Artykuł metodologiczny

Obrazowanie transportu komórek za pomocą pozytonowej tomografii emisyjnej: metoda znakowania radioaktywnego komórek

DOI:

10.3791/64117

⸱

27 października 2023

 ,  , 
1Division of Nuclear Medicine, Department of Radiology, Mayo Clinic, 2Department of Radiology, University of Colorado Anschutz Medical Campus

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiono tutaj protokół znakowania radioizotopowego komórek za pomocą radioizotopu pozytonowej tomografii emisyjnej (PET), 89Zr (t1/2 78.4 h), przy użyciu gotowego do użycia syntonu radioznakującego, [89Zr]Zr-p-isothiocyanatobenzyl-desferrioxamine ([89Zr]Zr-DBN). Znakowanie radioizotopowane komórek za pomocą [89Zr]Zr-DBN umożliwia nieinwazyjne śledzenie i obrazowanie podanych komórek znakowanych radioaktywnie w organizmie za pomocą PET przez okres do 7 dni po podaniu.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Terapie komórkami T z wykorzystaniem komórek macierzystych i chimerycznych receptorów antygenowych (CAR) stają się obiecującymi terapiami dla regeneracji narządów i immunoterapii różnych nowotworów. Pomimo znacznego postępu w tych dziedzinach, wciąż pozostaje wiele do nauczenia się, aby lepiej zrozumieć farmakokinetykę i farmakodynamikę podawanych komórek terapeutycznych w żywym systemie. Do nieinwazyjnego śledzenia in vivo komórek za pomocą pozytonowej tomografii emisyjnej (PET) opracowano nową metodę radioznakowania komórek za pośrednictwem [89Zr]Zr-p-izotiocyanatobenzylo-desferrioksaminy ([89Zr]Zr-DBN) przy użyciu 89Zr (t1/2 78,4 h). Niniejszy protokół opisuje [89Zr]Zr-DBN, gotowy do użycia, znakowany radioaktywnie synton do bezpośredniego znakowania radioaktywnego różnych komórek, w tym mezenchymalnych komórek macierzystych, kardiopoetycznych komórek macierzystych kierowanych przez linię, hepatocytów regenerujących wątrobę, białych krwinek, komórek czerniaka i komórek dendrytycznych. Opracowana metodologia umożliwia nieinwazyjne obrazowanie PET transportu komórkowego przez okres do 7 dni po podaniu bez wpływu na charakter lub funkcję komórek znakowanych radioaktywnie. Dodatkowo, protokół ten opisuje krokową metodę radiosyntezy [89Zr]Zr-DBN, biokompatybilnego preparatu [89Zr]Zr-DBN, przygotowania komórek do znakowania radioaktywnego, a na końcu znakowania radioaktywnego komórek za pomocą [89Zr]Zr-DBN, w tym wszystkich skomplikowanych szczegółów potrzebnych do pomyślnego znakowania radioaktywnego komórek.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Terapie komórkami T z wykorzystaniem komórek macierzystych i chimerycznego receptora antygenu (CAR) zyskują na popularności i są aktywnie badane pod kątem leczenia różnych chorób, takich jak niewydolność mięśnia sercowego1,2, zwyrodnienie siatkówki2, zwyrodnienie plamki żółtej2, cukrzyca2, zawał mięśnia sercowego3,4,5, oraz cancers6,7,8,9,10. Spośród dwóch prawdopodobnych podejść terapii komórkami macierzystymi, komórki macierzyste mogą być albo bezpośrednio wszczepione w miejsce choroby w celu wywołania odpowiedzi terapeutycznej, albo powodować zmiany w mikrośrodowisku miejsca chorobowego bez przylegania do miejsca chorobowego w celu zainicjowania pośredniej odpowiedzi terapeutycznej. Pośrednia odpowiedź terapeutyczna może spowodować zmiany w mikrośrodowisku miejsca choroby poprzez uwolnienie czynników, które naprawiłyby lub wyleczyły chorobę5. Te podejścia do terapii komórkami macierzystymi można ocenić za pomocą nieinwazyjnego obrazowania komórek macierzystych znakowanych radioaktywnie. Nieinwazyjne obrazowanie może skorelować wychwyt komórek znakowanych radioaktywnie w miejscu choroby z odpowiedzią terapeutyczną w celu rozszyfrowania bezpośredniej i pośredniej odpowiedzi terapeutycznej.

Dodatkowo, opracowywane są terapie oparte na komórkach odpornościowych do leczenia różnych nowotworów za pomocą CAR T-cell6,7,8,9,10i immunoterapii komórek dendrytycznych11,12. Mechanistycznie, w immunoterapii limfocytami T CAR class=6,7,8,9,10, limfocyty T są zaprojektowane tak, aby wyrażać epitop, który wiąże się z określonym antygenem na guzach, które muszą być leczone. Te zmodyfikowane limfocyty T CAR, po podaniu, wiążą się ze specyficznym antygenem obecnym na komórkach nowotworowych poprzez interakcję epitop-antygen. Po związaniu związane limfocyty T CAR ulegają aktywacji, a następnie proliferują i uwalniają cytokiny, co sygnalizuje układowi odpornościowemu gospodarza atak na guz wykazujący ekspresję specyficznego antygenu. Natomiast w przypadku terapii komórkami dendrytycznymi11,12, komórki dendrytyczne są zaprojektowane tak, aby prezentowały na swojej powierzchni określony antygen nowotworowy. Te zmodyfikowane komórki dendrytyczne, po podaniu, są domem dla węzłów chłonnych i wiążą się z komórkami T w węzłach chłonnych. Limfocyty T, po związaniu się ze specyficznymi antygenami nowotworowymi na podanych komórkach dendrytycznych, ulegają aktywacji/proliferacji i inicjują odpowiedź immunologiczną gospodarza przeciwko nowotworowi wyrażającemu ten specyficzny antygen. W związku z tym ocena transportu podanych limfocytów T CAR do miejsca nowotworu9,10 i naprowadzanie komórek dendrytycznych do węzłów chłonnych11,12 jest możliwe poprzez obrazowanie znakowanych radioaktywnie komórek T CAR i komórek dendrytycznych w celu określenia skuteczności immunoterapii. Co więcej, nieinwazyjny transport komórkowy może pomóc w lepszym zrozumieniu potencjału terapeutycznego, wyjaśnieniu bezpośredniej i pośredniej odpowiedzi terapeutycznej oraz przewidywaniu i monitorowaniu odpowiedzi terapeutycznej zarówno na terapie oparte na komórkach macierzystych, jak i komórkach odpornościowych.

Zbadano różne metody obrazowania dla transportu komórkowego3,4,9,10,12, w tym obrazowanie optyczne, rezonans magnetyczny (MRI), tomografia emisyjna pojedynczych fotonów (SPECT) i pozytonowa tomografia emisyjna (PET). Każda z tych technik ma swoje zalety i wady. Wśród nich PET jest najbardziej obiecującą metodą ze względu na jej ilościowy charakter i wysoką czułość, które są niezbędne do wiarygodnej kwantyfikacji komórek w transporcie komórkowym opartym na obrazowaniu3,4,9,10.

Radioizotop emitujący pozytony 89Zr, o okresie połowicznego rozpadu 78,4 h, nadaje się do znakowania komórek. Umożliwia obrazowanie PET transportu komórkowego przez ponad 1 tydzień i jest łatwo wytwarzany przez powszechnie dostępne, niskoenergetyczne cyklotrony medyczne13,14,15,16,17. Dodatkowo, odpowiednio funkcjonalizowany chelator p-izotiocyanatobenzylo-desferrioksaminy (DFO-Bn-NCS) jest dostępny na rynku do syntezy znakowanego 89Zr, gotowego do użycia syntonu znakującego komórki, [89Zr]Zr-p-isothiocyanatobenzyl-desferrioxamine, znanego również jako [89Zr]Zr-DBN18,19,20,21,22,23,24,25. Zasada znakowania komórek za pośrednictwem [89Zr]Zr-DBN opiera się na reakcji między pierwszorzędowymi aminami białek błony komórkowej a ugrupowaniem izotiocyjanianu (NCS) [89Zr]Zr-DBN w celu wytworzenia stabilnego kowalencyjnego wiązania tiomocznikowego.

[89Zr]Opublikowano znakowanie i obrazowanie komórek oparte na Zr-DBN w celu śledzenia różnych komórek, w tym komórek macierzystych18,23,25, komórki dendrytyczne18, kardiopoietyczne komórki macierzyste19, dziesiętne komórki zrębowe20, makrofagi pochodzące ze szpiku kostnego20, komórki jednojądrzaste krwi obwodowej20, Jurkat/CAR T-cells21, hepatocyty22,24, oraz białe krwinki25. Poniższy protokół przedstawia krok po kroku metody przygotowania i znakowania radioaktywnego komórek za pomocą [89Zr]Zr-DBN i opisuje zmiany, które mogą być wymagane w protokole znakowania radioaktywnego dla określonego typu komórki. Dla większej jasności przedstawiona tutaj metoda znakowania radioaktywnego komórek jest podzielona na cztery sekcje. Pierwsza sekcja dotyczy otrzymywania [89Zr]Zr-DBN poprzez chelatację 89Zr przez DFO-Bn-NCS. W drugiej sekcji opisano przygotowanie biokompatybilnego preparatu [89Zr]Zr-DBN, który może być łatwo stosowany do znakowania radioizotopowego komórek. W trzeciej sekcji omówiono etapy niezbędne do wstępnego kondycjonowania komórek do znakowania radioizotopem. Wstępne kondycjonowanie komórek polega na myciu komórek solą fizjologiczną buforowaną fosforanami bez białek (PBS) i buforowanym przez HEPES zrównoważonym roztworem soli Hanksa (H-HBSS) w celu usunięcia białek zewnętrznych, które mogą zakłócać lub konkurować z reakcją [89Zr]Zr-DBN z aminami pierwszorzędowymi obecnymi na białkach powierzchni komórki podczas znakowania radioaktywnego. Ostatnia sekcja zawiera kroki związane z faktycznym znakowaniem radioizotopowym komórek i analizą kontroli jakości.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Komórki dendrytyczne i komórki czerniaka zostały uzyskane komercyjnie18. Hepatocyty wyizolowano z wątroby świń po laparoskopowej częściowej hepatektomii22,24. Komórki macierzyste wyizolowano z aspiratów szpiku kostnego18,19,26. Komórki macierzyste pochodzące z tkanki tłuszczowej uzyskano z Laboratorium Terapii Komórkowej Człowieka, Mayo Clinic Rochester23. Ludzkie białe krwinki wyizolowano z krwi pobranej z Oddziału Medycyny Transfuzjologicznej, Mayo Clinic Rochester25. Uzyskano różne komórki używane do znakowania radioaktywnego i wykorzystano je zgodnie z wytycznymi zalecanymi przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Ich Użytkowania, Podkomitet Nadzoru nad Komórkami Macierzystymi Mayo Clinic, Komitet Badawczy Wydziału Medycyny Transfuzjologicznej, Instytucjonalny Komitet ds. Bezpieczeństwa Biologicznego oraz Komitet ds. Bezpieczeństwa Radiacyjnego.

1. Przygotowanie [ 89Zr ]Zr-p-isothiocyanatobenzyl-desferrioxamine ([ 89Zr ]Zr-DBN)

Czas: ~160-220 min
UWAGA: W celu przygotowania [89Zr]Zr-DBN należy wyizolować 89Zr w postaci [89Zr]Zr-wodorofosforanu ([89Zr]Zr(HPO4)2) lub [89Zr]Zr-chlorku ([89Zr]ZrCl4), jak wspomniano w kroku 1.1.

  1. Wyizoluj 89Zr od rodzica 89Y, stosując ustaloną metodę oczyszczania na bazie żywicy hydroksamianowej13,17. Krótko mówiąc, najpierw przygotuj kolumnę z ~100 mg żywicy hydroksaminowej, a następnie aktywuj żywicę hydroksaminową, przemywając kolumnę 8,0 ml czystego bezwodnego acetonitrylu, a następnie przepłucz 5,0-6,0 ml powietrza. Następnie przemyć kolumnę 15 ml wody dejonizowanej, a następnie ponownie przepłukać 5,0-6,0 ml powietrza, a następnie przepuścić 2,0 ml 0,50 N HCl (klasa na bazie metali śladowych), a następnie dodatkowo przepłukać 5,0-6,0 ml powietrza. Następnie powoli załadować roztwór zawierający zarówno 89Zr, jak i 89Y do żywicy hydroksamatowej i przepłukać niezwiązaną 89Y z żywicy hydroksamatomowej 20 ml 2,0 N HCl, a następnie 10 ml wody dejonizowanej i przepłukać 5,0-6,0 ml powietrza.
    UWAGA: Po spłukaniu powietrzem elucję 89Zr można przeprowadzić, jak pokazano poniżej.
    1. W celu elucji 89Zr w postaci [89Zr]Zr(HPO4)2, najpierw dodaj 0,50 ml buforu 1,2 MK 2HPO4/KH2PO4 (pH 3,5) do kolumny z kroku 1.1 i pozostaw ją na kolumnie przez 30 minut, aby przyspieszyć uwalnianie 89Zr jako [89Zr]Zr(HPO4)2 z żywicy. Następnie wymyj 89Zr z kolumny za pomocą dodatkowych 1,50 ml buforu 1,2 M K2HPO4 / KH2PO4 (pH 3,5). Po wymazaniu [89Zr]Zr(HPO4)2, wykonaj kroki 1.2, 1.2.1 i 1.2.2 w celu przygotowania [89Zr]Zr-DBN za pomocą [89Zr]Zr(HPO4)2, jak pokazano na Rysunek 1.
    2. Aby uzyskać 89Zr jako [89Zr]ZrCl4, najpierw eluuj 89Zr jako [89Zr]Zr-szczawian.
      1. W celu elucji 89Zr w postaci szczawianu [89Zr]Zr, dodać 0,50 ml 1,0 M kwasu szczawiowego do kolumny z kroku 1.1 i pozostawić na kolumnie przez 1 minutę, aby przyspieszyć uwalnianie 89Zr jako szczawianu [89Zr]-szczawianu z żywicy. Następnie wymyj 89Zr z kolumny dodatkowymi 2,50 ml 1,0 M kwasu szczawiowego (łącznie 3,0 ml)17.
      2. Aby przekształcić [89Zr]Zr-szczawian w [89Zr]ZrCl4 za pomocą kolumny wymiany anionów, jak opisano przez Larenkov et al.14, najpierw aktywuj kolumnę przez przemywanie 6,0 ml acetonitrylu, a następnie przepłukanie 5,0-6,0 ml powietrza. Następnie przemyj kolumnę 10,0 ml soli fizjologicznej, a następnie ponownie przepłucz 5,0-6,0 ml powietrza. Na koniec przepuść 10,0 ml wody dejonizowanej, a następnie spłucz 5,0-6,0 ml powietrza.
      3. Powoli załadować 3,0 ml roztworu zawierającego [89Zr]Zr-szczawianów do aktywowanej kolumny anionowymiennej, a następnie przepłukać 5,0-6,0 ml powietrza. Następnie przemyć kolumnę obciążoną 89Zr 50,0 ml dejonizowanej wody w celu usunięcia niezwiązanych jonów szczawianowych, a następnie przepłukać 5,0-6,0 ml powietrza.
      4. W celu elucji 89Zr w postaci [89Zr]ZrCl4, dodaj 0,10 ml 1,0 N HCl do kolumny, pozostaw ją na kolumnie na 1,0 minuty, aby przyspieszyć uwalnianie 89Zr jako [89Zr]ZrCl4 z żywicy i wymyj 89Zr z kolumny dodatkowym 0,40 ml 1,0 N HCl (łącznie 0,5 ml). Wyluzowany [89Zr]ZrCl4 wysuszyć w fiolce w kształcie litery V, umieszczając ją w bloku grzewczym w temperaturze 65 °C pod stałym przepływem azotu przez 10-30 minut. Po wysuszeniu rozpuść wysuszony [89Zr]ZrCl4 w wodzie i postępuj zgodnie z krokami 1.3 i 1.3.1 w celu przygotowania [89Zr]Zr-DBN przy użyciu [89Zr]ZrCl4, jak pokazano na Rysunek 1.
  2. Weź ~120 μL [89Zr]Zr(HPO4)2, sformułowany w 1,2 M K2HPO4/KH2PO4 (pH 3,5) (10-25 MBq) z kroku 1.1.1 i zneutralizuj roztwór, aby osiągnąć pH 7,5-8,0 z ~100 μL 1,0 M HEPES-KOH (pH 7,5) i ~65 μL 1,0 M K2CO3.
    1. Aby uzyskać odpowiednią ilość DFO-Bn-NCS dla kroków 1.2.2 lub 1.3.1 dla różnych postaci użytkowych 89Zr o zróżnicowanej pozornej aktywności właściwej 89Zr, należy przeprowadzić zestaw reakcji chelatacji przy użyciu ustalonej objętości zobojętnionego preparatu [89Zr]Zr(HPO4)2 lub [89Zr]ZrCl4 z zakresem DFO-Bn-NCS (7,5-15 μg). W przypadku [89Zr]Zr(HPO4)2 inkubować reakcję chelatacji w temperaturze 37 °C w wytrząsarce przy ~550 obr./min przez 60 minut. Natomiast w przypadku [89Zr]ZrCl4 inkubować reakcję chelatacji w temperaturze 25 °C w wytrząsarce przy ~550 obr./min przez 30 min. Odrzucić reakcję chelatacji, która wykazuje osad podczas lub pod koniec inkubacji. Pod koniec inkubacji przeprowadzić radioaktywną chromatografię cienkowarstwową (rad-TLC) z 100 mM pentaoctanem dietylenotriaminy (DTPA), pH 7,0, jako fazę ruchomą, aby oszacować skuteczność chelatacji DFO-Bn-NCS dla każdej reakcji chelatacji, jak omówiono poniżej w kroku 1.5.
      UWAGA: W oparciu o skuteczność chelatacji, należy użyć minimalnej ilości DFO-Bn-NCS w krokach 1.2.2 lub 1.3.1 potrzebnej do osiągnięcia ≥97% skuteczności chelatacji bez powodowania wytrącania DFO-Bn-NCS w zobojętnionej preparacie [89Zr]Zr(HPO4)2 lub [89Zr]ZrCl4. W tym przypadku [89Zr]Zr-DBN został zsyntetyzowany w czystości radiochemicznej ≥97%.
    2. Przygotować świeże 5,0 mM DFO-Bn-NCS w bezwodnym DMSO (3,76 mg/mL) i dodać 4,0 μl 5,0 mM DFO-Bn-NCS (20 nmol lub 15 μg) do ~285 μL zobojętnionego [89Zr]Zr(HPO4)2 (10-25 MBq) z kroku 1.2 i wymieszać roztwór pipetując. Utrzymać końcowe stężenie DMSO w mieszaninie chelatacyjnej poniżej 2% całkowitej objętości.
  3. Weź ~180 μL [89Zr]ZrCl4 sformułowanego w 0,1 N HCl (40-80 MBq) z kroku 1.1.2.4 i zneutralizuj otrzymany roztwór, aby osiągnąć pH 7,5-8,0 z ~25 μL 1,0 M Na2CO3.
    1. Przygotować świeże 2,5 mM DFO-Bn-NCS w bezwodnym dimetylosulfotlenku (DMSO) (1,88 mg/mL) i dodać 4,0 μl 2,5 mM DFO-Bn-NCS (10 nmol lub 7,5 μg) do ~205 μL zobojętnionego [89Zr]ZrCl4 (40-80 MBq) z kroku 1.3. Wymieszać roztwór, pipetując. Utrzymać końcowe stężenie DMSO w mieszaninie chelatacyjnej poniżej 2% całkowitej objętości.
  4. Postępować chelatację 89Zr w temperaturze 37 °C w wytrząsarce przy ~550 obr./min przez 60 min w przypadku [89Zr]Zr(HPO4)2 lub w temperaturze 25 °C w wytrząsarce przy ~550 obr./min przez 30 min w przypadku [89Zr]ZrCl4.
  5. Określić skuteczność chelatacji 89Zr za pomocą rad-TLC za pomocą 100 mM DTPA (pH 7,0) jako mobilnego rozpuszczalnika rad-TLC. Spodziewaj się, że [89Zr]Zr-DBN pokaże Rf ~0,021-0,035, [89Zr]ZrCl4 pokaże Rf ~1,0, a [89Zr]Zr(HPO4)2 pokaże Rf ~1,0. Obliczyć sprawność chelatacji (%) za pomocą równania (1):
    Procent 89Zr schelatowany do DFO-NCS w celu utworzenia [89Zr]Zr-DBN = [ (Radioaktywność przy Rf z [89Zr]Zr - DBN) / (Suma promieniotwórczości przy Rf z [89Zr]Zr - DBN i przy Rf z [89Zr]Zr(HPO4)2 lub [89Zr]ZrCl4) ] × 100 (1)
    UWAGA: Dopuszczalna skuteczność chelatacji 89Zr do przeprowadzenia radioznakowania komórek, określona przez rad-TLC, wynosi ≥97%. Sugerowana czystość radiochemiczna na poziomie ≥97% [89Zr]Zr-DBN została ustalona zgodnie ze standardowym wymogiem czystości radiochemicznej dla innych radiofarmaceutyków stosowanych w terenie. Patrz reprezentatywny rad-TLC na rysunku uzupełniającym S1 i rysunku uzupełniającym S2.

figure-protocol-1
Rysunek 1: Schemat przygotowania [89Zr]Zr-DBN. W celu przygotowania [89Zr]Zr-DBN należy zneutralizować wstępnie sformułowane [89Zr]Zr(HPO4)2 lub [89Zr]ZrCl4 do pH 7,5-8,0. Zobojętniony roztwór inkubować z DFO-Bn-NCS. Sprawdź skuteczność chelatacji 89Zr do DFO-Bn-NCS za pomocą rad-TLC. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

2. Biokompatybilny preparat [ 89Zr ]Zr-DBN do radioznakowania komórek (Rysunek 2)

Czas: ~35 min
UWAGA: Biorąc pod uwagę czas potrzebny na przygotowanie komórek w kroku 3, rozpocznij krok 3 około 20 minut przed rozpoczęciem kroku 2 dla ~30 minutowej inkubacji. Dzięki temu znakowanie radioizotopowe komórek w kroku 4 rozpoczyna się w ciągu ~5-10 minut po zakończeniu kroków 2-3.2.2.

  1. W przypadku preparatu [89Zr]Zr-DBN wykonanego z [89Zr]ZrCl4 dodać 50,0 μl mieszaniny zgodnej z komórkami zawierającej ~27,0 μl 1,2 M K2HPO4/KH2PO4 (pH 3,5) + ~23,0 μl 1,0 M buforu HEPES-KOH (PH 7,5) do 50,0 μL [89Zr]Zr-DBN. Inkubować mieszaninę kompatybilną z komórkami [89Zr]Zr-DBN przez ~30 minut w temperaturze pokojowej (25 °C).
    UWAGA: Preparat [89Zr]Zr-DBN wykonany z [89Zr]Zr(HPO4)2 jest biokompatybilny do znakowania radioizotopowego komórek i nie wymaga kroku 2.

figure-protocol-2
Rysunek 2: Przygotowanie biokompatybilnego preparatu [89Zr]Zr-DBN do znakowania radioaktywnego komórek. W celu przygotowania gotowej do użycia biokompatybilnej formulacji syntonu znakującego radioaktywnie, dodać równą objętość mieszaniny zgodnej z komórkami, składającej się z 1,2 M K2HPO4/KH2PO4 (pH 3,5) + 1,0 M HEPES-KOH do równej objętości [89Zr]Zr-DBN. Inkubować w temperaturze 25 °C przez ~ 30 min. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

3. Przygotowanie komórek do znakowania radioizotopem

Czas: ~40-50 min

  1. Trypsynizuj ~12 × 106 przylegających komórek (komórki macierzyste, komórki raka czerniaka, sercowo-poetyczne komórki macierzyste, komórki dendrytyczne lub hepatocyty) i odwiruj komórki w stożkowej probówce wirówkowej o pojemności 15,0 ml w temperaturze ~96 × g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
    1. Wyrzuć supernatant, ponownie zawieś osad komórkowy w ~500 μl PBS i przenieś zawiesinę komórek do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. Odwirować komórki w mikrowirówce o temperaturze ~96 × g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
    2. Wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórek w ~500 μL H-HBSS. Odwirować komórki w mikrowirówce o pojemności 1,5 ml przy ~96 × g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Powtórzyć krok 3.1.2 jeszcze raz i przejść do kroku 4.1.1.
      UWAGA: H-HBSS to zrównoważony roztwór soli Hanksa o stężeniu 0,01 M HEPES (pH 8,0).
  2. W przypadku komórek nieprzylegających, takich jak ludzkie białe krwinki (świeżo wyizolowane ludzkie białe krwinki z krwi), należy pominąć trypsynizację i odwirować zawiesinę komórek zawierającą ~12 × 106 komórek w mikrowirówce o pojemności 1,5 ml w temperaturze ~96 × g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
    1. Odrzucić supernatant, ponownie zawiesić osad komórkowy w ~500 μl PBS i odwirować komórki w mikrowirówce o pojemności 1,5 ml przy ~96 × g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
    2. Wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórek w ~500 μL H-HBSS. Odwirować komórki w mikrowirówce o pojemności 1,5 ml przy ~96 × g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Powtórzyć krok 3.2.2 jeszcze raz i przejść do kroku 4.1.1.

4. Radioznakowanie komórek

Czas: ~125-155 min

  1. Inicjacja znakowania radioaktywnego komórek (Rysunek 3)
    1. Użyj zawiesiny komórek z kroku 3.1.2 lub kroku 3.2.2, aby przygotować zawiesinę komórek o objętości ~500 μl z około ~6 × 106 komórek w ~500 μl H-HBSS o pH 7,5-8,0 w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml.
    2. Do tego dodaj ~100 μl biokompatybilnie sformułowanego [89Zr]Zr-DBN z kroku 2.
  2. Inkubacja komórek do znakowania radioaktywnego (Rysunek 4)
    1. Wymieszaj biokompatybilnie sformułowany [89Zr]Zr-DBN i zawiesinę komórkową, delikatnie pipetując w górę i w dół za pomocą mikropipety o pojemności ~500 μL. Zmierz ilość radioaktywności w probówce inkubacyjnej za pomocą kalibratora dawki promieniotwórczości przy ustawieniu 489 dla 89Zr-isotope16.
    2. Inkubować komórki i mieszaninę [89Zr]Zr-DBN w wytrząsarce z prędkością ~550 obr./min w temperaturze 25-37 °C przez 30-45 minut w celu znakowania komórek.
      UWAGA: Temperatura inkubacji będzie się różnić w zależności od typów komórek używanych do znakowania radioizotopowego, jak pokazano w Tabeli 1.
    3. Po inkubacji w kroku 4.2.2 należy przeprowadzić rad-TLC w reakcji znakowania radioaktywnego komórki przy użyciu świeżo przygotowanego rozpuszczalnika rad-TLC (20 mM cytrynian sodu [pH 4,9-5,1]:metanol [1:1, V:V]). Po przebiegu rad-TLC poszukaj [89Zr]Zr-DBN i [89Zr]ZrCl4 wokół Rf = ~0,73-0,81 i Rf = ~0,01-0,02 dla komórek znakowanych radioaktywnie. Obliczyć procentową zawartość promieniotwórczości przy Rf = ~0,01-0,02 za pomocą równania (2).
      Procent promieniotwórczości przy Rf = ~0,01-0,02 = [ (Radioaktywność przy Rf = ~0,01 - 0,02) / (Suma promieniotwórczości przy Rf = ~0,01 - 0,02 i Rf = ~0,73 - 0,81) ] × 100 (2)
      UWAGA: Aby zrozumieć piki uwidocznione przy Rf = ~0,01-0,02 i Rf = ~ 0,73-0,81, zobacz rad-TLC dla reakcji znakowania radiokrwinek białych na rysunku uzupełniającym S3.
    4. W oddzielnej probówce do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml wymieszaj ~100 μl biokompatybilnie opracowanego [89Zr]Zr-DBN z ~500 μl H-HBSS o pH 7,5-8,0 do użycia jako kontrola bez komórek w celu korekcji tła w kroku 4.2.5. Po inkubacji w podobnej temperaturze i czasie, jak w kroku 4.2.2, wykonaj rad-TLC. Po przebiegu rad-TLC poszukaj [89Zr]Zr-DBN i [89Zr]ZrCl4 wokół Rf = ~0,73-0,81. Obliczyć procentową zawartość promieniotwórczości przy Rf = ~ 0,01-0,02 za pomocą równania (3).
      Promieniotwórczość przy Rf = ~0,01-0,02 = [ (Promieniotwórczość przy Rf = ~0,01 - 0,02) / (Suma promieniotwórczości przy Rf = ~0,01 - 0,02 i Rf = ~0,73 - 0,81) ] × 100 (3)
      UWAGA: Aby zrozumieć piki uwidocznione przy Rf = ~ 0,01-0,02 i ~ 0,73-0,81, zobacz rad-TLC reakcji kontroli bez komórek na rysunku uzupełniającym S4.
    5. Oblicz efektywne znakowanie radioaktywne komórki (%), odejmując procent radioaktywności przy Rf = ~0,01-0,02 (od rad-TLC z kroku 4.2.4) od procentu radioaktywności przy Rf = ~0,01-0,02 (od rad-TLC z kroku 4.2.3).
  3. Wygaszanie znakowania radioaktywnego i mycie komórek (Rysunek 5)
    1. Po potwierdzeniu zakończenia znakowania radioaktywnego za pomocą rad-TLC w kroku 4.2.5, należy przeprowadzić wygaszanie reakcji znakowania radioaktywnego przez dodanie ~600 μl schłodzonej, odpowiedniej dla komórki kompletnej pożywki lub przez dodanie H-HBSS, jak pokazano w Tabeli 1.
    2. Odwirować komórki w mikrowirówce o sile ~96 × g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant.
    3. Delikatnie ponownie zawiesić granulowane komórki w ~ 500 μl schłodzonej pożywki (zmodyfikowana pożywka orła Dulbecco (DMEM) + 10% płodowej surowicy bydlęcej + 5% penicyliny/streptomycyny lub Roswell Park Memorial Institute-1640 (RPMI-1640) + 10% płodowej surowicy bydlęcej + 5% penicyliny/streptomycyny lub H-HBSS dla określonego typu komórek, jak pokazano w Tabeli 1. Przeprowadzić ponowne zawieszenie osadu komórkowego, delikatnie pipetując w górę i w dół za pomocą mikropipety o pojemności ~500 μL.
    4. Odwirować komórki w mikrowirówce o temperaturze ~96 × g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
    5. Powtórzyć kroki 4.3.2-4.3.4 dwukrotnie, aby zmyć niezwiązaną radioaktywność.
    6. Przenieść osad do świeżej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml z DMEM + 10% płodowej surowicy bydlęcej + 5% penicyliny/streptomycyny w przypadku komórek macierzystych lub H-HBSS i zmierzyć radioaktywność w osadzie komórkowej za pomocą kalibratora dawki przy ustawieniu 489 dla 89Zr-isotope16.
    7. Obliczyć końcową skuteczność znakowania izotopem po wszystkich płukaniach, stosując równanie (4).
      Skuteczność znakowania radioaktywnego = [(Radioaktywność skorygowana o zanik w osadzie komórkowej w kroku 4.3.6) / (Radioaktywność skorygowana o rozpad w osadzie komórkowej i H-HBSS w kroku 4.2.1) ] × 100 (4)
    8. Aby zapewnić jakość komórek znakowanych radioizotopem, należy najpierw sprawdzić wzrokowo końcową zawiesinę komórek znakowanych radioaktywnie pod kątem obecności jakichkolwiek grudek. Jeśli nie ma grudek, przejdź z tym ostatnim zawieszeniem do następnego kroku. Jeśli są grudki, ale można je ponownie zawiesić przez pipetowanie lub delikatne potrząsanie, należy to zrobić i przejść do następnego kroku, który przejdzie kontrolę wzrokową. Jeśli jednak grudki nie zostaną ponownie zawieszone przez pipetowanie lub delikatne wstrząsanie, należy wyrzucić zawiesinę i zacząć od nowa.
    9. Jeżeli oględziny przebiegną pomyślnie, należy przeprowadzić test żywotności błękitu trypanowego przy użyciu 0,4% roztworu błękitu trypanowego przygotowanego w PBS w ciągu 1 godziny od znakowania radioizotopem oraz etapów przemywania (4.3.3-4.3.7) w celu oceny żywotności komórek znakowanych radioizotopem.
      1. Aby przeprowadzić badanie, należy dodać 10,0 μl 0,4% roztworu błękitu trypanowego do 10,0 μl zawiesiny komórek znakowanych radioaktywnie i nieznakowanych i wymieszać je, pipetując zawiesinę błękitnych krwinek trypanowych w górę iw dół za pomocą mikropipety o zawartości 10,0 μl.
      2. Załadować hemytometr ~10,0 μl mieszaniny zawiesiny trypanowej krwinek niebieskich, natychmiast policzyć liczbę komórek zabarwionych na niebiesko i całkowitą liczbę komórek w hemacytometrze pod mikroskopem przy małym powiększeniu lub za pomocą automatycznego licznika komórek. Obliczyć procent żywotnych komórek za pomocą równania (5).
        Procent żywych komórek = 100 - [(Liczba komórek zabarwionych na niebiesko) / (Liczba komórek ogółem)] × 100 (5)
    10. Komórki znakowane radioizotopem należy stosować, jeśli nie ma zmian w procentowej liczbie komórek zdolnych do życia w zawiesinie komórek znakowanych radioaktywnie w porównaniu z nieznakowanym odpowiednikiem. Odrzucić komórki znakowane radioizotopem, jeśli odsetek komórek zdolnych do życia jest mniejszy niż ich nieznakowane odpowiedniki.

figure-protocol-3
Rysunek 3: Schemat inicjacji radioznakowania komórek. Rozpocząć znakowanie radioaktywne komórek poprzez dodanie biokompatybilnie sformułowanego [89Zr]Zr-DBN do zawiesiny komórkowej przygotowanej w buforowanym HEPES zrównoważonym roztworze soli Hanksa. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-protocol-4
Rysunek 4: Schemat inkubacji komórek do znakowania radioaktywnego. Dokładnie wymieszaj biokompatybilnie opracowany [89Zr]Zr-DBN z zawiesiną komórkową i inkubuj zawiesinę komórkową w bloku grzewczym o kontrolowanej temperaturze na wytrząsarce przez 30-60 minut. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-protocol-5
Rysunek 5: Schemat wygaszania radioznakowania i mycia komórek. Ugasić znakowanie radioizotopowe komórek przez dodanie schłodzonej pożywki komórkowej lub H-HBSS, a następnie odwirować w temperaturze 4 °C. W celu przepłukania komórek wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórek w ~500 μl schłodzonej pożywki komórkowej lub H-HBSS. Powtórzyć cykl odrzucania supernatantu i ponownego zawieszania osadu komórkowego w świeżym podłożu w celu usunięcia niezwiązanego syntonu znakowanego radioaktywnie. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Reprezentatywne wyniki przedstawione w tym manuskrypcie zostały skompilowane z poprzednich [89Zr]Zr-DBN syntezy i badań radioznakowania komórek18,19,22,23,24,25. Krótko mówiąc, 89Zr można z powodzeniem skompleksować z DFO-Bn-NCS w ciągu ~30-60 min w temperaturze 25-37 °C przy użyciu 7,5-15 μg DFO-Bn-NCS ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Poniżej przedstawiono krytyczne kroki w protokole, które wymagają optymalizacji w celu skutecznego znakowania radiokomórkowego. W krokach protokołu 1.2 i 1.3, w zależności od zastosowanej objętości [89Zr]Zr(HPO4)2 lub [89Zr]ZrCl4, należy użyć odpowiedniej objętości (mikrolitrów) zasady; Do neutralizacji [89Zr]Zr(HPO4)2 należy użyć roztworu 1,0 M K2CO3 i roztworu 1,0 M Na2CO3 do neutralizacji...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają konkurencyjnego interesu finansowego, ale są wynalazcami tej technologii (Patent # US20210330823A1).

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez granty NIH 5R21HL127389-02, NIH 4T32HL007111-39, NIH R01HL134664 i DOE DE-SC0008947, Międzynarodowa Agencja Energii Atomowej, Wiedeń, Mayo Clinic Division of Nuclear Medicine, Department of Radiology, oraz Mayo Clinic Center for Regenerative Medicine, Rochester, MN. Wszystkie figury zostały stworzone przy użyciu BioRender.com.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
AcetonitrylThermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USAA996-4
Alpha Minimum Essential MediumThermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, StanyZjednoczone 12571063
Kolumna anionowymiennaMacherey-Nagel, Inc., Dü ren, Niemcy731876Chromafix 30-PS-HCO3  Wkład SPE 45 mg
Stożkowe probówki wirówkowe (15 ml)Corning Inc., Glendale, AZ, USA352096Falcon 15 ml stożkowe probówki wirówkowe z polipropylenu (PP) o wysokiej czystości
Komórki dendrytyczneKolekcja kultur typu amerykańskiego, Manassas, Wirginia, USACRL-11904
DFO-BN-NCSMacrocyclics, Inc., Plano, TX, USAB-705p-SCN-BN-Deferoxamine
DMSOSigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO276855
Kalibrator dawkiMirion Technologies (Capintec), Inc., Florham Park, NJ, USA5130-3234Kalibrator dawki CRC-55tR 
Dulbecco' s zmodyfikowany Orzeł" s średni The American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA30-2002
Płodowa surowica bydlęca (FBS)The American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA30-2020
Zbilansowany roztwór soli Hanksa (HBSS)Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA14025092H-HBSS
(klasa na bazie metali śladowych)Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USAA508P212
Komórki czerniakaAmerykańska kolekcja kultur typowych, Manassas, Wirginia, USACRL-6475
MetanolSigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO34860
Probówka do mikrowirówekEppendorf, Hamburg, Niemcy30108442Probówka do mikrowirówek białkowych LoBind
Mysz GM-CSFR& D Systems, Inc., Minneapolis, MN USA415-ML-010
Penicylina/StreptomycynaThermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA15140-122
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami bez Ca2+ i Mg2+Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA10010023Do mycia komórek
SalineCovidien LLC, Mansfield, MA, USA10200,9% sterylny roztwór soli fizjologicznej
 Eppendorf, Hamburg, NiemcyT1317Thermomixer
Żel krzemionkowy-rad-TLC arkusz papieru Agilent Technologies Inc., Santa Clara, Kalifornia, Stany ZjednoczoneSGI0001iTLC-SG
Do przygotowania kwasu solnego

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bhawnani, N., et al. Effectiveness of stem cell therapies in improving clinical outcomes in patients with heart failure. Cureus. 13 (8), e17236(2021).
  2. Zakrzewski, W., Dobrzynski, M., Szymonowicz, M., Rybak, Z. Stem cells: past, present, and future. Stem Cell Research & Therapy. 10 (1), 68(2019).
  3. Bukhari, A. B., Dutta, S., De, A. Image guidance in stem cell therapeutics: unfolding the blindfold. Current Drug Targets. 16 (6), 658-671 (2015).
  4. Momeni, A., Neelamegham, S., Parashurama, N. Current challenges for the targeted delivery and molecular imaging of stem cells in animal models. Bioengineered. 8 (4), 316-324 (2017).
  5. Gnecchi, M., Zhang, Z., Ni, A., Dzau, V. J. Paracrine mechanisms in adult stem cell signaling and therapy. Circulation Research. 103 (11), 1204-1219 (2008).
  6. D'Aloia, M. M., Zizzari, I. G., Sacchetti, B., Pierelli, L., Alimandi, M. CAR-T cells: the long and winding road to solid tumors. Cell Death & Disease. 9 (3), 282(2018).
  7. Zhang, Q., et al. CAR-T cell therapy in cancer: tribulations and road ahead. Journal of Immunology Research. 2020, 1924379(2020).
  8. Sterner, R. C., Sterner, R. M. CAR-T cell therapy: current limitations and potential strategies. Blood Cancer Journal. 11 (4), 69(2021).
  9. Shao, F., et al. Radionuclide-based molecular imaging allows CAR-T cellular visualization and therapeutic monitoring. Theranostics. 11 (14), 6800-6817 (2021).
  10. Sakemura, R., Can, I., Siegler, E. L., Kenderian, S. S. In vivo CART cell imaging: Paving the way for success in CART cell therapy. Molecular Therapy Oncolytics. 20, 625-633 (2021).
  11. Wang, Y., et al. Dendritic cell biology and its role in tumor immunotherapy. Journal of Hematology & Oncology. 13 (1), 107(2020).
  12. Bulte, J. W. M., Shakeri-Zadeh, A. In vivo MRI tracking of tumor vaccination and antigen presentation by dendritic cells. Molecular Imaging and Biology. 24 (2), 198-207 (2022).
  13. Holland, J. P., Sheh, Y., Lewis, J. S. Standardized methods for the production of high specific-activity zirconium-89. Nuclear Medicine and Biology. 36 (7), 729-739 (2009).
  14. Larenkov, A., et al. Preparation of zirconium-89 solutions for radiopharmaceutical purposes: interrelation between formulation, radiochemical purity, stability and biodistribution. Molecules. 24 (8), 1534(2019).
  15. Pandey, M. K., et al. A new solid target design for the production of 89Zr and radiosynthesis of high molar activity [89Zr]Zr-DBN. American Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 12 (1), 15-24 (2022).
  16. Pandey, M. K., et al. Improved production and processing of 89Zr using a solution target. Nuclear Medicine and Biology. 43 (1), 97-100 (2016).
  17. Pandey, M. K., Engelbrecht, H. P., Byrne, J. P., Packard, A. B., DeGrado, T. R. Production of 89Zr via the 89Y(p,n)89Zr reaction in aqueous solution: effect of solution composition on in-target chemistry. Nuclear Medicine and Biology. 41 (4), 309-316 (2014).
  18. Bansal, A., et al. Novel 89Zr cell labeling approach for PET-based cell trafficking studies. EJNMMI Research. 5, 19(2015).
  19. Bansal, A., et al. 89Zr]Zr-DBN labeled cardiopoietic stem cells proficient for heart failure. Nuclear Medicine and Biology. 90-91, 23-30 (2020).
  20. Friberger, I., et al. Optimisation of the synthesis and cell labelling conditions for [89Zr]Zr-oxine and [89Zr]Zr-DFO-NCS: a direct in vitro comparison in cell types with distinct therapeutic applications. Molecular Imaging and Biology. 23 (6), 952-962 (2021).
  21. Lee, S. H., et al. Feasibility of real-time in vivo 89Zr-DFO-labeled CAR T-cell trafficking using PET imaging. PLoS One. 15 (1), e0223814(2020).
  22. Nicolas, C. T., et al. Hepatocyte spheroids as an alternative to single cells for transplantation after ex vivo gene therapy in mice and pig models. Surgery. 164 (3), 473-481 (2018).
  23. Yang, B., et al. Tracking and therapeutic value of human adipose tissue-derived mesenchymal stem cell transplantation in reducing venous neointimal hyperplasia associated with arteriovenous fistula. Radiology. 279 (2), 513-522 (2016).
  24. Nicolas, C. T., et al. Ex vivo cell therapy by ectopic hepatocyte transplantation treats the porcine tyrosinemia model of acute liver failure. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 18, 738-750 (2020).
  25. Bansal, A., Sharma, S., Klasen, B., Rosch, F., Pandey, M. K. Evaluation of different 89Zr-labeled synthons for direct labeling and tracking of white blood cells and stem cells in healthy athymic mice. Scientific Reports. 12 (1), 15646(2022).
  26. Behfar, A., et al. Guided cardiopoiesis enhances therapeutic benefit of bone marrow human mesenchymal stem cells in chronic myocardial infarction. Journal of the American College of Cardiology. 56 (9), 721-734 (2010).
  27. Charoenphun, P., et al. 89Zr]oxinate4 for long-term in vivo cell tracking by positron emission tomography. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 42 (2), 278-287 (2015).
  28. Sato, N., et al. In vivo tracking of adoptively transferred natural killer cells in rhesus macaques using 89zirconium-oxine cell labeling and PET imaging. Clinical Cancer Research. 26 (11), 2573-2581 (2020).
  29. Volpe, A., Pillarsetty, N. V. K., Lewis, J. S., Ponomarev, V. Applications of nuclear-based imaging in gene and cell therapy: probe considerations. Molecular Therapy Oncolytics. 20, 447-458 (2021).
  30. Fogli, L. K., et al. Challenges and next steps in the advancement of immunotherapy: summary of the 2018 and 2020 National Cancer Institute workshops on cell-based immunotherapy for solid tumors. Journal for Immunotherapy of Cancer. 9 (7), e003048(2021).
  31. Li, X., Hacker, M. Molecular imaging in stem cell-based therapies of cardiac diseases. Advanced Drug Delivery Reviews. 120, 71-88 (2017).
  32. Puges, M., et al. Retrospective study comparing WBC scan and 18F-FDG PET/CT in patients with suspected prosthetic vascular graft infection. European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. 57 (6), 876-884 (2019).
  33. Butterfield, L. H. Dendritic cells in cancer immunotherapy clinical trials: are we making progress. Frontiers in Immunology. 4, 454(2013).
  34. de Vries, I. J. M., et al. Magnetic resonance tracking of dendritic cells in melanoma patients for monitoring of cellular therapy. Nature Biotechnology. 23 (11), 1407-1413 (2005).
  35. Gosmann, D., et al. Promise and challenges of clinical non-invasive T-cell tracking in the era of cancer immunotherapy. EJNMMI Research. 12 (1), 5(2022).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

PET ImagingStem Cell TrackingCAR T CellsZirconium 89 LabelingCell PharmacokineticsRadiolabeled Cell ViabilityDFO Bn NCS Chelation

Powiązane artykuły