Artykuł metodologiczny

Synteza mikroprzepływowa mikrożelowych bloków budulcowych do rusztowania cząstek wyżarzonych mikroporowato

3.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/64119

⸱

16 czerwca 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, School of Engineering and Applied Sciences, University of Virginia, 2Department of Chemical Engineering, School of Engineering and Applied Sciences, University of Virginia

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje zestaw metod syntezy mikrożelowych bloków budulcowych dla mikroporowatych rusztowań z wyżarzonymi cząstkami, które mogą być używane do różnych zastosowań medycyny regeneracyjnej.

Streszczenie

Platforma rusztowania z mikroporowatymi cząstkami wyżarzonymi (MAP) jest podklasą granulowanych hydrożeli. Składa się z wstrzykiwanej zawiesiny mikrożeli, które mogą tworzyć strukturalnie stabilne rusztowanie z porowatością w skali komórkowej in situ po wtórnym etapie sieciowania chemicznego opartego na świetle (tj. wyżarzaniu). Rusztowanie MAP wykazało sukces w różnych zastosowaniach medycyny regeneracyjnej, w tym w gojeniu się ran skórnych, powiększaniu fałdów głosowych i dostarczaniu komórek macierzystych. W artykule opisano metody syntezy i charakterystyki mikrożeli z poli(glikolu etylenowego) (PEG) jako elementów budulcowych tworzących rusztowanie MAP. Metody te obejmują syntezę niestandardowego makromeru do wyżarzania (MethMAL), oznaczanie kinetyki żelowania prekursorów mikrożeli, wytwarzanie urządzeń mikroprzepływowych, mikroprzepływowe wytwarzanie mikrożeli, oczyszczanie mikrożeli i podstawową charakterystykę rusztowania, w tym wymiarowanie mikrożelu i wyżarzanie rusztowań. W szczególności opisane w niniejszym dokumencie wysokoprzepustowe metody mikroprzepływowe mogą wytwarzać duże ilości mikrożeli, które można wykorzystać do generowania rusztowań MAP do dowolnego pożądanego zastosowania, zwłaszcza w dziedzinie medycyny regeneracyjnej.

Wprowadzenie

Platforma rusztowań MAP to wstrzykiwalny biomateriał składający się wyłącznie z mikrocząsteczek hydrożelu (mikrożeli), które po usieciowaniu zapewniają mikroporowatość w skali komórki, co pozwala na migrację komórek niezależną od degradacji i integrację tkanek masowych1. Ze względu na zdolność do szybkiej integracji z tkanką gospodarza i z natury niską immunogenność, platforma rusztowań MAP wykazała przedkliniczne zastosowanie w szerokiej gamie terapii medycyny regeneracyjnej2,3,4,5,6,7,8,9,10, w tym przyspieszanie gojenia się ran skórnych1,3,11, rewaskularyzacja jamy mózgu po udarze7, dostarczanie mezenchymalnych komórek macierzystych2, oraz zapewnianie masowania tkanek w leczeniu niewydolności głośniowej6. Wykazano również, że MAP przekazuje działanie przeciwzapalne do tkanki gospodarza poprzez rekrutację makrofagów M23 i może być nawet dostrojony do promowania odpowiedzi immunologicznej Th2 "naprawy tkanek"8. Te korzystne właściwości platformy rusztowania MAP pozwalają na jej rozbudowę do różnorodnych zastosowań klinicznych.

Wcześniej opublikowane metody generowania mikrożeli do tworzenia rusztowań MAP obejmowały mikrofluidykę kropelkową skupiającą przepływ1,4,7,9, elektronatryskiwanie5,12, oraz wirowanie nad głową z emulsją wsadową6,10. Kropelkowa metoda mikroprzepływowa może wytwarzać cząstki o wysokiej monodyspersyjności, ale wykorzystuje bardzo niskie prędkości przepływu, które dają niską wydajność cząstek (μL/h). Alternatywnie, metody elektronatryskiwania i emulsji wsadowej mogą wytwarzać dużą ilość cząstek, ale z wysoką polidyspersją cząstek. Protokół ten wykorzystuje wysokoprzepustową metodę mikroprzepływową do produkcji mikrożeli z populacją monodyspersyjną, w oparciu o pracę de Rutte et al13. Metoda ta wykorzystuje techniki miękkiej litografii do wykonania urządzenia mikroprzepływowego z polidimetylosiloksanu (PDMS) z fotomaski, która jest następnie łączona ze szkiełkiem podstawowym . Konstrukcja urządzenia opiera się na emulgowaniu krokowym w celu wytworzenia dużej objętości cząstek mikrożelu (ml/h). Monodyspersjność, którą można osiągnąć za pomocą tej metody, zapewnia lepszą kontrolę porowatości w porównaniu z innymi technikami, ponieważ mikrożele monodyspersyjne mogą tworzyć rusztowania o bardziej jednolitych rozmiarach porów2.

Metody syntezy i charakterystyki poszczególnych mikrożeli, które mogą działać jako elementy budulcowe rusztowań MAP, są opisane w tym manuskrypcie, szczególnie w zakresie tworzenia mikrożeli, które składają się ze szkieletu PEG z grupą maleimidową (MAL), która łatwo uczestniczy w efektywnym dodawaniu typu Michaela z funkcjonalizowanymi tiolem środkami sieciującymi do żelowania mikrożeli. Aby oddzielić żelowanie mikrożelowe od wyżarzania rusztowań MAP, w tym manuskrypcie opisano również, jak zsyntetyzować opublikowany makromer do wyżarzania 14, MethMAL, który jest heterofunkcjonalnym 4-ramiennym makromerem PEG metakryloamidu/maleimidu. Grupy funkcyjne metakryloamidu łatwo uczestniczą w fotopolimeryzacji wolnorodnikowej (do wyżarzania mikrożeli), pozostając jednocześnie stosunkowo obojętne na warunki, które sprzyjają dodawaniu typu Michaela do grup funkcyjnych MAL.

Dodatkowo, ten manuskrypt opisuje protokoły tworzenia urządzeń mikroprzepływowych PDMS, określania kinetyki żelowania mikrożelu i charakteryzowania wielkości mikrożelu. Ostatnia część manuskryptu szczegółowo opisuje wyżarzanie rusztowań MAP, które ma miejsce, gdy mikrożele są przekształcane in situ w rusztowanie masowe poprzez wtórny, inicjowany foto etap sieciowania, który kowalencyjnie łączy ze sobą powierzchnie mikrożeli. Ważne jest, aby pamiętać, że istnieją inne metody wyżarzania, które można zastosować w systemach rusztowań MAP, które nie opierają się na chemii opartej na świetle, takie jak wyżarzanie za pośrednictwem enzymów, jak opisano wcześniej1. Ogólnie rzecz biorąc, metody te mogą być stosowane bezpośrednio lub z różnymi rodzajami chemicznymi hydrożelu (np. na bazie kwasu hialuronowego) w celu generowania rusztowań MAP do dowolnego zastosowania.

Protokół

1. Synteza makromeru sieciującego MethMAL

UWAGA: Niniejszy protokół dotyczy modyfikacji 1 g PEG-maleimidu, ale można go przeskalować w celu przygotowania większych partii.

  1. Do małego zlewki szklanej z mieszadłem magnetycznym dodać 1 g 4-ramiennego PEG-maleimidu o masie cząsteczkowej 20 kDa do 10 ml 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanowo (PBS, pH 7,4). Mieszać roztwór z prędkością 300 obr./min aż do całkowitego rozpuszczenia PEG (~30 min).
  2. Do mieszaniny reakcyjnej dodać 14,65 mg 2-aminoetanotiolu (molowy stosunek tiolu [SH] do maleimidu [MAL] wynoszący 0,67:1), mieszając przy prędkości 300 obr./min.
    UWAGA: Grupy tiolowe w 2-aminoetanotiolu zostaną przyłączone do około trzech ramion PEG-MAL poprzez addycję typu Michaela, pozostawiając końcowe grupy aminowe.
    1. Zapoznaj się z poniższym przykładem obliczenia ilości 2-aminoetanotiolu do dodania:
      Wzór na obliczanie liczby moli PEG, przedstawiający konwersję jednostek z gramów na mmol.
      wzór chemiczny PEG-MAL, obliczenia stechiometryczne, równanie analizy konwersji na mmol.
      Obliczanie masy molowej w równaniu konwersji moli na gramy dla 2-aminoetanotiolu.
      UWAGA: Aby uniknąć odważania bardzo małej ilości, rozpuścić 100 mg 2-aminoetanotiolu w 1 ml 1x PBS (pH 7,4) i dodać 146.5 µL tego roztworu do reakcji.
  3. Odczekać 1 h i 10 min po kroku 1.2., a następnie zmieszać 160,1 mg chlorku 4-(4,6-dimetoksy-1,3,5-triazyn-2-ylo)-4-metylomorfolinium (DMTMM, stosunek molowy do PEG 12:1) i 32.77 µL kwasu metakrylowego (stosunek molowy do PEG 8:1) w 5 ml 1x PBS (pH 7,4) w nowym zlewce szklanej i pozostawić do reakcji przez 50 min przy mieszaniu z prędkością 300 obr./min.
    UWAGA: Na tym etapie kwas metakrylowy reaguje z DMTMM, tworząc wysoce reaktywny ester, który może następnie zostać sprzężony z dostępnymi grupami aminowymi w PEG.
    1. Przeanalizuj poniższy przykład obliczeń służących do wyznaczenia ilości DMTMM, którą należy dodać:
      Wzór obliczania masy molowej glikolu polietylenowego, równanie wyznaczania mmol.
      Wzór obliczeń chemicznych: 0,0483 mmol × 12 DMTMM/PEG = 0,5796 mmol, równanie stechiometryczne.
      Obliczenia stechiometryczne, 0,5796 mmol × 276,2 g/mol DMTMM = 160,1 mg DMTMM, wzór chemiczny.
    2. Zapoznaj się z poniższym przykładem obliczeń ilości kwasu metakrylowego do dodania:
      Wzór na obliczanie masy molowej glikolu polietylenowego, równanie do wyznaczania mmol.
      Równanie do obliczenia konwersji molowej kwasu metakrylowego na PEG.
      Obliczanie wzoru masy kwasu metakrylowego; przeliczanie moli na gramy.
      Obliczenia kwasu metakrylowego; wzór: \(\frac{33.26 \, \text{mg}}{1.015 \, \text{g/mL}} = 32.77 \, \mu\text{L}\); analiza chemiczna.
  4. Dodaj roztwór kwasu metakrylowego/DMTMM do zlewki zawierającej roztwór PEG-MAL 20 kDa/2-aminoetanotiolu.
  5. Dodaj 53.56 µL trietyloaminy (stosunek molowy 1:1 w stosunku do kwasu metakrylowego) do zlewki i pozostawić do przereagowania przez noc przy mieszaniu z prędkością 300 obr./min. Zlewkę należy przykryć folią, aby zapobiec dostawaniu się do niej kurzu i innych zanieczyszczeń.
    1. Przeanalizuj poniższy przykładowy obliczenie ilości dodawanej trietyloaminy:
      Równanie chemiczne; konwersja kwasu metakrylowego do trietyloaminy; wzór obliczeń stechiometrycznych.
      Równanie przeliczenia masy, \(39,10 \, \text{mg}/(0,73 \, \text{g/mol}) = 53,56 \, \mu\text{L}\) trietyloaminy.
  6. Przenieś reakcję do membrany dializacyjnej typu snakeskin (próg odcięcia masy cząsteczkowej: 3 500 Da).
  7. Umieścić rurkę dializacyjną w dużym zlewce z 1 M NaCl w wodzie dejonizowanej (DI) (objętość powinna całkowicie zakrywać rurkę) na 3 dni, mieszając przy 300 obr./min. Roztwór 1 M NaCl należy wymieniać 2 razy dziennie, wykonując łącznie sześć płukań.
  8. Dializować przez 6 h w wodzie dejonizowanej. Wymieniać wodę dejonizowaną co godzinę, łącznie przez sześć cykli płukania.
  9. Przenieś mieszaninę reakcyjną do stożkowej probówki o pojemności 50 ml i zamroź w temperaturze −80 °C.
  10. Liofilizować zawartość probówki przez co najmniej 72 h, rozpoczynając od temperatury −70 °C oraz rampą temperatury wynoszącą 0.01 °C/min do 0 °C.
  11. Przygotuj próbkę do 1H-NMR poprzez rozpuszczenie 25 mg MethMAL w 700 µL chloroformu-d i przeniesienia do probówki NMR.
  12. Należy pobrać 1Widma H-NMR.
    UWAGA: Widma w niniejszym protokole zostały zarejestrowane przy użyciu spektrometru 500 MHz z następującymi parametrami: szerokość zakresu skanowania = 6 467,3 Hz, opóźnienie czasowe = 13,1 s, czas akwizycji = 5,1 s, czas impulsu = 5.1 µsor liczba skanów = 8.
  13. W celu przeprowadzenia analizy należy zintegrować sygnał maleimidu jako referencyjny (~6,76 ppm), a następnie zintegrować dwa sygnały metakrylamidu (~5,35 ppm i 5,6 ppm). Sumę pól sygnałów metakrylamidu należy podzielić przez całkowitą powierzchnię wszystkich trzech sygnałów, aby obliczyć procent ramion zmodyfikowanych metakrylamidem.
    UWAGA: Dopuszczalna modyfikacja to podstawienie grup funkcyjnych metakryloamidu w zakresie od 67% do 75%. Przykład 1Widmo H-NMR dla MethMAL przedstawiono na Rysunek 1.
    1. Użyj równania (1) jako równanie stopnia podstawienia:
      Wzór na stopień podstawienia, powierzchnie piku metakryloamidu, równanie chemii analitycznej.   (1)

Struktura chemiczna MethMAL wraz z danymi spektroskopowymi; schemat chemiczny i analiza widm NMR.
Rycina 1: Struktura chemiczna i widmo 1H-NMR MethMAL. (A) Struktura chemiczna: makromer sieciujący MethMAL składa się z 4-ramiennego poli(glikolu etylenowego) o masie 20 kDa, zmodyfikowanego trzema ramionami metakryloamidowymi. (B) Struktura ta generuje piki przy 5,36 ppm (3) i 5,76 ppm (2), których nie ma w widmach PEG-MAL, oraz jedno ramię maleimidowe, które generuje pik przy 6,71 ppm (1). Rozpuszczalnik, chloroform, wygenerował pik przy 7,26 ppm, a pozostałości wody w tej próbce wygenerowały pik przy 2,2 ppm (oznaczone na widmach). W widmach MethMAL zintegrowana powierzchnia piku maleimidowego wynosiła 0,27, a suma powierzchni pików metakryloamidowych wynosiła 0,73 (0,37 + 0,36). Procentowa modyfikacja metakryloamidowa wyniosła 73% (0,73/(0,27 + 0,73)). Rycina pochodzi z pracy Pfaff i wsp.14. Copyright (2021) American Chemical Society. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

2. Kinetyka żelowania prekursora mikrożelu

UWAGA: Czas żelowania można zmodyfikować poprzez dostosowanie pH buforu używanego do rozpuszczania składników prekursora żelu. W przypadku hydrożeli PEG-maleimidy bardziej kwasowe pH zazwyczaj odpowiada dłuższemu czasowi żelowania, ponieważ przy niższym pH zmniejsza się stężenie tiolanów15.

  1. Wstępnie określ pożądane stężenia polimeru, sieciującego oraz innych składników prekursorów żelu (tj.., peptydy, glikozaminoglikany). Rozpuścić PEG-MAL, RGD i MethMAL (szkielet PEG) w 10x PBS (pH 1,5), a czynnik sieciujący MMP-2 w 1x PBS (pH 7,4).
    UWAGA: W niniejszym protokole roztwór prekursorowy żelu jest oparty na opublikowanej recepturze3, w skład którego wchodzi 45,88 mg/ml 4-ramiennego PEG-MAL (10 kDa), 0,82 mg/ml RGD, 8,06 mg/ml MethMAL oraz 4,62 mg/ml sieciujący MMP-2 (sieciujący degradowalny enzymatycznie).
  2. Przygotować wiskozymetr lub równoważny instrument do pomiaru modułów magazynowania i strat przy zastosowaniu przerwy o wielkości 0,4 mm, odkształcenia ścinającego 1,0, częstotliwości 1,0 Hz oraz czasu trwania 10 800 s.
    1. Zamocuj geometrię rotora do płytek 35 mm (P35/Ti). W celu utrzymania wilgotnego środowiska zastosuj komorę nawilżaną lub wilgotną gąbkę wokół geometrii.
    2. Wymieszać szkielet PEG i sieciujący MMP w stosunku objętościowym 1:1.
    3. Pipeta 400 µL roztworu prekursora żelu na środek stolika wiskozymetru.
    4. Powoli opuszczaj geometrię na podstawkę, aż zostanie osiągnięta ustalona przerwa w wysokości 0,4 mm, a następnie niezwłocznie rozpocznij monitorowanie modułu zachowawczego (G') i modułu strat (G'') przez maksymalnie 6 h w temperaturze pokojowej.
      UWAGA: Przyjmuje się, że żelowanie rozpoczyna się w momencie, gdy moduł zachowawczy staje się większy od modułu strat, a żelowanie uznaje się za zakończone, gdy moduł zachowawczy osiągnie plateau. Reprezentatywna krzywa kinetyki żelowania przedstawiona jest na Rycina 2.

Wykres reologii żelowania przedstawiający moduł w funkcji czasu; wskazuje początek i plateau żelowania.
Rysunek 2: Reprezentatywna krzywa kinetyki żelowania roztworu prekursora żelu MAP (pH 4,5) wyznaczona za pomocą wiskozymetru. Żelowanie rozpoczyna się w momencie gwałtownego wzrostu modułu magazynowania (G'), a kończy się, gdy krzywa G' osiąga plateau. G'' oznacza moduł strat. Rysunek pochodzi z pracy Pruett et al.3. Copyright (2021) Wiley-VCH GmBH. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

3. Fabrykacja urządzenia mikrofluidycznego

UWAGA: Niniejszy protokół opisuje proces wytwarzania mikrofluidycznego urządzenia do emulsyfikacji stopniowej, którego projekt został dostosowany na podstawie pracy de Rutte i wsp.13, co przedstawiono na Ryc. 3A. Protokół ten można jednak zastosować do każdego projektu urządzenia wytrawionego w płytce SU-8. Zaleca się zlecenie zewnętrznemu wykonawcy wytwarzania matrycy z płytki krzemowej SU-8, chyba że do dyspozycji są odpowiednie pomieszczenia typu cleanroom umożliwiające jej wykonanie.

  1. Utworzenie pierwszego mikroprzepływowego urządzenia z polidimetylosiloksanu (PDMS) z fotomaski na płytce SU-8.
    1. Przygotować ~200 g PDMS poprzez zmieszanie bazy i czynnika sieciującego w stosunku masowym 10:1 (patrz Tabela materiałów).
    2. Umieścić płytkę SU-8 w szalce hodowlanej (przykleić krawędzie płytki do szalki) stroną z projektem mikroprzepływowym do góry.
    3. Wlać PDMS do szalki, tworząc warstwę o grubości 1-1,5 cm nad płytką. Umieścić szalkę w próżni w celu usunięcia pęcherzyków powietrza.
    4. Pozostawić PDMS do utwardzenia do momentu zestalenia (24 h w temperaturze pokojowej lub ~2 h w 60 °C).
    5. Po utwardzeniu PDMS ostrożnie użyć żyletki lub skalpela, aby wyciąć prostokąt w PDMS, zachowując margines 0,5-1 cm wokół projektu na płytce.
      UWAGA: Nie stosować zbyt dużego nacisku i postępować bardzo ostrożnie, aby uniknąć uszkodzenia (np. pęknięcia, zarysowania) płytki.
    6. Wsunąć szpatułkę w jedno z nacięć i przesunąć ją wzdłuż nacięć, aby oddzielić PDMS od płytki.
      UWAGA: W miarę oddzielania się PDMS od płytki, pod PDMS zacznie tworzyć się pęcherzyk powietrza (patrz Rycina 3B).
    7. Za pomocą szpatułki ostrożnie wyjąć prostokąt PDMS z szalki.
      UWAGA: Powstała przerwa w PDMS nad płytką będzie stanowiła formę dla urządzeń mikroprzepływowych.
  2. Utworzenie kolejnych mikroprzepływowych urządzeń z PDMS z fotomaski na płytce SU-8.
    1. Przygotować ~15-20 g PDMS na każdą formę, mieszając bazę i czynnik sieciujący w stosunku 10:1.
    2. Wlać PDMS do prostokątnej przerwy w formie, tworząc warstwę PDMS o grubości 5 mm nad płytką. Umieścić formę w próżni w celu usunięcia pęcherzyków powietrza.
    3. Pozostawić PDMS do utwardzenia do pełnego zestalenia (24 h w temperaturze pokojowej lub 2 h w 60 °C).
    4. Po utwardzeniu PDMS użyć żyletki lub skalpela, aby wyciąć PDMS wzdłuż krawędzi prostokąta.
      UWAGA: Nie stosować zbyt dużego nacisku i postępować bardzo ostrożnie, aby uniknąć uszkodzenia (tj. pęknięcia) płytki.
    5. Wsunąć szpatułkę w jedno z nacięć i przesunąć ją wzdłuż nacięć, aby oddzielić PDMS od płytki.
      UWAGA: W miarę oddzielania się PDMS od płytki, pod PDMS zacznie tworzyć się pęcherzyk powietrza.
    6. Użyć wycinaka do biopsji o średnicy 1,5 mm, aby wykonać otwory w prostokącie PDMS w dwóch wlotach i wylocie (patrz Rycina 3B).
    7. Jeśli na jednej płytce znajduje się wiele urządzeń, użyć szpatułki lub żyletki, aby lekko naciąć PDMS pomiędzy każdym urządzeniem, a następnie ostrożnie zgiąć PDMS wzdłuż linii nacięć, tak aby PDMS oddzielił się bardzo czysto.
    8. Przechowywać urządzenia z PDMS w pojemniku wolnym od kurzu.
  3. Łączenie mikroprzepływowych urządzeń z PDMS z szkiełkami przedmiotowymi.
    1. Przygotować jedno szkiełko przedmiotowe na każde mikroprzepływowe urządzenie z PDMS. Użyć taśmy, filtrowanego powietrza lub przemyć alkoholem izopropylowym (IPA), aby usunąć kurz ze szkiełka. Upewnić się, że szkiełka są całkowicie suche przed przejściem do następnego kroku.
    2. Umieścić szkiełko przedmiotowe i urządzenie z PDMS (stroną z projektem do góry) obok siebie na małej plastikowej tacy (dobrze sprawdza się pokrywka od płytki 96-dołkowej) i włożyć do oczyszczacza plazmowego. Zamknąć drzwiczki i zawór przepływu powietrza, a następnie włączyć pompę próżniową. Pozostawić włączoną przez co najmniej 30 s, a następnie wyłączyć.
    3. Podłączyć wąż z butli tlenowej do zaworu przepływu powietrza. Pozostawić komorę plazmową do napełnienia tlenem przez 30 s, następnie wyłączyć dopływ tlenu i zamknąć zawór przepływu powietrza.
    4. Włączyć pompę próżniową i ustawić poziom częstotliwości radiowej (RF) na wysoki. Czekać, aż komora przybierze kolor fioletowo-różowy (patrz Rycina 3B). Odczekać 30 s.
    5. Po sygnale czasomierza wyłączyć plazmę i próżnię. Następnie powoli otworzyć zawór przepływu powietrza, aby wypuścić próżnię. Wyjąć tacę z oczyszczacza plazmowego.
    6. Ostrożnie nałożyć urządzenie z PDMS na szkiełko przedmiotowe, aby je połączyć. W trakcie procesu łączenia obserwować niewielką różnicę w przezroczystości PDMS.
      UWAGA: Dla uzyskania najlepszych rezultatów połączone urządzenia przechowywać w 60 °C do momentu bezpośredniego użycia.
  4. Obróbka powierzchniowa mikroprzepływowych urządzeń z PDMS
    1. Przygotować preparat do obróbki powierzchniowej poprzez rozcieńczenie PFOCTS (trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silanu) w oleju Novec (1:50). Użyć 1 mL na 3-4 urządzenia. Przenieść objętość do strzykawki 1 mL i przymocować igłę 25 G.
      UWAGA: Igły stosowane w tym protokole są ścięte, dlatego należy zachować ostrożność podczas obchodzenia się z ostrymi narzędziami. Można również użyć igieł tępych, jeśli jest to preferowane.
    2. Odciąć kawałek rurki Tygon o długości 10-12 cm na każde urządzenie, które będzie poddane obróbce.
    3. Odciąć kawałek rurki PEEK o długości ~7 cm. Wsunąć kilka milimetrów rurki PEEK do końca rurki Tygon, jak pokazano na Rycina 4A, aby zapobiec przebiciu wlotów rurki Tygon przez igłę.
    4. Wyjąć urządzenie(ia) z komory grzewczej i wsunąć koniec rurki Tygon (ten bez PEEK) do otworu wlotowego dla fazy wodnej.
    5. Wsunąć igłę strzykawki z preparatem do obróbki powierzchniowej do rurki PEEK i zakryć otwór wylotowy komory olejowej (patrz Rycina 3B).
    6. Wstrzyknąć preparat do urządzenia powoli i upewnić się, że wypełnia ono urządzenie bez pęcherzyków powietrza. Poczekać, aż najpierw wypełnią się komory wodne, następnie mniejsze kanały, a na koniec komora olejowa. Usunąć rurkę Tygon z urządzenia. Po napełnieniu urządzenia pozostawić je na 10 min w temperaturze pokojowej.
    7. Napełnić strzykawkę 5 mL samym olejem (bez silanu) i przymocować igłę 25 G.
    8. Odssać preparat do obróbki powierzchniowej z urządzenia poprzez wloty i wylot. Wsunąć rurkę Tygon do wlotu wodnego, wsunąć strzykawkę z olejem do rurki PEEK i przepłukać każde urządzenie olejem. Odssać olej z urządzenia.
    9. Powtórzyć płukanie olejem jeszcze 2 razy. Usunąć rurkę Tygon.
      UWAGA: Urządzenie jest gotowe do użycia.

Projekt i proces wytwarzania chipa mikroprzepływowego; wloty wodne i olejowe, etapy przygotowania PDMS.
Rysunek 3: Mikroprzepływowe urządzenie z PDMS. (A) Rysunek projektu urządzenia mikroprzepływowego wykonany w programie do projektowania wspomaganego komputerowo (AutoCAD). Formowanie kropli mikrożeli odbywa się w kanałach po obu stronach kanału olejowego, co widać na powiększonym fragmencie. (B) Przegląd procesu wytwarzania urządzenia z PDMS. Skrót: PDMS = polidimetylosiloksan. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

4. Mikrofluidyczne generowanie mikrożeli

  1. Ustal wcześniej pożądane stężenia polimeru, sieciowania oraz innych komponentów prekursora żelu (t.j.., peptydy, glikozaminoglikany). Rozpuścić PEG-MAL, RGD oraz MethMAL (szkielet PEG) w 10x PBS (pH 1,5) a łącznik sieciujący MMP-2 wraz z 5 µM biotyny-maleimidu w 1x PBS (pH 7,4).
    UWAGA: W niniejszym protokole roztwór prekursora żelu jest oparty na opublikowanej formulacji3 składającego się z 45,88 mg/ml 4-ramiennego PEG-MAL (10 kDa), 0,82 mg/ml RGD, 8,06 mg/ml MethMAL oraz 4,62 mg/ml sieciujący MMP-2 (sieciujący ulegający degradacji enzymatycznej). Opisane poniżej metody pozwolą na otrzymanie ok. 3 ml mikrogeli.
  2. Przygotować 6 ml roztworu surfaktantu, rozcieńczając roztwór stokowy 5% FluoroSurfactant do stężenia co najmniej 1% w oleju Novec. Przenieść ten roztwór do strzykawki o pojemności 10 ml.
    UWAGA: Fluorowany surfaktant nie miesza się z wodą, co pozwala na jego łatwe usunięcie do fazy wodnej podczas przejścia żelu w trakcie płukania w roztworze PBS na etapie oczyszczania.
  3. Odetnij trzy odcinki rurki Tygon o długości odpowiedniej dla wysokości pompy strzykawkowej.
  4. Odetnij dwa kawałki rurki PEEK o długości ok. 1 cala. Wsuń kilka milimetrów rurki PEEK w końce dwóch kawałków rurki Tygon, jak pokazano w Rysunek 4Aaby zapobiec przebiciu wlotów rurek Tygon przez igłę.
  5. Wprowadź końcówkę rurki Tygon bez elementu PEEK do wlotów urządzeń mikroprzepływowych. Wprowadź pozostały fragment rurki Tygon (bez rurki PEEK na końcu) do wylotu urządzenia mikroprzepływowego, zgodnie z rysunkiem w Rycina 4C.
  6. Napełnij plastikową strzykawkę o objętości 5 ml co najmniej 3 ml oleju i załóż do niej igłę 25 G. Ostrożnie wprowadź igłę do rurki PEEK znajdującej się przy jednym z wlotów Tygon. Delikatnie przepłucz rurkę oraz urządzenie olejem. Zbierz olej z wylotu do probówki stożkowej. Powtórz płukanie olejem przy drugim wlocie Tygon.
  7. Ustaw pompy strzykawkowe na żądane przepływy.
    UWAGA: W niniejszym protokole zastosowano przepływ fazy wodnej wynoszący 3 ml/h oraz przepływ fazy olejowej wynoszący 6 ml/h. Może zajść potrzeba użycia dwóch oddzielnych pomp strzykawkowych.
  8. Podłącz strzykawkę zawierającą surfaktant do wlotu oleju za pomocą igły 25 G (patrz na Rycina 4A) i ostrożnie dozować odpowiednią ilość oleju, aby wypełnić przewodiki oraz kanał olejowy urządzenia mikroprzepływowego.
  9. Po przygotowaniu urządzenia i wlotów oleju, do nowej strzykawki o pojemności 5 mL, która będzie zawierać prekursor żelu, należy dodać 0,5 mL oleju. Celem dodania tej niewielkiej ilości oleju jest ułatwienie przepłukania roztworu prekursora przez urządzenie mikrofluidyczne pod koniec procesu.
  10. W probówce stożkowej połączyć 1,5 ml roztworu szkieletu PEG z 1,5 ml roztworu sieciującego. Mieszać na wibratorze (vortex) przez 30 s, a następnie szybko przenieść połączony roztwór prekursora żelu do strzykawki 5 ml.
  11. Połącz strzykawkę z roztworem prekursora żelu z wlotem wodnym za pomocą igły 25 G. Ostrożnie podaj odpowiednią ilość roztworu, aby wypełnić przewody oraz kanał wodny.
  12. Zamocuj strzykawki w odpowiednich pompach strzykawkowych i naciśnij uruchomić (patrz na Rysunek 4B). Należy upewnić się, że ciecz przepływa zarówno przez kanał wodny, jak i olejowy.
    UWAGA: Zaleca się użycie mikroskopu w celu wizualizacji tworzenia się mikrożeli w urządzeniu z PDMS.
  13. Należy wyszukać cząstki o jednolitym rozmiarze w kanałach (patrz na Rysunek 4D). Mikropelety z wylotu należy zebrać do probówki stożkowej.

Schemat układu mikroprzepływowego i obrazy mikroskopowe pokazujące interfejs olej-woda oraz tworzenie emulsji.
Rysunek 4: Układ mikroprzepływowy. (A) Przedstawienie metody łączenia rurek PEEK (góra) i rurek Tygon z igłą 25 G w strzykawce (dół). (B) Układ mikroprzepływowy z pompami strzykawkowymi, rurkami, urządzeniem i mikroskopem. (C) Obraz konfiguracji urządzenia mikroprzepływowego z dwoma wlotami (wodnym i olejowym) oraz jednym wylotem. (D) Schemat urządzenia mikroprzepływowego i reprezentatywny obraz w jasnym polu oczekiwanej formacji mikrożeli z kanałów w urządzeniu do emulsyfikacji stopniowej. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

5. Oczyszczanie i sterylizacja mikrogeli

  1. Po zakończeniu żelowania (wyznaczonym jako czas osiągnięcia plateau modułu magazynowania w charakterystyce kinetyki żelowania), za pomocą pipety ostrożnie usuń fazę olejową z dna probówki (patrz Rysunek 5). Przenieś ją do odpowiedniego pojemnika na odpady fluorowane.
    UWAGA: Czas żelowania można przyspieszyć, dodając do probówki zbiorczej zasadę rozpuszczalną w rozpuszczalnikach organicznych (np. trietyloaminę), jednak należy pamiętać, że dodanie silnej zasady może spowodować hydrolizę nieprzereagowanych maleimidów. Jeśli planowana jest funkcjonalizacja mikrogeli za pomocą nadmiaru maleimidów po żelowaniu, pomiń etap dodawania trietyloaminy.
  2. Dodaj do probówki z mikrogelami dodatkowy olej w stosunku 1:1. Wymieszaj, delikatnie odwracając probówkę. Nie używaj wirówki typu vortex.
  3. Pozostaw probówkę zbiorczą na około 5 min, aby umożliwić rozdzielenie faz. Faza olejowa powinna znajdować się na dnie, a faza wodna (mikrogela) na górze (patrz Rysunek 5).
  4. Powtórz przemywanie olejem co najmniej 2 razy.
  5. Dodaj olej w stosunku 1:1 do żelu oraz 1x PBS w stosunku PBS do żelu 4:1. Odwróć probówkę kilka razy, aby wymieszać zawartość. Aby rozdzielić warstwy, wiruj probówkę przy prędkości ~2,000 x g przez około 30 s. Faza olejowa powinna znajdować się na dnie probówki, żel w środku, a PBS na górze (patrz Rysunek 5).
  6. Usuń fazę olejową pipetą i wyrzuć do pojemnika na odpady.
    UWAGA: Nie usuwaj PBS. Jeśli oryginalna probówka zbiorcza miała pojemność 15 mL, użyj większej probówki stożkowej do dalszych etapów przemywania.
  7. Powtórz przemywanie olejem i PBS jeszcze 2 razy. Podczas ostatniego przemywania żel powinien zmienić barwę z mętnej na przejrzystą, jak pokazano na Rysunku 5, co wskazuje na usunięcie surfaktantu i przejście żelu w fazę PBS.
  8. Usuń cały olej. Nie usuwaj PBS z probówki stożkowej.
  9. W dygestorium chemicznym za pomocą pipety szklanej dodaj do probówki heksany w objętości równej objętości PBS. Wiruj probówkę stożkową typu vortex przez 30 s lub do całkowitego wymieszania. Wirowarkuj przy 4,696 x g przez 5 min.
  10. Po rozdzieleniu warstw heksany powinny znajdować się w górnej warstwie, PBS w środku, a żel na dnie (patrz Rysunek 5). Usuń warstwę heksanu i wyrzuć ją do pojemnika na odpady organiczne. Odsaj PBS.
  11. Powtórz przemywanie heksanem i PBS co najmniej 2 razy lub do momentu, aż żel stanie się prawie przezroczysty (patrz Rysunek 5). Przemyj żel PBS jeszcze raz, aby usunąć pozostałości heksanów. Wirowarkuj przy 4,696 x g przez 5 min. Odsaj warstwę PBS. Należy uważać, aby nie naruszyć osadu żelu.
    1. Aby zablokować (wygasić) nieprzereagowane maleimidy w mikrogelach, przygotuj 100 mM roztwór N-acetyl-L-cysteiny w 1x PBS i dodaj go do żelu. Umieść probówkę na rotatorze w temperaturze 37 °C przez noc, a następnie wielokrotnie przemyj PBS, aby usunąć nieprzereagowaną N-acetyl-L-cysteinę.
    2. Do długoterminowego przechowywania (do 1 roku) resuspenduj mikrogela w 70% IPA i przechowuj w temperaturze 4 °C, aby zapobiec wzrostowi bakterii na mikrogelach.
    3. Aby wysterylizować mikrogela, dodaj do żelu 70% IPA w stosunku objętościowym 4:1 v/v w komorze z laminarnym przepływem powietrza. Wiruj probówkę typu vortex przez 30 s, a następnie wirowarkuj przy 4,696 × g przez 5 min. Odsaj nadsącz IPA znad osadu żelu w komorze z laminarnym przepływem powietrza. Wykonaj jeszcze 2 przemycia IPA, a następnie 3 przemycia sterylnym 1x PBS.
      UWAGA: Przed użyciem żelu z komórkami lub zwierzętami należy usunąć cały IPA.

Proces oczyszczania żelu; etapowe przemywanie PBS i olejem; usuwanie heksanu; porównanie przejrzystości żelu.
Rycina 5: Przegląd procedury oczyszczania mikrożelu. Skróty: PBS = fosforanowy bufor solny; IPA = alkohol izopropylowy. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

6. Charakterystyka wielkości mikrożeli

UWAGA: Przed pomiarem wielkości zaleca się pozostawienie cząstek mikrogelu w 1x PBS przez noc w temperaturze 37 °C w celu ich pęcznienia do końcowej średnicy.

  1. Wykonaj obrazowanie cząsteczek żelu.
    1. Odwiruj żel MAP przy 4 696 × g przez 5 min, a następnie odessać supernatant.
    2. Za pomocą pipety wyporowej usunąć 5 µL mikrożeli z osadu żelowego i rozcieńczyć w 1 ml PBS w probówce do mikrocentryfugi (rozcieńczenie 1:200). Dostosować to rozcieńczenie w razie potrzeby.
      UWAGA: Podczas przygotowywania roztworu prekursora żelu, 5 µM można dodać biotynę z maleimidem i wykorzystać ją jako alternatywę dla znakowania mikrożeli fluoroforem. W takim przypadku można dodać streptawidynę sprzężoną z fluoroforem w rozcieńczeniu 1:300 (z roztworu stokowego o stężeniu 1 mg/mL). Przed obrazowaniem należy inkubować próbki ze streptawidyną przez co najmniej 15 min.
    3. Przy użyciu pipety wyporowej przenieś 100 µL rozcieńczonych mikrogeli do dołków przezroczystej płytki 96-dołkowej.
    4. Użyj mikroskopu szerokopolowego lub konfokalnego, aby zwizualizować mikrogela za pomocą obiektywu 10x. Wykonaj zdjęcia mikrogeli do analizy.
    5. Zobacz Rycina 6 dla reprezentatywnych obrazów konfokalnych mikrogeli.
  2. Pomiar rozmiaru cząstek za pomocą programu ImageJ
    1. Otwórz pliki obrazów z mikroskopu w programie ImageJ.
    2. Wybierz Analiza | Ustawienie skali oraz ustaw skalę obrazu zgodnie z obiektywem mikroskopu.
    3. Wybierz Obraz | Typ | 8-bitowy.
    4. Wybierz Obraz | Regulacja | Próg a następnie wybierz „Metoda Otsu" opcja automatycznego progu z listy rozwijanej.
    5. Kliknij w Analiza | Ustawienia pomiarów oraz wybierz średnica Fereta i ograniczyć do wartości progowej.
    6. Kliknij w Analizuj | Analizuj cząstki i wejdź do obszaru zakres wielkości (w px^2) przewidywane dla mikrogeli (aby wykluczyć analizę drobnych zanieczyszczeń). Zmień cykliczność do 0.75-1.00 i wybierz Pokaż | KonspektSprawdź Wyświetl wyniki i Wyklucz krawędzie.
      UWAGA: Filtr kształtu okrągłości wyklucza mikrożele znajdujące się na krawędzi obrazu, które mogą dawać nieprawidłowy pomiar średnicy.
    7. Uruchomić Analiza cząstek moduł
    8. Należy odczekać na wynik, którym jest średnica Fereta każdej cząstki, a następnie wyeksportować te wyniki do arkusza kalkulacyjnego.
    9. W niniejszym protokole należy obliczyć indeks polidyspersyjności (PDI), aby określić heterogeniczność rozmiaru mikrogeli. Przeanalizuj co najmniej 100 mikrogeli w celu zdefiniowania populacji: zakres PDI od 1,00 do 1,05 definiuje populację monodyspersyjną, a PDI powyżej 1,05 definiuje populację polidyspersyjną. Skorzystaj z równania (2), równanie (3), a równanie (4) w celu obliczenia PDI, zgodnie z opisem poniżej.
      Wzór na średnicę mikrożeli liczbowo średnią, Σ(liczba mikrożeliלrednica)/(liczba mikrożeli). (2)
      Wzór na średnią ważoną średnicę mikrogelu, równanie do obliczania \(D_w\), zastosowanie edukacyjne. (3)
      wzór na równanie PDI; stosunek średniej masy cząsteczkowej średniej wagowej do średniej masy cząsteczkowej średniej liczbowej; koncepcja analizy polimerów. (4)

Mikroskopia fluorescencyjna, analiza obrazu cząsteczek mikrożeli, obejmuje progowanie i wyniki pomiarów.
Rysunek 6: Reprezentatywne obrazy mikrożeli. (A) konfokalny obraz fluorescencyjny populacji mikrożeli A, (B) obraz mikrożeli po progowaniu oraz (C) obrysy cząsteczek po analizie w programie ImageJ. (D) konfokalny obraz fluorescencyjny populacji mikrożeli B oraz (E) obraz mikrożeli w świetle przechodzącym (mikrożele są niemal przezroczyste). (F) Przedstawienie reprezentatywnych wyników analizy w programie ImageJ opisanej w niniejszym protokole. Obie populacje mikrożeli charakteryzują się stosunkowo monodyspersyjnymi PDI. Obie populacje mikrożeli zostały zsyntetyzowane przy szybkości przepływu fazy wodnej 3 mL/h i szybkości przepływu fazy olejowej 6 mL/h. Różnica w rozmiarze mikrożeli wynika jednak z różnic w rozmiarze stopnia urządzenia mikroprzepływowego. Na przykład populacja mikrożeli A została zsyntetyzowana w urządzeniu mikroprzepływowym o rozmiarze stopnia kanału 11 µm, a populacja mikrożeli B w urządzeniu o rozmiarze stopnia 40 µm. Paski skali = 100 µm. Skrót: PDI = indeks polidyspersyjności. Aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.

7. Wygrzewanie rusztowania z mikroporowatych wyżarzanego cząsteczek (MAP)

  1. Przygotować roztwór zapasowy 2 mM fenylo-2,4,6-trimetylobenzoilfosfinianu litu (LAP) w 1x PBS (pH 7.4).
  2. Rozcieńczyć roztwór zapasowy LAP do stężenia 0.2 mM w objętości 1x PBS odpowiadającej objętości żelu. W przypadku stosowania fotoinicjatora LAP do badań nad komórkami lub badań na zwierzętach, należy pamiętać o sterylizacji roztworu przed użyciem.
  3. Odwirować żel MAP przy 4,696 × g przez 5 min i odprowadzić nadosad.
  4. Za pomocą pipety wypierającej przenieść pożądaną objętość żelu do probówki do mikrocentryfugi.
  5. Dodać 0.2 mM LAP do żelu w stosunku objętościowym 1:1 (końcowe stężenie LAP wynosi 0.1 mM).
  6. Wymieszać mieszaninę w wstrząsarze typu vortex i inkubować przez co najmniej 15 min w ciemności.
  7. Wirować mieszaninę przy 18,000 × g przez 5 min, aby uzyskać osad z żelu.
  8. Ostrożnie usunąć nadosad z osadu żelu.
  9. Przenieść żel MAP do docelowego miejsca za pomocą pipety wypierającej.
  10. Naświetlić próbkę skupionym światłem (365 nm, 8.66mW/cm2) przez 113 s w celu utwardzenia rusztowania.
    UWAGA: Czas utwardzania wynoszący 113 s został zoptymalizowany zgodnie z wcześniejszą publikacją dla stężenia LAP 0.1 mM14, jednak może być wymagana dodatkowa optymalizacja dla innych stężeń fotoinicjatora.

Wyżarzanie indukowane światłem, schematy molekularne; mikroskopia fluorescencyjna 3D sieci polimerowej.
Rysunek 7: Wyżarzanie rusztowania MAP. (A) Schemat wyżarzania rusztowania MAP. Po wystawieniu na działanie fotoinicjatora i światła, grupy funkcyjne metakryloamidowe w makromerze MethMAL ulegają reakcji fotopolimeryzacji typu click, co wiąże ze sobą powierzchnie mikrogeli. (B) Przedstawienie renderowania 3D (Imaris) obrazu z mikroskopu dwufotonowego, ukazującego mikrogele MAP (kolor zielony) wyżarzone razem w kształt krążka 3D, z dekstranem (kolor czerwony) w porach. (C) Przedstawienie renderowania 3D (Imaris) obrazu z mikroskopu dwufotonowego wykazującego porowatość rusztowania MAP, które zostało przepłukane fluorescencyjnym dekstranem 70 kDa (kolor czerwony). Paski skali = (B) 100 µm, (C) 70 µm. Skróty: MAP = microporous annealed particle; MethMAL = niestandardowy makromer do wyżarzania. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Wyniki

Celem tego protokołu jest nakreślenie wszystkich kroków niezbędnych do syntezy bloków budulcowych mikrożelu, które mają być użyte w rusztowaniu MAP. Makromer do wyżarzania MethMAL jest wysoce selektywny i wydajny oraz jest kompatybilny z wieloma szkieletami polimerowymi14. Ważne jest, aby co najmniej 67%-75% z 20 kDa PEG-maleimidu było modyfikowane grupami funkcyjnymi metakryloamidu, aby zapewnić wysoką wydajność wyżarzania. Procentową modyfikację można najłatwiej wyznaczyć, analizując piki widma 1H-NMR, jak pokazano na rysunku Rysunek 1. Kinetyka żelowania, określana za pomocą lepkościomierza, jest ważnym wskaźnikiem, który należy wziąć pod uwagę dla każdej formuły żelu. Protokół ten wykorzystuje roztwór prekursora żelu składający się ze szkieletu PEG z grupą MAL, który skutecznie reaguje z funkcjonalizowanymi tiolami sieciami w celu żelowania mikrożelu. Jednak wiele chemii hydrożeli można wykorzystać do wytwarzania mikrożeli za pomocą opisanej w niniejszym dokumencie metody mikroprzepływowej o wysokiej przepustowości. Czas do rozpoczęcia żelowania zapewni wgląd w czas wytwarzania mikrożelu mikroprzepływowego. Zaleca się wybór pH prekursora żelu, który może zainicjować żelowanie między 30 minutami (Rysunek 2) do 2 godzin.

Jeśli czas żelowania jest zbyt krótki, roztwór prekursora żelu zacznie polimeryzować w urządzeniu mikroprzepływowym i zatkać kanały. Ponadto ważne jest, aby pamiętać, że zmiana stężeń tiolowanych ligandów (np. RGD) może mieć wpływ na tworzenie sieci podczas żelowania i może być konieczna do uwzględnienia poprzez dostosowanie preparatu. Etapy produkcji urządzenia mikroprzepływowego mogą być żmudne, ale reprezentatywne wyniki pomyślnie połączonego urządzenia są pokazane w Rysunek 3. Protokół ten wykorzystuje wysokowydajne, równoległe, krokowe urządzenie mikroprzepływowe, które zostało zaadaptowane z projektu de Rutte et al.13, a produkcja płytek krzemowych została zlecona firmie zajmującej się technologią mikroprzepływową. Jednak kroki opisane w tym protokole mogą być używane z dowolnym projektem urządzenia wytrawionym na fotomasce z wafla krzemowego SU-8. Ważne jest, aby pamiętać, że rozmiar kroku kanałów na fotomasce musi być zoptymalizowany podczas produkcji urządzenia, ponieważ będzie to miało wpływ na wielkość cząsteczek mikrożelu.

Natężenia przepływu dla mikroprzepływowego wytwarzania mikrożeli powinny być zoptymalizowane dla każdej formuły żelu w oparciu o takie czynniki jak czas żelowania, pożądana wielkość cząstek i konstrukcja urządzenia mikroprzepływowego. W przypadku korzystania z urządzenia o wysokiej przepustowości, natężenia przepływu w fazie wodnej mogą sięgać nawet 5 ml/h. Rysunek 4B przedstawia konfigurację dla urządzeń o wysokiej przepustowości używanych w tym protokole. Jeśli urządzenie działa poprawnie, tworzenie mikrożelu powinno wyglądać podobnie do pokazanego na Rysunek 4D. Przed oczyszczeniem mikrożele będą nieprzezroczyste. Po zakończeniu różnych myć olejem, PBS i heksanem, żel powinien wyglądać na przezroczysty, jak na reprezentatywnym obrazie na Rysunek 5. W przypadku włączenia fluoroforu do mikrożeli, oczyszczony produkt może mieć lekki odcień koloru, ale nadal powinien być bliski półprzezroczystości. Po oczyszczeniu i spęcznieniu mikrożele powinny mieć bardzo jednolitą wielkość i PDI między 1,00 a 1,05, jak pokazano na Rysunek 6. Do fotowyżarzania rusztowań MAP można stosować różne fotoinicjatory. W przypadku korzystania z alternatywy dla LAP, opisanej w niniejszym dokumencie, należy określić kinetykę wyżarzania zgodnie z wcześniejszym opisem14. Dodatkowo do fotowyżarzania można stosować różne źródła światła, o ile źródło światła odpowiada fotoinicjatorowi. Należy upewnić się, że źródło światła zostało skalibrowane i ustawione na ostrości. Czas wyżarzania i intensywność światła mogą wymagać optymalizacji w oparciu o formułę żelu i stężenie fotoinicjatora. Metoda wyżarzania opisana w niniejszym protokole może być stosowana w badaniach in vitro i in vivo. Po wyżarzaniu mikrożele utworzą porowate rusztowanie, które można uwidocznić za pomocą mikroskopii dwufotonowej (Rysunek 7B-C).

Dyskusja

Protokół ten opisuje metody syntezy i charakterystyki mikrożeli, które służą jako elementy budulcowe rusztowań z mikroporowatymi cząstkami wyżarzonymi (MAP). Protokół ten wykorzystuje wysokoprzepustowe podejście mikroprzepływowe do generowania dużych objętości jednorodnych mikrożeli, czego nie można osiągnąć innymi metodami, takimi jak mikrofluidykaskupiająca przepływ 1,4,7,9 (wysoka monodyspersja, niska wydajność), emulsja wsadowa 6,10 i elektronatryskiwanie 5,12 (niska monodyspersyjność, wysoka wydajność). Dzięki metodom opisanym w niniejszym dokumencie, mikrożele monodyspersyjne mogą być wytwarzane do stosowania w rusztowaniach MAP, które mogą być wykorzystywane do różnych zastosowań w medycynie regeneracyjnej (np. dostarczanie komórek, gojenie się ran).

Kluczowym etapem tego protokołu jest stworzenie urządzeń mikroprzepływowych PDMS. Jeśli urządzenia nie są wykonane prawidłowo, może to mieć negatywny wpływ na tworzenie mikrożeli i monodyspersyjność. Ważne jest, aby zapobiec wprowadzaniu artefaktów (tj. pęcherzyków, kurzu) do PDMS przed jego utwardzeniem, ponieważ może to zatkać kanały i znacząco wpłynąć na tworzenie mikrożelu. Aby to w jak największym stopniu złagodzić, należy użyć taśmy do usunięcia kurzu, przechowywać urządzenia w pojemniku bezpyłowym i pracować w okapie odpylającym, jeśli to możliwe. Zaleca się również przechowywanie urządzeń w temperaturze 60 °C w celu uzyskania najlepszych rezultatów obróbki powierzchni.

Podczas nalewania urządzeń PDMS ważne jest, aby utrzymać jednolitą grubość, która jest mniej więcej równa lub mniejsza niż długość stempla biopsyjnego. Jeśli urządzenie jest zbyt grube, stempel biopsyjny nie będzie w stanie przeniknąć na wylot. Ważne jest również, aby nie rozerwać wlotów/wylotów urządzenia PDMS podczas przebijania dziurkaczem do biopsji i/lub wkładania rurki. Rozdarcie w urządzeniu PDMS spowoduje wyciek z wlotów/wylotów, co może spowodować utratę roztworu prekursora żelu. Jeśli w urządzeniu PDMS występuje nieszczelność, najlepszym rozwiązaniem jest jak najszybsza wymiana go na nowe.

Podczas obróbki plazmowej urządzenia, użycie czystego tlenu i obróbka plazmowa przez 30 s dały najlepsze wyniki w przypadku przylegania PDMS do szkiełka podstawowego. Jeśli urządzenie nie łączy się prawidłowo (tj. PDMS można nadal podnieść ze szkiełka po obróbce plazmowej), należy dokładnie sprawdzić, czy urządzenie do obróbki plazmowej działa prawidłowo i czy urządzenie i szkiełka zostały dokładnie wyczyszczone. Ważne jest również, aby stosować odpowiednią obróbkę powierzchni silanową, a w celu uzyskania najlepszych wyników urządzenia PDMS powinny być poddane obróbce powierzchniowej bezpośrednio przed użyciem. Można również zastosować inne metody obróbki powierzchni, takie jak chemiczne osadzanie z fazy gazowej.

Kolejnym kluczowym krokiem jest prawidłowe użycie urządzeń mikroprzepływowych PDMS do tworzenia mikrożelu. Zaleca się stosowanie współczynnika przepływu co najmniej 2:1 (w tym protokole wykorzystuje się natężenie przepływu oleju 6 ml/h i natężenie przepływu wody 3 mL/h), ale można go dostroić, aby osiągnąć pożądany rozmiar mikrożelu. pH roztworu prekursora mikrożelu jest również ważnym wskaźnikiem, który należy zoptymalizować, aby zapobiec zatkaniu urządzenia. Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) przyspiesza tworzenie tiolanów w chemii addycji typu Michaela, a stężenia PBS stosowane w tym protokole dają najlepsze wyniki żelowania mikrożeli w urządzeniach mikroprzepływowych. Po uruchomieniu pomp strzykawkowych w kanałach mikroprzepływowych mogą pojawić się pęcherzyki, ale po kilku minutach powinny się one zrównoważyć. Zaleca się monitorowanie tworzenia się mikrożelu pod mikroskopem. Jeśli przepływ nie wygląda podobnie jak na tym filmie i/lub istnieje kilka kanałów wytwarzających duże cząstki, prawdopodobnie jest to spowodowane problemami z etapem obróbki powierzchni. Najlepszym rozwiązaniem jest wymiana urządzenia na takie, które zostało świeżo poddane obróbce powierzchniowej.

Jeśli mikrożele wydają się łączyć w konwalescencję, może to być spowodowane niewystarczającym stężeniem FluoroSurfaktantu. Zalecanym rozwiązaniem jest zwiększenie % wag. surfaktantu w fazie olejowej. Jednak jednym z ograniczeń w stosowaniu wysokich stężeń środka powierzchniowo czynnego jest to, że może on być trudniejszy do usunięcia na etapie oczyszczania. Zaleca się jednorazowe użycie urządzeń mikroprzepływowych, ale urządzenia mogą być ponownie użyte, jeśli zostaną przepłukane olejem Novec natychmiast po użyciu w celu usunięcia roztworu wodnego, który mógłby zalać urządzenie i zatkać kanały. Podczas gdy jedno urządzenie mikroprzepływowe może wyprodukować dużą przepustowość mikrożeli (ml/h), ta szybkość produkcji może być skalowana poprzez równoległe stosowanie wielu urządzeń mikroprzepływowych.

Etap wyżarzania montażu rusztowania MAP opiera się na zastosowaniu aktywowanego światłem fotoinicjatora polimeryzacji rodnikowej, a fotoinicjator można wybrać w zależności od pożądanego zastosowania. Na przykład fotoinicjator LAP ma krótki czas wyżarzania (<30 s) przy użyciu długofalowego światła UV, co ma minimalny wpływ na żywotność komórek in vitro14. Jednak ta długość fali jest silnie absorbowana przez tkankę16 i może nie mieć tak wysokiej skuteczności wyżarzania in vivo , jak in vitro.

Eozyna Y jest kolejnym fotoinicjatorem aktywowanym przez widzialne długości fal (505 nm) i ma głębszą penetrację w tkankę, co zwiększa zdolność rusztowania MAP do wyżarzania pod tkanką. Jednak długie czasy ekspozycji na światło potrzebne do wyżarzania eozyny Y mogą przedłużyć narażenie komórek na wolne rodniki i wpłynąć na żywotność komórek in vitro14. Wykorzystanie tych metod do wysokoprzepustowego generowania wysoce jednorodnych bloków budulcowych mikrożelu przyspieszy badania skoncentrowane na rusztowaniach MAP i przyczyni się do rozwoju wiedzy w dziedzinie wstrzykiwanych materiałów porowatych dla medycyny regeneracyjnej.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Autorzy chcieliby podziękować Joe de Rutte i Laboratorium Di Carlo na Uniwersytecie Kalifornijskim w Los Angeles za pomoc w oryginalnym projekcie urządzenia mikroprzepływowego, na podstawie którego powstało zgłoszone urządzenie, a także za ich wczesne wskazówki dotyczące produkcji urządzeń PDMS i rozwiązywania problemów. Schematy rysunkowe zostały stworzone za pomocą Biorender.com.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Chlorowodorek 2-aminoetanotioluAcros OrganicsAC153770250Do syntezy metMalu
MW: 113,61 Da
Wirnik płytowy 35 mmGeometria HAAKEP35/Tido wiskozymetru HAAKE
4-ramienny PEG-Maleimide (10 kDa)NOF AMERICA CorporationSUNBRIGHT PTE-100MADo roztworu prekursora mikrożelu
4-ramienny PEG-Maleimid (20 kDa)NOF AMERICA KorporacjaSUNBRIGHT PTE-200MADo syntezy metMal
Masa cząsteczkowa specyficzna dla każdej partii
Strzykawka BD z końcówkami Luer-LokBecton DickinsonJednorazowe plastikowe strzykawki
Dziurkacz do biopsjiMitexMLTX33-31A-P/25
Chloroform-dAcros OrganicsAC209561000 odo syntezy metMalu
Kolimowane światło LED ŹródłoThorLabsM365LP1-C1365 nm
Naczynie hodowlane (15 cm)CorningCLS430599150 mm x 25 mm
DMTMM(chlorek 4-(4,6-dimetoksy-1,3,5-triazyno-2-ylo)-4-metylo-morfoliny)Oakwood Chemical151882do syntezy metmalu
MW: 276.72 Da
FluorosurfactantRan Technologies008-Flurosurfactant-5wtH-200G5 procent wagowy 008- Flurosurfaktant w
systemie liofilizacji triady FreeZone HFE7500 FreeZoneSeria Labconco7400000do syntezy metmalu
Liofilizator
Szkiełka szklaneFisher Scientific12-550-A3Szkiełka zwykłe szklane, niepowlekane
Wiskozymetr HAAKE RheowinHAAKE
ImageJwersja 1.8.0_172
KDS Legato 210 Strzykawka z podwójnym bolcem PompaKd Scientific 
Sterownik LEDThorLabsDC2200
Fenylo-2,4,6-trimetylobenzoilofosfinian litu (LAP)Sigma-Aldrich900889Fotoinicjator
Kwas metakrylowySigma Aldrich155721do syntezy metmalu
MW: 86,09 Da
Gęstość: 1,015 g / ml
Urządzenie mikroprzepływowe SU8-Si wafel głównyFlowJemN/AWykonane na zamówienie, z
silanizacją MMP-2 degradowalny środek sieciującySekwencja FlowJem: Ac-GCGPQGIAGQDGCG-NH2
Igły (25 G, fazowane)BD305122Długość: 15,88 mm
Wskaźnik: 0,5 mm
Novec 75003M7100025016Olej fluorowany
TlenPraxairUN1072Rurki kompresyjne
PeekTrajan Scientific03-350-5231/32" Średnica zewnętrzna; 0.02" Średnica wewnętrzna; 10' Długość
PFOCTS (trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooktylo)silan)Silan)Sigma-Aldrich448931Do obróbki powierzchni
Sól fizjologiczna buforowana fosforanamiFisher BioReagantsBP3994Rozcieńczony do 1x w ultraczystej wodzie, pH = 7,4
Środek do czyszczenia plazmowegoHarrick PlasmaPDC-001-HP
ŻyletkaFisher Scientific12-640
RGD peptyd adhezyjny do komórekWatsonBio SciencesSekwencja: Ac-RGDSPGGC-NH2
Rheowin oprogramowanieHAAKE Oprogramowanie kompatybilne z wiskozymetrem HAAKE
Ostrze skalpelaBard-Parker371210Rozmiar: #10
Rękojeść skalpelaBard-Parker371030Rozmiar: #3
Chlorek soduFisher BioReagentsBP358-1do syntezy metmalu
MW: 58.44 Da
Sylgard 184 zestaw elastomerów silikonowychDOW Chemical2065622Baza i utwardzacz
TriethylamineFisher ScientificO4884-100Do syntezy metmalu
MW: 101,19 Da
Gęstość: 0,73 g / ml
Rurka TygonSaint Gobain Performance PlasticsAAD04103ID: 0,51 mm < br / > OD: 1,52 mm
Spektrometr Varian Inova 500 VarianNMR
Znajduje się w Zakładzie Biomolekularnego Rezonansu Magnetycznego UVA
średnicy 1,5 mm :

Bibliografia

  1. Griffin, D. R., Weaver, W. M., Scumpia, P. O., di Carlo, D., Segura, T. Accelerated wound healing by injectable microporous gel scaffolds assembled from annealed building blocks. Nature Materials. 14 (7), 737-744 (2015).
  2. Koh, J., et al. Enhanced in vivo delivery of stem cells using microporous annealed particle scaffolds. Small. 15 (39), 1903147(2019).
  3. Pruett, L. J., Jenkins, C. H., Singh, N. S., Catallo, K. J., Griffin, D. R. Heparin microislands in microporous annealed particle scaffolds for accelerated diabetic wound healing. Advanced Functional Materials. 31 (35), 2104337(2021).
  4. Darling, N. J., Sideris, E., Hamada, N., Carmichael, S. T., Segura, T. Injectable and spatially patterned microporous annealed particle (MAP) hydrogels for tissue repair applications. Advanced Science. 5 (11), 1801046(2018).
  5. Isaac, A., et al. Microporous bio-orthogonally annealed particle hydrogels for tissue engineering and regenerative medicine. ACS Biomaterials Science and Engineering. 5 (12), 6395-6404 (2019).
  6. Pruett, L., et al. Development of a microporous annealed particle hydrogel for long-term vocal fold augmentation. Laryngoscope. 130 (10), 2432-2441 (2020).
  7. Nih, L. R., Sideris, E., Carmichael, S. T., Segura, T. Injection of microporous annealing particle (MAP) hydrogels in the stroke cavity reduces gliosis and inflammation and promotes NPC migration to the lesion. Advanced Materials. 29 (32), (2017).
  8. Griffin, D. R., et al. Activating an adaptive immune response from a hydrogel scaffold imparts regenerative wound healing. Nature Materials. 20 (4), 560-569 (2021).
  9. Sideris, E., et al. Particle hydrogels based on hyaluronic acid building blocks. ACS Biomaterials Science and Engineering. 2 (11), 2034-2041 (2016).
  10. Schaeffer, C., et al. Injectable microannealed porous scaffold for articular cartilage regeneration. Annals of Plastic Surgery. 84, 6S Suppl 5 446-450 (2020).
  11. Pruett, L., Ellis, R., McDermott, M., Roosa, C., Griffin, D. Spatially heterogeneous epidermal growth factor release from microporous annealed particle (MAP) hydrogel for improved wound closure. Journal of Materials Chemistry B. 9 (35), 7132-7139 (2021).
  12. Jivan, F., Alge, D. L. Bio-orthogonal, site-selective conjugation of recombinant proteins to microporous annealed particle hydrogels for tissue engineering. Advanced Therapeutics. 3 (1), 1900148(2020).
  13. de Rutte, J. M., Koh, J., di Carlo, D. Scalable high-throughput production of modular microgels for in situ assembly of microporous tissue scaffolds. Advanced Functional Materials. 29 (25), 1900071(2019).
  14. Pfaff, B. N., et al. Selective and improved photoannealing of microporous annealed particle (MAP) scaffolds. ACS Biomaterials Science and Engineering. 7 (2), 422-427 (2021).
  15. Darling, N. J., Hung, Y. S., Sharma, S., Segura, T. Controlling the kinetics of thiol-maleimide Michael-type addition gelation kinetics for the generation of homogenous poly(ethylene glycol) hydrogels. Biomaterials. 101, 199-206 (2016).
  16. Sandell, J. L., Zhu, T. C. A review of in-vivo optical properties of human tissues and its impact on PDT. Journal of Biophotonics. 4 (11-12), 773-787 (2011).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Rusztowanie MAPhydro ele ziarnistemikro ele z glikolu polietylenowegowy arzanie rusztowamedycyna regeneracyjnawytwarzanie urz dze mikroprzep ywowychoczyszczanie mikro elicharakteryzacja rusztowa
Synteza mikroprzepływowa mikrożelowych bloków budulcowych do rusztowania cząstek wyżarzonych mikroporowato
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.