Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Obrazowanie transportu komórek za pomocą pozytonowej tomografii emisyjnej: metoda znakowania radioaktywnego komórek

2.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/64117

⸱

27 października 2023

 ,  , 
1Division of Nuclear Medicine, Department of Radiology, Mayo Clinic, 2Department of Radiology, University of Colorado Anschutz Medical Campus

W tym artykule

Podsumowanie

Przedstawiono tutaj protokół znakowania radioizotopowego komórek za pomocą radioizotopu pozytonowej tomografii emisyjnej (PET), 89Zr (t1/2 78.4 h), przy użyciu gotowego do użycia syntonu radioznakującego, [89Zr]Zr-p-isothiocyanatobenzyl-desferrioxamine ([89Zr]Zr-DBN). Znakowanie radioizotopowane komórek za pomocą [89Zr]Zr-DBN umożliwia nieinwazyjne śledzenie i obrazowanie podanych komórek znakowanych radioaktywnie w organizmie za pomocą PET przez okres do 7 dni po podaniu.

Streszczenie

Terapie komórkami T z wykorzystaniem komórek macierzystych i chimerycznych receptorów antygenowych (CAR) stają się obiecującymi terapiami dla regeneracji narządów i immunoterapii różnych nowotworów. Pomimo znacznego postępu w tych dziedzinach, wciąż pozostaje wiele do nauczenia się, aby lepiej zrozumieć farmakokinetykę i farmakodynamikę podawanych komórek terapeutycznych w żywym systemie. Do nieinwazyjnego śledzenia in vivo komórek za pomocą pozytonowej tomografii emisyjnej (PET) opracowano nową metodę radioznakowania komórek za pośrednictwem [89Zr]Zr-p-izotiocyanatobenzylo-desferrioksaminy ([89Zr]Zr-DBN) przy użyciu 89Zr (t1/2 78,4 h). Niniejszy protokół opisuje [89Zr]Zr-DBN, gotowy do użycia, znakowany radioaktywnie synton do bezpośredniego znakowania radioaktywnego różnych komórek, w tym mezenchymalnych komórek macierzystych, kardiopoetycznych komórek macierzystych kierowanych przez linię, hepatocytów regenerujących wątrobę, białych krwinek, komórek czerniaka i komórek dendrytycznych. Opracowana metodologia umożliwia nieinwazyjne obrazowanie PET transportu komórkowego przez okres do 7 dni po podaniu bez wpływu na charakter lub funkcję komórek znakowanych radioaktywnie. Dodatkowo, protokół ten opisuje krokową metodę radiosyntezy [89Zr]Zr-DBN, biokompatybilnego preparatu [89Zr]Zr-DBN, przygotowania komórek do znakowania radioaktywnego, a na końcu znakowania radioaktywnego komórek za pomocą [89Zr]Zr-DBN, w tym wszystkich skomplikowanych szczegółów potrzebnych do pomyślnego znakowania radioaktywnego komórek.

Wprowadzenie

Terapie komórkami T z wykorzystaniem komórek macierzystych i chimerycznego receptora antygenu (CAR) zyskują na popularności i są aktywnie badane pod kątem leczenia różnych chorób, takich jak niewydolność mięśnia sercowego1,2, zwyrodnienie siatkówki2, zwyrodnienie plamki żółtej2, cukrzyca2, zawał mięśnia sercowego3,4,5, oraz cancers6,7,8,9,10. Spośród dwóch prawdopodobnych podejść terapii komórkami macierzystymi, komórki macierzyste mogą być albo bezpośrednio wszczepione w miejsce choroby w celu wywołania odpowiedzi terapeutycznej, albo powodować zmiany w mikrośrodowisku miejsca chorobowego bez przylegania do miejsca chorobowego w celu zainicjowania pośredniej odpowiedzi terapeutycznej. Pośrednia odpowiedź terapeutyczna może spowodować zmiany w mikrośrodowisku miejsca choroby poprzez uwolnienie czynników, które naprawiłyby lub wyleczyły chorobę5. Te podejścia do terapii komórkami macierzystymi można ocenić za pomocą nieinwazyjnego obrazowania komórek macierzystych znakowanych radioaktywnie. Nieinwazyjne obrazowanie może skorelować wychwyt komórek znakowanych radioaktywnie w miejscu choroby z odpowiedzią terapeutyczną w celu rozszyfrowania bezpośredniej i pośredniej odpowiedzi terapeutycznej.

Dodatkowo, opracowywane są terapie oparte na komórkach odpornościowych do leczenia różnych nowotworów za pomocą CAR T-cell6,7,8,9,10i immunoterapii komórek dendrytycznych11,12. Mechanistycznie, w immunoterapii limfocytami T CAR class=6,7,8,9,10, limfocyty T są zaprojektowane tak, aby wyrażać epitop, który wiąże się z określonym antygenem na guzach, które muszą być leczone. Te zmodyfikowane limfocyty T CAR, po podaniu, wiążą się ze specyficznym antygenem obecnym na komórkach nowotworowych poprzez interakcję epitop-antygen. Po związaniu związane limfocyty T CAR ulegają aktywacji, a następnie proliferują i uwalniają cytokiny, co sygnalizuje układowi odpornościowemu gospodarza atak na guz wykazujący ekspresję specyficznego antygenu. Natomiast w przypadku terapii komórkami dendrytycznymi11,12, komórki dendrytyczne są zaprojektowane tak, aby prezentowały na swojej powierzchni określony antygen nowotworowy. Te zmodyfikowane komórki dendrytyczne, po podaniu, są domem dla węzłów chłonnych i wiążą się z komórkami T w węzłach chłonnych. Limfocyty T, po związaniu się ze specyficznymi antygenami nowotworowymi na podanych komórkach dendrytycznych, ulegają aktywacji/proliferacji i inicjują odpowiedź immunologiczną gospodarza przeciwko nowotworowi wyrażającemu ten specyficzny antygen. W związku z tym ocena transportu podanych limfocytów T CAR do miejsca nowotworu9,10 i naprowadzanie komórek dendrytycznych do węzłów chłonnych11,12 jest możliwe poprzez obrazowanie znakowanych radioaktywnie komórek T CAR i komórek dendrytycznych w celu określenia skuteczności immunoterapii. Co więcej, nieinwazyjny transport komórkowy może pomóc w lepszym zrozumieniu potencjału terapeutycznego, wyjaśnieniu bezpośredniej i pośredniej odpowiedzi terapeutycznej oraz przewidywaniu i monitorowaniu odpowiedzi terapeutycznej zarówno na terapie oparte na komórkach macierzystych, jak i komórkach odpornościowych.

Zbadano różne metody obrazowania dla transportu komórkowego3,4,9,10,12, w tym obrazowanie optyczne, rezonans magnetyczny (MRI), tomografia emisyjna pojedynczych fotonów (SPECT) i pozytonowa tomografia emisyjna (PET). Każda z tych technik ma swoje zalety i wady. Wśród nich PET jest najbardziej obiecującą metodą ze względu na jej ilościowy charakter i wysoką czułość, które są niezbędne do wiarygodnej kwantyfikacji komórek w transporcie komórkowym opartym na obrazowaniu3,4,9,10.

Radioizotop emitujący pozytony 89Zr, o okresie połowicznego rozpadu 78,4 h, nadaje się do znakowania komórek. Umożliwia obrazowanie PET transportu komórkowego przez ponad 1 tydzień i jest łatwo wytwarzany przez powszechnie dostępne, niskoenergetyczne cyklotrony medyczne13,14,15,16,17. Dodatkowo, odpowiednio funkcjonalizowany chelator p-izotiocyanatobenzylo-desferrioksaminy (DFO-Bn-NCS) jest dostępny na rynku do syntezy znakowanego 89Zr, gotowego do użycia syntonu znakującego komórki, [89Zr]Zr-p-isothiocyanatobenzyl-desferrioxamine, znanego również jako [89Zr]Zr-DBN18,19,20,21,22,23,24,25. Zasada znakowania komórek za pośrednictwem [89Zr]Zr-DBN opiera się na reakcji między pierwszorzędowymi aminami białek błony komórkowej a ugrupowaniem izotiocyjanianu (NCS) [89Zr]Zr-DBN w celu wytworzenia stabilnego kowalencyjnego wiązania tiomocznikowego.

[89Zr]Opublikowano znakowanie i obrazowanie komórek oparte na Zr-DBN w celu śledzenia różnych komórek, w tym komórek macierzystych18,23,25, komórki dendrytyczne18, kardiopoietyczne komórki macierzyste19, dziesiętne komórki zrębowe20, makrofagi pochodzące ze szpiku kostnego20, komórki jednojądrzaste krwi obwodowej20, Jurkat/CAR T-cells21, hepatocyty22,24, oraz białe krwinki25. Poniższy protokół przedstawia krok po kroku metody przygotowania i znakowania radioaktywnego komórek za pomocą [89Zr]Zr-DBN i opisuje zmiany, które mogą być wymagane w protokole znakowania radioaktywnego dla określonego typu komórki. Dla większej jasności przedstawiona tutaj metoda znakowania radioaktywnego komórek jest podzielona na cztery sekcje. Pierwsza sekcja dotyczy otrzymywania [89Zr]Zr-DBN poprzez chelatację 89Zr przez DFO-Bn-NCS. W drugiej sekcji opisano przygotowanie biokompatybilnego preparatu [89Zr]Zr-DBN, który może być łatwo stosowany do znakowania radioizotopowego komórek. W trzeciej sekcji omówiono etapy niezbędne do wstępnego kondycjonowania komórek do znakowania radioizotopem. Wstępne kondycjonowanie komórek polega na myciu komórek solą fizjologiczną buforowaną fosforanami bez białek (PBS) i buforowanym przez HEPES zrównoważonym roztworem soli Hanksa (H-HBSS) w celu usunięcia białek zewnętrznych, które mogą zakłócać lub konkurować z reakcją [89Zr]Zr-DBN z aminami pierwszorzędowymi obecnymi na białkach powierzchni komórki podczas znakowania radioaktywnego. Ostatnia sekcja zawiera kroki związane z faktycznym znakowaniem radioizotopowym komórek i analizą kontroli jakości.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Komórki dendrytyczne i komórki czerniaka pozyskano komercyjnie18. Hepatocyty wyizolowano z wątrób świń po laparoskopowej częściowej hepatektomii22,24. Komórki macierzyste wyizolowano z aspiratów szpiku kostnego18,19,26. Komórki macierzyste pochodzące z tkanki tłuszczowej otrzymano z Human Cellular Therapy Laboratory, Mayo Clinic Rochester23. Ludzkie białe krwinki wyizolowano z pobranej krwi otrzymanej z Division of Transfusion Medicine, Mayo Clinic Rochester25. Różne rodzaje komórek wykorzystanych do znakowania radioizotopowego pozyskano i użyto zgodnie z wytycznymi rekomendowanymi przez Institutional Animal Care and Use Committee, Mayo Clinic Stem Cell Research Oversight Subcommittee, Division of Transfusion Medicine Research Committee, Institutional Biosafety Committee oraz Radiation Safety Committee.

1. Przygotowanie [ 89Zr ]Zr-p-izotiocyjanobenzylo-desferioksaminy ([ 89Zr ]Zr-DBN)

Czas trwania: ~160-220 min
UWAGA: W celu przygotowania [89Zr]Zr-DBN należy wyizolować 89Zr w formie [89Zr]Zr-wodorofosforanu ([89Zr]Zr(HPO4)2) lub [89Zr]Zr-chlorku ([89Zr]ZrCl4), zgodnie z opisem w kroku 1.1.

  1. Wyizolować 89Zr z nuklidu macierzystego 89Y, stosując uznaną metodę oczyszczania opartą na żywicy hydroksamianowej13,17. W skrócie: najpierw przygotować kolumnę z ~100 mg żywicy hydroksamianowej, następnie aktywować żywicę hydroksamianową, przemywając kolumnę 8,0 mL czystego bezwodnego acetonitrylu, a następnie przepłukując ją 5,0-6,0 mL powietrza. Następnie przemyć kolumnę 15 mL wody dejonizowanej, po czym ponownie przepłukać 5,0-6,0 mL powietrza, a następnie przepuścić 2,0 mL 0,50 N HCl (klasy trace metal basis), po czym ponownie przepłukać 5,0-6,0 mL powietrza. Następnie powoli nanieść na żywicę hydroksamianową roztwór zawierający zarówno 89Zr, jak i 89Y, i wypłukać nieprzypisany 89Y z żywicy hydroksamianowej za pomocą 20 mL 2,0 N HCl, a następnie 10 mL wody dejonizowanej i przepłukać 5,0-6,0 mL powietrza.
    UWAGA: Po przepłukaniu powietrzem można przeprowadzić elucję 89Zr zgodnie z poniższym opisem.
    1. Aby eluować 89Zr w formie [89Zr]Zr(HPO4)2, najpierw dodać 0,50 mL buforu 1,2 M K2HPO4/KH2PO4 (pH 3,5) do kolumny z etapu 1.1 i pozostawić na kolumnie na 30 min, aby ułatwić uwalnianie 89Zr z żywicy jako [89Zr]Zr(HPO4)2. Następnie eluować 89Zr z kolumny dodatkowymi 1,50 mL buforu 1,2 M K2HPO4/KH2PO4 (pH 3,5). Po elucji [89Zr]Zr(HPO4)2 postępować zgodnie z etapami 1.2, 1.2.1 i 1.2.2 w celu przygotowania [89Zr]Zr-DBN przy użyciu [89Zr]Zr(HPO4)2, jak pokazano na Rysunku 1.
    2. Aby otrzymać 89Zr jako [89Zr]ZrCl4, najpierw eluować 89Zr jako [89Zr]Zr-szczawian.
      1. Aby eluować 89Zr w formie [89Zr]Zr-szczawianu, dodać 0,50 mL 1,0 M kwasu szczawiowego do kolumny z etapu 1.1 i pozostawić na kolumnie na 1 min, aby ułatwić uwalnianie 89Zr z żywicy jako [89Zr]-szczawian. Następnie eluować 89Zr z kolumny dodatkowymi 2,50 mL 1,0 M kwasu szczawiowego (łącznie 3,0 mL)17.
      2. Aby przekształcić [89Zr]Zr-szczawian w [89Zr]ZrCl4 przy użyciu kolumny wymiany anionowej, zgodnie z opisem Larenkova i wsp.14, najpierw aktywować kolumnę poprzez przemycie 6,0 mL acetonitrylu, a następnie przepłukać 5,0-6,0 mL powietrza. Następnie przemyć kolumnę 10,0 mL soli fizjologicznej, a potem ponownie przepłukać 5,0-6,0 mL powietrza. Na koniec przepuścić 10,0 mL wody dejonizowanej, a następnie przepłukać 5,0-6,0 mL powietrza.
      3. Powoli nanieść 3,0 mL roztworu zawierającego [89Zr]Zr-szczawian na aktywowaną kolumnę wymiany anionowej, a następnie przepłukać 5,0-6,0 mL powietrza. Następnie przemyć załadowaną 89Zr kolumnę 50,0 mL wody dejonizowanej, aby usunąć nieprzypisane jony szczawianowe, a następnie przepłukać 5,0-6,0 mL powietrza.
      4. Aby eluować 89Zr w formie [89Zr]ZrCl4, dodać do kolumny 0,10 mL 1,0 N HCl, pozostawić na kolumnie na 1,0 min, aby ułatwić uwalnianie 89Zr z żywicy jako [89Zr]ZrCl4, i eluować 89Zr z kolumny dodatkowymi 0,40 mL 1,0 N HCl (łącznie 0,5 mL). Osuszyć eluoany [89Zr]ZrCl4 w probówce w kształcie litery V, umieszczając ją w bloku grzejnym w temperaturze 65 °C pod stałym przepływem azotu przez 10-30 min. Po odparowaniu do sucha zrekonstytuować osuszony [89Zr]ZrCl4 w wodzie i postępować zgodnie z etapami 1.3 i 1.3.1 w celu przygotowania [89Zr]Zr-DBN przy użyciu [89Zr]ZrCl4, jak pokazano na Rysunku 1.
  2. Pobrać ~120 µL [89Zr]Zr(HPO4)2 w 1,2 M K2HPO4/KH2PO4 (pH 3,5) (10-25 MBq) z etapu 1.1.1 i zneutralizować roztwór do pH 7,5-8,0 przy użyciu ~100 µL 1,0 M HEPES-KOH (pH 7,5) oraz ~65 µL 1,0 M K2CO3.
    1. Aby uzyskać odpowiednią ilość DFO-Bn-NCS do etapów 1.2.2 lub 1.3.1 dla różnych formulacji 89Zr o zmiennej pozornej aktywności swoistej 89Zr, przeprowadzić serię reakcji chelatowania, używając stałej objętości zneutralizowanej formulacji [89Zr]Zr(HPO4)2 lub [89Zr]ZrCl4 z zakresem ilości DFO-Bn-NCS (7,5-15 µg). W przypadku [89Zr]Zr(HPO4)2 inkubować reakcję chelatowania w temperaturze 37 °C w wytrząsarce przy ~550 rpm przez 60 min. Natomiast w przypadku [89Zr]ZrCl4 inkubować reakcję chelatowania w temperaturze 25 °C w wytrząsarce przy ~550 rpm przez 30 min. Odrzucić reakcje chelatowania, w których podczas lub po zakończeniu inkubacji pojawił się osad. Po zakończeniu inkubacji przeprowadzić radiochromatografię cienkowarstwową (rad-TLC) z użyciem 100 mM pięciooctanu dietylenotriaminy (DTPA), pH 7,0, jako fazy ruchomej, aby oszacować wydajność chelatowania DFO-Bn-NCS dla każdej reakcji, jak omówiono poniżej w etapie 1.5.
      UWAGA: W oparciu o wydajność chelatowania należy w etapach 1.2.2 lub 1.3.1 użyć minimalnej ilości DFO-Bn-NCS niezbędnej do osiągnięcia wydajności chelatowania ≥97% bez powodowania wytrącania DFO-Bn-NCS w zneutralizowanej formulacji [89Zr]Zr(HPO4)2 lub [89Zr]ZrCl4. W niniejszej pracy [89Zr]Zr-DBN został zsyntetyzowany z czystością radiochemiczną ≥97%.
    2. Przygotować świeży roztwór 5,0 mM DFO-Bn-NCS w bezwodnym DMSO (3,76 mg/mL) i dodać 4,0 µL 5,0 mM DFO-Bn-NCS (20 nmol lub 15 µg) do ~285 µL zneutralizowanego [89Zr]Zr(HPO4)2 (10-25 MBq) z etapu 1.2 i wymieszać roztwór poprzez pipetowanie. Końcowe stężenie DMSO w mieszaninie do chelatowania powinno być niższe niż 2% całkowitej objętości.
  3. Pobrać ~180 µL [89Zr]ZrCl4 w 0,1 N HCl (40-80 MBq) z etapu 1.1.2.4 i zneutralizować otrzymany roztwór do pH 7,5-8,0 przy użyciu ~25 µL 1,0 M Na2CO3.
    1. Przygotować świeży roztwór 2,5 mM DFO-Bn-NCS w bezwodnym dimetylosulfoksydzie (DMSO) (1,88 mg/mL) i dodać 4,0 µL 2,5 mM DFO-Bn-NCS (10 nmol lub 7,5 µg) do ~205 µL zneutralizowanego [89Zr]ZrCl4 (40-80 MBq) z etapu 1.3. Wymieszać roztwór poprzez pipetowanie. Końcowe stężenie DMSO w mieszaninie do chelatowania powinno być niższe niż 2% całkowitej objętości.
  4. Przeprowadzić chelatowanie 89Zr w temperaturze 37 °C w wytrząsarce przy ~550 rpm przez 60 min w przypadku [89Zr]Zr(HPO4)2 lub w temperaturze 25 °C w wytrząsarce przy ~550 rpm przez 30 min w przypadku [89Zr]ZrCl4.
  5. Określić wydajność chelatowania 89Zr za pomocą rad-TLC z 100 mM DTPA (pH 7,0) jako rozpuszczalnika ruchomego rad-TLC. Należy spodziewać się, że [89Zr]Zr-DBN wykaże Rf ~0,021-0,035, [89Zr]ZrCl4 wykaże Rf ~1,0, a [89Zr]Zr(HPO4)2 wykaże Rf ~1,0. Obliczyć wydajność chelatowania (%) korzystając z równania (1):
    Procent 89Zr schelatowanego przez DFO-NCS w celu utworzenia [89Zr]Zr-DBN = [ (Radioaktywność przy Rf dla [89Zr]Zr-DBN) / (Suma radioaktywności przy Rf dla [89Zr]Zr-DBN oraz przy Rf dla [89Zr]Zr(HPO4)2 lub [89Zr]ZrCl4) ] × 100 (1)
    UWAGA: Akceptowalna wydajność chelatowania 89Zr pozwalająca na przejście do radioznakowania komórek, określona za pomocą rad-TLC, wynosi ≥97%. Sugerowana czystość radiochemiczna [89Zr]Zr-DBN na poziomie ≥97% została ustalona zgodnie ze standardowymi wymaganiami dotyczącymi czystości radiochemicznej dla innych radiofarmaceutyków stosowanych w tej dziedzinie. Reprezentatywne wyniki rad-TLC przedstawiono na Rysunku Uzupełniającym S1 oraz Rysunku Uzupełniającym S2.

Schemat przygotowania [89Zr]Zr-DBN; izolacja izotopu, neutralizacja, chelatacja z analizą rad-TLC.
Rysunek 1: Schemat przygotowania [89Zr]Zr-DBN. W celu przygotowania [89Zr]Zr-DBN należy zneutralizować sformułowany wcześniej [89Zr]Zr(HPO4)2 lub [89Zr]ZrCl4 do pH 7,5-8,0. Zneutralizowany roztwór inkubuje się z DFO-Bn-NCS. Efektywność chelatacji 89Zr do DFO-Bn-NCS należy sprawdzić za pomocą rad-TLC. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

2. Biokompatybilna formulacja [  89Zr ]Zr-DBN do radiomarkowania komórek (Rycina 2)

Czas trwania: ~35 min
UWAGA: Biorąc pod uwagę czas potrzebny na przygotowanie komórek w kroku 3, należy rozpocząć krok 3 około 20 min przed rozpoczęciem kroku 2, aby zapewnić ~30 min inkubacji. Pozwala to na rozpoczęcie radioznakowania komórek w kroku 4 w ciągu ~5-10 min po zakończeniu kroków 2-3.2.2.

  1. W przypadku formulacji [89Zr]Zr-DBN otrzymanej z [89Zr]ZrCl4, dodać 50,0 µL mieszaniny kompatybilnej z komórkami, składającej się z ~27,0 µL 1,2 M K2HPO4/KH2PO4 (pH 3,5) + ~23,0 µL buforu 1,0 M HEPES-KOH (pH 7,5), do 50,0 µL [89Zr]Zr-DBN. Inkubować mieszaninę [89Zr]Zr-DBN kompatybilną z komórkami przez ~30 min w temperaturze pokojowej (25 °C).
    UWAGA: Formulacja [89Zr]Zr-DBN otrzymana z [89Zr]Zr(HPO4)2 jest biokompatybilna w procesie radioznakowania komórek i nie wymaga wykonania kroku 2.

Proces przygotowania biokompatybilnej formulacji [89Zr]Zr-DBN do znakowania komórek; schemat z odczynnikami.
Rycina 2: Przygotowanie biokompatybilnej formulacji [89Zr]Zr-DBN do znakowania komórek. W celu przygotowania gotowej do użycia biokompatybilnej formulacji syntonu do znakowania radiologicznego, należy dodać taką samą objętość mieszaniny kompatybilnej z komórkami, składającej się z 1,2 M K2HPO4/KH2PO4 (pH 3,5) + 1,0 M HEPES-KOH, do takiej samej objętości [89Zr]Zr-DBN. Inkubować w temperaturze 25 °C przez ok. 30 min. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

3. Przygotowanie komórek do znakowania radioaktywnego

Czas trwania: ~40-50 min

  1. Poddać trypsynizacji ~12 × 106 komórek adherentnych (komórki macierzyste, komórki raka czerniaka, kardiopoetyczne komórki macierzyste, komórki dendrytyczne lub hepatocyty) i odwirować komórki w stożkowej probówce wirówkowej o pojemności 15,0 mL przy ~96 × g przez 10 min w temperaturze 4 °C.
    1. Odlać nadsącz, resuspender osad komórkowy w ~500 µL PBS i przenieść zawiesinę komórkową do probówki do mikrowirowania o pojemności 1,5 mL. Odwirować komórki w mikrowirowarce przy ~96 × g przez 10 min w temperaturze 4 °C.
    2. Odlać nadsącz i resuspender osad komórkowy w ~500 µL H-HBSS. Odwirować komórki w mikrowirowarce o pojemności 1,5 mL przy ~96 × g przez 10 min w temperaturze 4 °C. Powtórzyć krok 3.1.2 jeszcze raz i przejść do kroku 4.1.1.
      UWAGA: H-HBSS to zrównoważony roztwór soli Hanksa z 0,01 M HEPES (pH 8,0).
  2. W przypadku komórek nieadherentnych, takich jak ludzkie leukocyty (świeżo wyizolowane z krwi ludzkiej leukocyty), pominąć trypsynizację i odwirować zawiesinę zawierającą ~12 × 106 komórek w mikrowirowarce o pojemności 1,5 mL przy ~96 × g przez 10 min w temperaturze 4 °C.
    1. Odlać nadsącz, resuspender osad komórkowy w ~500 µL PBS i odwirować komórki w mikrowirowarce o pojemności 1,5 mL przy ~96 × g przez 10 min w temperaturze 4 °C.
    2. Odlać nadsącz i resuspender osad komórkowy w ~500 µL H-HBSS. Odwirować komórki w mikrowirowarce o pojemności 1,5 mL przy ~96 × g przez 10 min w temperaturze 4 °C. Powtórzyć krok 3.2.2 jeszcze raz i przejść do kroku 4.1.1.

4. Radiomarkowanie komórek

Czas trwania: ~125-155 min

  1. Inicjowanie znakowania radiacyjnego komórek (Rysunek 3)
    1. Wykorzystując zawiesinę komórkową z kroku 3.1.2 lub 3.2.2, przygotować w probówce do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mL zawiesinę komórkową o objętości ~500 µL zawierającą około ~6 × 106 komórek w ~500 µL H-HBSS o pH 7,5-8,0.
    2. Do zawiesiny dodać ~100 µL sformułowanego w sposób biokompatybilny [89Zr]Zr-DBN z kroku 2.
  2. Inkubacja komórek w celu znakowania radiacyjnego (Rysunek 4)
    1. Wymieszać sformułowany w sposób biokompatybilny [89Zr]Zr-DBN z zawiesiną komórkową, delikatnie pipetując ciecz w górę i w dół mikropipetą ustawioną na ~500 µL. Zmierzyć aktywność promieniotwórczą w probówce z inkubatem za pomocą kalibratora dawek ustawionego na wartość 489 dla izotopu 89Zr16.
    2. Mieszaninę komórek i [89Zr]Zr-DBN inkubować w wytrząsarce przy ~550 rpm w temperaturze 25-37 °C przez 30-45 min w celu znakowania komórek.
      UWAGA: Temperatura inkubacji będzie różnić się w zależności od typów komórek stosowanych do znakowania radiacyjnego, zgodnie z Tabelą 1.
    3. Po inkubacji w kroku 4.2.2 przeprowadzić analizę rad-TLC reakcji znakowania radiacyjnego komórek, używając świeżo przygotowanego rozpuszczalnika rad-TLC (20 mM cytrynian sodu [pH 4,9-5,1]:metanol [1:1, V:V]). Po wykonaniu rad-TLC zlokalizować [89Zr]Zr-DBN i [89Zr]ZrCl4 w okolicach Rf = ~0,73-0,81 oraz Rf = ~0,01-0,02 dla komórek znakowanych radiacyjnie. Obliczyć procent aktywności promieniotwórczej przy Rf = ~0,01-0,02, korzystając z równania (2).
      Procent aktywności promieniotwórczej przy Rf = ~0,01-0,02 = [ (Aktywność przy Rf = ~0,01 - 0,02) / (Suma aktywności przy Rf = ~0,01 - 0,02 oraz Rf = ~0,73 - 0,81) ] × 100 (2)
      UWAGA: W celu zrozumienia pików widocznych przy Rf = ~0,01-0,02 i Rf = ~0,73-0,81 należy zapoznać się z rad-TLC dla reakcji znakowania radiacyjnego leukocytów na Rysunku Uzupełniającym S3.
    4. W oddzielnej probówce do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mL wymieszać ~100 µL sformułowanego w sposób biokompatybilny [89Zr]Zr-DBN z ~500 µL H-HBSS o pH 7,5-8,0, aby służyło to jako kontrola bezkomórkowa do korekcji tła w kroku 4.2.5. Po inkubacji w temperaturze i czasie zbliżonym do tych zastosowanych w kroku 4.2.2 przeprowadzić analizę rad-TLC. Po wykonaniu rad-TLC zlokalizować [89Zr]Zr-DBN i [89Zr]ZrCl4 w okolicach Rf = ~0,73-0,81. Obliczyć procent aktywności promieniotwórczej przy Rf = ~0,01-0,02, korzystając z równania (3).
      Aktywność promieniotwórcza przy Rf = ~0,01-0,02 = [ (Aktywność przy Rf = ~0,01 - 0,02) / (Suma aktywności przy Rf = ~0,01 - 0,02 oraz Rf = ~0,73 - 0,81) ] × 100 (3)
      UWAGA: W celu zrozumienia pików widocznych przy Rf = ~0,01-0,02 i ~0,73-0,81 należy zapoznać się z rad-TLC reakcji kontrolnej bezkomórkowej na Rysunku Uzupełniającym S4.
    5. Obliczyć efektywne znakowanie radiacyjne komórek (%), odejmując procent aktywności promieniotwórczej przy Rf = ~0,01-0,02 (z rad-TLC z kroku 4.2.4) od procentu aktywności promieniotwórczej przy Rf = ~0,01-0,02 (z rad-TLC z kroku 4.2.3).
  3. Zatrzymanie znakowania radiacyjnego i płukanie komórek (Rysunek 5)
    1. Po potwierdzeniu zakończenia znakowania radiacyjnego za pomocą rad-TLC w kroku 4.2.5, zatrzymać reakcję znakowania radiacyjnego poprzez dodanie ~600 µL schłodzonego, odpowiedniego dla danego typu komórek pożywki kompletnej lub poprzez dodanie H-HBSS, zgodnie z Tabelą 1.
    2. Odwirować komórki w mikrocentryfudze przy ~96 × g przez 10 min w temperaturze 4 °C. Odpić nadosad.
    3. Delikatnie resuspender osad komórkowy w ~500 µL schłodzonej pożywki (pożywka DMEM + 10% płodowej surowicy bydlęcej + 5% penicyliny/streptomycyny lub pożywka RPMI-1640 + 10% płodowej surowicy bydlęcej + 5% penicyliny/streptomycyny lub H-HBSS dla konkretnego typu komórek, zgodnie z Tabelą 1). Resuspensję osadu komórkowego przeprowadzić, delikatnie pipetując ciecz w górę i w dół mikropipetą ustawioną na ~500 µL.
    4. Odwirować komórki w mikrocentryfudze przy ~96 × g przez 10 min w temperaturze 4 °C.
    5. Powtórzyć kroki 4.3.2-4.3.4 dwukrotnie, aby wypłukać niezwiązaną aktywność promieniotwórczą.
    6. Przenieść osad do nowej probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mL z DMEM + 10% płodową surowicą bydlęcą + 5% penicyliną/streptomycyną w przypadku komórek macierzystych lub z H-HBSS i zmierzyć aktywność promieniotwórczą w osadzie komórkowym za pomocą kalibratora dawek ustawionego na wartość 489 dla izotopu 89Zr16.
    7. Obliczyć końcową wydajność znakowania radiacyjnego po wszystkich etapach płukania, korzystając z równania (4).
      Wydajność znakowania radiacyjnego = [(Aktywność w osadzie komórkowym w kroku 4.3.6 skorygowana o rozpad) / (Aktywność w osadzie komórkowym i H-HBSS w kroku 4.2.1 skorygowana o rozpad) ] × 100 (4)
    8. Aby zapewnić jakość komórek znakowanych radiacyjnie, najpierw przeprowadzić inspekcję wizualną końcowej zawiesiny komórek znakowanych pod kątem obecności grudek. Jeśli grudki nie występują, przejść do następnego kroku z tą zawiesiną. Jeśli grudki są obecne, ale można je resuspender poprzez pipetowanie lub delikatne wytrząsanie, należy to zrobić i przejść do następnego kroku, ponieważ taka próbka przechodzi inspekcję wizualną. Jednakże, jeśli grudki nie ulegają resuspensji ani przez pipetowanie, ani przez delikatne wytrząsanie, należy odrzucić zawiesinę i rozpocząć procedurę od nowa.
    9. Jeśli inspekcja wizualna przebiegła pomyślnie, przeprowadzić test żywotności metodą wykluczania błękitu trypanu, używając 0,4% roztworu błękitu trypanu przygotowanego w PBS w ciągu 1 h od znakowania radiacyjnego i etapów płukania (4.3.3-4.3.7), aby ocenić żywotność komórek znakowanych radiacyjnie.
      1. W celu wykonania testu dodać 10,0 µL 0,4% roztworu błękitu trypanu do 10,0 µL zawiesiny komórek znakowanych oraz nieznakowanych i wymieszać je, pipetując zawiesinę komórkową z błękitem trypanu w górę i w dół mikropipetą ustawioną na 10,0 µL.
      2. Nanieść ~10,0 µL mieszaniny zawiesiny komórkowej z błękitem trypanu na hemocytometr, natychmiast odliczyć liczbę komórek zabarwionych na niebiesko oraz całkowitą liczbę komórek w hemocytometrze pod mikroskopem przy małym powiększeniu lub za pomocą automatycznego licznika komórek. Obliczyć procent żywych komórek, korzystając z równania (5).
        Procent żywych komórek = 100 - [(Liczba komórek zabarwionych na niebiesko) / (Całkowita liczba komórek)] × 100 (5)
    10. Użyć komórek znakowanych radiacyjnie, jeśli nie występuje zmiana procentu żywych komórek w zawiesinie komórek znakowanych w porównaniu do ich nieznakowanego odpowiednika. Odrzucić komórki znakowane radiacyjnie, jeśli procent żywych komórek jest niższy niż w przypadku odpowiednika nieznakowanego.

Schemat radiomarkowania komórek: znakowanie komórek za pomocą [89Zr]Zr-DBN, proces formulacji biokompatybilnej.
Rysunek 3: Schemat rozpoczęcia radiomarkowania komórek. Rozpoczęcie radiomarkowania komórek poprzez dodanie biokompatybilnie sformułowanego [89Zr]Zr-DBN do zawiesiny komórek przygotowanej w zbuforowanym HEPES roztworze soli Hanksa. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Schemat procesu znakowania radioizotopowego; inkubacja komórek z [89Zr]Zr-DBN, inkubacja i analiza rad-TLC.
Rysunek 4: Schemat inkubacji komórek w celu znakowania radioizotopowego. Dokładnie wymieszaj biokompatybilnie sformułowany [89Zr]Zr-DBN z zawiesiną komórkową i inkubuj zawiesinę komórkową w bloku grzewczym z kontrolą temperatury na wytrząsarce przez 30-60 min. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Schemat procesu znakowania radioizotopowego; etapy wirowania, pomiaru radioaktywności i zawieszenia osadu.
Rysunek 5: Schemat przerywania znakowania radioizotopowego i płukania komórek. Proces znakowania radioizotopowego komórek należy przerwać poprzez dodanie schłodzonego medium komórkowego lub H-HBSS, a następnie przeprowadzić wirowanie w temperaturze 4 °C. W celu płukania komórek należy odlać nadsącz i zawiesić osad komórkowy w ~500 µL schłodzonego medium komórkowego lub H-HBSS. Cykl odlewania nadsączu i ponownego zawieszania osadu komórkowego w świeżym medium należy powtórzyć, aby usunąć niezwiązany synton znakujący. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Reprezentatywne wyniki przedstawione w niniejszym manuskrypcie zostały zestawione z wcześniejszych badań nad syntezą [89Zr]Zr-DBN oraz radioznakowaniem komórek18,19,22,23,24,25. W skrócie, 89Zr może zostać z powodzeniem kompleksowany z DFO-Bn-NCS w czasie ~30-60 min w temperaturze 25-37 °C przy użyciu 7,...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Poniżej przedstawiono krytyczne kroki w protokole, które wymagają optymalizacji w celu skutecznego znakowania radiokomórkowego. W krokach protokołu 1.2 i 1.3, w zależności od zastosowanej objętości [89Zr]Zr(HPO4)2 lub [89Zr]ZrCl4, należy użyć odpowiedniej objętości (mikrolitrów) zasady; Do neutralizacji [89Zr]Zr(HPO4)2 należy użyć roztworu 1,0 M K2CO3 i roztworu 1,0 M Na2CO3 do neutralizacji...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają konkurencyjnego interesu finansowego, ale są wynalazcami tej technologii (Patent # US20210330823A1).

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez granty NIH 5R21HL127389-02, NIH 4T32HL007111-39, NIH R01HL134664 i DOE DE-SC0008947, Międzynarodowa Agencja Energii Atomowej, Wiedeń, Mayo Clinic Division of Nuclear Medicine, Department of Radiology, oraz Mayo Clinic Center for Regenerative Medicine, Rochester, MN. Wszystkie figury zostały stworzone przy użyciu BioRender.com.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
AcetonitrylThermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USAA996-4
Alpha Minimum Essential MediumThermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, StanyZjednoczone 12571063
Kolumna anionowymiennaMacherey-Nagel, Inc., Dü ren, Niemcy731876Chromafix 30-PS-HCO3  Wkład SPE 45 mg
Stożkowe probówki wirówkowe (15 ml)Corning Inc., Glendale, AZ, USA352096Falcon 15 ml stożkowe probówki wirówkowe z polipropylenu (PP) o wysokiej czystości
Komórki dendrytyczneKolekcja kultur typu amerykańskiego, Manassas, Wirginia, USACRL-11904
DFO-BN-NCSMacrocyclics, Inc., Plano, TX, USAB-705p-SCN-BN-Deferoxamine
DMSOSigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO276855
Kalibrator dawkiMirion Technologies (Capintec), Inc., Florham Park, NJ, USA5130-3234Kalibrator dawki CRC-55tR 
Dulbecco' s zmodyfikowany Orzeł" s średni The American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA30-2002
Płodowa surowica bydlęca (FBS)The American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA30-2020
Zbilansowany roztwór soli Hanksa (HBSS)Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA14025092H-HBSS
(klasa na bazie metali śladowych)Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USAA508P212
Komórki czerniakaAmerykańska kolekcja kultur typowych, Manassas, Wirginia, USACRL-6475
MetanolSigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO34860
Probówka do mikrowirówekEppendorf, Hamburg, Niemcy30108442Probówka do mikrowirówek białkowych LoBind
Mysz GM-CSFR& D Systems, Inc., Minneapolis, MN USA415-ML-010
Penicylina/StreptomycynaThermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA15140-122
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami bez Ca2+ i Mg2+Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA10010023Do mycia komórek
SalineCovidien LLC, Mansfield, MA, USA10200,9% sterylny roztwór soli fizjologicznej
 Eppendorf, Hamburg, NiemcyT1317Thermomixer
Żel krzemionkowy-rad-TLC arkusz papieru Agilent Technologies Inc., Santa Clara, Kalifornia, Stany ZjednoczoneSGI0001iTLC-SG
Do przygotowania kwasu solnego

Bibliografia

  1. Bhawnani, N., et al. Effectiveness of stem cell therapies in improving clinical outcomes in patients with heart failure. Cureus. 13 (8), e17236(2021).
  2. Zakrzewski, W., Dobrzynski, M., Szymonowicz, M., Rybak, Z. Stem cells: past, present, and future. Stem Cell Research & Therapy. 10 (1), 68(2019).
  3. Bukhari, A. B., Dutta, S., De, A. Image guidance in stem cell therapeutics: unfolding the blindfold. Current Drug Targets. 16 (6), 658-671 (2015).
  4. Momeni, A., Neelamegham, S., Parashurama, N. Current challenges for the targeted delivery and molecular imaging of stem cells in animal models. Bioengineered. 8 (4), 316-324 (2017).
  5. Gnecchi, M., Zhang, Z., Ni, A., Dzau, V. J. Paracrine mechanisms in adult stem cell signaling and therapy. Circulation Research. 103 (11), 1204-1219 (2008).
  6. D'Aloia, M. M., Zizzari, I. G., Sacchetti, B., Pierelli, L., Alimandi, M. CAR-T cells: the long and winding road to solid tumors. Cell Death & Disease. 9 (3), 282(2018).
  7. Zhang, Q., et al. CAR-T cell therapy in cancer: tribulations and road ahead. Journal of Immunology Research. 2020, 1924379(2020).
  8. Sterner, R. C., Sterner, R. M. CAR-T cell therapy: current limitations and potential strategies. Blood Cancer Journal. 11 (4), 69(2021).
  9. Shao, F., et al. Radionuclide-based molecular imaging allows CAR-T cellular visualization and therapeutic monitoring. Theranostics. 11 (14), 6800-6817 (2021).
  10. Sakemura, R., Can, I., Siegler, E. L., Kenderian, S. S. In vivo CART cell imaging: Paving the way for success in CART cell therapy. Molecular Therapy Oncolytics. 20, 625-633 (2021).
  11. Wang, Y., et al. Dendritic cell biology and its role in tumor immunotherapy. Journal of Hematology & Oncology. 13 (1), 107(2020).
  12. Bulte, J. W. M., Shakeri-Zadeh, A. In vivo MRI tracking of tumor vaccination and antigen presentation by dendritic cells. Molecular Imaging and Biology. 24 (2), 198-207 (2022).
  13. Holland, J. P., Sheh, Y., Lewis, J. S. Standardized methods for the production of high specific-activity zirconium-89. Nuclear Medicine and Biology. 36 (7), 729-739 (2009).
  14. Larenkov, A., et al. Preparation of zirconium-89 solutions for radiopharmaceutical purposes: interrelation between formulation, radiochemical purity, stability and biodistribution. Molecules. 24 (8), 1534(2019).
  15. Pandey, M. K., et al. A new solid target design for the production of 89Zr and radiosynthesis of high molar activity [89Zr]Zr-DBN. American Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 12 (1), 15-24 (2022).
  16. Pandey, M. K., et al. Improved production and processing of 89Zr using a solution target. Nuclear Medicine and Biology. 43 (1), 97-100 (2016).
  17. Pandey, M. K., Engelbrecht, H. P., Byrne, J. P., Packard, A. B., DeGrado, T. R. Production of 89Zr via the 89Y(p,n)89Zr reaction in aqueous solution: effect of solution composition on in-target chemistry. Nuclear Medicine and Biology. 41 (4), 309-316 (2014).
  18. Bansal, A., et al. Novel 89Zr cell labeling approach for PET-based cell trafficking studies. EJNMMI Research. 5, 19(2015).
  19. Bansal, A., et al. 89Zr]Zr-DBN labeled cardiopoietic stem cells proficient for heart failure. Nuclear Medicine and Biology. 90-91, 23-30 (2020).
  20. Friberger, I., et al. Optimisation of the synthesis and cell labelling conditions for [89Zr]Zr-oxine and [89Zr]Zr-DFO-NCS: a direct in vitro comparison in cell types with distinct therapeutic applications. Molecular Imaging and Biology. 23 (6), 952-962 (2021).
  21. Lee, S. H., et al. Feasibility of real-time in vivo 89Zr-DFO-labeled CAR T-cell trafficking using PET imaging. PLoS One. 15 (1), e0223814(2020).
  22. Nicolas, C. T., et al. Hepatocyte spheroids as an alternative to single cells for transplantation after ex vivo gene therapy in mice and pig models. Surgery. 164 (3), 473-481 (2018).
  23. Yang, B., et al. Tracking and therapeutic value of human adipose tissue-derived mesenchymal stem cell transplantation in reducing venous neointimal hyperplasia associated with arteriovenous fistula. Radiology. 279 (2), 513-522 (2016).
  24. Nicolas, C. T., et al. Ex vivo cell therapy by ectopic hepatocyte transplantation treats the porcine tyrosinemia model of acute liver failure. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 18, 738-750 (2020).
  25. Bansal, A., Sharma, S., Klasen, B., Rosch, F., Pandey, M. K. Evaluation of different 89Zr-labeled synthons for direct labeling and tracking of white blood cells and stem cells in healthy athymic mice. Scientific Reports. 12 (1), 15646(2022).
  26. Behfar, A., et al. Guided cardiopoiesis enhances therapeutic benefit of bone marrow human mesenchymal stem cells in chronic myocardial infarction. Journal of the American College of Cardiology. 56 (9), 721-734 (2010).
  27. Charoenphun, P., et al. 89Zr]oxinate4 for long-term in vivo cell tracking by positron emission tomography. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 42 (2), 278-287 (2015).
  28. Sato, N., et al. In vivo tracking of adoptively transferred natural killer cells in rhesus macaques using 89zirconium-oxine cell labeling and PET imaging. Clinical Cancer Research. 26 (11), 2573-2581 (2020).
  29. Volpe, A., Pillarsetty, N. V. K., Lewis, J. S., Ponomarev, V. Applications of nuclear-based imaging in gene and cell therapy: probe considerations. Molecular Therapy Oncolytics. 20, 447-458 (2021).
  30. Fogli, L. K., et al. Challenges and next steps in the advancement of immunotherapy: summary of the 2018 and 2020 National Cancer Institute workshops on cell-based immunotherapy for solid tumors. Journal for Immunotherapy of Cancer. 9 (7), e003048(2021).
  31. Li, X., Hacker, M. Molecular imaging in stem cell-based therapies of cardiac diseases. Advanced Drug Delivery Reviews. 120, 71-88 (2017).
  32. Puges, M., et al. Retrospective study comparing WBC scan and 18F-FDG PET/CT in patients with suspected prosthetic vascular graft infection. European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. 57 (6), 876-884 (2019).
  33. Butterfield, L. H. Dendritic cells in cancer immunotherapy clinical trials: are we making progress. Frontiers in Immunology. 4, 454(2013).
  34. de Vries, I. J. M., et al. Magnetic resonance tracking of dendritic cells in melanoma patients for monitoring of cellular therapy. Nature Biotechnology. 23 (11), 1407-1413 (2005).
  35. Gosmann, D., et al. Promise and challenges of clinical non-invasive T-cell tracking in the era of cancer immunotherapy. EJNMMI Research. 12 (1), 5(2022).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Obrazowanie PETśledzenie komórek macierzystychkomórki CAR-Tznakowanie cyrkonem-89farmakokinetyka komórekżywotność komórek znakowanych izotopowochelatowanie DFO-Bn-NCS
Obrazowanie transportu komórek za pomocą pozytonowej tomografii emisyjnej: metoda znakowania radioaktywnego komórek
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.