Synteza mikroprzepływowa mikrożelowych bloków budulcowych do rusztowania cząstek wyżarzonych mikroporowato

Podsumowanie

Ten protokół opisuje zestaw metod syntezy mikrożelowych bloków budulcowych dla mikroporowatych rusztowań z wyżarzonymi cząstkami, które mogą być używane do różnych zastosowań medycyny regeneracyjnej.

Streszczenie

Platforma rusztowania z mikroporowatymi cząstkami wyżarzonymi (MAP) jest podklasą granulowanych hydrożeli. Składa się z wstrzykiwanej zawiesiny mikrożeli, które mogą tworzyć strukturalnie stabilne rusztowanie z porowatością w skali komórkowej in situ po wtórnym etapie sieciowania chemicznego opartego na świetle (tj. wyżarzaniu). Rusztowanie MAP wykazało sukces w różnych zastosowaniach medycyny regeneracyjnej, w tym w gojeniu się ran skórnych, powiększaniu fałdów głosowych i dostarczaniu komórek macierzystych. W artykule opisano metody syntezy i charakterystyki mikrożeli z poli(glikolu etylenowego) (PEG) jako elementów budulcowych tworzących rusztowanie MAP. Metody te obejmują syntezę niestandardowego makromeru do wyżarzania (MethMAL), oznaczanie kinetyki żelowania prekursorów mikrożeli, wytwarzanie urządzeń mikroprzepływowych, mikroprzepływowe wytwarzanie mikrożeli, oczyszczanie mikrożeli i podstawową charakterystykę rusztowania, w tym wymiarowanie mikrożelu i wyżarzanie rusztowań. W szczególności opisane w niniejszym dokumencie wysokoprzepustowe metody mikroprzepływowe mogą wytwarzać duże ilości mikrożeli, które można wykorzystać do generowania rusztowań MAP do dowolnego pożądanego zastosowania, zwłaszcza w dziedzinie medycyny regeneracyjnej.

Wprowadzenie

Platforma rusztowań MAP to wstrzykiwalny biomateriał składający się wyłącznie z mikrocząsteczek hydrożelu (mikrożeli), które po usieciowaniu zapewniają mikroporowatość w skali komórki, co pozwala na migrację komórek niezależną od degradacji i integrację tkanek masowych¹. Ze względu na zdolność do szybkiej integracji z tkanką gospodarza i z natury niską immunogenność, platforma rusztowań MAP wykazała przedkliniczne zastosowanie w szerokiej gamie terapii medycyny regeneracyjnej^2,3,4,5^,6,7,8,9,10, w tym przyspieszanie gojenia się ran skórnych^1,3,11, rewaskularyzacja jamy mózgu po udarze⁷, dostarczanie mezenchymalnych komórek macierzystych², oraz zapewnianie masowania tkanek w leczeniu niewydolności głośniowej⁶. Wykazano również, że MAP przekazuje działanie przeciwzapalne do tkanki gospodarza poprzez rekrutację makrofagów M2³ i może być nawet dostrojony do promowania odpowiedzi immunologicznej Th2 "naprawy tkanek"⁸. Te korzystne właściwości platformy rusztowania MAP pozwalają na jej rozbudowę do różnorodnych zastosowań klinicznych.

Wcześniej opublikowane metody generowania mikrożeli do tworzenia rusztowań MAP obejmowały mikrofluidykę kropelkową skupiającą przepływ^1,4,7,9, elektronatryskiwanie5^,12, oraz wirowanie nad głową z emulsją wsadową^6,10. Kropelkowa metoda mikroprzepływowa może wytwarzać cząstki o wysokiej monodyspersyjności, ale wykorzystuje bardzo niskie prędkości przepływu, które dają niską wydajność cząstek (μL/h). Alternatywnie, metody elektronatryskiwania i emulsji wsadowej mogą wytwarzać dużą ilość cząstek, ale z wysoką polidyspersją cząstek. Protokół ten wykorzystuje wysokoprzepustową metodę mikroprzepływową do produkcji mikrożeli z populacją monodyspersyjną, w oparciu o pracę de Rutte et al¹³. Metoda ta wykorzystuje techniki miękkiej litografii do wykonania urządzenia mikroprzepływowego z polidimetylosiloksanu (PDMS) z fotomaski, która jest następnie łączona ze szkiełkiem podstawowym . Konstrukcja urządzenia opiera się na emulgowaniu krokowym w celu wytworzenia dużej objętości cząstek mikrożelu (ml/h). Monodyspersjność, którą można osiągnąć za pomocą tej metody, zapewnia lepszą kontrolę porowatości w porównaniu z innymi technikami, ponieważ mikrożele monodyspersyjne mogą tworzyć rusztowania o bardziej jednolitych rozmiarach porów².

Metody syntezy i charakterystyki poszczególnych mikrożeli, które mogą działać jako elementy budulcowe rusztowań MAP, są opisane w tym manuskrypcie, szczególnie w zakresie tworzenia mikrożeli, które składają się ze szkieletu PEG z grupą maleimidową (MAL), która łatwo uczestniczy w efektywnym dodawaniu typu Michaela z funkcjonalizowanymi tiolem środkami sieciującymi do żelowania mikrożeli. Aby oddzielić żelowanie mikrożelowe od wyżarzania rusztowań MAP, w tym manuskrypcie opisano również, jak zsyntetyzować opublikowany makromer do wyżarzania ¹⁴, MethMAL, który jest heterofunkcjonalnym 4-ramiennym makromerem PEG metakryloamidu/maleimidu. Grupy funkcyjne metakryloamidu łatwo uczestniczą w fotopolimeryzacji wolnorodnikowej (do wyżarzania mikrożeli), pozostając jednocześnie stosunkowo obojętne na warunki, które sprzyjają dodawaniu typu Michaela do grup funkcyjnych MAL.

Dodatkowo, ten manuskrypt opisuje protokoły tworzenia urządzeń mikroprzepływowych PDMS, określania kinetyki żelowania mikrożelu i charakteryzowania wielkości mikrożelu. Ostatnia część manuskryptu szczegółowo opisuje wyżarzanie rusztowań MAP, które ma miejsce, gdy mikrożele są przekształcane in situ w rusztowanie masowe poprzez wtórny, inicjowany foto etap sieciowania, który kowalencyjnie łączy ze sobą powierzchnie mikrożeli. Ważne jest, aby pamiętać, że istnieją inne metody wyżarzania, które można zastosować w systemach rusztowań MAP, które nie opierają się na chemii opartej na świetle, takie jak wyżarzanie za pośrednictwem enzymów, jak opisano wcześniej¹. Ogólnie rzecz biorąc, metody te mogą być stosowane bezpośrednio lub z różnymi rodzajami chemicznymi hydrożelu (np. na bazie kwasu hialuronowego) w celu generowania rusztowań MAP do dowolnego zastosowania.

Protokół

1. Synteza makromerów z wyżarzaniem MethMAL

UWAGA: Ten protokół jest specjalnie do modyfikacji 1 g PEG-maleimidu, ale może być skalowany w górę, aby uzyskać większe partie.

1. Dodać 1 g 4-ramiennego 20 kDa PEG-maleimidu do 10 ml 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS, pH 7,4) w małej szklanej zlewce z mieszadłem. Mieszaj roztwór z prędkością 300 obr./min, aż PEG całkowicie się rozpuści (~30 min).
2. Dodać 14,65 mg 2-aminoetanotiolu (stosunek molowy tiolu [SH] do maleimidu [MAL] 0,67:1) do reakcji mieszając przy 300 obr./min.
   UWAGA: Grupy tiolowe na 2-aminoetanotiolu zostaną dodane do około trzech ramion PEG-MAL poprzez dodanie typu Michaela, pozostawiając grupy końcowe aminy.
   1. Zwróć uwagę na następujące przykładowe obliczenia ilości 2-aminoetanotiolu do dodania:
      
      
      
      UWAGA: Aby uniknąć odmierzania bardzo małej ilości, rozpuść 100 mg 2-aminoetanotiolu w 1 ml 1x PBS (pH 7,4) i dodaj 146,5 μl tego roztworu do reakcji.
3. Odczekać 1 godzinę i 10 minut po kroku 1.2., następnie wymieszać 160,1 mg chlorku 4-(4,6-dimetoksy-1,3,5-triazyno-2-ylo)-4-metylomorfoliniowego (DMTMM, stosunek molowy 12:1 do PEG) i 32,77 μl kwasu metakrylowego (stosunek molowy 8:1 do PEG) w 5 ml 1x PBS (pH 7,4) w nowej szklanej zlewce i reagować przez 50 minut, mieszając przy 300 obr./min.
   UWAGA: Na tym etapie kwas metakrylowy reaguje z DMTMM, tworząc wysoce reaktywny ester, który można następnie sprzęgnąć z dostępnymi grupami aminowymi na PEG.
   1. Zwróć uwagę na następujące przykładowe obliczenia, aby obliczyć ilość DMTMM do dodania:
      
      
      
   2. Zwróć uwagę na następujące przykładowe obliczenia w celu obliczenia ilości kwasu metakrylowego do dodania:
      
      
      
      
4. Dodać roztwór kwasu metakrylowego/DMTMM do zlewki z roztworem 20 kDa PEG-MAL/2-aminoetanotiolu.
5. Dodać 53,56 μl trietyloaminy (stosunek molowy 1:1 do kwasu metakrylowego) do zlewki i pozostawić do reakcji na noc, mieszając przy 300 obr./min. Przykryj zlewkę folią, aby zapobiec przedostawaniu się do niej kurzu i innych zanieczyszczeń.
   1. Zwróć uwagę na następujące przykładowe obliczenia ilości trietyloaminy do dodania:
      
      
6. Przenieść reakcję do rurki dializacyjnej ze skóry węża (granica masy cząsteczkowej: 3,500 Da).
7. Umieścić rurkę do dializy w dużej zlewce z 1 M NaCl w wodzie dejonizowanej (DI) (objętość powinna całkowicie pokrywać przewód) na 3 dni, mieszając przy 300 obr./min. Zmieniaj 1 M roztwór NaCl 2 razy dziennie, co daje w sumie sześć prań.
8. Dializować przez 6 godzin w wodzie DI. Zmieniaj wodę DI co godzinę, w sumie sześć prań.
9. Przenieść reakcję do stożkowej probówki o pojemności 50 ml i zamrozić w temperaturze −80 °C.
10. Liofilizować probówkę przez co najmniej 72 godziny w temperaturze początkowej −70 °C i przy wzroście temperatury 0,01 °C/min aż do 0 °C.
11. Przygotować próbkę do ¹H-NMR, rozpuszczając 25 mg MethMAL w 700 μl chloroformu-d i przenosząc do probówki NMR.
12. Uzyskaj widma ¹H-NMR.
    UWAGA: Widma w tym protokole zostały uzyskane za pomocą spektrometru 500 MHz o następujących parametrach: szerokość przemiatania = 6 467,3 Hz, opóźnienie czasowe = 13,1 s, czas akwizycji = 5,1 s, czas impulsu = 5,1 μs i liczba skanów = 8.
13. Do analizy należy zintegrować pik maleimidu jako odniesienie (~6,76 ppm), a następnie zintegrować dwa piki metakryloamidu (~5,35 ppm i 5,6 ppm). Podzielić stosunek powierzchni pików metakryloamidu przez całkowitą powierzchnię wszystkich trzech pików, aby uzyskać procent ramion zmodyfikowanych metakrylamidem.
    UWAGA: Dopuszczalną modyfikacją jest 67%-75% substytucja grup funkcyjnych metakrylamidu. Przykładowe widmo ¹H-NMR dla MethMAL pokazano na Rysunek 1.
    1. Użyj równania (1) jako równania stopnia podstawienia:
       (1)

Rysunek 1: Struktura chemiczna i 1 widmo H-NMR MethMAL. (A) Struktura chemiczna: makromer wyżarzania MethMAL składa się z 4-ramiennego poli(glikolu etylenowego) o masie 20 kDa modyfikowanego trzema ramionami metakrylamidu. (B) Struktura ta generuje piki na poziomie 5,36 ppm (3) i 5,76 ppm (2) niewystępujące w widmach PEG-MAL oraz jedno ramię maleimidowe, które generuje pik przy 6,71 ppm (1). Rozpuszczalnik, chloroform, wygenerował pik przy 7,26 ppm, a woda resztkowa w tej próbce wygenerowała pik przy 2,2 ppm (oznaczony na widmach). W widmach MethMAL pik maleimidu miał zintegrowaną powierzchnię 0,27, a suma powierzchni pików metakryloamidu wynosiła 0,73 (0,37 + 0,36). Procentowa modyfikacja metakryloamidu wynosiła 73% (0,73/(0,27 + 0,73)). Ten rysunek pochodzi z Pfaff et al.¹⁴. Prawa autorskie (2021) Amerykańskie Towarzystwo Chemiczne. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

2. Kinetyka żelowania prekursorów mikrożelu

UWAGA: Czas żelowania może być modyfikowany poprzez dostosowanie pH buforu używanego do rozpuszczania składników prekursora żelu. W przypadku hydrożeli PEG-maleimidowych bardziej kwaśne pH zazwyczaj odpowiada wolniejszemu czasowi żelowania, ponieważ stężenie tiolanu zmniejsza się przy niższym pH¹⁵.

1. Z góry określ pożądane stężenia polimeru, środka sieciującego i innych składników prekursorowych żelu (tj. peptydów, glikozaminoglikanów). Rozpuść PEG-MAL, RGD i MethMAL (PEG-backbone) w 10x PBS (pH 1,5), a środek sieciujący MMP-2 w 1x PBS (pH 7,4).
   UWAGA: W tym protokole roztwór prekursora żelu jest opublikowanym preparatem ³, który składa się z 45,88 mg/ml 4-ramiennego PEG-MAL (10 kDa), 0,82 mg/ml RGD, 8,06 mg/ml MethMAL i 4,62 mg/ml środka sieciującego MMP-2 (enzymatycznie degradowalny środek sieciujący).
2. Przygotuj lepkościomierz lub równoważny przyrząd do monitorowania modułów przechowywania i strat przy użyciu szczeliny o wielkości 0,4 mm, odkształcenia ścinającego 1,0, częstotliwości 1,0 Hz i czasu trwania 10 800 s.
   1. Zamocuj wirnik płytowy o geometrii 35 mm (P35/Ti). Użyj wilgotnej komory lub wilgotnej gąbki wokół geometrii, aby utrzymać nawilżone środowisko.
   2. Wymieszaj szkielet PEG i środek sieciujący MMP w stosunku objętościowym 1:1.
   3. Odpipetować 400 μl roztworu prekursora żelu na środek stolika lepkościomierza.
   4. Powoli opuść geometrię na stolik, aż osiągnie określony rozmiar szczeliny 0,4 mm i natychmiast rozpocznij monitorowanie modułów przechowywania (G') i strat (G'') przez okres do 6 godzin w temperaturze pokojowej.
      UWAGA: Uważa się, że żelowanie rozpoczyna się, gdy moduł spichrzeniowy staje się większy niż moduł strat, a żelowanie uważa się za zakończone, gdy moduł spichrzeniowy ustabilizuje się. Reprezentatywna krzywa kinetyki żelowania jest pokazana na Rysunek 2.

Rysunek 2: Reprezentatywna krzywa kinetyki żelowania roztworu prekursora żelu MAP (pH 4,5) wyznaczona przez lepkościomierz. Żelowanie rozpoczyna się od szybkiego wzrostu modułu spichrzeniowego (G'), a żelowanie kończy się, gdy krzywa G' ustabilizuje się. G'' oznacza moduł stratności. Ten rysunek pochodzi z Pruett et al.³. Prawa autorskie (2021) Wiley-VCH GmBH. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

3. Produkcja urządzeń mikroprzepływowych

UWAGA: Ten protokół opisuje wytwarzanie urządzenia do mikroprzepływowego emulgowania krokowego projektu zaczerpniętego z de Rutte et al.¹³, który można zobaczyć w Rysunek 3A. Jednak protokół ten może być używany z dowolnym projektem urządzenia, które jest wytrawione w płytce SU-8. Zaleca się zlecenie na zewnątrz produkcji głównej płytki krzemowej SU-8, chyba że dostępne są odpowiednie pomieszczenia czyste do produkcji.

1. Stwórz pierwsze urządzenie mikroprzepływowe z polidimetylosiloksanu (PDMS) z fotomaski waflowej SU-8.
   1. Przygotować ~200 g PDMS, mieszając bazę i utwardzacz w stosunku 10:1 w/w (patrz Tabela Materiałów).
   2. Umieść wafel SU-8 w naczyniu hodowlanym (przyklej krawędzie płytki do naczynia), konstrukcją mikroprzepływową skierowaną do góry.
   3. Wlej PDMS do naczynia, aby utworzyć warstwę o grubości 1-1,5 cm na wafelku. Umieść naczynie pod próżnią, aby usunąć wszelkie bąbelki.
   4. Pozostawić PDMS do utwardzenia aż do zestalenia (24 h w temperaturze pokojowej lub ~2 h w 60 °C).
   5. Po utwardzeniu PDMS ostrożnie użyj żyletki lub skalpela, aby przeciąć prostokąt przez PDMS, tak aby wokół wzoru na wafli był margines 0,5-1 cm.
      UWAGA: Nie wywieraj zbyt dużego nacisku i bądź bardzo delikatny, aby uniknąć uszkodzenia (np. pęknięcia, zarysowania) płytki.
   6. Wciśnij szpatułkę w jedno z nacięć i przesuń ją wzdłuż nacięć, aby oddzielić PDMS od wafla.
      UWAGA: Gdy PDMS oddzieli się od płytki, pod PDMS zacznie tworzyć się pęcherzyk powietrza (patrz Rysunek 3B).
   7. Użyj szpatułki, aby delikatnie wyjąć prostokąt PDMS z naczynia.
      UWAGA: Powstała szczelina w PDMS nad płytką będzie formą dla urządzeń mikroprzepływowych.
2. Twórz kolejne urządzenia mikroprzepływowe PDMS z fotomaski wafli SU-8.
   1. Przygotuj ~15-20 g PDMS na formę, mieszając bazę i utwardzacz w proporcji 10:1.
   2. Wlej PDMS do prostokątnej szczeliny w formie, aby utworzyć 5 mm warstwę PDMS nad waflem. Umieść formę pod próżnią, aby usunąć wszelkie pęcherzyki.
   3. Pozostawić PDMS do utwardzenia aż do całkowitego zestalenia (24 godziny w temperaturze pokojowej lub 2 godziny w temperaturze 60 °C).
   4. Po utwardzeniu PDMS użyj żyletki lub skalpela, aby przeciąć PDMS wokół krawędzi prostokąta.
      UWAGA: Nie używaj zbyt dużego nacisku i bądź bardzo delikatny, aby uniknąć uszkodzenia (tj. pęknięcia) płytki.
   5. Wciśnij szpatułkę w jedno z nacięć i przesuń ją wzdłuż nacięć, aby oddzielić PDMS od wafla.
      UWAGA: Gdy PDMS oddzieli się od płytki, pod PDMS zacznie tworzyć się pęcherzyk powietrza.
   6. Użyj dziurkacza do biopsji o średnicy 1,5 mm, aby utworzyć otwory w prostokącie PDMS na dwóch wlotach i wylocie (patrz Rysunek 3B).
   7. Jeśli na jednej płytce znajduje się wiele urządzeń, użyj szpatułki lub żyletki, aby lekko naciąć PDMS między każdym urządzeniem, a następnie delikatnie złóż PDMS wzdłuż naciętych linii, aby PDMS sam się bardzo czysto rozdzielił.
   8. Przechowuj urządzenia PDMS w pojemniku wolnym od kurzu.
3. Przymocuj urządzenia mikroprzepływowe PDMS do szkiełek podstawowych.
   1. Przygotuj jedno szkiełko podstawowe na urządzenie mikroprzepływowe PDMS. Użyj taśmy, przefiltrowanego powietrza lub płynów do płukania alkoholem izopropylowym (IPA), aby usunąć kurz ze szkiełka. Upewnij się, że szkiełka są całkowicie suche, zanim przejdziesz do następnego kroku.
   2. Umieść szklane szkiełko podstawowe i urządzenie PDMS, projektową stroną do góry, obok siebie na małej plastikowej tacy (dobrze sprawdza się do tego 96-dołkowa pokrywka na płytkę) i umieść je w myjce plazmowej. Zamknij drzwiczki i zawór przepływu powietrza i włącz pompę próżniową. Pozwól mu działać przez co najmniej 30 sekund, a następnie wyłącz go.
   3. Podłącz rurkę gazową butli tlenu do zaworu przepływu powietrza. Pozwól, aby komora plazmowa wypełniła się tlenem przez 30 sekund, a następnie wyłącz tlen i zamknij zawór przepływu powietrza.
   4. Włącz pompę próżniową i ustaw poziom częstotliwości radiowej (RF) na wysoki. Poczekaj, aż komora zmieni kolor na fioletowo-różowy (patrz Rysunek 3B). Odczekaj 30 sekund.
   5. Gdy timer się wyłączy, wyłącz plazmę i odkurz. Następnie powoli otwórz zawór przepływu powietrza, aby uwolnić podciśnienie. Wyjmij tackę z urządzenia do czyszczenia plazmowego.
   6. Delikatnie obróć urządzenie PDMS na szklane szkiełko, aby je połączyć. W miarę wiązania należy zwrócić uwagę na niewielką różnicę w przezroczystości PDMS.
      UWAGA: Aby uzyskać najlepsze wyniki, przechowuj połączone urządzenia w temperaturze 60 °C do momentu bezpośrednio przed użyciem.
4. Obróbka powierzchniowa urządzeń mikroprzepływowych PDMS
   1. Przygotować obróbkę powierzchniową przez rozcieńczenie PFOCTS (trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooktylo)silan) w oleju Novec (1:50). Użyj 1 ml na 3-4 urządzenia. Przenieść objętość do strzykawki o pojemności 1 ml i założyć igłę 25 G.
      UWAGA: Igły używane w tym protokole są skośne, dlatego należy zachować ostrożność podczas obchodzenia się z ostrymi narzędziami. W razie potrzeby można również użyć igieł.
   2. Wytnij 10-12 cm kawałek rurki Tygon na urządzenie, które będzie poddawane obróbce.
   3. Wytnij kawałek rurki PEEK o długości ~7 cm. Włóż kilka milimetrów rurki PEEK do końca rurki Tygon, jak pokazano na Rysunek 4A, aby zapobiec przebiciu przez igłę wlotów rurki Tygon.
   4. Wyjmij urządzenie(a) z podgrzewanej komory i włóż końcówkę rurki Tygon bez PEEK do wodnego otworu wlotowego.
   5. Włóż igłę strzykawki do obróbki powierzchni do rurki PEEK i zakryj otwór wylotowy komory olejowej (patrz Rysunek 3B).
   6. Powoli wstrzyknij preparat do urządzenia i upewnij się, że wypełnia on urządzenie bez pęcherzyków powietrza. Poczekaj, aż najpierw wypełnią się komory wodne, następnie mniejsze kanały, a następnie komora olejowa. Wyjmij rurkę Tygon z urządzenia. Po napełnieniu urządzenia odstaw je na 10 minut w temperaturze pokojowej.
   7. Napełnij strzykawkę o pojemności 5 ml samym olejem (bez silanu) i podłącz igłę 25 G.
   8. Zassać obróbkę powierzchniową z urządzenia przez wloty i wyloty. Włóż rurkę Tygon do wlotu wody wodnej, włóż strzykawkę z olejem do rurki PEEK i przepłucz każde urządzenie olejem. Odessać olej z urządzenia.
   9. Powtórz płukanie olejem jeszcze 2 razy. Usuń rurkę Tygon.
      UWAGA: Urządzenie jest gotowe do użycia.

Rysunek 3: Mikroprzepływowe urządzenie PDMS. (A) Rysunek projektu urządzenia mikroprzepływowego wspomagany komputerowo (AutoCAD). Tworzenie się kropelek mikrożelu następuje w kanałach po obu stronach kanału olejowego, jak widać w powiększonej wychodni. (B) Przegląd produkcji urządzeń PDMS. Skrót: PDMS = polidimetylosiloksan. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

4. Mikroprzepływowe wytwarzanie mikrożeli

1. Z góry określ pożądane stężenia polimeru, środka sieciującego i innych składników prekursorowych żelu (tj. peptydów, glikozaminoglikanów). Rozpuść PEG-MAL, RGD i MethMAL (PEG-backbone) w 10x PBS (pH 1,5) i sieciowniku MMP-2 wraz z 5 μM biotyny-maleimidu w 1x PBS (pH 7,4).
   UWAGA: W tym protokole roztwór prekursora żelu jest opublikowanym preparatem³ składającym się z 45,88 mg/ml 4-ramienny PEG-MAL (10 kDa), 0,82 mg/ml RGD, 8,06 mg/ml MethMAL i 4,62 mg/ml MMP-2 środek sieciujący (enzymatycznie degradowalny środek sieciujący). Metody opisane poniżej pozwolą uzyskać ~ 3 ml mikrożeli.
2. Przygotować 6 ml roztworu środka powierzchniowo czynnego, rozcieńczając podstawowy 5% FluoroSurfaktant do co najmniej 1% w oleju Novec. Dodaj ten roztwór do strzykawki o pojemności 10 ml.
   UWAGA: Fluorowany środek powierzchniowo czynny nie miesza się z wodą, co pozwala na łatwe usunięcie go podczas przejścia żelu do fazy wodnej podczas płukania PBS na etapie oczyszczania.
3. Wytnij trzy kawałki rurki Tygon o długości odpowiedniej do wysokości pompy strzykawkowej.
4. Wytnij dwa kawałki rurki PEEK o długości ~1 cala. Włóż kilka milimetrów rurki PEEK do końca dwóch kawałków rurki Tygon, jak pokazano na Rysunek 4A, aby zapobiec przebiciu wlotów rurki Tygon przez igłę
.
5. Włóż końcówkę rurki Tygon bez PEEK do wlotów urządzeń mikroprzepływowych. Włóż pozostały kawałek rurki Tygon (bez rurki PEEK na końcu) do wylotu urządzenia mikroprzepływowego, jak pokazano na Rysunek 4C.
6. Dodaj co najmniej 3 ml oleju do plastikowej strzykawki o pojemności 5 ml i podłącz ją do igły 25 G. Ostrożnie włóż igłę do rurki PEEK na jednym z wlotów Tygon. Delikatnie przepłucz rurkę i urządzenie olejem. Zbierz olej z wylotu do stożkowej rurki. Powtórz płukanie olejem na drugim wlocie Tygon.
7. Ustawić pompy strzykawkowe na żądane natężenia przepływu.
   UWAGA: W tym protokole stosuje się 3 ml/h dla natężenia przepływu w wodzie i 6 ml/h dla natężenia przepływu oleju. Może być konieczne użycie dwóch oddzielnych pomp strzykawkowych.
8. Podłącz strzykawkę zawierającą środek powierzchniowo czynny do wlotu oleju za pomocą igły 25 G (patrz Rysunek 4A) i delikatnie dozuj wystarczającą ilość oleju, aby zalać rurkę i kanał olejowy urządzenia mikroprzepływowego.
9. Po ustawieniu urządzenia i wlotów oleju dodaj 0,5 ml oleju do nowej strzykawki o pojemności 5 ml, która będzie zawierać prekursor żelu. Celem tej niewielkiej ilości oleju jest pomoc w przepłukaniu roztworu prekursora przez urządzenie mikrofuilidowe pod koniec cyklu.
10. W stożkowej probówce połącz 1,5 ml roztworu PEG-szkielet i 1,5 ml roztworu sieciującego. Wirować przez 30 s i szybko przenieść połączony żelowy roztwór prekursora do strzykawki o pojemności 5 ml.
11. Połączyć strzykawkę z roztworem prekursora żelu z wlotem wody za pomocą igły 25 G. Delikatnie dozuj wystarczającą ilość roztworu, aby zalać rurkę i kanał wodny.
12. Zacisnąć strzykawki na odpowiednich pompach strzykawkowych i wcisnąć przycisk (patrz Rysunek 4B). Upewnij się, że ciecz przepływa zarówno przez kanał wodny, jak i olejowy.
    UWAGA: Zaleca się użycie mikroskopu do wizualizacji tworzenia się mikrożelu w urządzeniu PDMS.
13. Poszukaj cząstek o jednakowej wielkości z kanałów (patrz Rysunek 4D). Zbierz mikrożele z wylotu do stożkowej tuby.

Rysunek 4: Konfiguracja mikroprzepływowa. (A) Opis metody łączenia rurki PEEK (na górze) i rurki Tygon do igły 25 G na strzykawce (na dole). (B) Konfiguracja mikroprzepływowa z pompami strzykawkowymi, rurką, urządzeniem i mikroskopem. (C) Obraz układu urządzenia mikroprzepływowego, z dwoma wlotami (wodnym i olejowym) i jednym wylotem. (D) Schemat urządzenia mikroprzepływowego i reprezentatywny obraz w jasnym polu oczekiwanego tworzenia się mikrożelu z kanałów w urządzeniu do emulgowania krokowego. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

5. Oczyszczanie i sterylizacja mikrożeli

1. Po zakończeniu żelowania (określonym jako czas do plateau modułu magazynowania w charakterystyce kinetyki żelowania), użyj pipety, aby ostrożnie usunąć fazę olejową z dna probówki (patrz Rysunek 5). Zdeponuj je w odpowiednim pojemniku na odpady fluorowane.
   UWAGA: Czas żelowania można przyspieszyć, dodając do probówki zbiorczej organiczną rozpuszczalną zasadę (np. trietyloaminę), ale ważne jest, aby pamiętać, że dodanie mocnej zasady może hydrolizować wszelkie nieprzereagowane maleimidy. Jeśli pożądane jest funkcjonalizowanie mikrożeli poprzez nadmiar maleimidów po żelowaniu, należy pominąć dodawanie trietyloaminy.
2. Dodaj więcej oleju do probówki do zbierania mikrożelu w stosunku 1:1. Wymieszaj, delikatnie odwracając probówkę zbiorczą. Nie wirować.
3. Pozwól probówce zbiorczej osiąść na ~ 5 minut, aby umożliwić rozdzielenie faz. Poszukaj fazy olejowej na dole i fazy wodnej (mikrożeli) na górze (patrz Rysunek 5).
4. Powtórz płukanie olejem co najmniej 2x więcej.
5. Dodaj więcej oleju w stosunku 1:1 z żelem i dodaj 1x PBS w proporcji 4:1 PBS do żelu. Odwróć, aby wymieszać kilka razy. Aby oddzielić warstwy, odwiruj probówkę przy ~2,000 x g przez ~30 s. Poszukaj fazy olejowej na dole tuby, żelu w środku i PBS na górze (patrz Rysunek 5).
6. Usunąć fazę olejową za pomocą pipety i wyrzucić do pojemnika na odpady.
   UWAGA: Nie wyjmuj PBS. Użyj większej stożkowej tuby, aby kontynuować mycie, jeśli oryginalna probówka miała 15 ml.
7. Powtórz płukanie olejem i PBS 2x więcej. Szukaj, czy żel przejdzie z nieprzezroczystego do przezroczystego do końcowego mycia, jak pokazano na Rysunek 5, wskazując, że środek powierzchniowo czynny został usunięty, a żel jest w fazie PBS.
8. Usuń cały olej. Nie wyjmuj PBS z rurki stożkowej.
9. W dygestorium chemicznym użyj szklanej pipety, aby dodać heksany do rurki w objętości równej PBS. Obracaj stożkową rurkę przez 30 sekund lub do całkowitego wymieszania. Wirować przy 4 696 x g przez 5 min.
10. Po oddzieleniu poszukaj heksanów w górnej warstwie, PBS w środku i żelu na dole (patrz Rysunek 5). Usuń warstwę heksanu i wyrzuć ją do pojemnika na odpady organiczne. Zassać PBS.
11. Powtórz mycie heksanem i PBS co najmniej 2 razy więcej lub do momentu, gdy żel stanie się prawie przezroczysty (patrz Rysunek 5). Umyj żel PBS 1x więcej, aby usunąć wszelkie pozostałe heksany. Wirować przy 4 696 x g przez 5 min. Zassać warstwę PBS. Uważaj, aby nie naruszyć granulki żelu.
    1. Aby zakryć lub stłumić wszelkie nieprzereagowane maleimidy w mikrożelach, przygotuj 100 mM roztwór N-acetylo-L-cysteiny w 1x PBS i dodaj ten roztwór do żelu. Umieścić na rotatorze probówki w temperaturze 37 °C na noc, a następnie przeprowadzić wiele płukań PBS w celu usunięcia nieprzereagowanej N-acetylo-L-cysteiny.
    2. W przypadku długotrwałego przechowywania (do 1 roku) należy ponownie zawiesić mikrożele w 70% IPA i przechowywać w temperaturze 4 °C, aby zapobiec rozwojowi bakterii na mikrożelach.
    3. Aby wysterylizować mikrożele, dodaj 70% IPA do żelu w stosunku 4:1 v/v w kapturze bezpieczeństwa biologicznego. Wirować probówkę przez 30 s, a następnie odwirowywać przy 4,696 × g przez 5 minut. Odessać supernatant IPA z granulatu żelu do okapu bezpieczeństwa biologicznego. Wykonaj jeszcze 2 razy płukanie IPA, a następnie 3 razy płukanie sterylnym 1x PBS.
       UWAGA: Wszystkie IPA należy usunąć przed użyciem żelu z komórkami lub zwierzętami.

Rysunek 5: Przegląd procedury oczyszczania mikrożelu. Skróty: PBS = sól fizjologiczna buforowana fosforanami; IPA = alkohol izopropylowy. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

6. Charakterystyka wielkości mikrożelu

UWAGA: Zaleca się, aby cząstki mikrożelu zrównoważyły się w 1x PBS przez noc w temperaturze 37 °C, aby pęcznieły do swojej ostatecznej średnicy przed zaklejeniem.

1. Obraz cząsteczek żelu.
   1. Odkręcać żel MAP o stężeniu 4 696 × g przez 5 minut i odessać supernatant.
   2. Za pomocą pipety wyporowej usunąć 5 μl mikrożeli z granulki żelu i rozcieńczyć w 1 ml PBS w probówce do mikrowirówek (rozcieńczenie 1:200). Dostosuj to rozcieńczenie zgodnie z potrzebami.
      UWAGA: Podczas formułowania roztworu prekursora żelu można dodać 5 μM maleimidu biotyny i zastosować go jako alternatywę dla znakowania mikrożeli za pomocą fluoroforu. W takim przypadku można dodać streptawidynę-fluorofor w rozcieńczeniu 1:300 (z 1 mg/ml zapasu). Pozostawić na inkubację ze streptawidyną przez co najmniej 15 minut przed obrazowaniem.
   3. Za pomocą pipety wyporowej przenieść 100 μl rozcieńczonych mikrożeli do dołków przezroczystej 96-dołkowej płytki.
   4. Użyj mikroskopu szerokokątnego lub konfokalnego, aby uwidocznić mikrożele za pomocą obiektywu 10x. Pozyskaj obrazy mikrożeli do analizy.
   5. Zobacz Rysunek 6 dla reprezentatywnych obrazów konfokalnych mikrożeli.
2. Wymiarowanie cząstek za pomocą ImageJ
   1. Otwórz pliki obrazów z mikroskopu w programie ImageJ.
   2. Wybierz pozycję Analizuj | Ustaw Skala i ustaw skalę obrazu zgodnie z obiektywem mikroskopu.
   3. Wybierz punkt menu Obraz | Rodzaj | 8-bitowy.
   4. Wybierz punkt menu Obraz | Dostosuj | Próg, a następnie wybierz opcję automatycznego progu "Otsu" z listy rozwijanej.
   5. Kliknij Analizuj | Ustaw Measurements (Wymiary) i wybierz Średnicę Fereta oraz ogranicz do progu.
   6. Kliknij Analizuj | Przeanalizuj cząstki i wprowadź zakres rozmiarów obszaru (w pikselach^2) oczekiwany dla mikrożeli (aby wykluczyć małe zanieczyszczenia z analizy). Zmień cyrkularność na 0,75-1,00 i wybierz pozycję Pokaż | Kontury. Sprawdź wyświetlanie wyników i wykluczanie na krawędziach.
      UWAGA: Filtr o okrągłym kształcie wyklucza mikrożele na obramowaniu obrazu, które mogą powodować niedokładny pomiar średnicy.
   7. Uruchom moduł Analizuj cząstki.
   8. Poczekaj na wynik, którym jest średnica Fereta każdej cząstki, i wyeksportuj te wyniki do arkusza kalkulacyjnego.
   9. W tym protokole oblicz wskaźnik polidyspersyjności (PDI), aby określić niejednorodność wielkości mikrożelu. Przeanalizuj co najmniej 100 mikrożeli, aby zdefiniować populację: zakres PDI 1,00-1,05 definiuje populację monodyspersyjną, a PDI większy niż 1,05 definiuje populację polidyspersyjną. Użyj równania (2), równania (3) i równania (4), aby obliczyć PDI, jak opisano poniżej.
      (2)
      (3)
      (4)

Rysunek 6: Reprezentatywne obrazy mikrożeli. (A) Fluorescencyjny obraz konfokalny populacji mikrożeli A, (B) obraz progowych mikrożeli, oraz (C) kontury cząstek po analizie ImageJ. (D) Fluorescencyjny obraz konfokalny populacji mikrożeli B i (E) obraz mikrożeli w świetle przechodzącym (mikrożele są prawie przezroczyste). (F) Przedstawienie reprezentatywnych wyników analizy ImageJ przedstawionej w niniejszym protokole. Obie populacje mikrożeli mają stosunkowo monodyspersyjne PDI. Obie populacje mikrożeli zsyntetyzowano z natężeniem przepływu wody 3 ml/h i natężeniem przepływu oleju 6 mL/h. Jednak różnica w wielkości mikrożelu wynika z różnic w wielkości kroku urządzenia mikroprzepływowego. Na przykład populację mikrożeli A zsyntetyzowano za pomocą urządzenia mikroprzepływowego o wielkości kroku kanału 11 μm, a populację mikrożeli B zsyntetyzowano w urządzeniu o wielkości kroku 40 μm. Podziałka = 100 μm. Skrót: PDI = wskaźnik polidyspersyjności. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

7. Wyżarzanie rusztowań z mikroporowatymi cząstkami (MAP)

1. Stworzyć roztwór podstawowy 2 mM fenylo-2,4,6-trimetylobenzoilofosfinianu litu (LAP) w 1x PBS (pH 7,4).
2. Rozcieńczyć roztwór podstawowy LAP do 0,2 mM w objętości 1x PBS odpowiadającej objętości żelu. Jeśli używasz fotoinicjatora LAP do badań komórkowych lub badań na zwierzętach, przed użyciem należy wysterylizować roztwór.
3. Odkręcać żel MAP o stężeniu 4 696 × g przez 5 minut i odessać supernatant.
4. Za pomocą pipety wyporowej przenieś żądaną objętość żelu do probówki mikrowirówkowej.
5. Dodaj 0,2 mM LAP do żelu w stosunku objętościowym 1:1 (końcowe stężenie LAP wynosi 0,1 mM).
6. Zmieszaj mieszaninę i inkubuj przez co najmniej 15 minut w ciemności.
7. Odwirować mieszaninę o stężeniu 18 000 × g przez 5 minut, aby uzyskać granulki żelu.
8. Ostrożnie usunąć supernatant z osadu żelowego.
9. Przenieś żel MAP do miejsca docelowego za pomocą pipety wyporowej.
10. Zastosuj skupione światło (365 nm, 8,66 mW/cm²) do próbki przez 113 s, aby wyżarzyć rusztowanie.
    UWAGA: Czas wyżarzania wynoszący 113 s został zoptymalizowany zgodnie z wcześniejszymi publikacjami dla stężenia LAP 0,1 mM¹⁴, ale może być konieczna dodatkowa optymalizacja dla różnych stężeń fotoinicjatora.

Rysunek 7: Wyżarzanie rusztowań MAP. (A) Schemat wyżarzania rusztowań MAP. Po wystawieniu na działanie fotoinicjatora i światła, grupy funkcyjne metakryloamidu na makromerze MethMAL ulegają reakcji fotopolimeryzacji klikanej, która łączy ze sobą powierzchnie mikrożeli. (B) Przedstawienie renderingu 3D (Imaris) obrazu z mikroskopu dwufotonowego mikrożeli MAP (zielonych) wyżarzonych razem w kształcie krążka 3D, z dekstranem (czerwonym) w porach. (C) Przedstawienie renderingu 3D (Imaris) obrazu z mikroskopu dwufotonowego pokazującego porowatość rusztowania MAP, które zostało perfundowane fluorescencyjnym dekstranem o stężeniu 70 kDa (czerwony). Podziałka = (B) 100 μm, (C) 70 μm. Skróty: MAP = mikroporowata cząstka wyżarzona; MethMAL = niestandardowy makromer wyżarzania. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Wyniki

Celem tego protokołu jest nakreślenie wszystkich kroków niezbędnych do syntezy bloków budulcowych mikrożelu, które mają być użyte w rusztowaniu MAP. Makromer do wyżarzania MethMAL jest wysoce selektywny i wydajny oraz jest kompatybilny z wieloma szkieletami polimerowymi¹⁴. Ważne jest, aby co najmniej 67%-75% z 20 kDa PEG-maleimidu było modyfikowane grupami funkcyjnymi metakryloamidu, aby zapewnić wysoką wydajność wyżarzania. Procentową modyfikację można najłatwiej wyznaczyć, analizując piki widma ¹H-NMR, jak pokazano na rysunku Rysunek 1. Kinetyka żelowania, określana za pomocą lepkościomierza, jest ważnym wskaźnikiem, który należy wziąć pod uwagę dla każdej formuły żelu. Protokół ten wykorzystuje roztwór prekursora żelu składający się ze szkieletu PEG z grupą MAL, który skutecznie reaguje z funkcjonalizowanymi tiolami sieciami w celu żelowania mikrożelu. Jednak wiele chemii hydrożeli można wykorzystać do wytwarzania mikrożeli za pomocą opisanej w niniejszym dokumencie metody mikroprzepływowej o wysokiej przepustowości. Czas do rozpoczęcia żelowania zapewni wgląd w czas wytwarzania mikrożelu mikroprzepływowego. Zaleca się wybór pH prekursora żelu, który może zainicjować żelowanie między 30 minutami (Rysunek 2) do 2 godzin.

Jeśli czas żelowania jest zbyt krótki, roztwór prekursora żelu zacznie polimeryzować w urządzeniu mikroprzepływowym i zatkać kanały. Ponadto ważne jest, aby pamiętać, że zmiana stężeń tiolowanych ligandów (np. RGD) może mieć wpływ na tworzenie sieci podczas żelowania i może być konieczna do uwzględnienia poprzez dostosowanie preparatu. Etapy produkcji urządzenia mikroprzepływowego mogą być żmudne, ale reprezentatywne wyniki pomyślnie połączonego urządzenia są pokazane w Rysunek 3. Protokół ten wykorzystuje wysokowydajne, równoległe, krokowe urządzenie mikroprzepływowe, które zostało zaadaptowane z projektu de Rutte et al.¹³, a produkcja płytek krzemowych została zlecona firmie zajmującej się technologią mikroprzepływową. Jednak kroki opisane w tym protokole mogą być używane z dowolnym projektem urządzenia wytrawionym na fotomasce z wafla krzemowego SU-8. Ważne jest, aby pamiętać, że rozmiar kroku kanałów na fotomasce musi być zoptymalizowany podczas produkcji urządzenia, ponieważ będzie to miało wpływ na wielkość cząsteczek mikrożelu.

Natężenia przepływu dla mikroprzepływowego wytwarzania mikrożeli powinny być zoptymalizowane dla każdej formuły żelu w oparciu o takie czynniki jak czas żelowania, pożądana wielkość cząstek i konstrukcja urządzenia mikroprzepływowego. W przypadku korzystania z urządzenia o wysokiej przepustowości, natężenia przepływu w fazie wodnej mogą sięgać nawet 5 ml/h. Rysunek 4B przedstawia konfigurację dla urządzeń o wysokiej przepustowości używanych w tym protokole. Jeśli urządzenie działa poprawnie, tworzenie mikrożelu powinno wyglądać podobnie do pokazanego na Rysunek 4D. Przed oczyszczeniem mikrożele będą nieprzezroczyste. Po zakończeniu różnych myć olejem, PBS i heksanem, żel powinien wyglądać na przezroczysty, jak na reprezentatywnym obrazie na Rysunek 5. W przypadku włączenia fluoroforu do mikrożeli, oczyszczony produkt może mieć lekki odcień koloru, ale nadal powinien być bliski półprzezroczystości. Po oczyszczeniu i spęcznieniu mikrożele powinny mieć bardzo jednolitą wielkość i PDI między 1,00 a 1,05, jak pokazano na Rysunek 6. Do fotowyżarzania rusztowań MAP można stosować różne fotoinicjatory. W przypadku korzystania z alternatywy dla LAP, opisanej w niniejszym dokumencie, należy określić kinetykę wyżarzania zgodnie z wcześniejszym opisem¹⁴. Dodatkowo do fotowyżarzania można stosować różne źródła światła, o ile źródło światła odpowiada fotoinicjatorowi. Należy upewnić się, że źródło światła zostało skalibrowane i ustawione na ostrości. Czas wyżarzania i intensywność światła mogą wymagać optymalizacji w oparciu o formułę żelu i stężenie fotoinicjatora. Metoda wyżarzania opisana w niniejszym protokole może być stosowana w badaniach in vitro i in vivo. Po wyżarzaniu mikrożele utworzą porowate rusztowanie, które można uwidocznić za pomocą mikroskopii dwufotonowej (Rysunek 7B-C).

Dyskusja

Protokół ten opisuje metody syntezy i charakterystyki mikrożeli, które służą jako elementy budulcowe rusztowań z mikroporowatymi cząstkami wyżarzonymi (MAP). Protokół ten wykorzystuje wysokoprzepustowe podejście mikroprzepływowe do generowania dużych objętości jednorodnych mikrożeli, czego nie można osiągnąć innymi metodami, takimi jak mikrofluidyka^skupiająca przepływ 1,4,7,9 (wysoka monodyspersja, niska wydajność), emulsja wsadowa ^6,10 i elektronatryskiwanie ^5,12 (niska monodyspersyjność, wysoka wydajność). Dzięki metodom opisanym w niniejszym dokumencie, mikrożele monodyspersyjne mogą być wytwarzane do stosowania w rusztowaniach MAP, które mogą być wykorzystywane do różnych zastosowań w medycynie regeneracyjnej (np. dostarczanie komórek, gojenie się ran).

Kluczowym etapem tego protokołu jest stworzenie urządzeń mikroprzepływowych PDMS. Jeśli urządzenia nie są wykonane prawidłowo, może to mieć negatywny wpływ na tworzenie mikrożeli i monodyspersyjność. Ważne jest, aby zapobiec wprowadzaniu artefaktów (tj. pęcherzyków, kurzu) do PDMS przed jego utwardzeniem, ponieważ może to zatkać kanały i znacząco wpłynąć na tworzenie mikrożelu. Aby to w jak największym stopniu złagodzić, należy użyć taśmy do usunięcia kurzu, przechowywać urządzenia w pojemniku bezpyłowym i pracować w okapie odpylającym, jeśli to możliwe. Zaleca się również przechowywanie urządzeń w temperaturze 60 °C w celu uzyskania najlepszych rezultatów obróbki powierzchni.

Podczas nalewania urządzeń PDMS ważne jest, aby utrzymać jednolitą grubość, która jest mniej więcej równa lub mniejsza niż długość stempla biopsyjnego. Jeśli urządzenie jest zbyt grube, stempel biopsyjny nie będzie w stanie przeniknąć na wylot. Ważne jest również, aby nie rozerwać wlotów/wylotów urządzenia PDMS podczas przebijania dziurkaczem do biopsji i/lub wkładania rurki. Rozdarcie w urządzeniu PDMS spowoduje wyciek z wlotów/wylotów, co może spowodować utratę roztworu prekursora żelu. Jeśli w urządzeniu PDMS występuje nieszczelność, najlepszym rozwiązaniem jest jak najszybsza wymiana go na nowe.

Podczas obróbki plazmowej urządzenia, użycie czystego tlenu i obróbka plazmowa przez 30 s dały najlepsze wyniki w przypadku przylegania PDMS do szkiełka podstawowego. Jeśli urządzenie nie łączy się prawidłowo (tj. PDMS można nadal podnieść ze szkiełka po obróbce plazmowej), należy dokładnie sprawdzić, czy urządzenie do obróbki plazmowej działa prawidłowo i czy urządzenie i szkiełka zostały dokładnie wyczyszczone. Ważne jest również, aby stosować odpowiednią obróbkę powierzchni silanową, a w celu uzyskania najlepszych wyników urządzenia PDMS powinny być poddane obróbce powierzchniowej bezpośrednio przed użyciem. Można również zastosować inne metody obróbki powierzchni, takie jak chemiczne osadzanie z fazy gazowej.

Kolejnym kluczowym krokiem jest prawidłowe użycie urządzeń mikroprzepływowych PDMS do tworzenia mikrożelu. Zaleca się stosowanie współczynnika przepływu co najmniej 2:1 (w tym protokole wykorzystuje się natężenie przepływu oleju 6 ml/h i natężenie przepływu wody 3 mL/h), ale można go dostroić, aby osiągnąć pożądany rozmiar mikrożelu. pH roztworu prekursora mikrożelu jest również ważnym wskaźnikiem, który należy zoptymalizować, aby zapobiec zatkaniu urządzenia. Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) przyspiesza tworzenie tiolanów w chemii addycji typu Michaela, a stężenia PBS stosowane w tym protokole dają najlepsze wyniki żelowania mikrożeli w urządzeniach mikroprzepływowych. Po uruchomieniu pomp strzykawkowych w kanałach mikroprzepływowych mogą pojawić się pęcherzyki, ale po kilku minutach powinny się one zrównoważyć. Zaleca się monitorowanie tworzenia się mikrożelu pod mikroskopem. Jeśli przepływ nie wygląda podobnie jak na tym filmie i/lub istnieje kilka kanałów wytwarzających duże cząstki, prawdopodobnie jest to spowodowane problemami z etapem obróbki powierzchni. Najlepszym rozwiązaniem jest wymiana urządzenia na takie, które zostało świeżo poddane obróbce powierzchniowej.

Jeśli mikrożele wydają się łączyć w konwalescencję, może to być spowodowane niewystarczającym stężeniem FluoroSurfaktantu. Zalecanym rozwiązaniem jest zwiększenie % wag. surfaktantu w fazie olejowej. Jednak jednym z ograniczeń w stosowaniu wysokich stężeń środka powierzchniowo czynnego jest to, że może on być trudniejszy do usunięcia na etapie oczyszczania. Zaleca się jednorazowe użycie urządzeń mikroprzepływowych, ale urządzenia mogą być ponownie użyte, jeśli zostaną przepłukane olejem Novec natychmiast po użyciu w celu usunięcia roztworu wodnego, który mógłby zalać urządzenie i zatkać kanały. Podczas gdy jedno urządzenie mikroprzepływowe może wyprodukować dużą przepustowość mikrożeli (ml/h), ta szybkość produkcji może być skalowana poprzez równoległe stosowanie wielu urządzeń mikroprzepływowych.

Etap wyżarzania montażu rusztowania MAP opiera się na zastosowaniu aktywowanego światłem fotoinicjatora polimeryzacji rodnikowej, a fotoinicjator można wybrać w zależności od pożądanego zastosowania. Na przykład fotoinicjator LAP ma krótki czas wyżarzania (<30 s) przy użyciu długofalowego światła UV, co ma minimalny wpływ na żywotność komórek in vitro¹⁴. Jednak ta długość fali jest silnie absorbowana przez tkankę¹⁶ i może nie mieć tak wysokiej skuteczności wyżarzania in vivo , jak in vitro.

Eozyna Y jest kolejnym fotoinicjatorem aktywowanym przez widzialne długości fal (505 nm) i ma głębszą penetrację w tkankę, co zwiększa zdolność rusztowania MAP do wyżarzania pod tkanką. Jednak długie czasy ekspozycji na światło potrzebne do wyżarzania eozyny Y mogą przedłużyć narażenie komórek na wolne rodniki i wpłynąć na żywotność komórek in vitro¹⁴. Wykorzystanie tych metod do wysokoprzepustowego generowania wysoce jednorodnych bloków budulcowych mikrożelu przyspieszy badania skoncentrowane na rusztowaniach MAP i przyczyni się do rozwoju wiedzy w dziedzinie wstrzykiwanych materiałów porowatych dla medycyny regeneracyjnej.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Chlorowodorek 2-aminoetanotiolu	Acros Organics	AC153770250	Do syntezy metMalu MW: 113,61 Da
Wirnik płytowy 35 mm	Geometria HAAKE	P35/Ti	do wiskozymetru HAAKE
4-ramienny PEG-Maleimide (10 kDa)	NOF AMERICA Corporation	SUNBRIGHT PTE-100MA	Do roztworu prekursora mikrożelu
4-ramienny PEG-Maleimid (20 kDa)	NOF AMERICA Korporacja	SUNBRIGHT PTE-200MA	Do syntezy metMal Masa cząsteczkowa specyficzna dla każdej partii
Strzykawka BD z końcówkami Luer-Lok	Becton Dickinson		Jednorazowe plastikowe strzykawki
Dziurkacz do biopsji	Mitex	MLTX33-31A-P/25
Chloroform-d	Acros Organics	AC209561000 o	do syntezy metMalu
Kolimowane światło LED Źródło	ThorLabs	M365LP1-C1	365 nm
Naczynie hodowlane (15 cm)	Corning	CLS430599	150 mm x 25 mm
DMTMM(chlorek 4-(4,6-dimetoksy-1,3,5-triazyno-2-ylo)-4-metylo-morfoliny)	Oakwood Chemical	151882	do syntezy metmalu MW: 276.72 Da
Fluorosurfactant	Ran Technologies	008-Flurosurfactant-5wtH-200G	5 procent wagowy 008- Flurosurfaktant w
systemie liofilizacji triady FreeZone HFE7500 FreeZone	Seria Labconco	7400000	do syntezy metmalu Liofilizator
Szkiełka szklane	Fisher Scientific	12-550-A3	Szkiełka zwykłe szklane, niepowlekane
Wiskozymetr HAAKE Rheowin	HAAKE
ImageJ			wersja 1.8.0_172
KDS Legato 210 Strzykawka z podwójnym bolcem Pompa	Kd Scientific
Sterownik LED	ThorLabs	DC2200
Fenylo-2,4,6-trimetylobenzoilofosfinian litu (LAP)	Sigma-Aldrich	900889	Fotoinicjator
Kwas metakrylowy	Sigma Aldrich	155721	do syntezy metmalu MW: 86,09 Da Gęstość: 1,015 g / ml
Urządzenie mikroprzepływowe SU8-Si wafel główny	FlowJem	N/A	Wykonane na zamówienie, z
silanizacją MMP-2 degradowalny środek sieciujący	Sekwencja FlowJem		: Ac-GCGPQGIAGQDGCG-NH2
Igły (25 G, fazowane)	BD	305122	Długość: 15,88 mm Wskaźnik: 0,5 mm
Novec 7500	3M	7100025016	Olej fluorowany
Tlen	Praxair	UN1072	Rurki kompresyjne
Peek	Trajan Scientific	03-350-523	1/32" Średnica zewnętrzna; 0.02" Średnica wewnętrzna; 10' Długość
PFOCTS (trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooktylo)silan)Silan)	Sigma-Aldrich	448931	Do obróbki powierzchni
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami	Fisher BioReagants	BP3994	Rozcieńczony do 1x w ultraczystej wodzie, pH = 7,4
Środek do czyszczenia plazmowego	Harrick Plasma	PDC-001-HP
Żyletka	Fisher Scientific	12-640
RGD peptyd adhezyjny do komórek	WatsonBio Sciences		Sekwencja: Ac-RGDSPGGC-NH2
Rheowin oprogramowanie	HAAKE		Oprogramowanie kompatybilne z wiskozymetrem HAAKE
Ostrze skalpela	Bard-Parker	371210	Rozmiar: #10
Rękojeść skalpela	Bard-Parker	371030	Rozmiar: #3
Chlorek sodu	Fisher BioReagents	BP358-1	do syntezy metmalu MW: 58.44 Da
Sylgard 184 zestaw elastomerów silikonowych	DOW Chemical	2065622	Baza i utwardzacz
Triethylamine	Fisher Scientific	O4884-100	Do syntezy metmalu MW: 101,19 Da Gęstość: 0,73 g / ml
Rurka Tygon	Saint Gobain Performance Plastics	AAD04103	ID: 0,51 mm < br / > OD: 1,52 mm
Spektrometr Varian Inova 500 Varian			NMR Znajduje się w Zakładzie Biomolekularnego Rezonansu Magnetycznego UVA