Artykuł metodologiczny

Selekcja aptamerów in vitro w celu odróżnienia wirusów zakaźnych od niezakaźnych

1.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/64127

⸱

7 września 2022

 ,  ,  , 
1INQUIMAE (CONICET), Departamento de Química Inorgánica, Analítica y Química Física, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Buenos Aires, 2Department of Chemistry, University of Illinois at Urbana-Champaign, 3Department of Chemistry, University of Texas at Austin

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Udostępniamy protokół, który może być ogólnie stosowany do wybranych aptamerów, które wiążą się tylko z wirusami zakaźnymi, a nie z wirusami, które stały się niezakaźne za pomocą metody dezynfekcji lub z innymi podobnymi wirusami. Otwiera to możliwość określenia statusu zakaźności w testach przenośnych i szybkich.

Streszczenie

Infekcje wirusowe mają duży wpływ na społeczeństwo; większość metod wykrywania ma trudności z ustaleniem, czy wykryty wirus jest zakaźny, co powoduje opóźnienia w leczeniu i dalsze rozprzestrzenianie się wirusa. Opracowanie nowych czujników, które mogą informować o zakaźności próbek klinicznych lub środowiskowych, sprosta temu niespełnionemu wyzwaniu. Jednak bardzo niewiele metod pozwala uzyskać cząsteczki wykrywające, które mogą rozpoznać nienaruszonego wirusa zakaźnego i odróżnić go od tego samego wirusa, który stał się niezakaźny za pomocą metod dezynfekcji. W tym miejscu opisujemy protokół wyboru aptamerów, które mogą odróżnić wirusy zakaźne od wirusów niezakaźnych przy użyciu systematycznej ewolucji ligandów przez wzbogacenie wykładnicze (SELEX). Korzystamy z dwóch cech firmy SELEX. Po pierwsze, SELEX może być dostosowany do usuwania konkurencyjnych celów, takich jak wirusy niezakaźne lub inne podobne wirusy, przy użyciu selekcji liczników. Dodatkowo, cały wirus może być wykorzystany jako cel dla SELEX, zamiast np. białka powierzchniowego wirusa. Cały wirus SELEX pozwala na wybór aptamerów, które wiążą się specyficznie ze stanem natywnym wirusa, bez konieczności przerywania działania wirusa. Metoda ta pozwala zatem na uzyskanie czynników rozpoznających w oparciu o funkcjonalne różnice w powierzchni patogenów, które nie muszą być znane z wyprzedzeniem.

Wprowadzenie

Infekcje wirusowe mają ogromne skutki ekonomiczne i społeczne na całym świecie, co stało się coraz bardziej widoczne po niedawnej pandemii COVID-19. Terminowa i dokładna diagnoza ma kluczowe znaczenie w leczeniu infekcji wirusowych, jednocześnie zapobiegając rozprzestrzenianiu się wirusów na zdrowych ludzi. Chociaż opracowano wiele metod wykrywania wirusów, takich jak testy PCR1,2 i inmunoassays3, większość obecnie stosowanych metod nie jest w stanie określić, czy wykryty wirus jest rzeczywiście zakaźny, czy nie. Dzieje się tak dlatego, że sama obecność składników wirusa, takich jak wirusowy kwas nukleinowy lub białka, nie wskazuje, że nienaruszony, zakaźny wirus jest obecny, a poziomy tych biomarkerów wykazały słabą korelację z zakaźnością4,5,6. Na przykład wirusowe RNA, powszechnie stosowane w obecnych testach COVID-19 opartych na PCR, ma bardzo niski poziom we wczesnych stadiach infekcji, gdy pacjent jest zaraźliwy, podczas gdy poziom RNA jest często nadal bardzo wysoki, gdy pacjenci wyzdrowieli z infekcji i nie są już zaraźliwi7,8. Biomarkery białka wirusa lub antygenu podążają za podobnym trendem, ale zazwyczaj pojawiają się nawet później niż wirusowe RNA, a zatem są jeszcze mniej predykcyjne dla zakaźności6,9. Aby rozwiązać ten problem, opracowano pewne metody, które mogą informować o stanie zakaźności wirusa, ale opierają się one na technikach mikrobiologii hodowli komórkowych, które wymagają długiego czasu (dni lub tygodni) do uzyskania wyników4,10. W związku z tym opracowanie nowych czujników, które mogą informować o zakaźności próbek klinicznych lub środowiskowych, może uniknąć opóźnień w leczeniu i dalszego rozprzestrzeniania się wirusa. Jednak bardzo niewiele metod pozwala uzyskać cząsteczki wykrywające, które mogą rozpoznać nienaruszony zakaźny wirion i odróżnić go od tego samego wirusa, który stał się niezakaźny.

W tym kontekście, aptamery szczególnie dobrze sprawdzają się jako unikalne narzędzie biomolekularne11,12,13,14. Aptamery to krótkie, jednoniciowe cząsteczki DNA lub RNA o specyficznej sekwencji nukleotydowej, która pozwala im tworzyć specyficzną konformację 3D w celu rozpoznania celu o wysokim powinowactwie i selektywności15,16. Uzyskuje się je w procesie selekcji kombinatorycznej zwanym systematyczną ewolucją ligandów przez wzbogacenie wykładnicze (SELEX), znanym również jako selekcja in vitro, który przeprowadza się w probówkach z dużą biblioteką losowego pobierania próbek DNA zawierającą 1014-10 15 sekwencji17,18,19. W każdej rundzie tego iteracyjnego procesu pula DNA jest najpierw poddawana presji selekcyjnej poprzez inkubację z celem w pożądanych warunkach. Wszelkie sekwencje, które nie są powiązane z celem, są następnie usuwane, pozostawiając tylko te kilka sekwencji, które są w stanie związać się w danych warunkach. Na koniec sekwencje, które zostały wybrane w poprzednim kroku, są amplifikowane metodą PCR, wzbogacając populację puli o pożądane sekwencje funkcjonalne dla następnej rundy selekcji, a proces jest powtarzany. Gdy aktywność puli selekcyjnej osiąga plateau (zwykle po 8-15 rundach), biblioteka jest analizowana przez sekwencjonowanie DNA w celu zidentyfikowania zwycięskich sekwencji wykazujących najwyższe powinowactwo.

SELEX ma unikalne zalety, które można wykorzystać do zwiększenia selektywności w stosunku do innych podobnych celów20,21, np. dla statusu zakaźności wirusa22. Po pierwsze, do selekcji można wykorzystać szeroką gamę różnych typów celów, od małych cząsteczek i białek po całe patogeny i komórki16. Tak więc, aby uzyskać aptamer, który wiąże się z zakaźnym wirusem, jako cel można użyć nienaruszonego wirusa, zamiast białka powierzchniowego wirusa19. Cały wirus SELEX pozwala na wybór aptamerów, które wiążą się specyficznie ze stanem natywnym wirusa, bez konieczności zakłócania działania wirusa. Po drugie, SELEX może być dostosowany do usuwania konkurencyjnych celów21,23, takich jak inne podobne wirusy lub niezakaźne wirusy inaktywowane, korzystając z kroków wyboru licznika w każdej rundzie selekcji22. Podczas etapów kontrselekcji pula DNA jest wystawiana na działanie celów, dla których wiązanie nie jest pożądane, a wszelkie sekwencje, które się wiążą, są odrzucane.

W tej pracy udostępniamy protokół, który może być ogólnie stosowany do wyboru aptamerów, które wiążą się z zakaźnym wirusem, ale nie z tym samym wirusem, który stał się niezakaźny za pomocą określonej metody dezynfekcji lub z innymi pokrewnymi wirusami. Metoda ta pozwala na uzyskanie czynników rozpoznających na podstawie funkcjonalnych różnic powierzchni wirusa, które nie muszą być znane z wyprzedzeniem, a tym samym oferują dodatkową korzyść w wykrywaniu nowo powstałych patogenów lub niedostatecznie zbadanych chorób.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie odczynników i

  1. Przygotować 10x Tris-boran EDTA (10x TBE) dodając 0,9 M tris-zasadę, 0,9 M kwasu borowego, 20 mM EDTA (sól disodową) i wodę dejonizowaną do końcowej objętości 1 l. Mieszać, aż wszystkie składniki się rozpuszczą.
  2. Przygotować 10% denaturujący roztwór podstawowy poliakryloamidu w następujący sposób. Do szklanej butelki o pojemności 250 ml dodaj 120 g mocznika (8 M), 25 ml 10x TBE, 62,5 ml 40% roztworu akryloamidu/bisakryloamidu (29:1) i tyle wody destylowanej, aby osiągnąć ostateczną objętość 250 ml. Mieszaj, aż wszystkie składniki się rozpuszczą.
  3. Przygotuj bufor załadowczy 2x w następujący sposób. Do probówki o pojemności 50 ml dodaj 21,636 g mocznika (8 M), 1,675 g EDTA (1 mM) i 4,5 ml 10 TBE. Napełnij do 45 ml wodą destylowaną i mieszaj, aż wszystkie składniki się rozpuszczą.
  4. Przygotować bufor ekstrakcyjny, dodając 100 mM octanu sodu i 1 mM EDTA (sól disodową). Ustaw końcowe pH na 5.
  5. Przygotować roztwory wytrącające etanol w następujący sposób. Przygotować 3 M octan sodu, dostosować do pH 5,2 i przechowywać w temperaturze 4 °C. Przygotować 70% etanol v/v i przechowywać w temperaturze -20 °C. Przygotować 100% etanol i przechowywać w temperaturze -20 °C.
  6. Przygotować 500 ml buforu SELEX zawierającego 1x PBS, 2,5 mM MgCl2 i 0,5 mM CaCl2. Dostosuj do pH 7,4. Przygotować 100 ml buforu SELEX z 8 M mocznikiem, dodając 1x PBS, 2,5 mM MgCl2, 0,5 mM CaCl2 i 8 M mocznika. Dostosować do pH 7.4.
    UWAGA: Wybór bufora SELEX ma kluczowe znaczenie dla zapewnienia, że wybrany aptamer będzie działał na próbce końcowej, w której zostanie zastosowany. Na przykład aptamery specyficzne dla SARS-CoV-2 będą stosowane w próbkach biologicznych (np. wymazach ze śliny lub nosogardzieli). Dlatego ważne jest, aby wybrać stężenia jonów, pH i bufor, które ściśle naśladują te warunki w zamierzonych próbkach biologicznych.
  7. Przygotować bufor wiążący i myjący w następujący sposób. W probówce o pojemności 50 ml przygotuj 5 mM Tris, 0,5 mM EDTA (sól disodową) i 2 M NaCl. Dostosuj do pH 7,5.

2. Projektowanie i synteza biblioteki DNA i starterów

  1. Zaprojektuj początkową bibliotekę ssDNA i startery zgodnie z następującymi kryteriami (patrz Tabela 1, aby zapoznać się z przykładową biblioteką ssDNA i zestawem starterów, gdzie N oznacza losową pozycję nukleotydu).
    1. Upewnij się, że biblioteka zawiera centralny losowy region składający się z 35 do 60 nukleotydów otoczonych dwiema stałymi sekwencjami na końcach 3' i 5', które działają jako regiony starterów do amplifikacji. Typowa długość biblioteki to 45 losowych nukleotydów.
    2. Upewnij się, że odwrotny starter zawiera modyfikację biotyny w celu oddzielenia ssDNA od amplifikowanych dwuniciowych produktów PCR przy użyciu kulek pokrytych streptawidyną podczas procesu selekcji in vitro.
  2. Kupuj oligonukleotydy DNA ze źródeł komercyjnych ze standardowym oczyszczaniem odsalającym. Oczyść bibliotekę ssDNA i startery za pomocą 10% denaturacji elektroforezy w żelu poliakrylamidowym (dPAGE), a następnie wytrącania etanolu zgodnie ze standardowymi procedurami24.
    UWAGA: Monomer akrylamidu i bromek etydyny są niebezpiecznymi substancjami chemicznymi (czynnikami rakotwórczymi dla ludzi), dlatego podczas wykonywania PAGE należy stosować odpowiednie środki ochrony osobistej (fartuchy laboratoryjne, rękawice i ochronę oczu). Jeśli to możliwe, unikaj stosowania bromku etydyny i zastąp go bezpieczniejszym barwnikiem.
    UWAGA: Możliwe jest zamówienie oligonukleotydów z oczyszczaniem metodą HPLC, aby uniknąć wykonywania tego etapu oczyszczania, chociaż nie usunie to tak skutecznie krótkich oligonukleotydów.
  3. Dodać wodę wolną od nukleaz, aby ponownie zawiesić ssDNA po wytrąceniu etanolu do pożądanego stężenia (100 μM). Oznaczyć stężenie biblioteki ssDNA i starterów przez absorpcję UV przy λ = 260 nm. Przechowywać w temperaturze -20 °C.
  4. Kup niezmodyfikowany starter odwrotny, aby użyć go do wysokoprzepustowego sekwencjonowania, przygotowania biblioteki i kwantyfikacji qPCR.

3. Zakaźne i niezakaźne próbki wirusów

UWAGA: Próbki wirusów zakaźnych i niezakaźnych to próbki poziomu bezpieczeństwa biologicznego 2 (BSL2), które wymagają szczególnej ostrożności, aby obchodzić się z nimi bezpiecznie i właściwie. Wszystkie etapy procedury, które obejmują te próbki, muszą być wykonane w komorze bezpieczeństwa biologicznego lub roztwór wirusa musi znajdować się w szczelnie zamkniętym pojemniku (np. plastikowych probówkach z nakrętką).

  1. Uzyskać podstawowy roztwór zakaźnych wirusów lub przygotować je, postępując zgodnie z odpowiednim protokołem dla każdego wirusa. Użyte tutaj pseudowirusy SARS-CoV-2, SARS-CoV-1 i H5N1 zostały dostarczone przez laboratorium prof. Lijun Rong (UIC) w buforze PBS i zostały przygotowane zgodnie z zgłoszonymi protokołami22,25,26.
    UWAGA: W przypadku wirusów, które wymagają obiektów poziomu bezpieczeństwa biologicznego 3 do radzenia sobie z nienaruszonym wirusem zakaźnym, możliwa jest praca z pseudowirusami. Wirus pseudotypowy jest generowany z lentiwirusa (HIV), który wyświetla białka powierzchniowe wirusa w otoczce wirusa, a tym samym ściśle naśladuje powierzchnię i mechanizm wnikania wirusa, ale jest wadliwy w ciągłej replikacji wirusa.
  2. Zaopatrzyć się w niezakaźny roztwór podstawowy wirusa lub przygotować go, postępując zgodnie z procedurą dezynfekcji. Zastosowany tutaj zapas pseudowirusa SARS-CoV-2 inaktywowany promieniami UV (p-SARS-CoV-2) został dostarczony przez laboratorium prof. Rong (UIC) w buforze PBS, a wcześniej zgłoszony protokół został wykorzystany do inaktywacji UV22.
    UWAGA: Jeśli to możliwe, wykonaj test w celu zbadania zakaźności wirusa, aby upewnić się, że wirus został całkowicie inaktywowany.
  3. Ilościowe określenie zapasów wirusa
    1. Określ ilościowo wirusa za pomocą testu płytki nazębnej zgodnie ze standardowymi procedurami27,28,29. Test ten nie tylko pozwala na ilościowe określenie wirusa, ale także wskazuje status zakaźności wirusa, potwierdzając stężenie zakaźnego wirusa.
    2. W przypadku pseudowirusów lub wirusów, w przypadku których nie jest dostępny test płytki nazębnej, należy określić ilościowo wirusa za pomocą dostępnego w handlu ilościowego zestawu ELISA lentiwirusa.
    3. Przygotuj 1 x 108 kopii/ml roztworu podstawowego dla p-SARS-CoV-2, p-SARS-CoV-1 i p-H5N1. Oddzielić każdy roztwór podstawowy w podwielokrotnościach zawierających 50 μl każdy i utrzymywać w temperaturze -80 °C. Przed każdym doświadczeniem rozmrozić nową porcję.

4. Selekcja in vitro lub proces SELEX: runda wstępna

UWAGA: Dla wszystkich kroków z użyciem zakaźnego wirusa, pracuj w szafie BSL2.

  1. Denaturyzacja biblioteki ssDNA. Pobrać 10 μl ze 100 μM biblioteki ssDNA (1 nmol) i wymieszać z 240 μl buforu SELEX. Podgrzewać w temperaturze 95 °C przez 15 minut w suchej kąpieli, a następnie umieścić probówkę na lodzie na 15 minut.
  2. Inkubuj bibliotekę ssDNA z zakaźnym wirusem (etap selekcji pozytywnej) w następujący sposób. Wymieszaj 250 μl biblioteki ssDNA w buforze SELEX z kroku 4.1 z 50 μl zakaźnego wirusa (1 x 108 kopii/ml). Inkubować przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.
  3. Zablokuj nieokreślone miejsca w filtrach wirówek w następujący sposób. Czekając na krok 4.2, przygotuj filtry wirówkowe do kolejnych kroków.
    1. Dodać 400 μl 1 mM sekwencji T20 (Tabela 1) do każdego 0,5 ml filtra wirówkowego, który będzie używany - jeden filtr wirówkowy z odcięciem 100 kDa i jeden z odcięciem 10 kDa.
    2. Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej i odwirowywać przy 14 000 x g przez 10 minut w celu usunięcia roztworu T20 z filtra. Przemyć 3x buforem SELEX, aby usunąć nadmiar sekwencji T20.
  4. Umyj niezwiązane sekwencje w następujący sposób. Dodać mieszaninę inkubowaną w kroku 4.2 do zablokowanego filtra wirówkowego o stężeniu 100 kDa i wirować przy 14 000 x g przez 10 minut. Przemyć 3x, dodając 400 μl buforu SELEX i odwirować przy 14 000 x g przez 10 min. Zachowaj frakcję w filtrze i wyrzuć przepływ.
  5. Elute związane sekwencje, jak opisano poniżej.
    1. Wymienić probówkę zbiorczą filtra wirówkowego i dodać 300 μl buforu SELEX zawierającego 8 M mocznika do filtra wirówkowego w kroku 4.4. Podgrzewać filtr wirówkowy w temperaturze 95 °C przez 15 minut w suchej kąpieli, a następnie wirować w temperaturze 14 000 x g przez 10 minut.
    2. Zebrać frakcję, która przepłynęła przez filtr zawierający eluowane sekwencje. Powtórz kolejne trzy razy. Pracuj w szafce BSL2 i umyj wszystkie materiały 10% wybielaczem, aby dezaktywować wirusa przed wyrzuceniem materiałów.
  6. Skoncentruj i odsolić w następujący sposób. Dodać roztwór zebrany w 4.5 do zablokowanego filtra wirówkowego o sile 10 kDa. Wirować przy 14 000 x g przez 15 min. Odrzuć frakcję, która przepłynęła przez filtr.
    UWAGA: Ponieważ wirusy są zatrzymywane i inaktywowane za pomocą 8 M mocznika w filtrze w poprzednim kroku, ten i następne kroki nie muszą być wykonywane w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Procedurę tę należy powtórzyć, jeśli używana jest probówka wirówkowa o pojemności 0,5 ml, aż cały roztwór zostanie zebrany, jak w kroku 4.5, 1,2 ml przepływa przez filtr.
  7. Przemyć 3x 300 μl buforu SELEX w celu usunięcia mocznika przez odwirowanie przy 14 000 x g przez 15 min. Wyrzuć frakcję, która przepłynęła przez filtr. Odzyskaj roztwór z filtra, obracając go do góry nogami w czystej probówce zbiorczej i odwirowując przez 5 minut.
  8. Zmierzyć końcową objętość odzyskanego roztworu z ppkt 4.7 za pomocą pipety umieszczonej w plastikowej probówce. To rozwiązanie nosi nazwę Ria, gdzie i odpowiada okrągłej liczbie. Zazwyczaj uzyskuje się objętości od 30 μL do 50 μL. Weź 1 μl eluowanego ssDNA, aby określić ilościowo ilość DNA metodą qPCR.
    UWAGA: Jest to możliwy punkt pauzy, w którym próbka R1a może być przechowywana w temperaturze -20 °C, aby kontynuować w innym czasie.
  9. Wykonaj amplifikację PCR zgodnie z poniższym opisem.
    1. W pierwszej rundzie należy pobrać 90% próbki R1jako matrycę do PCR. W kolejnych rundach należy pobrać 60% całkowitej objętości z kroku 4.8, aby przeprowadzić PCR i przechowywać pozostałą frakcję w temperaturze -20 °C.
    2. Przygotuj 50 μl reakcji PCR z następującymi składnikami o określonym stężeniu końcowym: 1x bufor reakcyjny PCR, 200 μM dNTP, 10 μL matrycy DNA (R1próbka), 200 nM każdy starter i polimeraza 1,25 U (zapas 2,5 U/μL).
    3. Zoptymalizuj warunki PCR, w tym liczbę cykli i temperaturę wyżarzania dla każdego zestawu starterów i biblioteki ssDNA. Unikaj używania zbyt wielu cykli, które spowodują powstanie niepożądanych podproduktów PCR, takich jak startery-dimery. Przetestuj różne temperatury wyżarzania w oparciu o temperaturę topnienia podkładów.
    4. Uruchom PCR w zoptymalizowanych warunkach w temperaturze 95 °C przez 5 minut, a następnie 18 cykli po 1 minutę w 95 °C, 30 s w 52 °C i 1 minutę w 72 °C, z ostatnim krokiem przedłużania w temperaturze 72 °C przez 10 minut, aby uzyskać pulę dsDNA.
      UWAGA: Jest to kolejny możliwy punkt pauzy, w którym produkt PCR może być przechowywany w temperaturze -20 °C, aby kontynuować w innym czasie.
  10. Odzyskaj ssDNA za pomocą kulek magnetycznych modyfikowanych streptawidyną.
    1. Weź 80% produktu PCR. Pozostałą frakcję przechowywać w temperaturze -20 °C.
    2. Podzielić produkt PCR na porcje po 50 μl i dodać je do probówek do mikrofuge zawierających 50 μl kulek magnetycznych modyfikowanych streptawidyną (MB). Inkubować przez 30 minut z łagodnym mieszaniem (na przykład użyć obrotowego shakera) w temperaturze pokojowej. Następnie umieść probówkę do mikrofuge na stojaku magnetycznym, aby odizolować MB i usunąć supernatant przez pipetowanie (musi to być klarowny roztwór).
    3. Przemyć poprzez dodanie do probówki 200 μl buforu wiążącego i płuczącego. Wyjmij probówkę ze stojaka magnetycznego, postukaj w probówkę i ponownie zawiesij MB do jednorodnego roztworu przez pipetowanie. Umieść probówkę do mikrofuge z powrotem na stojaku magnetycznym, aby odizolować MB i usunąć supernatant przez pipetowanie. Powtórz ten krok prania dwa razy.
    4. Po zakończeniu płukania ponownie zawiesić MB w sumie 100 μl buforu SELEX i podgrzewać roztwór do temperatury 95 °C przez 10 minut. Natychmiast umieścić probówkę w stojaku magnetycznym, zanim probówka ostygnie i pobrać supernatant zawierający pulę ssDNA. Powtórzyć ten etap odzyskiwania, dodając 50 μl buforu SELEX.
  11. Zmierzyć końcową objętość odzyskanej frakcji z 4,10 za pomocą pipety. Ten ułamek nazywa się Rix, gdzie i odpowiada okrągłej liczbie. Na ogół uzyskuje się objętości od 140 do 150 μl. Weź 1 μl R1x, aby określić ilościowo ilość DNA za pomocą qPCR.

5. Kolejne rundy selekcji

  1. Denaturacja puli ssDNA. Pobrać 60% próbki R1x i wymieszać z 50 μl buforu SELEX. Ogrzewać w temperaturze 95 °C przez 15 minut w suchej kąpieli. Umieść probówkę na lodzie na 15 minut.
  2. Inkubuj pulę ssDNA z niezakaźnym wirusem i innymi potencjalnymi wirusami zakłócającymi (etap kontrselekcji). Wymieszaj zdenaturowaną pulę ssDNA w buforze SELEX z 5.1 z 50 μl każdego wirusa (5 x 109 kopii/ml; np. niezakaźne p-SARS-CoV-2, p-SARS-CoV-1 i p-H5N1). Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
  3. Blokuj nieokreślone miejsca w filtrach wirówkowych. Czekając na krok 5.2., przygotuj filtry wirówkowe do kolejnych kroków. Zazwyczaj należy użyć dwóch filtrów wirówkowych, jednego z odcięciem 100 kDa i jednego z odcięciem 10 kDa. Postępować zgodnie z tą samą procedurą, co w ppkt 4.3.
  4. Zmyj sekwencje związane z wirusami niedocelowymi. Dodać mieszaninę inkubowaną w kroku 5.2 do zablokowanego filtra wirówkowego o sile 100 kDa. Wirować przy 14 000 x g przez 10 minut i odzyskać frakcję, która przepływa przez filtr wirówkowy. Przemyć 2x, dodając 100 μl buforu SELEX i odwirować przy 14 000 x g przez 10 min. Zachowaj frakcję, która przepłynęła przez filtr.
  5. Inkubuj pulę ssDNA z zakaźnym wirusem (etap selekcji pozytywnej). Pobrać 300 μl frakcji z kroku 5.4 i wymieszać z 50 μl zakaźnego wirusa (1 x 108 kopii/ml). Inkubować przez 2 godziny w temperaturze pokojowej. Wykonaj kroki od 4.4 do 4.11.

6. Monitorowanie procesu SELEX

UWAGA: Do monitorowania wzbogacenia puli, qPCR jest używany na dwa sposoby. Po pierwsze, za pomocą bezwzględnej kwantyfikacji możliwe jest zbadanie wzbogacenia basenów (wydajność elucji). Po drugie, monitorując krzywą topnienia, można ocenić różnorodność basenów (konwergencję gatunków aptamerów) 30.

  1. Wykonać wszystkie testy qPCR z objętością reakcji 10 μl na 96-dołkowych płytkach przeznaczonych do qPCR.
  2. Przygotować wzorcową mieszaninę qPCR zawierającą 5 μl mieszanki wzorcowej, 0,3 μl 500 nM każdego nieznakowanego startera, 3,4 μlH2Oi 1 μl matrycy DNA.
    1. Przygotować rozcieńczenia oczyszczonej biblioteki ssDNA (krok 2.3), aby uruchomić krzywą wzorcową.
    2. Rozcieńczyć próbki DNA, aby ich stężenie zmieściło się w krzywej wzorcowej. W przypadku próbek Ria do mieszaniny qPCR dodać 1 μl próbki bez rozcieńczania i 1 μl o rozcieńczeniu 1:10. W przypadku próbek Rix należy uwzględnić rozcieńczenia w stosunku 1:10 lub 1:100.
  3. Uruchom qPCR, ustawiając następujący protokół. Najpierw ustaw początkowy etap denaturacji na 98 °C na 2 minuty. Następnie ustaw 40 cykli denaturacji w temperaturze 98 °C przez 5 s oraz wyżarzanie i przedłużanie w temperaturze 52 °C przez 10 s. Na koniec ustaw analizę krzywej topnienia od 65 do 95 °C. Określ wartości progowe cyklu (Ct) za pomocą automatycznej analizy progowej.
  4. Korzystając z krzywej wzorcowej, określ ilościowo ilość ssDNA w próbkach Ria oraz Rix.
  5. Obliczyć wydajność elucji jako ilość związanego DNA (liczba moli w R i a) podzielona przez ilość początkowego DNA (liczba moli w Ri-1x). Wykreśl wydajność elucji w funkcji liczby rundy, aby sprawdzić, czy obserwuje się wzbogacenie w rundach.
  6. Wykreśl krzywe topnienia dla różnych rund. Wraz ze wzrostem liczby rund spodziewane jest przejście do wyższych temperatur topnienia w szczytowym momencie w pobliżu 75/85 °C. Oznacza to, że zmniejsza się różnorodność puli.

7. Sekwencjonowanie o wysokiej przepustowości

  1. Skonsultuj się z ośrodkiem sekwencjonowania o wysokiej przepustowości, aby dowiedzieć się, jakie typy sekwencjonowania i skale są dostępne, co określi metodę przygotowania biblioteki.
    UWAGA: Decyzja ta będzie brała pod uwagę zarówno długość pul, które mają być sekwencjonowane (w tym startery), jak i liczbę pul, które należy złożyć (ogólnie rzecz biorąc, należy dążyć do co najmniej 1 x 105-10 6 sekwencji na pulę). Jeśli określona skala sekwencjonowania nie może odczytać całej długości puli, sekwencjonowanie sparowanych końców może być używane do odczytu z obu końców sekwencji, w przeciwieństwie do sekwencjonowania pojedynczego, które odczytuje tylko z jednego końca.
  2. Wybierz odpowiedni dostępny na rynku zestaw w zależności od rodzaju sekwencjonowania, w porozumieniu z zakładem sekwencjonowania. Przygotuj wiele pul rund selekcyjnych reprezentujących wysokie, średnie i niskie wzbogacenie, a także pulę końcową, używając innej pary indeksów w adapterach dla każdej puli, która umożliwiała analizę próbki wszystkich rund przy użyciu jednego pasa.
    UWAGA: Amplifikacja PCR może być również wykorzystana do włączenia adapterów i indeksów wymaganych do sekwencjonowania o wysokiej przepustowości, ale zazwyczaj kosztuje to podobnie jak zestawy komercyjne i nie działa lepiej.
    1. Wykonaj przygotowanie biblioteki, wykonując następujące kroki: zakończ naprawę fragmentarycznego DNA, ligację adaptorową i amplifikację PCR w celu wytworzenia końcowych bibliotek.
    2. Oczyść produkt PCR za pomocą magnetycznych kulek do czyszczenia DNA zgodnie z instrukcją producenta.
    3. Określ ilościowo DNA za pomocą zestawu do kwantyfikacji opartej na fluorescencji. Unikaj stosowania mniej dokładnych metod, takich jak pomiary UV przy małej objętości
      4. .
    4. Wymieszaj w przybliżeniu równe ilości (według ilości DNA, a nie objętości) każdej biblioteki puli zawierającej określone indeksy.
    5. Sprawdź jakość końcowej biblioteki za pomocą kwantyfikacji qPCR i analizatora fragmentów DNA. Ten krok jest często wykonywany przez urządzenie do sekwencjonowania.
      UWAGA: Personel zakładu sekwencjonowania może udzielić przydatnych informacji na temat sposobu przygotowania biblioteki i sugerowanych kontroli jakości. Dyskusja z nimi jest wymagana przed przygotowaniem bibliotek.
  3. Wyślij przygotowaną bibliotekę końcową do zakładu sekwencjonowania zgodnie z jego wymaganiami.

8. Analiza sekwencjonowania

  1. Większość oprogramowania dostępnego do analizy sekwencjonowania jest przeznaczona do uruchamiania w wierszu poleceń w systemie operacyjnym Linux. W przypadku małych zestawów danych skonfiguruj żądany system operacyjny Linux i zainstaluj wymagane programy na komputerze osobistym; w przypadku większych zestawów danych analiza HTS jest uruchamiana na zasobach obliczeniowych o wysokiej wydajności lub superkomputerach (zalecane).
    UWAGA: Do korzystania z zasobów obliczeniowych o wysokiej wydajności potrzebny będzie dostęp i szkolenie, których uzyskanie może zająć trochę czasu. Dodatkowo wymagana będzie podstawowa wiedza na temat korzystania z wiersza poleceń systemu UNIX. Wiele bezpłatnych zasobów dotyczących podstawowego korzystania z wiersza poleceń jest dostępnych online, a zasoby obliczeniowe prawdopodobnie dostarczą dodatkowych informacji na temat korzystania z ich systemów.
  2. Uzyskaj dostęp do plików sekwencjonowania, zwykle w skompresowanym formacie pliku FastQ, korzystając z informacji dostarczonych przez narzędzie sekwencjonowania.
    1. Użyj klienta FTP, aby przenieść pliki na własny komputer i/lub do zasobu obliczeniowego o wysokiej wydajności. Wiele programów do analizy sekwencji może bezpośrednio używać plików skompresowanych, więc jeśli to możliwe, należy je skompresować, aby ograniczyć ich rozmiary plików (duże odczyty sekwencji 50 M+ sekwencji mogą zająć 100 Gb+ miejsca na plikach bez kompresji).
    2. Jeśli pliki sekwencji muszą zostać zdekompresowane, użyj funkcji gzip, która jest standardem w większości instalacji Linuksa. Uzyskaj dodatkowe informacje o gzip i jego opcjach z zainstalowanego podręcznika, wpisując "man gzip" w wierszu poleceń.
  3. Oczyść sekwencje przed analizą przez demultipleksowanie, usuwanie adapterów sekwencjonowania, usuwanie odczytów o niskiej jakości i uwzględnianie odczytów zarówno w przód, jak i w tył.
    1. Użyj programu FastQC 31 po każdym z poniższych kroków, aby uzyskać podstawowe informacje o kontroli jakości sekwencji, aby ocenić skuteczność każdego kroku czyszczenia.
    2. Demultipleksuj sekwencje, aby oddzielić wszystkie sekwencje z jednego odczytanego pliku do różnych pul na podstawie indeksów zawartych w adapterach sekwencjonowania. Ten etap jest często wykonywany przez zakład sekwencjonowania, z którym należy się skonsultować, ponieważ dokładna procedura będzie zależeć od użytej maszyny do sekwencjonowania.
    3. Usuń adaptery sekwencjonowania za pomocą programu wiersza poleceń Cutadapt32. Użyj starterów wyboru (zamiast adapterów sekwencjonowania) jako danych wejściowych w trybie połączonej karty. Użyj opcji --discard-untrimmed, aby odrzucić wszystkie sekwencje, które nie zawierają starterów wyboru.
    4. Ustaw opcje maksymalnej liczby błędów, aby dopasować karty, oraz minimalnej i maksymalnej długości sekwencji do zaakceptowania. Jeśli używasz sparowanych odczytów końcowych, wprowadź dostępne określone parametry i podaj zarówno pliki sekwencjonowania odczytu 1, jak i odczytu 2. W razie potrzeby ustaw dodatkowe parametry, odwołując się do Cutadapt manual32.
      UWAGA: Podwiązanie adapterów sekwencjonowania do pul jest niezależne od kierunku i obejmuje około 50% sekwencji w kierunku do przodu i 50% w kierunku odwrotnym. Aby uniknąć utraty 50% sekwencji w odwrotnym kierunku, Cutadapt może zostać uruchomiony po raz drugi, używając odwrotnego uzupełnienia starterów selekcji jako danych wejściowych.
    5. (Opcjonalnie) Jeśli używane jest sekwencjonowanie sparowanych końców, połącz pliki Odczyt 1 i Odczyt 2 z programem PEAR33.
    6. Użyj programu FASTX-Toolkit class<="xref">34, aby usunąć sekwencje niskiej jakości, które mają jakość poniżej pewnego progu na dowolnym nukleotydzie. Dobry punkt wyjścia to dobry punkt wyjścia, który wynosi 30. Jeśli ogólna jakość jest ogólnie dobra, ten krok można pominąć.
    7. Aby scalić pliki sekwencji w odwrotnym kierunku z plikami w kierunku do przodu, użyj funkcji FASTX-Toolkit fastx_reverse_complement na plikach w odwrotnym kierunku. Następnie użyj wbudowanego programu cat (standard w większości instalacji Linuksa), aby połączyć pliki do przodu i do tyłu - do tyłu w jeden plik.
  4. Aby przeanalizować wzbogacenie sekwencji w różnych pulach selekcji, użyj zestawu narzędzi do analizy FASTAptamer class35.
    1. Użyj FASTAptamer-Count, aby policzyć, ile razy pojawia się każda sekwencja. Następnie uszereguj i posortuj sekwencje według obfitości. Plik wyjściowy count jest wymagany jako dane wejściowe dla wszystkich innych programów FASTAptamer.
    2. Użyj FASTAptamer-Clust, aby pogrupować wszystkie sekwencje w pliku w klastry ściśle powiązanych sekwencji. Użyj parametru "distance", aby zdefiniować liczbę mutacji pojedynczych nukleotydów lub indeli, które mogą zgrupować się w klaster.
      UWAGA: Program FASTAptamer-Clust może być bardzo kosztowny obliczeniowo, jeśli występuje duża liczba unikalnych sekwencji (szczególnie w przypadku wczesnych rund), których pełne ukończenie może zająć dni, a nawet tygodnie. Parametr filtra odcinającego może być używany do wykluczania sekwencji o niskiej liczebności z grupowania. Ogólnie rzecz biorąc, dobrze jest zacząć od wyższego odcięcia, takiego jak 10 lub 5 odczytów na milion (RPM) i zmniejszyć go, jeśli program zakończy się szybko. Jeśli pule są bardzo niejednorodne, grupowanie sekwencji w rozsądnych ramach czasowych może nie być wykonalne.
    3. Użyj FASTAptamer-Enrich, aby obliczyć wzbogacenie każdej sekwencji obecnej w więcej niż jednej rundzie selekcji. Porównaj prędkość obrotową sekwencji z jednej populacji z prędkością obrotową na minutę w innej. Użyj programu Wzbogacanie w plikach zliczania lub klastra. Danymi wyjściowymi jest plik wartości rozdzielany tabulatorami (.tsv), który można otworzyć w dowolnym arkuszu kalkulacyjnym w celu dalszej analizy i łatwego sortowania.
      UWAGA: Program FASTAptamer-Enrich może być również bardzo kosztowny obliczeniowo, jeśli występuje duża liczba unikalnych sekwencji. Parametr filtra odcięcia może być używany do wykluczania sekwencji o niskiej obfitości z danych wyjściowych, aby uniknąć plików, które są zbyt duże, aby można je było otworzyć w oprogramowaniu do obsługi arkuszy kalkulacyjnych.
    4. (Opcjonalnie) Jeśli wiele pul jest zbyt heterogenicznych (wiele unikatowych sekwencji i niewiele zduplikowanych sekwencji), użycie programów Clust lub Enrich może nie być możliwe. W takim przypadku należy przeprowadzić ręczne sprawdzanie wzbogacania przy użyciu pliku wyjściowego Count, który sortuje sekwencje według obfitości (najliczniejszy na górze) i zmienia nazwę identyfikatora sekwencji, aby zawierał ważne informacje, takie jak RPM.
      1. Użyj standardowego linuksowego programu "head" w plikach Count, aby uzyskać listę najliczniejszych sekwencji. Następnie użyj standardowego linuksowego programu "grep", aby przeszukać każdą z najliczniejszych sekwencji w plikach Count wszystkich innych odpowiednich pul. Jeśli istnieją jakiekolwiek dopasowania, użyj zmodyfikowanego identyfikatora sekwencji, aby określić RPM w tej puli, aby ręcznie skonstruować informacje o wzbogacaniu.
        UWAGA: Skrypty dla wszystkich etapów analizy sekwencjonowania można znaleźć w Dodatkowych plikach kodowania 1-11.

9. Walidacja i testy wiązania aptamerów

  1. Na podstawie informacji o wzbogaceniu uzyskanych w wyniku analizy sekwencji, zidentyfikuj potencjalne sekwencje aptamerów na podstawie sekwencji, które mają największe wzbogacenie w kolejnych rundach selekcji i/lub najliczniejsze sekwencje w ostatniej rundzie selekcyjnej. Wybierz kilka różnych sekwencji kandydujących (co najmniej 10-20) do dalszych testów, ponieważ najbardziej wzbogacone aptamery niekoniecznie muszą być najlepiej działającymi aptamerami.
  2. Przeprowadzić wstępne badania przesiewowe potencjalnych aptamerów przy użyciu testu wiązania, który można szybko przeprowadzić dla wielu próbek. Test wiązania ultrafiltracji oparty na kolumnach36 lub test oligonukleotydowy sprzężony z enzymem (ELONA) są dobrymi metodami do tego wstępnego badania przesiewowego.
  3. Przeanalizuj specyficzność i powinowactwo sekwencji, które wykazują najlepszą aktywność wiązania od wstępnego badania przesiewowego, używając co najmniej dwóch niezależnych testów wiązania (np. Termoforeza w mikroskali (MST)37,38, Test oligonukleotydów sprzężonych z enzymem (ELONA)39, powierzchniowy rezonans plazmonów40, lub interferometria biowarstw (BLI)41).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Ponieważ aptamery DNA można uzyskać za pomocą SELEX w probówce15, ta strategia SELEX została starannie zaprojektowana, aby uwzględnić zarówno etapy pozytywnej selekcji w kierunku nienaruszonego, całego wirusa zakaźnego (tj. zachowania cząsteczek DNA, które wiążą się z zakaźnym wirusem), jak również kroki kontrselekcji dla tego samego wirusa, który stał się niezakaźny za pomocą określonej metody dezynfekcji, w szczególności obróbka UV, poprzez odrzucenie sekwencji DNA, które mogą wiązać się z niez...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

SELEX pozwala nie tylko na identyfikację aptamerów o wysokim powinowactwie, w zakresie pM-nM 22,43,44,45, ale także o wysokiej i przestrajalnej selektywności. Korzystając z selekcji przeciwnej, można uzyskać aptamery o trudnej selektywności. Na przykład grupa Li wykazała zdolność do uzyskiwania sekwencji, które mogą odróżniać patogenne szczepy bakterii od szczepów niepatogennych

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Pragniemy podziękować Pani Laurze M. Cooper i Dr. Lijun Rong z Uniwersytetu Illinois w Chicago za dostarczenie próbek pseudowirusów używanych w tym protokole (SARS-CoV-2, SARS-CoV-1, H5N1), a także Dr. Alvaro Hernandez i Dr. Chris Wright z Centrum Usług DNA Centrum Biotechnologii im. Roya J. Carvera na Uniwersytecie Illinois w Urbana-Champaign za pomoc w sekwencjonowaniu o wysokiej przepustowości, oraz wielu członków grupy Lu, którzy pomogli nam w selekcji in vitro i technikach charakteryzacji aptamerów. Prace te były wspierane przez grant RAPID z National Science Foundation (CBET 20-29215) oraz grant zalążkowy z Instytutu Zrównoważonego Rozwoju, Energii i Środowiska na Uniwersytecie Illinois w Urbana-Champaign oraz Illinois-JITRI Institute (JITRI 23965). A.S.P. dziękuje PEW Latin American Fellowship za wsparcie finansowe. Dziękujemy również Fundacji Roberta A. Welcha (Grant F-0020) za wsparcie programu badawczego grupy Lu na Uniwersytecie Teksańskim w Austin.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
10% Nadsiarczan amonu (APS)BioRad1610700
100% EtanolSigma-AldrichE7023
1x PBS bez wapnia i magnezuCorning21-040-CM
40% roztwór akrylamidu/bisakryloamidu (29:1)BioRad1610146
Agencourt AMPure XP KoralikiBeckman CoulterA63880DNA Kulki czyszczące - Sekcja 7.2.2
Filtr odśrodkowy Amicon Ultra-0.5Odcięcie UFC501024 Merck 10 kDa
Filtr odśrodkowy Amicon Ultra-0,5UFC510024100 kDa
TermocyklerSigma-Aldrich100165
C1000 z podwójnym modułem szybkiej reakcji 48/48BioRad1851148
Chlorek wapniaSigma-AldrichC4901
CFX Connect System wykrywania PCR w czasie rzeczywistymBioRad1855201
Cyfrowe suche wanny/grzejniki blokoweThermo Scientific88870001
Dynabeads MyOne Streptawidin C1Thermo Fisher65001kulki magnetyczne modyfikowane streptawidyną - sekcja 4.9
Sól disodowa EDTASigma-Aldrich
Probówki do mikrowirówek Eppendorf Safe-LockSigma-AldrichT96611,5 ml
Lenti-X p24 Zestaw do szybkiegomianowania Takara Bio USA, Inc.632200Zestaw do kwantyfikacji lentiwirusa - sekcja 3.3.2.1
Stojak separacyjny MagJET, probówka 12 x 1,5 mlThermo ScientificMR02
Chlorek magnezuSigma-AldrichM8266
Microseal 'B' PCR Folia uszczelniająca, klej, optycznaBioRadMSB1001nieabsorbująca promieniowania UV
Mini-PROTEAN Tetra Cell do gotowych żelowych żeli prefabrykowanychBioRad1658004EDU
Płytki krótkie Mini-PROTEAN Płytki dystansoweBioRad1653308
Mini-PROTEAN ze zintegrowanymi przekładkami 0,75 mm BioRad1653310
Biologia molekularna Klasa wodnaLonza51200
Multiplate 96-dołkowe płytki do PCR, wysokoprofilowe, bez osłony, przezroczysteBioRadMLP9611
Nanodrop OneThermo ScientificND-ONE-W
OneTaq DNA Polimeraza NewEngland BioLabM0480S
Ovation Ultralow v2 + UDITecan0344NB-A01Zestaw do przygotowania biblioteki sekwencjonowania o wysokiej wydajności - Sekcja 7.2.
PIPETMAN G (100-1000 &mikro; L, 20-200 i mikro; L, 2-20 i mikro; L oraz 0,2-2 &mikro; L)GilsonF144059M, F144058M, F144056M, F144054M
Purifier Logic+ klasa II, Szafy bezpieczeństwa biologicznego typu A2Labconco4261
Zestaw testowy Qubit dsDNA BR Zestaw do oznaczaniaInvitrogenQ32850bazie fluorescencji  Zestaw do oznaczania DSDN  - Sekcja 7.2.3
Klasyczne końcówki do pipet SHARP o niskiej retencji (10 uL, 200 uL, 1000 uL)Thomas Scientific1158U43, 1159M44, 1158U40
Octan soduSigma-AldrichS2889
Chlorek soduSigma-AldrichS7653
Mikrowirówka Sorvall Legend Micro 17RThermo Scientific75002440
SsoFast EvaGreen SupermixBioRad1725201qPCR mastermix - Sekcja 6.2.
Tris(hydroksymetylo)aminometanSigma-AldrichT1503
Probówki i Ultra Clear Caps, paski po 8amerykańskich naukowych probówek PCRAB1183
MocznikSigma-AldrichU5128
Odcięcie kwas borowy dotykowy 324503 fluorescencji na

Bibliografia

  1. Carter, L. J., et al. Assay techniques and test development for COVID-19 diagnosis. ACS Central Science. 6 (5), 591-605 (2020).
  2. Ranoa, D. R. E., et al. Saliva-based molecular testing for SARS-CoV-2 that bypasses RNA extraction. bioRxiv. , 1-35 (2020).
  3. Tang, Z., et al. A materials-science perspective on tackling COVID-19. Nature Reviews Materials. 5 (11), 847-860 (2020).
  4. Cook, N., Cliver, D. O. VIRUSES | Detection. Encyclopedia of Food Microbiology. 3, 727-731 (2014).
  5. Weissleder, R., Lee, H., Ko, J., Pittet, M. J. COVID-19 diagnostics in context. Science Translational Medicine. 12 (546), 1-7 (2020).
  6. Joynt, G. M., Wu, W. K. Understanding COVID-19: what does viral RNA load really mean. The Lancet Infectious Diseases. 3099 (20), 19-20 (2020).
  7. Wölfel, R., et al. Virological assessment of hospitalized patients with COVID-2019. Nature. 581 (7809), 465-469 (2020).
  8. Perera, R. A. P. M., et al. SARS-CoV-2 virus culture and subgenomic RNA for respiratory specimens from patients with mild coronavirus disease. Emerging Infectious Diseases. 26 (11), 2701-2704 (2020).
  9. Sethuraman, N., Jeremiah, S. S., Ryo, A. Interpreting diagnostic tests for SARS-CoV-2. JAMA - Journal of the American Medical Association. 323 (22), 2249-2251 (2020).
  10. Basile, K., et al. Cell-based culture informs infectivity and safe de-isolation assessments in patients with coronavirus disease 2019. Clinical Infectious Diseases. 73 (9), 2952-2959 (2021).
  11. Xing, H., Hwang, K., Li, J., Torabi, S. -F., Lu, Y. DNA aptamer technology for personalized medicine. Current Opinion in Chemical Engineering. 4, 79-87 (2014).
  12. Xiong, Y., et al. Functional DNA regulated CRISPR-Cas12a sensors for point-of-care diagnostics of non-nucleic-acid targets. Journal of the American Chemical Society. 142 (1), 207-213 (2020).
  13. Lake, R. J., Yang, Z., Zhang, J., Lu, Y. DNAzymes as activity-based sensors for metal ions: recent applications, demonstrated advantages, current challenges, and future directions. Accounts of Chemical Research. 52 (12), 3275-3286 (2019).
  14. Chakraborty, B., et al. Aptamers for viral detection and inhibition. ACS Infectious Diseases. 8 (4), 667-692 (2022).
  15. Liu, J., Cao, Z., Lu, Y. Functional nucleic acid sensors. Chemical Reviews. 109 (5), 1948-1998 (2009).
  16. Dunn, M. R., Jimenez, R. M., Chaput, J. C. Analysis of aptamer discovery and technology. Nature Reviews Chemistry. 1 (10), 1-16 (2017).
  17. Ellington, A. D., Szostak, J. W. In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands. Nature. 346 (6287), 818-822 (1990).
  18. Tuerk, C., Gold, L. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase. Science. 249 (4968), 505-510 (1990).
  19. Sefah, K., Shangguan, D., Xiong, X., O'Donoghue, M. B., Tan, W. Development of DNA aptamers using Cell-SELEX. Nature Protocols. 5 (6), 1169-1185 (2010).
  20. Bruesehoff, P. J., Li, J., Augustine, A. J., Lu, Y. Improving metal ion specificity during in vitro selection of catalytic DNA. Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening. 5 (4), 327-335 (2012).
  21. Shen, Z., et al. A catalytic DNA activated by a specific strain of bacterial pathogen. Angewandte Chemie International Edition. 55 (7), 2431-2434 (2016).
  22. Peinetti, A. S., et al. Direct detection of human adenovirus or SARS-CoV-2 with ability to inform infectivity using DNA aptamer-nanopore sensors. Science Advances. 7 (39), (2021).
  23. Ihms, H. E., Lu, Y. In vitro selection of metal ion-selective DNAzymes. Ribozymes: Methods and Protocols. , 297-316 (2012).
  24. Summer, H., Grämer, R., Dröge, P. Denaturing urea polyacrylamide gel electrophoresis (urea PAGE). Journal of Visualized Experiments. (32), e1485(2009).
  25. Cui, Q., et al. Identification of diaryl-quinoline compounds as entry inhibitors of Ebola virus. Viruses. 10 (12), 678(2018).
  26. Guo, Y., et al. Identification of a new region of SARS-CoV S protein critical for viral entry. Journal of Molecular Biology. 394 (4), 600-605 (2009).
  27. Panec, M., Katz, D. S. Plaque assay protocols. Protocols American Society for Microbiology. 7, 1-5 (2011).
  28. Baer, A., Kehn-Hall, K. Viral concentration determination through plaque assays: Using traditional and novel overlay systems. Journal of Visualized Experiments. (93), 1-10 (2014).
  29. Mendoza, E. J., Manguiat, K., Wood, H., Drebot, M. Two detailed plaque assay protocols for the quantification of infectious SARS-CoV-2. Current Protocols in Microbiology. 57 (1), 1-15 (2020).
  30. Luo, Z., He, L., Wang, J., Fang, X., Zhang, L. Developing a combined strategy for monitoring the progress of aptamer selection. The Analyst. 142 (17), 3136-3139 (2017).
  31. Babraham bioinformatics - FastQC a quality control tool for high throughput sequence data. , Available from: https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ (2022).
  32. Martin, M. Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads. EMBnet.journal. 17 (1), 10(2011).
  33. Zhang, J., Kobert, K., Flouri, T., Stamatakis, A. P. E. A. R. PEAR: a fast and accurate Illumina Paired-End reAd mergeR. Bioinformatics. 30 (5), 614-620 (2014).
  34. FASTX-Toolkit. , Available from: http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/ (2022).
  35. Alam, K. K., Chang, J. L., Burke, D. H. FASTAptamer: A bioinformatic toolkit for high-throughput sequence analysis of combinatorial selections. Molecular Therapy-Nucleic Acids. 4 (3), 230(2015).
  36. McKeague, M., et al. Comprehensive analytical comparison of strategies used for small molecule aptamer evaluation. Analytical Chemistry. 87 (17), 8608-8612 (2015).
  37. Entzian, C., Schubert, T. Mapping the binding site of an aptamer on ATP using MicroScale Thermophoresis. Journal of Visualized Experiments. (119), e55070(2017).
  38. Romain, M., Thiroux, B., Tardy, M., Quesnel, B., Thuru, X. Measurement of protein-protein interactions through microscale thermophoresis (MST). Bio-Protocol. 10 (7), 1-10 (2020).
  39. Eble, J. A. Titration ELISA as a method to determine the dissociation constant of receptor ligand interaction. Journal of Visualized Experiments. (132), e57334(2018).
  40. Chang, A. L., McKeague, M., Liang, J. C., Smolke, C. D. Kinetic and equilibrium binding characterization of aptamers to small molecules using a label-free, sensitive, and scalable platform. Analytical Chemistry. 86 (7), 3273-3278 (2014).
  41. Lou, X., Egli, M., Yang, X. Determining functional aptamer-protein interaction by biolayer interferometry. Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry. 67 (1), 7-25 (2016).
  42. Cheng, H., et al. Identification of a coumarin-based antihistamine-like small molecule as an anti-filoviral entry inhibitor. Antiviral Research. 145, 24-32 (2017).
  43. Sun, M., et al. Aptamer blocking strategy inhibits SARS-CoV-2 virus infection. Angewandte Chemie International Edition. 60 (18), 10266-10272 (2021).
  44. Li, J., et al. Diverse high-affinity DNA aptamers for wild-type and B.1.1.7 SARS-CoV-2 spike proteins from a pre-structured DNA library. Nucleic Acids Research. 49 (13), 7267-7279 (2021).
  45. Zhang, L., et al. Discovery of sandwich type COVID-19 nucleocapsid protein DNA aptamers. Chemical Communications. 56 (70), 10235-10238 (2020).
  46. Hamula, C. L. A., et al. An improved SELEX technique for selection of DNA aptamers binding to M-type 11 of Streptococcus pyogenes. Methods. 97, 51-57 (2016).
  47. Liu, J., Lu, Y. Rational design of "turn-on" allosteric DNAzyme catalytic beacons for aqueous mercury ions with ultrahigh sensitivity and selectivity. Angewandte Chemie International Edition. 46 (40), 7587-7590 (2007).
  48. Liu, J., Mazumdar, D., Lu, Y. A simple and sensitive "dipstick" test in serum based on lateral flow separation of aptamer-linked nanostructures. Angewandte Chemie International Edition. 45 (47), 7955-7959 (2006).
  49. Xiang, Y., Lu, Y. Using personal glucose meters and functional DNA sensors to quantify a variety of analytical targets. Nature Chemistry. 3 (9), 697-703 (2011).
  50. Lake, R. J., Yang, Z., Zhang, J., Lu, Y. DNAzymes as activity-based sensors for metal ions: recent applications, demonstrated advantages, current challenges, and future directions. Accounts of Chemical Research. 52 (12), 3275-3286 (2019).
  51. Li, N., et al. Overcoming the limitations of COVID-19 diagnostics with nanostructures, nucleic acid engineering, and additive manufacturing. Current Opinion in Solid State & Materials Science. 26, 100966(2022).
  52. Li, N., et al. Label-free digital detection of intact virions by enhanced scattering microscopy. Journal of the American Chemical Society. 144 (4), 1498-1502 (2022).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Selekcja aptamer wwykrywanie wirus w zaka nychprotok SELEXaptamery DNAkontraselekcjar nicowanie wirus wmonitorowanie qPCRtest wi zaniasekwencjonowanie wysokoprzepustowemonitorowanie wirus w w rodowisku

Powiązane artykuły