593/46 nm) oraz długość fali wzbudzenia na 1 000 nm. Uzyskuj obrazy z rozdzielczością przestrzenną 0,25 μm/piksel za pomocą obiektywu 25x 1,1 NA i gazomierzy GaAsP PMT.
    4. Znajdź region obrazowania, w którym neurony R-CaMP(+) i mikroglej EGFP(+) mogą być jednocześnie obrazowane w warstwie 2/3. W przypadku tej konfiguracji dane uzyskane w Rysunek 4 i Wideo 1 znajdowały się na głębokości 100 μm od powierzchni obrazu, przy użyciu podglądu obrazu na żywo. Utrzymuj moc lasera wzbudzającego na jak najniższym poziomie, aby uniknąć fotowybielania i uszkodzeń spowodowanych podwyższoną lokalną temperaturą w obszarze obrazowania.
    5. Rejestruj obrazy z częstotliwością odświeżania 30 Hz. Równocześnie z akwizycją obrazu, prezentuj dryfujące bodźce wizualne o 100% kontraście, 1,5 Hz, 0,04 cykli na stopień w 12 kierunkach w 6 orientacjach od 0° do 150° w krokach co 30° do mouse17.
    6. Po uzyskaniu obrazu wyjmij mysz ze stolika mikroskopu, odłącz urządzenie zacieniające i instrument stereotaktyczny od myszy i umieść mysz z powrotem w klatce domowej.
  3. Rejestracja danych
    1. Przekonwertuj i zapisz uzyskane dane obrazu (w tym przypadku format nd2) jako serię plików obrazów tiff dla każdego kanału koloru, korzystając z Fiji lub oprogramowania dostarczonego z mikroskopem.
    2. Zastosuj Turboreg, wtyczkę Fidżi, aby przeprowadzić rejestrację za pomocą mode = translation. Użyj uśrednionego obrazu jako obrazu referencyjnego z plikami obrazów tiff kanału EGFP.
    3. Wykonaj następujące przetwarzanie dla każdej klatki za pomocą MATLAB.
      UWAGA: Chociaż MATLAB jest używany w poniższym przetwarzaniu, opis koncentruje się głównie na intencji każdego kroku, aby dane mogły być analizowane przez inne oprogramowanie programistyczne, takie jak Python.
      1. Użyj funkcji imread, aby odczytać dwa obrazy tiff EGFP odpowiednio przed i po zarejestrowaniu tej samej ramki. Użyj funkcji imread, aby odczytać obraz Tiff R-CaMP tej samej ramki.
      2. Funkcja normcorr2 służy do obliczania funkcji korelacji między zmiennymi wektorowymi dwóch obrazów GFP odczytanych w kroku 4.3.3.1.
      3. Użyj funkcji max, aby wykryć indeks liniowy z najwyższą korelacją krzyżową funkcji korelacji, a następnie użyj funkcji ind2sub, aby obliczyć pozycję ruchu zarejestrowanego obrazu na podstawie jego oryginalnego obrazu.
      4. Użyj funkcji imwarp, aby przetłumaczyć obraz R-CaMP na pozycję obliczoną w kroku 4.3.3.3, a następnie użyj funkcji imwrite, aby zapisać zarejestrowany obraz R-CaMP.
  4. Wytwarzanie śladowych ilości wapnia
    1. Wykonaj następujące przetwarzanie za pomocą programu MATLAB. Użyj funkcji imread, aby odczytać wszystkie zarejestrowane obrazy Tiff R-CaMP wygenerowane w kroku 4.3.3.4. Jeśli zarejestrowane obrazy zostały już załadowane jako zmienna w obszarze roboczym, pomiń ten krok.
    2. Użyj funkcji średniej, aby wygenerować obraz projekcji czasowej. Użyj funkcji imshow, aby pokazać uśredniony obraz jako figurę; użyj funkcji roipoly, aby wygenerować binarną maskę ROI struktury docelowej (w tym przypadku grzbiet dendrytyczny).
    3. Korzystając z funkcji średniej z obrazami uzyskanymi przez pomnożenie maski binarnej z obrazami każdej klatki jako zmiennymi wejściowymi, oblicz uśrednioną intensywność fluorescencji w ROI dla każdej klatki.
    4. Jak opisano wcześniej17, do zmiennej otrzymanej w kroku 4.4.3 zastosuj filtr częstotliwości Butter Worth przy odcięciu = 1,6 s, aby wyciąć szum o wysokiej częstotliwości, a następnie zastosuj przesuwany filtr mediany w oknie czasowym = 200 s, aby wyciąć szum o niskiej częstotliwości.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przeprowadziliśmy iniekcję AAV i implantację okna czaszkowego w V1 8-tygodniowej transgenicznej myszy CX3XR1-EGFP, jak opisano w tym protokole. Cztery tygodnie po operacji przeprowadziliśmy jednoczesne obrazowanie dwufotonowe in vivo aktywności neuronalnej i dynamiki mikrogleju opartej na R-CaMP w warstwie 2/3 V1 (Rysunek 4 i Wideo 1). Podczas obrazowania mysz umieszczono na bieżni i pozwolono jej swobodnie biegać. Obrazy zostały uzyskane z częstotliwością odświeżania 30 Hz z rozdzielczością przestrzenną 0,25 μm/piksel przy użyciu obiektywu 25x, 1,1 NA i GaAsP PMT. Zarówno EGFP, jak i R-CaMP były wzbudzane na długości fali 1000 nm, a fluorescencja EGFP (filtr emisyjny 525/50 nm) i fluorescencja R-CaMP (filtr emisyjny 593/46 nm) były zbierane jednocześnie. Po zarejestrowaniu pozyskanych danych w celu zminimalizowania artefaktów ruchu, co cztery klatki zostały uśrednione do jednej klatki w celu zmniejszenia szumu tła. Mysz została przedstawiona kratujące bodźce wzrokowe, a także przeanalizowano reakcje wzrokowe neuronów i poszczególnych kolców dendrytycznych (Ryc. 4D). Procesy mikrogleju wykazywały szybką dynamikę i zmieniały swoją morfologię w ciągu 10 sekund (Rysunek 4E i Wideo 1). Jak szczegółowo opisano w sekcji Dyskusja, gdy wstrzyknięcie AAV nie powiodło się, nie można było wykryć ekspresji R-CaMP. Jeśli operacja nie powiodła się, nie można było zaobserwować sygnałów EGFP i R-CaMP.

figure-results-1
Rysunek 1: Wstrzyknięcie AAV. (A) Szklana pipeta została podłączona do strzykawki Hamiltona 26 G za pomocą silikonowej rurki. (B) Przygotowanie do wstrzyknięcia AAV. (C) Roztwór AAV wstrzykiwano za pomocą szklanej pipety przechylonej o 60° do przodu od osi pionowej. (D) Schemat ideowy procedury otwierania czaszki (opisany w kroku 3.3). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Okno czaszki i płyta główna. (A) Schemat ideowy implantacji okna czaszkowego. (B) Zastosowano płyty czołowe wykonane na zamówienie. Do obrazowania w prawej półkuli należy używać krótszego ramienia po prawej stronie. (C) Widok grzbietowy myszy z oknem czaszkowym i wszczepioną płytą głowy. (D) Widok w dużym powiększeniu okna czaszki pokazany na Rysunek 2C. (E) Widok grzbietowy myszy unieruchomionej za pomocą specjalnie wykonanego instrumentu stereotaktycznego. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Przygotowanie do obrazowania dwufotonowego in vivo. (A) Widok grzbietowy urządzenia zacieniającego. (B) Widok z boku urządzenia zacieniającego. (C) Widok myszy z urządzeniem zacieniającym na płycie czołowej pod soczewką obiektywu. Mysz jest umieszczona na bieżni. (D) Widok pod mikroskopem wzbudzenia dwufotonowego. Po prawej stronie figury umieszczony jest monitor prezentujący bodźce wzrokowe. Soczewka obiektywu jest pokryta urządzeniem zacieniającym i czarną folią aluminiową, aby uniknąć światła z monitora do soczewki obiektywu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Dynamika mikrogleju i reakcje wzrokowe w kręgosłupie dendrytycznym. (A-C) Uśrednione w czasie obrazy mikrogleju EGFP(+) i neuronów R-CaMP(+) w warstwie 2/3 V1 u 12-tygodniowej myszy transgenicznej CX3XR1-EGFP. Natężenie sygnału w każdym kanale było normalizowane niezależnie. (D) Reakcje wzrokowe w kręgosłupie dendrytycznym. Diagramy paskowe z czarnymi strzałkami wskazują kierunek bodźców kratowych prezentowanych w czasie wskazanym przez szare kolumny. W śladach wapniowych szare linie wskazują poszczególne reakcje, a linia wskazuje ich średnią. W prawej wstawce żółty grot strzałki wskazuje grzbiet dendrytyczny, w którym wygenerowano obszar zainteresowania (ROI) w celu pozyskania śladów wapnia. (E) Proces mikrogleju (cyjanowy grot strzały) wykazał szybkie wycofanie w ciągu 10 sekund. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Wideo 1: Dwufotonowe obrazowanie aktywności neuronalnej i dynamiki mikrogleju. Dane obrazowe mikrogleju EGFP(+) i neuronów R-CaMP(+) w warstwie 2/3 V1 u 12-tygodniowej myszy transgenicznej CX3XR1-EGFP. Po lewej stronie filmu karmazynowy oznacza R-CaMP w neuronach, a zielony oznacza EGFP w mikrogleju. Środek filmu odpowiada sygnałowi EGFP, a prawa strona odpowiada sygnałowi R-CaMP. Natężenie sygnału w każdym kanale było normalizowane niezależnie. Liczba klatek na sekundę filmu jest 40 razy większa niż rzeczywista częstotliwość. Podziałka = 10 μm Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisujemy protokół wstrzyknięcia AAV i kraniotomii do jednoczesnego obrazowania dynamiki mikrogleju i aktywności neuronalnej u obudzonych myszy, a także przetwarzania danych. Technika ta może odkryć koordynację między dynamiką mikrogleju a aktywnością neuronów w skalach czasowych od subsekund do kilkudziesięciu sekund.

Protokół chirurgiczny składa się z kilku technicznie wymagających etapów. Wstrzyknięcie AAV jest jednym z krytycznych etapów. Nieudane wstrzyknięcie AAV może spowodować znaczne zmniejszenie ekspresji R-CaMP. Powody są dwa: zatkane szklane pipety i uszkodzenie tkanek. Zatkanie szklanych pipet zmniejsza lub całkowicie blokuje wyrzut roztworu AAV. Takiej sytuacji można uniknąć, barwiąc roztwór AAV barwnikiem, takim jak fast green, i wizualnie potwierdzając powodzenie wstrzyknięcia. Uszkodzenie tkanki spowodowane wstrzyknięciem AAV zapobiega egzogennej ekspresji genów w pobliżu środka miejsca wstrzyknięcia. Uszkodzenia wywołane wstrzyknięciem AAV mogą być spowodowane nagłym wzrostem wypływu z końcówki szklanej pipety po nagromadzeniu ciśnienia wewnątrz pipety. W związku z tym odpływ roztworu AAV ze szklanej pipety powinien być stały podczas wstrzykiwania. Wybór szklanych pipet o nieco większej średnicy na końcówkach rozwiązałby ten problem. W przypadku implantacji okienka czaszkowego szybkość operacji ma kluczowe znaczenie. Jeśli operacja trwa zbyt długo, tkanka mózgowa może zostać poważnie uszkodzona. W związku z tym konieczne jest powtarzanie ćwiczeń, aby zapewnić szybkość i płynność operacji. Ponadto w ciągu 4 tygodni od operacji do obrazowania jakość obrazowania może ulec pogorszeniu poprzez regenerację tkanki między oknem czaszkowym a tkanką mózgową metodą konwencjonalną17. Opracowana metoda rozwiązuje ten problem poprzez zastosowanie grubych szkieł do wewnętrznej szklanej tarczy okien czaszki, aby zahamować regenerację tkanek i utrzymać okno w czystości. W opisywanym tu układzie efekt ten był widoczny dzięki zastosowaniu wewnętrznego dysku szklanego o grubości 0,525 ± 0,075 μm.

Metodę można z powodzeniem stosować u myszy starszych niż 4 tygodnie, ale zastosowanie u młodszych myszy może być problematyczne. U młodych myszy czaszka wykazuje szybki i wyraźny wzrost, co powoduje niedopasowanie między kością czaszki a szklanym okienkiem.

W niektórych nowatorskich badaniach do badania interakcji mikrogleju i neuronów wykorzystano obrazowanie dwufotonowe in vivo 12,21,23. Zwłaszcza w pionierskiej pracy Merliniego i wsp. przeprowadzili oni jednoczesne obrazowanie in vivo dynamiki mikrogleju i aktywności neuronalnej w ciałach komórkowych21. W tej metodzie, stosując grubsze szkła wewnętrzne do okien czaszki, mogliśmy stłumić artefakty ruchu w orientacji głębokości i uzyskać stabilny pomiar aktywności neuronalnej w mikrostrukturach, takich jak kolce dendrytyczne. Metoda ta pomogłaby w badaniu interakcji synaps-mikroglej u obudzonych myszy.

Niedawne badania in vitro wykazały, że cienkie wyrostki mikrogleju podobne do filopodiów mają szybszą ruchliwość niż grube procesy, co sugeruje znaczenie ich szybszej ruchliwości w nadzorze. System może śledzić ruchliwość cienkich procesów mikrogleju z rozdzielczością czasową od sekundy poniżej sekundy do kilkudziesięciu sekund. Ta właściwość pomaga wyjaśnić funkcjonalne znaczenie ich ruchliwości dla nadzoru in vivo.

W przyszłości połączenie tej techniki obrazowania z interwencjami, takimi jak optogenetyka24 lub chemogenetyka25, zastosowana do lokalnych obwodów nerwowych lub międzyregionalnych połączeń neuronalnych, rzuciłoby światło na nowe funkcje mikrogleju w rozwoju synaps i plastyczności, które kształtują cechy obwodów neuronalnych. Ponadto dalsza integracja zadań związanych z obrazowaniem, interwencją i zachowaniem przyczyniłaby się do ujawnienia koordynacji mikrogleju i neuronów leżących u podstaw określonych zachowań.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Dr. Masashi Kondo i Dr. Masanori Matsuzaki za dostarczenie wektorów wirusowych. Prace te były wspierane przez Grants-in-Aid for Scientific Research (20H00481, 20A301, 20H05894, 20H05895 dla S.O.), Japońską Agencję Badań i Rozwoju Medycznego (JP19gm1310003 i JP17gm5010003 dla S.O. i JP19dm0207082 dla H.M.), UTokyo Center for Integrative Science of Human Behavior (CiSHuB), Japońską Agencję Nauki i Technologii Moonshot R&D (JPMJMS2024 do H.M.), Fundacja Nauk o Mózgu (do Jego Wysokości (do Jego Wysokości).

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
10-calowy monitor LCDEIZODuraVision FDX1003Do prezentacji siatkowych bodźców wizualnych
Strzykawka Hamilton 26G IgłaHamilton701N
27GTerumoNN-2719S
AAV-hSyn-R-CAMP1.07N/AN/AUprzejmie podarowany z laboratorium prof. Matsuzaki 
Węgiel aktywny w proszkuNacalai tesque07909-65
folia aluminiowaTHORLABSBKF12
CX3CR1-EGFP myszIMSR_JAX laboratoryjna Jackson: myszy 005582CX3CR-1EGFP/+ knock-in/knock-out wyrażające EGFP w mikrogleju w mózgu pod kontrolą endogennego Cx3cr1 locus.
DENT SILICONE-VShofu IncN/ADo mocowania urządzenia zacieniającego do płyty czołowej
Cement dentystyczny (szybka żywica, płyn)ShofuInc N/A
AB Cement dentystyczny (szybka żywica, proszek)ShofuInc N / AB Color 3
WiertarkaToyo AssociatesHP-200
Szklana pipeta kapilarnaDrummond Scientific Company2-000-075
Szklany krążek (duży)MatsunamiN/Ao średnicy 4 mm, 0,15± Grubość 0,02 mm
Szklany dysk (mały)MatsunamiN/Ao średnicy 2 mm, 0,525 plusmn; Grubość 0,075 mm
Płyta czołowaDostosowanaNie dotyczyMateriał: SUS304, grubość: 0,5 mm, patrz rysunek 2B dla kształtu
Włókno hemostatyczneDavol Inc1010090
OprogramowanieDarmowe oprogramowanieDo rejestracji danych
Klej błyskawiczny (Aron alpha)Daiichi SankyoN/A
IsofluranePfizerN/A
LidokainaAstrazenecaN/A
MATLAB 2017bMathWorksN/ADo rejestracji i przetwarzania danych
MeloxicamTokyo Chemical IndustryM1959
MikrowtryskiwaczKD ScientificKDS-100
Ściągacz do mikropipetSutter Instrument CompanyP-97
Wielofotonowy mikroskop wzbudzeniaNIKONN/ANazwa handlowa to "A1MP+".
Soczewka obiektywowaNIKONN/ANazwa handlowa to "CFI75 apochromat 25xC W".
Płyn parafinowyNacalai tesque26132-35
PsychtoolboxDarmowe oprogramowanieDo prezentacji siatkowych bodźców wizualnych
Urządzenie zacieniająceDostosowaneNie dotyczy
LeicaM165 FC
Instrument stereotaktycznyNarishige Instrument naukowySR-611Do zabiegu
Przyrząd stereotaktycznyDostosowanyNie dotyczy Domocowania myszy pod mikroskopem dwufotonowym
Zawór odcinającyISISVXB1079
Jedwab chirurgicznyBieżnia EthiconK881H
Dostosowanydotyczy
Środek utwardzający światłem UVNorland Products IncNOA 65
ParownikPenlonSigma DeltaMaszyna anestezjologiczna
ImageJ Fidżi Mikroskop stereoskopowy nie

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Andoh, M., et al. Exercise reverses behavioral and synaptic abnormalities after maternal inflammation. Cell Reports. 27 (10), 2817-2825 (2019).
  2. Inoue, K., Tsuda, M. Microglia in neuropathic pain: cellular and molecular mechanisms and therapeutic potential. Nature Reviews. Neuroscience. 19 (3), 138-152 (2018).
  3. Clasadonte, J., Scemes, E., Wang, Z., Boison, D., Haydon, P. G. Connexin 43-mediates astroglial metabolic networks contribute to the regulation of the sleep-wake cycle. Neuron. 95 (6), 1365-1380 (2017).
  4. Taylor, A. M. W., et al. Microglia disrupt mesolimbic reward circuitry in chronic pain. Journal of Neuroscience. 35 (22), 8442-8450 (2015).
  5. Kondo, S., Kohsaka, S., Okabe, S. Long-term changes of spine dynamics and microglia after transient peripheral immune response triggered by LPS in vivo. Molecular Brain. 4, 27(2011).
  6. Wu, Y., Dissing-Olsen, L., MacVicar, B. A., Stevens, B. Microglia: Dynamic mediators of synapse development and plasticity. Trends in Immunology. 36 (10), 605-613 (2015).
  7. Andoh, M., Koyama, R. Microglia regulate synaptic development and plasticity. Developmental Neurobiology. 81 (5), 568-590 (2020).
  8. Iida, T., Tanaka, S., Okabe, S. Spatial impact of microglial distribution on dynamics of dendritic spines. European Journal of Neuroscience. 49 (11), 1400-1417 (2019).
  9. Nakayama, H., et al. Microglia permit climbing fiber elimination by promoting GABAergic inhibition in the developing cerebellum. Nature Communications. 9 (1), 2830(2018).
  10. Wake, H., Moorhouse, A. J., Jinno, S., Kohsaka, S., Nabekura, J. Resting microglia directly monitor the functional state of synapses in vivo and determine the fate of ischemic terminals. Journal of Neuroscience. 29 (13), 3974-3980 (2009).
  11. Tremblay, M. E., Lowery, R. L., Majewska, A. K. Microglial interactions with synapses are modulated by visual experience. PLoS Biology. 8 (11), 10000527(2010).
  12. Liu, Y. U., et al. Neuronal network activity controls microglial process surveillance in awake mice via norepinephrine signaling. Nature Neuroscience. 22 (11), 1771-1781 (2019).
  13. Kim, T. H., Schnitzer, M. J. Fluorescence imaging of large-scale neural ensemble dynamics. Cell. 185 (1), 9-41 (2022).
  14. Grienberger, C., Konnerth, A. Imaging calcium in neurons. Neuron. 73 (5), 862-885 (2012).
  15. Isshiki, M., Okabe, S. Evaluation of cranial window types for in vivo two-photon imaging of brain microstructures. Microscopy (Oxf). 63 (1), 53-63 (2014).
  16. Ohtsuki, G., et al. Similarity of visual selectivity among clonally related neurons in visual cortex. Neuron. 75 (1), 65-72 (2012).
  17. Maruoka, H., et al. Lattice system of functionally distinct cell types in the neocortex. Science. 358 (6363), 610-615 (2017).
  18. Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. Resting microglial cells are highly dynamic surveillants of brain parenchyma in vivo. Science. 308 (5726), 1314-1318 (2005).
  19. Bernier, L. P., et al. Nanoscale surveillance of the brain by microglia via cAMP-regulated filopodia. Cell Reports. 27 (10), 2895(2019).
  20. Sun, W., et al. In vivo two-photon imaging of anesthesia-specific alterations in microglial surveillance and photodamage-directed motility in mouse cortex. Frontiers in Neuroscience. 13, 421(2019).
  21. Merlini, M., et al. Microglial Gi-dependent dynamics regulate brain network hyperexcitability. Nature Neuroscience. 24 (1), 19-23 (2021).
  22. Kondo, M., Kobayashi, K., Ohkura, M., Nakai, J., Matsuzaki, M. Two-photon calcium imaging of the medial prefrontal cortex and hippocampus without cortical invasion. eLife. 6, 26839(2017).
  23. Badimon, A., et al. Negative feedback control of neuronal activity by microglia. Nature. 586 (7829), 417-423 (2020).
  24. Rajasethupathy, P., Ferenczi, E., Deisseroth, K. Targeting neural circuits. Cell. 165 (3), 524-534 (2016).
  25. Roth, B. L. DREADDs for Neuroscientists. Neuron. 89 (4), 683-694 (2016).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Microglial DynamicsNeuronal ActivityAwake Mice ImagingTwo Photon ImagingCranial WindowAAV InjectionPrimary Visual CortexCalcium ImagingEGFP MicrogliaVisual Stimulation

Related Articles