Obrazowanie limfocytów B CD19 + w eksperymentalnym mysim modelu autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia przy użyciu pozytonowej tomografii emisyjnej

Podsumowanie

Ten artykuł szczegółowo opisuje metodologię znakowania radioaktywnego przeciwciała monoklonalnego anty-CD19 specyficznego dla człowieka i jak go używać do ilościowego oznaczania limfocytów B w ośrodkowym układzie nerwowym i tkankach obwodowych mysiego modelu stwardnienia rozsianego przy użyciu obrazowania in vivo PET, zliczania gamma ex vivo i metod autoradiograficznych.

Streszczenie

Stwardnienie rozsiane (MS) jest najczęstszą chorobą demielinizacyjną ośrodkowego układu nerwowego (OUN) dotykającą młodych dorosłych, często powodującą deficyty neurologiczne i niepełnosprawność w miarę postępu choroby. Limfocyty B odgrywają złożoną i kluczową rolę w patologii stwardnienia rozsianego i są celem kilku terapii w badaniach klinicznych. Obecnie nie ma sposobu, aby dokładnie wybrać pacjentów do specyficznych terapii komórkami anty-B lub nieinwazyjnie określić ilościowo wpływ tych terapii na obciążenie limfocytów B w OUN i narządach obwodowych. Obrazowanie za pomocą pozytonowej tomografii emisyjnej (PET) ma ogromny potencjał, aby dostarczyć bardzo szczegółowych, ilościowych informacji dotyczących czasoprzestrzennego rozmieszczenia i obciążenia limfocytów B in vivo u żywych osób.

Ten artykuł opisuje metody syntezy i zastosowania znacznika PET specyficznego dla ludzkich komórek B CD19⁺ w dobrze znanym mysim modelu SM opartym na komórkach B, eksperymentalnym autoimmunologicznym zapaleniu mózgu i rdzenia kręgowego (EAE), które jest indukowane przez ludzką rekombinowaną glikoproteinę oligodendrocytów mieliny 1-125. Opisano tutaj zoptymalizowane techniki wykrywania i ilościowego oznaczania komórek B CD19 ⁺ w mózgu i rdzeniu kręgowym za pomocą obrazowania PET in vivo. Ponadto w artykule przedstawiono uproszczone metody liczenia ex vivo gamma narządów istotnych dla choroby, w tym szpiku kostnego, rdzenia kręgowego i śledziony, wraz z autoradiografią o wysokiej rozdzielczości wiązania znacznika CD19 w tkankach OUN.

Wprowadzenie

Stwardnienie rozsiane jest zaburzeniem neurologicznym o podłożu immunologicznym; unikalna prezentacja u każdego pacjenta może utrudnić leczenie zarówno pacjentom, jak i klinicystom¹. Sama choroba charakteryzuje się obecnością zmian demielinizacyjnych i infiltracji komórek odpornościowych w mózgu i rdzeniu kręgowym, co skutkuje upośledzeniem fizycznym i poznawczym². Tradycyjny paradygmat, zgodnie z którym stwardnienie rozsiane jest chorobą wywoływaną przez limfocyty T, został po raz pierwszy zakwestionowany w przełomowym badaniu klinicznym fazy II rytuksymabu³, terapii ukierunkowanej ^{na podzbiór} limfocytów B CD20+. Od tego czasu opracowano dodatkowe terapie komórkami B, które są ukierunkowane na CD19⁴, biomarker limfocytów B pan, który ulega ekspresji w szerszym zakresie limfocytów B, co może być korzystne zarówno diagnostycznie, jak i terapeutycznie. Co więcej, istniejące metody oceny skuteczności leczenia (tj. monitorowania liczby nawrotów i aktywności rezonansu magnetycznego [MRI]) nie pozwalają na wczesne pomiary odpowiedzi, co naraża pacjentów na znaczne ryzyko uszkodzenia OUN z powodu nieoptymalnego doboru i optymalizacji terapii. W związku z tym istnieje pilna potrzeba opracowania strategii monitorowania określonych komórek odpornościowych, takich jak limfocyty B CD19⁺, w czasie rzeczywistym w OUN i na obrzeżach pacjentów ze stwardnieniem rozsianym.

Obrazowanie PET to solidna technika obrazowania, która pozwala na wizualizację in vivo całego ciała danego celu zainteresowania, takiego jak CD19. Podczas gdy pobieranie krwi, rejestry częstości nawrotów i monitorowanie zmian za pomocą rezonansu magnetycznego dostarczają informacji na temat skuteczności leczenia, obrazowanie PET może umożliwić badaczom i klinicystom monitorowanie skuteczności terapii w całym ciele. To proaktywne podejście do monitorowania terapeutycznego pozwala klinicystom oceniać skuteczność leków w czasie rzeczywistym, umożliwiając szybkie dostosowanie w razie potrzeby. Monitorowanie lokalizacji i gęstości populacji komórek związanych z chorobą umożliwia również długotrwałą ocenę ciężkości choroby przy użyciu informacji anatomicznych specyficznych dla pacjenta. W związku z tym niezbędne jest opracowanie powtarzalnych metod analitycznych, aby niezawodnie wykorzystać pełny potencjał obrazowania PET w warunkach klinicznych i przedklinicznych.

Ten artykuł opisuje metody (Rysunek 1) do wykonywania obrazowania PET, liczenia gamma ex vivo i autoradiografii (ARG) komórek B CD19⁺ z przeciwciałem monoklonalnym (mAb) anty-ludzkim CD19 znakowanym ⁶⁴Cu, znanym jako 16C4-TM (⁶⁴Cu-hCD19-mAb), w eksperymentalnym mysim modelu autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia kręgowego (EAE) wywołanego u myszy transgenicznych z ekspresją ludzkiego CD19 (hCD19) przy użyciu ludzkiej rekombinowanej mieliny glikoproteina oligodendrocytów 1-125 (MOG_1-125). Dostarczamy również metody do dokładnej i powtarzalnej oceny wiązania radioznacznika w mózgu i rdzeniu kręgowym, obu krytycznych miejscach patogenezy, często poważnie dotkniętych w tym i innych modelach neurodegeneracyjnych. Techniki te pozwalają na nieinwazyjne badanie roli limfocytów B w patologii choroby i mają potencjał do klinicznego przełożenia na ocenę skuteczności terapii komórkami anty-B w stwardnieniu rozsianym.

Protokół

Rysunek 1: Schemat badania. Przegląd kluczowych technik opisanych w tym artykule. (A) Umieszczenie myszy w stole do skanowania na grzbiecie ogranicza ruchy kręgosłupa. (B) Obrazowanie PET/CT myszy. (C) Wykonanie nacięcia wzdłuż grzbietu zwierzęcia w celu odsłonięcia kręgosłupa. (D) Podział kręgosłupa na odcinek szyjny/piersiowy i lędźwiowy oraz usunięcie sekcji zgodnie z pięcioma wskazanymi cięciami. (E) Użycie strzykawki do usunięcia rdzenia kręgowego z kanału kręgowego poprzez uszczelnienie połączenia strzykawki z kręgosłupem i przepłukanie od końców czaszkowego i ogonowego, jak pokazano na schemacie. (F) Wyizolowane segmenty rdzenia kręgowego z odcinka szyjnego/piersiowego i lędźwiowego. Skróty: PET/CT = pozytonowa tomografia emisyjna/tomografia komputerowa. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Wszystkie badania na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Administracyjnego Panelu ds. Opieki nad Zwierzętami Laboratoryjnymi (APLAC) na Uniwersytecie Stanforda, programu akredytowanego przez Stowarzyszenie ds. Oceny i Akredytacji Opieki nad Zwierzętami Laboratoryjnymi (AAALAC International). Myszy aklimatyzowano w wiwariacie przez co najmniej 7 dni przed rozpoczęciem badania, aby zminimalizować stres u zwierząt, ponieważ stres może wpływać na indukcję EAE.

1. Indukcja EAE u samic myszy CD19 zhumanizowanych

1. Indukuj EAE u zhumanizowanych samic myszy CD19 C57BL/6J w wieku 9-13 tygodni, zgodnie z wcześniejszym opisem⁵, wykorzystując MOG_1-125.

2. Opieka nad zwierzętami i ocena punktowa w mysim modelu EAE

1. Oceń stopień progresji choroby i opiekę nad myszami zgodnie z wcześniejszym opisem⁵. W skrócie, model ten ocenia się w skali od 1 do 5 w następujący sposób: 1 oznacza osłabienie/wiotkość ogona, 2 oznacza osłabienie kończyn tylnych, 3 oznacza paraliż kończyn tylnych, 4 oznacza paraliż kończyn tylnych z osłabieniem kończyn przednich, a 5 oznacza stan agonalny.

3. Koniugacja przeciwciał monoklonalnych, znakowanie radioizotopowe i charakterystyka

1. Sprzęgnij bifunkcyjny chelator kwas 1,4,7,10-tetraazacyklododekan-1,4,7,10-tetraoctowy mono-Nester N-hydroksysukcynimidowy (DOTA-NHS-ester) do przeciwciała hCD19-mAb w celu znakowania radioizotopowego ⁶⁴Cu.
   1. Za pomocą kolumny do odsalania należy wymienić bufor do przechowywania hCD19-mAb na bufor HEPES (pH 8,5–9): należy uzależnić kolumnę(s) do odsalania buforem HEPES. Oblicz liczbę potrzebnych kolumn na podstawie pojemności objętościowej próbki kolumny do odsalania oraz wymaganej objętości przeciwciał mAb: probówki 0,5 ml: 30-130 µL objętości próbki, 300 µL płukania; probówki 2 ml: 200-700 µL objętość próbki, 1 ml przemywania.
   2. Schłodzić wirówkę do 4 °C do wymiany buforu poprzez kolumna do odsalania.
   3. Wyjmij kolumnę odsalającą z lodówki. Zdejmij dno kolumny odsalającej, poluzuj zatyczkę i umieść kolumnę w probówce zbiorczej.
   4. Wirować przy 1500 × g przez 2 min, aby usunąć roztwór do przechowywania; odrzucić filtrat zawierający roztwór do przechowywania i ponownie wykorzystać probówkę zbierającą. Zaznaczyć linię na kolumnie w miejscu, w którym najwyższy punkt zbitej żywicy do odsalania jest nachylony ku górze.
   5. Do dolnej części kolumny odsalającej należy dodać bufor HEPES. Kolumnę odsalającą umieszczamy w wirówce tak, aby linia była skierowana na zewnątrz, a następnie wirujemy z prędkością 1500 × g przez 2 min. Odrzucić frakcję przepływową i ponownie wykorzystać probówkę do zbierania.
   6. Powtórz kroki 3.1.4 i 3.1.5 dwukrotnie, używając tej samej probówki do zbierania i odrzucając frakcję przepływową pomiędzy poszczególnymi etapami.
   7. Umieść przygotowaną kolumnę odsalającą w nowej probówce zbiorczej i opisz ją; probówka ta będzie zawierać hCD19-mAb.
   8. Nanieś hCD19-mAb na górę przygotowanej kolumny odsalającej, a następnie użyj buforu HEPES do wypłukania pustej fiolki po mAb i dodaj go do kolumny odsalającej (objętość całkowita zgodnie z zaleceniami producenta). Wirować z prędkością 1500 × g przez 2 min w celu elucji hCD19-mAb. Należy zachować frakcję przepływową zawierającą hCD19-mAb.
   9. Zmierz stężenie hCD19-mAb za pomocą spektrofotometru UV/Vis i dostosuj je do 0.5 µg/µL w razie potrzeby z buforem HEPES.
   10. Do roztworu hCD19-mAb dodać 1/50^th objętość roztworu przeciwciał monoklonalnych (mAb) z 0,5 M EDTA, aby uzyskać końcowe stężenie EDTA wynoszące 0,01 M w roztworze hCD19-mAb. Pozostawić roztwór hCD19-mAb-EDTA w temperaturze pokojowej na 15 min.
   11. Wyjąć ester DOTA-NHS z zamrażarki i pozostawić do osiągnięcia temperatury pokojowej (10–15 min). Obliczyć objętość DMSO, którą należy dodać do estru DOTA-NHS, aby uzyskać stężenie DOTA umożliwiające zastosowanie pożądanego stosunku molowego DOTA/mAb (który zazwyczaj wynosi od 1 do 2 DOTA/mAb).
       UWAGA: Objętość DMSO-DOTA-NHS-ester dodana do hCD19-mAb nie powinna przekraczać 10% objętości mAb. Obliczenia te należy przeprowadzić za pomocą arkusza kalkulacyjnego, aby umożliwić ich szybkie i powtarzalne wykonywanie.
   12. W oparciu o pożądany stosunek DOTA do hCD19-mAb należy obliczyć ilość DOTA-NHS-esteru, którą należy dodać do hCD19-mAb.
       nmol przeciwciał monoklonalnych × 10 DOTA/mAb → nmol DOTA → mg DOTA → mg/ml DOTA/DMSO → ml DMSO → czynnik rozcieńczenia roztworu DOTA/DMSO
   13. Odważyć 1–2 mg estru DOTA-NHS, a następnie ostrożnie dodać do niego odpowiednią objętość DMSO (obliczoną w punkcie 3.1.11); wymieszać i odwirować.
   14. Odmierzyć pipetą obliczoną objętość roztworu DOTA-NHS-esteru (krok 3.1.12) i przenieść do roztworu hCD19-mAb; przed dodaniem przetrzeć zewnętrzną stronę końcówki pipety, aby upewnić się, że nie zostanie dodany nadmiar DOTA-NHS-esteru (bez zmiany ilości cieczy wewnątrz pipety). Delikatnie wymieszać i odwirować.
   15. Umieścić w lodówce (4 °C) i pozostawić do reakcji przez noc (12–16 h).
2. Oczyszczanie i zagęszczanie
   1. Schłodzić wirówkę do 4 °C w krokach wymiany buforu z użyciem koncentratora odśrodkowego; umieścić metalowy blok do probówek PCR na suchym lodzie w celu błyskawicznego zamrożenia koniugatu.
   2. Wyjmij mieszaninę reakcyjną DOTA-hCD19-mAb z lodówki i przerwij reakcję, dodając bufor TRIS klasy biologicznej w ilości stanowiącej 10% całkowitej objętości reakcji. Pobierz 10-20 µg próbki do analizy spektrometrią mas.
   3. Przygotuj kolumnę/kolumny do odsalania zgodnie z powyższym opisem (kroki 3.1.1-3.1.5), używając buforu octanu amonu 0,1 M o pH 5,5.
   4. Przeprowadź wymianę buforu roztworu DOTA-hCD19-mAb na octan amonu (kroki 3.1.1-3.1.8).
   5. Skoncentruj roztwór DOTA-hCD19-mAb: przenieś roztwór do wirówkowej kolumny koncentrującej z granicą odcięcia masy cząsteczkowej 50 kDa, zgodnie z zaleceniami producenta dotyczącymi objętości. Wiruj przy 4 000 × g przez 10 min (lub do momentu odparowania 80%–90% objętości); odrzucić frakcję przepływową.
   6. Powtórzyć czynność jeszcze dziewięć razy (łącznie 10): dodać wystarczającą ilość octanu amonu, aby przywrócić objętość do maksymalnej zalecanej wartości.
      UWAGA: Suma powinna odpowiadać ilości dodanej początkowo, wliczając w to objętość pozostałą w kolumnie, zazwyczaj 400-450 µL dla a 500 µL pojemność wirówkowego koncentratora
      1. Przepłucz fiolkę reakcyjną buforem octanu amonu, aby odzyskać wszelkie pozostałości DOTA-hCD19-mAb; dodaj płuczynkę do koncentratora odśrodkowego.
      2. Wirować przy 4000 obr./min × g przez 10 min.
         UWAGA: Czas wirowania może zostać skrócony podczas kolejnych cykli, jeśli objętość zostanie zredukowana do 80%–90% w krótszym czasie.
   7. Usuń roztwór białka z koncentratora wirówkowego. Odnotuj całkowitą objętość DOTA-hCD19-mAb.
      1. Do koncentratora odwirującego 2 należy dodać odpowiednią ilość buforu octanu amonu, aby uzyskać objętość całkowitą wynoszącą 100 µL i wymieszać za pomocą pipety. Zakręcić kolumnę koncentratora wirówkowego i odwrócić. Wirować przy 4000 × g przez 2 min, aby zebrać roztwór. Przenieść do nowej probówki.
      2. W koncentratorze odśrodkowym 500 należy za pomocą pipety zebrać roztwór przeciwciał monoklonalnych (mAb) i przenieść go do nowej probówki.
   8. Zmierz stężenie za pomocą spektrofotometru UV-Vis. Jeśli stężenie przekracza 2 mg/ml, rozcieńcz próbkę octanem amonu do stężenia 2 mg/ml.
   9. Aliquota 100 µg na probówkę do PCR (około 50 µL); opisać probówki, podając nazwę DOTA-hCD19-mAb, datę, masę oraz stężenie. Wirować fiolki w celu zebrania cieczy.
   10. Szybko zamroź DOTA-hCD19-mAb na schłodzonym bloku PCR na suchym lodzie (lub zamroź na suchym lodzie). Po zamrożeniu wszystkich próbek umieść je w -80 °C zamrażarka
   11. Wyznaczyć liczbę cząsteczek DOTA przypadających na hCD19-mAb za pomocą spektrometrii mas. Od każdego procesu koniugacji należy zachować próbkę niekoniugowanego (czystego) przeciwciała w celu obliczenia stosunku. Użyć równania (1) podane poniżej; masę cząsteczkową oznaczono skrótem MW.
            (1)
3. Radiomarkowanie
   UWAGA: Należy stosować odpowiednie środki ochrony indywidualnej (ŚOI) podczas pracy z materiałami promieniotwórczymi, w tym fartuch laboratoryjny, rękawice oraz osobiste dozymetry ciała i pierścienia, zgodnie z przepisami instytucjonalnymi. Należy regularnie monitorować i zmieniać rękawice, aby zapobiec skażeniu promieniotwórczemu. Należy stosować osłony ołowiane i, w miarę możliwości, zwiększać odległość od źródła promieniotwórczego, posługując się kleszczami.
   1. Przenieś substancję promieniotwórczą z fiolki transportowej do nowej fiolki za pomocą pipety. Zmierz aktywność promieniotwórczą.
   2. Pobierz alikwot do pierwszej reakcji znakowania radioaktywnego. Dodaj 50 µL octanu amonu (pH 5,5) na każde 1 mCi ⁶⁴Cu-CuCl₃Pomiar pH należy przeprowadzić za pomocą pipety. 1 µL na pasek wskaźnika pH o zakresie obejmującym wartość 5,5 i z rozdzielczością wystarczającą do rozróżnienia wartości 5 i 6.
   3. Jeśli pH nie mieści się w zakresie 4–5,5, należy je skorygować, używając 1 M NaOH lub 0,1 M HCl. Dodawać niewielkie ilości, 1–5 µLdodając 1 M NaOH, jeśli pH jest niższe niż 4, lub 0,1 M HCl, jeśli pH jest wyższe niż 5,5, aż do osiągnięcia właściwego pH. Po każdym dodaniu należy dokładnie wymieszać, odwir {zwirować} i zmierzyć pH zgodnie z powyższym opisem. Należy odnotować każde dodanie i pobranie roztworu (również w celu sprawdzenia pH), aby móc obliczyć końcową objętość.
   4. Po osiągnięciu optymalnego pH należy dodać 10 µg DOTA-hCD19-mAb na 1 mCi ⁶⁴Cu-CuCl₃Delikatnie wymieszać i krótko wirować.
   5. Umieść fiolkę z reakcją w termomikserze ustawionym na 37 °C oraz 400 obrotów na minutę (rpm).
   6. Po 30 min należy przerwać reakcję: podzielić całkowitą objętość reakcji przez 50 i dodać taką objętość 0,5 M EDTA do mieszaniny reakcyjnej.
   7. Oznaczono wydajność znakowania przy użyciu błyskawicznej chromatografii cienkowarstwowej (ITLC) w celu pomiaru procentowej zawartości miedzi związanej i wolnej w roztworze.
      1. Wytnij paski papieru do TLC o szerokości 1 cm. Zaznacz odległość 1 cm od górnej i dolnej krawędzi paska, a następnie przygotuj probówkę (kolbę stożkową 50 ml) z fazą ruchomą w postaci kwasu cytrynowego 0,1 M o wysokości mniejszej niż 1 cm (po umieszczeniu paska w probówce poziom fazy ruchomej powinien znajdować się poniżej zaznaczonej linii 1 cm).
      2. Pipeta 1 µL roztworu reakcyjnego na pasku na wysokości 1 cm od dołu (front rozpuszczalnika), a następnie umieść pasek w probówce. Obserwuj proces do momentu, aż front rozpuszczalnika osiągnie poziom 1 cm od góry, po czym wyjmij pasek i owiń go folią spożywczą.
      3. Umieść pasek na platformie i wprowadź go do skanera obrazowania radio-TLC. Poszukaj znakowanego radioaktywnie przeciwciała mAb w punkcie startowym oraz wolnego ⁶⁴Cu przemieszczające się z czołem fazy ruchomej (Rycina 2). Jeśli zawartość wolnej miedzi wynosi mniej niż 5% (wydajność znakowania 95%), należy przystąpić do wstrzyknięcia preparatu zwierzętom. Jeśli zawartość wolnej miedzi przekracza 5%, należy przystąpić do oczyszczania.
         UWAGA: Procent wolnej miedzi zależy zazwyczaj od stosunku DOTA-mAb do ⁶⁴Cu, czas reakcji, pH i temperatura. Warunki reakcji powinny zostać zoptymalizowane przez każdego użytkownika dla każdego nowego przeciwciała monoklonalnego (mAb), aby zapewnić powtarzalne wyniki.
4. Oczyszczanie poprzez jednorazowa kolumna grawitacyjna klasy DNA
   1. Przygotuj jednorazową kolumnę grawitacyjną klasy DNA (kolumnę do odsalania/wymiany buforu) zgodnie z instrukcjami producenta. Umieść jednorazową kolumnę grawitacyjną klasy DNA na statywie z pierścieniem lub innym urządzeniu za odpowiednim osłoną ołowianą; upewnij się, że aparatura jest stabilna i łatwo przesuwalna. Pod kolumną umieść probówkę.
   2. Przenieś pipetą surową mieszaninę poreakcyjną na żywicę w kolumnie do filtracji grawitacyjnej. Odczekaj, aż cały płyn przesączy się do żywicy. Dodaj pipetą odpowiednią ilość buforu PBS, aby doprowadzić całkowitą objętość (surowego produktu oraz PBS) do 500 µLZutylizować frakcję przepływową.
   3. Umieść kolumnę nad probówkami do wirowania o pojemności 1,5 ml, ponumerowanymi od 1 do 10. Dodaj do kolumny 1 ml PBS. Zbieraj po pięć kropli do każdej probówki, aż do całkowitego zatrzymania przepływu.
      UWAGA: Może być wymaganych mniej niż 10 probówek.
   4. Zamknij dół kolumny i zmierz pozostałą radioaktywność. Zmierz każdą fiolkę z przepływem. Dla każdej fiolki zawierającej więcej niż 50 µCiprzygotować ITLC zgodnie z krokiem 3.3.7, aby zmierzyć procent związanej miedzi w każdej frakcji.
      UWAGA: Pierwsze jedna lub dwie frakcje będą zawierać wyłącznie fazę ruchomą; znakowane radioaktywnie przeciwciało mAb zostanie wypłukane jako pierwsze (zazwyczaj frakcje od 2 lub 3 do 5 lub 6), a wolne ⁶⁴Cu eluuje jako ostatnie (część zostanie związana z kolumną). Procent związania ⁶⁴Zawartość Cu może różnić się pomiędzy frakcjami.
   5. Połączyć frakcje z wiązaniem przekraczającym 95% (poniżej 5% wolnej miedzi); otrzymany roztwór wykorzystać do iniekcji. W razie potrzeby przeprowadzić HPLC z wykluczaniem molekularnym w celu potwierdzenia znakowania radioizotopowego.⁵ następnie oblicz aktywność molową. Odlej alikwot w celu zmierzenia stężenia za pomocą spektrofotometru UV-Vis po upływie 10 okresów półtrwania (127 h lub 5,3 dnia).

4. Przygotowanie dawek

UWAGA: Przed kontaktem z dawką należy założyć odpowiednie środki ochrony osobistej, w tym fartuch laboratoryjny, dozymetry osobiste i pierścieniowe oraz rękawiczki.

1. Wstrzyknąć ⁶⁴Cu-DOTA-hCD19-mAb od 18 do 24 h przed skanowaniem PET, aby umożliwić odpowiednią cyrkulację radiotraceru w organizmie.
2. Natychmiast umieścić ołowiany pojemnik z ⁶⁴Cu-DOTA-hCD19-mAb za osłoną ołowianą. Włączyć licznik Geigera w celu monitorowania potencjalnego skażenia.
   UWAGA: Często zmieniać rękawiczki podczas pracy z materiałem radioaktywnym. Zaleca się stosowanie podwójnych rękawiczek podczas pobierania dawek, aby ułatwić ich szybką wymianę. Zawsze umieszczać skażone przedmioty ostre i odpady w wyznaczonym osłoniętym obszarze na odpady.
3. Rozcieńczyć ⁶⁴Cu-DOTA-hCD19-mAb do odpowiedniego stężenia w plastikowej probówce wirówkowej 1,5 mL o niskim stopniu wiązania (low bind).
   UWAGA: ⁶⁴Cu-DOTA-hCD19-mAb będzie wiązać się z plastikiem, jeśli nie jest on typu low bind; ⁶⁴Cu będzie wiązać się ze szkłem.
   1. Rozcieńczyć radiotracer w soli fizjologicznej, aby zapobiec radiolizie i ułatwić pobieranie powtarzalnych dawek.
   2. Przygotować dawki do podania w ilości od 75 do 150 µCi w 100 µL, jeśli to możliwe. Upewnić się, że maksymalna całkowita objętość wstrzykniętej substancji nie przekracza 10% masy ciała myszy.
4. Użyć strzykawki insulinowej 500 µL (50 cc) do pobrania dawki z plastikowej probówki low bind. Upewnić się, że w strzykawce nie ma pęcherzyków powietrza, ponieważ preparat będzie wstrzykiwany dożylnie.
   1. Wcześniej oznakować strzykawki odpowiednimi numerami zwierząt.
   2. Zanotować aktywność dawki oraz godzinę w zeszycie laboratoryjnym do późniejszej analizy danych.
   3. Przygotować dawki do wstrzyknięcia natychmiast po kanulacji zwierząt, aby skrócić czas przebywania w narkozie.
5. Po przygotowaniu dawek przygotować wzorzec (fantom) do skanowania w celu wyznaczenia współczynnika kalibracji.
   1. Napełnić stożkową probówkę 15 mL roztworem o aktywności 50-75 µCi rozcieńczonej w wodzie (lub PBS).
      UWAGA: Zapewnić dokładne wymieszanie roztworu. Wzorzec może stanowić wolny ⁶⁴Cu pozostały po znakowaniu.
      1. Zmierzyć ilość aktywności we wzorcu i zapisać godzinę.

5. Kanulacja i iniekcja

UWAGA: W celu wykonania kaniulacji dożylnej myszy w celu wstrzyknięcia radiotraceru⁶ należy zapoznać się z wcześniej opisanymi metodami⁶.

1. Zważ myszy i oceń stopień nasilenia choroby zgodnie z opisem w sekcji 2.1 przed znieczuleniem zwierząt w komorze indukcyjnej wypełnionej 1,5-3% izofluranem w celu przygotowania do podania radiotraceru.
   UWAGA: Iniekcje u tych myszy będą wykonywane na blacie laboratoryjnym, a nie w skanerze PET, jak opisano wcześniej. Nie ma potrzeby przyklejania kaniul, ponieważ myszy nie będą przenoszone pomiędzy kaniulacją a iniekcją.
2. Po kaniulacji myszy wprowadź igłę do końca cewnika i wstrzyknij preparat powoli. Po iniekcji przepłucz cewnik niewielką ilością soli fizjologicznej, aby upewnić się, że podano całą dawkę.
   UWAGA: Objętość powinna być w przybliżeniu równa objętości martwej cewnika, która w przypadku cewników użytych przez autorów wynosi 50 µL.
   1. Wykonywanie iniekcji nad kawałkiem ręcznika laboratoryjnego w celu zebrania ewentualnych kropel radiotraceru; należy uwzględnić go podczas pomiaru dawki resztkowej.
   2. Zapisz czas iniekcji w dzienniku laboratoryjnym.
3. Usuń kaniulę natychmiast po iniekcji. Zmierz kaniulę, strzykawkę z dawką oraz tkankę za pomocą kalibratora dawki, aby określić dawkę resztkową, która nie została wstrzyknięta myszy.
   1. Zapisz aktywność i czas w dzienniku laboratoryjnym.
4. Po wykonaniu iniekcji oznacz klatki myszy etykietą informującą, że zwierzęta są radioaktywne. Zarejestruj i wpisz klatki do ewidencji zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi. Następnie umieść myszy w wyznaczonym obszarze przechowywania materiałów radioaktywnych.

6. Obrazowanie PET/CT

1. Wykonać obrazowanie PET od 18 do 24 h po wstrzyknięciu ⁶⁴Cu-DOTA-hCD19-mAb. Przed skanowaniem należy zważyć myszy i ocenić ich stan kliniczny.
   UWAGA: Instrukcje obsługi skanera zależą od rodzaju używanego urządzenia.
   1. Należy upewnić się, że komponent rentgenowski skanera PET/CT został rozgrzany i jest gotowy do akwizycji.
   2. Uruchom oprogramowanie do akwizycji skanera PET na komputerze.
   3. Z Logowanie badacza menu rozwijane, kliknij odpowiednie informacje o laboratorium.
   4. Na Projekt strona, albo utwórz a nowy zaprojektuj lub wybierz istniejący projekt z menu rozwijanego.
   5. Kiedy Inicjacja na ekranie automatycznie pojawia się monit, kliknij w Łóżko domowe i poczekaj, aż stół wróci do pozycji home. Następnie kliknij w Rozgrzewanie tomografu komputerowego (CT).
      1. Upewnij się, że drzwi osłonowe tomografu komputerowego są zamknięte, aby umożliwić rozgrzanie urządzenia.
2. Podczas rozgrzewania skanera należy ocenić stan myszy z EAE, a następnie wstrzyknąć im podskórnie w okolicę boku od 0,2 do 0,4 ml ciepłej soli fizjologicznej w celu nawodnienia.
3. Po rozgrzaniu skanera należy wrócić do komputera, aby skonfigurować badania PET dla danej analizy.
   UWAGA: Elementy te można przygotować przed dniem skanowania.
   1. Pod Najnowsze badania nagłówek, kliknij w Utwórz nowe badanieWypełnij nazwa badania, protokół, związeki informacje o badanych.
      1. W przypadku wykonywania badania PET/CT należy wybrać Protokół PET najpierw, a następnie wybrać Protokół TK.
         UWAGA: Zazwyczaj standardowa tomografia komputerowa (TK) jest wystarczająca do obrazowania mysiego modelu EAE. Skan TK trwa 1 minutę i jest nabywany z binningiem 2 x 2 przy napięciu 80 kVp oraz natężeniu prądu 150 µAoraz 720 projekcji. Obrazy CT są rekonstruowane przy użyciu zmodyfikowanego algorytmu Feldkampa.
      2. W przypadku protokołu PET należy wybrać statyczne skanowanie miedzią-64 trwające 10–15 min. Jeśli skanowanie to nie znajduje się na liście dostępnych protokołów, należy je dodać, klikając w Protokoły karta w Standard menu Utwórz nowy protokół | Izotopy menu rozwijane. Jeśli pożądany izotop nie znajduje się na liście, kliknij w Więcej | Dodaj z biblioteki i dodaj wybrany izotop. Określ czas trwania skanowania, kliknij przycisk opcji dla Skan statycznywpisz nazwę protokołu i kliknij Zapisz.
      3. Powrót do Badania naciśnij klawisz tab i kontynuuj nazywanie oraz konfigurowanie wszystkich planowanych na dany dzień skanów.
         UWAGA: Zaleca się również przygotowanie jednej "Badanie TK" wykonać skanowanie przy użyciu standardowej tomografii komputerowej (TK) w celu sprawdzenia ustawienia stołu podczas pierwszego skanowania, aby zapewnić optymalne rozmieszczenie. Powinno to być pierwsze skanowanie przeprowadzone w ramach badania.
4. Po przygotowaniu skanera znieczul myszy w komorze do znieczulania, aby przygotować je do badania.
   UWAGA: Na tym etapie myszy są prawdopodobnie w bardzo ciężkim stanie; zaleca się zminimalizowanie czasu trwania znieczulenia.
   1. Nanieś żel do oczu.
5. Należy upewnić się, że platforma skanująca dla czterech myszy jest wyposażona w elementy grzewcze, takie jak maty grzewcze lub nawiew ciepłego powietrza, przy ustawionym stężeniu izofluranu na poziomie 1,5%–2% i włączonej macie grzewczej (Rycina 3). Umieścić myszy w pozycji grzbietnej na stole do skanowania.
   1. W miarę postępu choroby EAE kręgosłup myszy ulega silnemu wygięciu. Skanowanie myszy w pozycji na plecach pozwala maksymalnie wyprostować kręgosłup, co usprawnia późniejszą analizę. Aby pomóc w wyprostowaniu kręgosłupa, należy delikatnie pociągnąć mysz za ogon.
6. Po ułożeniu myszy w pozycji grzbietnej, należy je stabilnie przymocować za pomocą miękkiej taśmy mikroskopowej. Jeden pasek taśmy należy nakleić nad głową, a drugi delikatnie nad brzuchem, aby zminimalizować ruchy wywołane oddychaniem.
   1. Zapisz w dzienniku laboratoryjnym, która mysz znajduje się w której pozycji skanowania.
7. Po unieruchomieniu myszy należy wrócić do komputera sterującego, aby obsłużyć skaner.
8. Otwórz Kontroler ruchu menu. Kliknij w Pole widzenia (FOV) centrum PET aby przenieść myszy z platformy skanującej do pierścienia PET. Przy pierwszym skanowaniu w ciągu dnia należy kliknąć FOV centrum TKPo ustawieniu pacjenta wykonaj skan testowy CT, aby upewnić się, że pozycja jest prawidłowa; powtarzaj czynność do momentu uzyskania satysfakcjonującego położenia stołu.
   1. Naklej mały kawałek białej taśmy na stole skanującym, aby zaznaczyć prawidłowe miejsce ułożenia próbki na pozostały czas badania.
9. Po ustawieniu stołu do badania PET, rozpocznij sekwencję skanowania, klikając w Uruchom.
   1. Należy odczekać, aż skaner automatycznie przesunie się z pierścienia PET do CT.
   2. Zawsze sprawdzaj wizualnie, czy zwierzęta znalazły się w odpowiedniej pozycji zarówno do badania PET, jak i CT.
   3. Zapisz w dzienniku laboratoryjnym czas rozpoczęcia skanowania w celu przeprowadzenia korekty rozpadu dawki wstrzykniętej podczas analizy danych.
10. Po zakończeniu skanowania należy odczekać do czasu zrekonstruowania obrazu. Przed wyjęciem zwierząt należy sprawdzić dane.
    UWAGA: Rekonstrukcja z wykorzystaniem algorytmu OSEM (3D-ordered subsets expectation-maximization) potrwa około 5 min w przypadku skanu statycznego.
11. Wizualnie sprawdź i zatwierdź dane, wykorzystując śledzionę jako kontrolę pozytywną, ponieważ tkanka ta zawiera dużą liczbę limfocytów B. Zdejmij zwierzęta z platformy skanującej i umieść je w komorze z izofluranem w celu uśpienia, przygotowując je do perfuzji i późniejszej sekcji.
12. Powtórz kroki 6.5–6.12 dla pozostałych myszy biorących udział w badaniu.
13. Po zeskanowaniu wszystkich myszy lub w przypadku skanowania grupy, w której w stole skanera pozostało wolne miejsce, należy zeskanować standard przygotowany w kroku 4.6.

7. Disekcja do zliczania gamma ex vivo i autoradiografii

1. Przed przystąpieniem do sekcji należy upewnić się, że wszystkie probówki do liczenia gamma oraz probówki do wirowania zostały wcześniej zważone.
2. Eutanazję przeprowadza się poprzez perfuzję, zgodnie z wcześniejszym opisem⁶, stosując PBS oraz torakotomię, podczas gdy myszy znajdują się w głębokiej narkozie (ciągła inhalacja 4% izofluranu, 2 L/min 100% O₂).
3. Aby wyizolować szpik kostny, należy przeciąć obie kości udowe na wysokości kolana i miednicy. Należy upewnić się, że obie głowy zostały usunięte z kości udowej.
   1. Obie kości udowe należy umieścić w probówce do wirowania o pojemności 0,5 mL, która posiada otwór w dnie (wykonany igłą 20 G) i z odciętą pokrywką.
   2. Probówkę 0,5 mL zawierającą kości udowe należy umieścić wewnątrz probówki do wirowania o pojemności 1,5 mL z odciętą pokrywką.
   3. Cały zestaw probówek należy umieścić w miniwirówce. Wirować przez 4 min przy 4 500 × g.
      UWAGA: Szpik kostny powinien zostać wypchnięty przez otwór w probówce 0,5 mL i osadzić się na dnie probówki 1,5 mL.
      1. Rozdzielić probówki. Zważyć puste kości udowe w probówce 0,5 mL. Zważyć szpik kostny w probówce 1,5 mL. Przenieść zawartość każdej probówki do probówek do liczenia gamma.
4. Mózg należy usunąć za pomocą pęsety i nożyczek, dbając o zachowanie nienaruszonego pnia mózgu. Mózg umieszcza się w probówce do liczenia gamma. Należy zapisać masę na sucho, przepłukać PBS i przechowywać w lodzie do momentu pomiaru.
5. W celu wyizolowania rdzenia kręgowego należy wykonać następujące kroki.
   1. Usunąć skórę i futro, wykonując nacięcie wzdłuż grzbietowej strony zwierzęcia, aby odsłonić kręgosłup (Rysunek 1).
   2. Oddzielić odcinek lędźwiowy (L) od odcinków szyjnego (C) i piersiowego, wykonując cięcia wzdłuż trzech płaszczyzn poprzecznych wokół i przez kręgosłup: u podstawy szyi (kręg C1) (Rysunek 1D, Numer 1); u podstawy klatki piersiowej (kręg L1) (Rysunek 1D, Numer 2); u podstawy miednicy (kręg L5) (Rysunek 1D, Numer 3).
   3. Przeciąć pod klatką piersiową (Rysunek 1D, Numer 2).
   4. Przeciąć bezpośrednio nad kością krzyżową, aby oddzielić lędźwiowy odcinek rdzenia. Ostrożnie przyciąć kręgosłup od strony miednicy, aż do momentu, gdy widoczny będzie lędźwiowy rdzeń kręgowy (Rysunek 1D, Numer 3). Odciąć tkanki otaczające, aby wyizolować lędźwiowy oraz szyjny/piersiowy odcinki kręgosłupa (Rysunek 1D, Numery 4 i 5).
   5. Aby wypchnąć rdzeń kręgowy, należy użyć strzykawki z wąską końcówką (3-10 mL) wypełnionej PBS. Za pomocą kciuka i palca wskazującego należy stworzyć szczelne połączenie między strzykawką a kręgosłupem.
      1. Delikatnie wprowadzić PBS przez strzykawkę, aby wypchnąć rdzeń kręgowy na podkład chłonny (Rysunek 1E); powtórzyć czynność dla obu odcinków rdzenia. Tkanki rdzenia kręgowego umieścić w probówce do liczenia gamma.
      2. Zapisać masę na sucho i dodać PBS, aby upewnić się, że tkanka znajduje się na dnie probówki, co zapobiegnie jej wysychaniu. Probówkę przechowywać w lodzie do momentu pomiaru.
      3. Wypchnąć rdzeń szyjny/piersiowy od końca czaszkowego, a rdzeń lędźwiowy od końca ogonowego kręgosłupa (Rysunek 1E).

8.​ Pomiar aktywności gamma ex vivo

1. Otwórz oprogramowanie licznika gamma. Przejdź do listy zadań i wybierz odpowiedni protokół, np. protokół zliczania 30 s dla ⁶⁴Cu.
2. Przygotuj co najmniej trzy wzorce w oddzielnych probówkach. Przemierz je teraz, aby wykorzystać je w analizie (krok 10.2). Dąż do uzyskania trzech powtórzeń objętości i ilości aktywności w trzech oddzielnych probówkach.
   UWAGA: Objętość 500 µL daje dobre wyniki. Chociaż aktywność zostanie określona przez użyte urządzenie, wartość 10 µCi zazwyczaj sprawdza się dobrze.
3. Umieść wzorce w statywie oznaczonym kodem kreskowym odpowiadającym wybranemu protokołowi do uruchomienia. Umieść statyw w liczniku gamma.
4. Po zapisaniu masy organów umieść probówki zawierające organy w statywie do zliczania gamma za probówkami zawierającymi wzorce.
   UWAGA: Organy istotne dla tego modelu mogą obejmować: węzły chłonne osiowe, krew, szpik kostny, mózg, węzły chłonne szyjne, kość udową, serce, wątrobę, rdzeń kręgowy lędźwiowy, mięśnie, śledzionę, ogon oraz rdzeń kręgowy szyjny/piersiowy.
5. Włóż statyw z kodem kreskowym stopu do tylnej części licznika gamma.
6. Naciśnij przycisk Play na komputerze. Jeśli to możliwe, nie naciskaj Play , dopóki nie będzie wielu statywów lub organów do zliczania, aby umożliwić ciągłe zliczanie wszystkich probówek w jednym pliku. Upewnij się, że przy każdym pomiarze w tylnej części licznika gamma znajduje się statyw z kodem kreskowym stopu.
7. Kontynuuj pomiar, aż wszystkie próbki zostaną zliczone. Zapisz i wyeksportuj plik.

9. Autoradiografia (ARG) tkanki OUN ex vivo

1. Należy postępować zgodnie z wcześniej opublikowanymi krokami dla ARG mózgu i rdzenia kręgowego (z wyłączeniem kroków 2-6 opisanych przez Chaney i wsp., ponieważ myszy zostały już wstrzyknięte radiotracierem podczas badania PET)⁶.
   UWAGA: Szczegółowe instrukcje przygotowania kasety ARG do rdzenia kręgowego znajdują się tutaj⁶.
2. Po zakończeniu pomiarów gama dla lędźwiowego oraz szyjnego/piersiowego odcinka rdzenia kręgowego, należy niezwłocznie umieścić probówki w lodzie do czasu przeliczenia wszystkich tkanek OUN.
   UWAGA: W kwestii ARG mózgu należy odnieść się do wcześniej opublikowanej metody⁶.
3. Należy delikatnie przechylić probówki, aby rdzenie kręgowe wypadły na podkładkę chłonną. Jeśli rdzeń kręgowy przyklei się do ścianki probówki, należy go delikatnie wypłukać zimnym PBS i ponownie przechylić probówkę. Każdy rdzeń kręgowy należy ostrożnie osuszyć, delikatnie przykładając chusteczkę laboratoryjną. Osuszone rdzenie kręgowe należy ułożyć w uporządkowany sposób na grubej czarnej kartce papieru.
   1. Obok rdzeni kręgowych należy wykonać opisy białym pisakiem w celu łatwej identyfikacji.
   2. W narożnikach i na środku czarnego papieru należy pozostawić miejsce na ułożenie stosów po trzy szkiełka przedmiotowe, które będą pełnić funkcję dystansów zapobiegających uciśnięciu rdzeni kręgowych po zamknięciu kasety ARG. Należy użyć od 5 do 7 takich stosów.
4. Gdy wszystkie lędźwiowe i szyjne/piersiowe rdzenie kręgowe zostaną ułożone na czarnym papierze i opisane, należy ostrożnie umieścić kartkę w kasecie ARG. Otwartą kasetę należy położyć na tacy z suchym lodem, aby zamrozić rdzenie kręgowe.
5. Po zamrożeniu należy delikatnie umieścić folię spożywczą pomiędzy cyfrowym ekranem fosforowym a rdzeniami kręgowymi, a następnie położyć ekran na próbkach. Należy natychmiast zamknąć kasetę i umieścić ją w zamrażarce w temperaturze -20 °C na około 10 okresów półtrwania (~127 h).
6. Po upływie czasu ekspozycji należy zeskanować film za pomocą obrazownika fosforowego. Uzyskany obraz cyfrowy należy poddać analizie (instrukcje znajdują się w sekcji 12).

10. Analiza danych dotyczących biodystrybucji

1. Utwórz arkusz kalkulacyjny „Korekcja dawki” (Dose Correction), aby matematycznie wyznaczyć korektę czasu dla rozpadu promieniotwórczego, co pozwoli na normalizację dawek promieniowania i umożliwienie porównań między osobnikami.
   1. Skoryguj wszystkie dawki pod kątem rozpadu do momentu iniekcji, uwzględniając aktywność resztkową pozostałą w strzykawce i cewniku po wstrzyknięciu.
   2. Wykorzystując standardy przygotowane w kroku 8.2, wyciągnij średnią z ilości aktywności (µCi) oraz znormalizowanej liczby zliczeń na minutę (CPM). Podziel średnią wartość CPM przez średnią ilość aktywności standardu, aby otrzymać wartość CPM/µCi.
      UWAGA: Upewnij się, że ilość aktywności dla każdego standardu została skorygowana pod kątem rozpadu do czasu, w którym licznik gamma zlicza CPM standardów. Licznik gamma powinien normalizować wszystkie wartości CPM do czasu rozpoczęcia protokołu.
2. Utwórz arkusz kalkulacyjny „Wyniki” (Results), aby obliczyć końcowy procent wstrzykniętej dawki na gram tkanki (%ID/g) dla każdej próbki.
   1. Skoryguj pod kątem rozpadu znormalizowane wartości CPM z licznika gamma dla każdej zliczonej próbki do momentu iniekcji u zwierzęcia.
      UWAGA: Korekcja rozpadu może być odniesiona do dowolnego punktu czasowego; upewnij się, że wszystkie dawki i wartości CPM są skorygowane pod kątem rozpadu do tego samego punktu czasowego.
   2. Znormalizuj skorygowane pod kątem rozpadu wartości CPM do masy każdej próbki, aby wyznaczyć CPM na próbkę. Oblicz całkowite wstrzyknięte CPM, odejmując CPM z ogona od obliczonego wstrzykniętego CPM.
      UWAGA: Masa ogona nie wymaga korekty, ponieważ wartość CPM z ogona zostanie po prostu odjęta od całkowitego wstrzykniętego CPM, aby uwzględnić ewentualne podanie znacznika poza naczynia podczas iniekcji.
   3. Podziel CPM na masę przez całkowite wstrzyknięte CPM, aby obliczyć %ID/g.
3. Utwórz arkusz kalkulacyjny „Podsumowanie” (Summary), aby wyświetlić końcowe wyniki do wprowadzenia do oprogramowania graficznego oraz późnej wizualizacji danych i analizy statystycznej.

11. Analiza obrazów PET

1. Otwórz oprogramowanie do analizy PET. Kliknij File |Open Local Data | DICOM. Znajdź odpowiedni plik (format DICOM). Otwórz zarówno obraz PET, jak i CT.
2. W Data Manager dostosuj kontrast PET oraz CT do pożądanych poziomów.
3. Zarejestruj i przytnij obrazy poszczególnych myszy.
   1. W menu Navigation wybierz zakładkę Reorientation/Registration.
   2. Przejdź do menu Rigid w tej zakładce. Wyznacz skan CT (0) jako skan Fixed (stały), a skan PET (1) jako skan Moving (ruchomy).
   3. Wybierz transformację Rigid oraz jakość Fast . Kliknij Register.
   4. Po zakończeniu rejestracji (5-10 min) kliknij znaczek zatwierdzenia , aby zapisać rejestrację.
   5. Dokonaj wizualnej inspekcji danych, aby upewnić się, że rejestracja przebiegła pomyślnie. Eksportuj sesję, klikając File | Session | Export.
   6. Następnie przytnij każdą mysz w pełnym kadrze ciała: przejdź do menu Navigation i kliknij Cropping. Przeciągnij boki każdego przekroju od krawędzi zewnętrznej do wewnątrz.
   7. Gdy wybrana mysz zostanie ciasno przycięta, kliknij znaczek zatwierdzenia i wyeksportuj sesję, aby ją zapisać.
   8. Następnie przytnij i wyprostuj głowy każdej myszy do analizy mózgu, korzystając z ręcznego Translation (przesunięcia), Rotations (obrotów) i Flips (odbić lustrzanych) w menu Registration/Reorientation . Wyeksportuj, aby zapisać.
4. Przeanalizuj rdzeń kręgowy.
   1. Aby rozpocząć analizę obszarów zainteresowania (ROI) w rdzeniu kręgowym, otwórz 3D ROI Tool z menu Navigation .
   2. W sekcji ROIs użyj znaku plus na dole menu, aby utworzyć sześć ROI: Lumbar ROI, Cervical/Thoracic ROI, Lumbar Skeleton, Thoracic Skeleton, Lumbar Spinal Cord, Thoracic Spinal Cord.
      UWAGA: ROI lędźwiowe oraz szyjno-piersiowe to ogólne, duże obszary ROI, które posłużą do utworzenia ROI szkieletu (Rycina 4).
   3. Aby uniknąć zakłóceń wizualnych z sygnału PET na tym etapie, naciśnij F3 , aby wyłączyć obraz PET.
   4. Przejdź do górnej części 3D ROI Tool Operator. Kliknij pełną kropkę po prawej stronie symbolu kursora, aby otworzyć menu 3D Paint Mode and Erode/Dilate .
   5. Wybierz Sphere i zmień rozmiar na 20 pixels. Ustaw Dilate na +5.
      1. Przed kontynuacją przejdź do dołu menu. Upewnij się, że wybrano Lumbar ROI, ponieważ jest to pierwszy obszar ROI do narysowania.
   6. Na obrazie CT zlokalizuj kręg L6 kręgosłupa (miejsce połączenia kręgosłupa z biodrami). Zaczynając od jednego kręgu powyżej L6, narysuj przybliżony obszar Lumbar ROI obejmujący pięć kręgów powyżej bioder (kręgi L1-L5). Następnie przełącz się na Cervical/Thoracic ROI i obrysuj pozostałą część kręgosłupa aż do podstawy czaszki.
      UWAGA: Nie musi to być precyzyjne, ponieważ służy to jedynie do wskazania miejsca, w którym w kroku 11.4.8 nastąpi progowanie metodą Otsu.
   7. Po narysowaniu ogólnych ROI przejdź do górnej części operatora. Wybierz menu Segmentation Algorithms .
   8. Z menu rozwijanego wybierz Otsu Thresholding. Jako wejście wybierz Lumbar ROI. Na dole menu upewnij się, że wybrano Lumbar Skeleton. W menu rozwijanym obok Image upewnij się, że wybrano CT scan, a następnie kliknij Apply. Powtórz czynność dla Cervical/Thoracic ROI i Thoracic Skeleton.
      1. Jeśli progowanie metodą Otsu nie wyróżnia w wystarczającym stopniu kręgosłupa, użyj Global Thresholding i zmień wartość Min na 350 oraz Max na 3,500 w celu ręcznego progowania i dostosuj wartości tak, aby odizolować kręgi.
   9. Po utworzeniu ROI szkieletu za pomocą progowania Otsu wróć do menu Navigation (ikona kursora). Usuń lub zaznacz kolumnę H (hide), aby ukryć zarówno przybliżone Lumbar, jak i Cervical/Thoracic ROIs. Zaznacz kolumnę I (immutable) dla obu ROI szkieletu, aby nie można było ich edytować.
   10. Na koniec wróć do górnej części 3D ROI Tool Operator i przejdź do 3D Paint menu, aby narysować Spinal Cord ROIs.
       1. Ponownie wybierz narzędzie Sphere i obrysuj rdzeń kręgowy w obrębie szkieletu zarówno dla odcinka Lumbar , jak i Thoracic, upewniając się, że na dole menu wybrano odpowiednie ROI.
       2. Aby wymazać dowolne ROI, naciśnij Command/Control i obrysuj część do usunięcia.
       3. Sprawdź ROI rdzenia kręgowego we wszystkich trzech płaszczyznach, aby upewnić się, że żadne ROI nie zostało narysowane poza kręgosłupem.
5. Eksportuj wyniki analizy rdzenia kręgowego.
   1. Jeśli sygnał PET został wyłączony w kroku 11.4.3, po narysowaniu Spinal Cord ROIs naciśnij F3 , aby ponownie włączyć PET, lub wybierz Visual Controller (VC) i kliknij pasek PET.
   2. Wróć do menu Navigation (ikona kursora). Kliknij ikonę siatki , aby wyświetlić tabelę (Show Table). Skopiuj tabelę do oprogramowania arkuszowego i zapisz.
   3. Na koniec wyeksportuj plik w oprogramowaniu do analizy PET, jak opisano powyżej, aby zapisać narysowane ROI.
6. Przeanalizuj mózg za pomocą półautomatycznego atlasu 3D.
   1. Otwórz plik przycięty obraz głowy. Zaimportuj atlas mózgu myszy, przechodząc do menu Advanced Modules i wybierając 3D Brain Atlas Tool. Upewnij się, że referencja jest ustawiona na CT , a opcja crop jest odznaczona. Ustaw ścieżkę do katalogu wyjściowego.
   2. W Advanced Setting zmień Transform na Versor-Affine. Pozostaw wszystkie pozostałe ustawienia domyślne. Kliknij Run.
   3. Ręcznie dostosuj atlas w menu Reorientation/Registration i użyj obrazu CT czaszki jako wytycznej do dopasowania atlasu.
      1. Zachowaj szczególną ostrożność, jeśli skalowanie jest konieczne, ponieważ może ono znacznie wpłynąć na objętości struktur mózgu. Kliknij znaczek zatwierdzenia po zakończeniu dostosowywania.
      2. Uruchom ponownie atlas z wybraną opcją Import 3D ROIs.
      3. Wyeksportuj plik, aby zapisać atlas dopasowany do przyciętej głowy.
   4. Po narysowaniu i wyeksportowaniu wszystkich ROI z wybranych organów oblicz standardową wartość korekcji wiązania. Skoryguj wszystkie dane o rozpadzie i przekonwertuj na %ID/g zgodnie z wcześniejszym opisem⁶. Znormalizuj dane względem organu odpowiedniego dla modelu zwierzęcego, np. serca, aby znormalizować ilość radiotraceru obecnego w puli krwi.

12. Analiza autoradiograficzna ex vivo

1. Otwórz cyfrowy plik obrazu (.gel) za pomocą oprogramowania do analizy obrazu. Dostosuj jasność i kontrast do pożądanego poziomu. Jeśli chcesz, zastosuj odpowiednią tablicę kolorów (lookup table).
   UWAGA: Dla łatwiejszej wizualizacji zaleca się kolor Royal lub odcienie szarości (Grays).

Wyniki

Przeciwciało hCD19-mAb sprzęgnięto z DOTA i oznakowano izotopem ⁶⁴Cu, jak pokazano na Rysunku 2. Myszy z EAE oraz myszy naiwne poddano badaniu PET/CT (Rysunek 3) od 18 do 24 h po wstrzyknięciu ⁶⁴Cu-DOTA-hCD19-mAb. Obrazy PET/CT zarejestrowano wspólnie przy użyciu oprogramowania do analizy PET, a tkanki OUN przeanalizowano z wykorzystaniem ręcznie wyznaczonych ROI lub półautomatycznego atlasu mózgu 3D. Wiązanie radioznacznika w ROI (Rysunek 4) było wyższe u myszy z EAE niż u myszy naiwnych. Pomiary gamma ex vivo oraz ARG wykazały zwiększone wiązanie w rdzeniu kręgowym (zarówno w odcinkach lędźwiowych, jak i szyjno-piersiowych) oraz w mózgu (tylko ARG) u myszy z EAE w porównaniu do myszy naiwnych (Rysunek 5 i Rysunek 6). Pomiary gamma ex vivo u myszy perfundowanych wykazały również zmniejszone wiązanie radioznacznika w narządach obwodowych, w tym w śledzionie, kości udowej i szpiku kostnym (Rysunek 5), co jest zgodne z migracją limfocytów B z obwodu i naciekaniem OUN w tym modelu EAE.

Rysunek 2: Schemat koniugacji i znakowania radioizotopowego w celu otrzymania przeciwciała monoklonalnego swoistego dla ludzkiego CD19 znakowanego ⁶⁴Cu, 16C4-TM mAb (⁶⁴Cu-DOTA-hCD19-mAb), wraz z danymi kontroli jakości. (A) Reakcja estru DOTA-NHS z przeciwciałem monoklonalnym hCD19 w celu wytworzenia koniugatu hCD19-DOTA (nie w skali) oraz znakowanie radioizotopowe za pomocą ⁶⁴Cu-CuCl₃ w celu otrzymania ⁶⁴Cu-DOTA-hCD19-mAb. (B) Reprezentatywny chromatogram ITLC. Piki w zakresie 40-60 cm odpowiadają znakowanemu przeciwciału; niezwiązany ⁶⁴Cu-CuCl₃ przemieszcza się wraz z fazą ruchomą i występowałby w zakresie od 200 do 240 cm. Na tym chromatogramie nie wykryto wolnego ⁶⁴Cu-CuCl₃. (C) Specyfikacje kontroli jakości znakowanego przeciwciała. Skróty: ester DOTA-NHS = ester mono-N-hydroksysuccynimidowy kwasu 1,4,7,10-tetraazacyklododekanu-1,4,7,10-tetraoctowego; ITLC/HPLC = błyskawiczna chromatografia cienkowarstwowa/wysokosprawna chromatografia cieczowa; MALDI/LC-MS = spektrometria mas z desorpcją/jonizacją laserową wspomaganą macierzą/chromatografią cieczową; CPM = zliczeń na minutę. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Rycina 3: Fotografie przedstawiające sposób unieruchamiania myszy w wydrukowanym w technologii 3D podłożu wewnątrz skanera PET w celu uzyskania wysokiej jakości obrazowania rdzenia kręgowego i mózgu przy jednoczesnej minimalizacji ruchów. (A) Wydrukowane w 3D podłoże skanera dla czterech myszy (znane również jako „hotel dla myszy”) wyposażone w elementy grzejne i przewody do znieczulenia. (B) Znieczulone myszy w pozycji grzbietnej w celu maksymalnego wyprostowania kręgosłupa; rejestrowana jest pozycja każdej myszy w podłożu. (C) Myszy zabezpieczone taśmą w obrębie głowy, aby zminimalizować ruchy mózgu, oraz w obrębie brzucha, aby zminimalizować ruchy związane z oddychaniem, bez wpływania na proces oddychania. (D) Podłoże dla myszy umieszczone wewnątrz skanera i przymocowane taśmą do stołu skanującego. Przewody do znieczulenia zostały podłączone ze skanera do podłoża, a stężenie izofluranu ustawiono na 2%. Przed zamknięciem drzwi skanera monitorowano oddychanie myszy, aby zapewnić odpowiedni poziom izofluranu. Skrót: PET = pozytonowa tomografia emisyjna. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rycina 4Obrazowanie rdzenia kręgowego oraz analiza mózgu i wyniki z wykorzystaniem oprogramowania do analizy PET. (A) i) Obszary zainteresowania (ROI, kolory różowy i beżowy) wyznaczone na kręgosłup w celu oddzielenia kręgów lędźwiowych od piersiowych i szyjnych oraz przygotowania obrazu do progowania metodą Otsu. ii) Kręgi kręgosłupa (turkusowe i czerwone) zostały wysegmentowane przy użyciu progowania Otsu. iii) Następnie w menu 3D ROI ustawiono kręgi jako niezmienne, a rdzeń kręgowy podzielono na ROI odcinka szyjnego/piersiowego (fioletowy) oraz lędźwiowego (granatowy). iv) Usunięto ROI kręgów, pozostawiając ROI rdzenia kręgowego i zastosowany reprezentatywny atlas mózgu.B) Reprezentatywna analiza wyników PET z różnych obszarów OUN przedstawiona jako %ID/g znormalizowany do ROI serca dla każdego zwierzęcia. Akwizycja PET polegała na 10-minutowym skanie statycznym poprzez Obrazowanie PET/CT. Regiony mózgu ilościowo określone przy użyciu półautomatycznego podejścia z wykorzystaniem atlasu mózgu, przedstawione na panelu A. iv) Reprezentatywne wyniki wskazują na istotność statystyczną lub tendencję do istotnego wzrostu wiązania znacznika w mózgu i piersiowym odcinku rdzenia kręgowego. Analizy statystyczne przeprowadzono przy użyciu testu Studenta t-test (*: p < 0,0332). Skróty: PET = pozytonowa tomografia emisyjna; ROIs = obszary zainteresowania; CNS = ośrodkowy układ nerwowy; CT = tomografia komputerowa; %ID/g = procent wstrzykniętej dawki na gram tkanki; EAE = eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie mózgu i rdzenia. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rycina 5Reprezentatywne ilościowe oznaczenie ex vivo pomiar aktywności gamma w różnych narządach u myszy z EAE i myszy naiwnych, wyrażony jako %ID/g. Po badaniu PET myszy poddano perfuzji roztworem PBS w celu usunięcia radiotracera obecnego we krwi, zarówno w formie wolnej, jak i związanego z krążącymi w krwi komórkami CD19.⁺ limfocyty B, a organy są szybko wycinane i ważone, aby uzyskać dokładną masę każdego z nich. Wiązanie znacznika jest znacznie zmniejszone w śledzionie i szpiku kostnym myszy z EAE w porównaniu do myszy naiwnych. Zwiększone wiązanie radioznacznika obserwuje się zarówno w odcinku lędźwiowym, jak i szyjnym/piersiowym rdzenia kręgowego myszy z EAE. W mózgu nie stwierdzono istotnego wzrostu sygnału radioznacznika, choć wykazuje on tendencję do istotnego wzrostu. Analizy statystyczne przeprowadzono za pomocą testu Studenta t-test (*: p < 0,0332; ****: p < 0,0001). Skróty: PET = pozytonowa tomografia emisyjna; %ID/g = procent wstrzykniętej dawki na gram tkanki; EAE = eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie mózgu i rdzenia; PBS = roztwór soli fizjologicznej z buforem fosforanowym. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rysunek 6: Obrazy ARG ex vivo przedstawiają wiązanie ⁶⁴Cu-DOTA-hCD19-mAb w sagitalnych przekrojach mózgu oraz w całych rdzeniach kręgowych myszy z EAE w porównaniu z myszami naiwnymi. Cyfrowe folie fosforowe były skanowane za pomocą obrazownika fosforowego po naświetlaniu próbkami tkanek radioaktywnych przez około 10 okresów połowicznego rozpadu (127 h lub 5 dni). Uzyskane obrazy wykazują wizualnie wyższy sygnał w mózgach myszy z EAE w porównaniu z przekrojami mózgu myszy naiwnych, co jest oczekiwane ze względu na regiony znane z obecności limfocytów B w tym modelu⁵. W szczególności zwiększony sygnał znacznika obserwuje się w pniu mózgu, móżdżku i komorach w przekrojach mózgu myszy z EAE. Ten wzrost sygnału w przekrojach mózgu myszy z EAE odzwierciedla wyniki ilościowej analizy PET całego mózgu opisanej powyżej. Podobnie, następuje zwiększenie wiązania radioznacznika zarówno w szyjnym/piersiowym, jak i lędźwiowym odcinku rdzenia kręgowego w porównaniu z rdzeniami myszy naiwnych, co odpowiada wynikom uzyskanym podczas zliczania gamma ex vivo. Skróty: PET = pozytonowa tomografia emisyjna; EAE = eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie mózgu i rdzenia; Vent = komory; Cb = móżdżek; BS = pień mózgu; TSc = połączone odcinki piersiowy i szyjny rdzenia kręgowego; LSc = lędźwiowy odcinek rdzenia kręgowego. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Rysunek uzupełniający S1: Barwienie tkanek OUN mózgu myszy naiwnych i z modelem EAE przeciwko CD45R/B220. Komórki B obserwuje się w pniu mózgu, oponach mózgowo-rdzeniowych i istoci białej u myszy z EAE (n = 7 EAE, n = 5 myszy naiwnych, średnio cztery skrawki na zwierzę). Rysunek pochodzi z ⁵. Paski skali = 5 mm (małe powiększenie [1x]) na obrazach mózgu w przekroju strzałkowym, 100 µm (duże powiększenie [20x]) w pniu mózgu, oponach mózgowo-rdzeniowych i istoci białej móżdżku. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

W tym artykule opisano uproszczoną metodę obrazowania ludzkich komórek B CD19 ⁺ w mysim modelu stwardnienia rozsianego przy użyciu CD19-PET. Ze względu na niejednorodny obraz stwardnienia rozsianego i różne odpowiedzi na leczenie, zarządzanie nim w klinice może być trudne i bardzo potrzebne są nowe podejścia do wyboru i monitorowania terapii. Obrazowanie PET może służyć jako potężne narzędzie do monitorowania postępu choroby i indywidualnej odpowiedzi na terapię zubożającą limfocyty B. Oprócz stwardnienia rozsianego, obrazowanie CD19-PET może być stosowane do monitorowania wyczerpania komórek B po leczeniu w podtypach chłoniaków i białaczki lub innych chorób zależnych od komórek B. Ten protokół i reprezentatywne dane pokazują użyteczność obrazowania limfocytów B w chorobach neurologicznych.

Do badania ludzkich limfocytów B CD19 ⁺ w kontekście stwardnienia rozsianego wybraliśmy zależny od limfocytów B MOG_1-125 EAE model⁷. Podobnie jak inne modele EAE, model ten objawia się objawami postępującego paraliżu i infiltracji komórek odpornościowych do OUN. Jednak model MOG_1-125 jest wyjątkowy, ponieważ jest modelem sterowanym przez limfocyty B: myszy zawierają różną liczbę komórek B w przestrzeni podpajęczynówkowej w oponach mózgowych, pniu mózgu, miąższu i komorach. Limfocyty te mogą być słabo rozproszone w tych regionach i/lub tworzyć struktury podobne do pęcherzyków, które obserwuje się również u ludzi ze stwardnieniem^{rozsianym 8,9}. Oprócz używania naiwnych myszy jako kontroli, można użyć kompletnego zestawu do indukcji adiuwanta Freunda (CFA) (tj. identycznej emulsji indukcyjnej do tego, którą podaje się myszom EAE bez białka MOG). W mysim modelu EAE bariera krew-mózg (BBB) jest dysfunkcyjna i umożliwia przekraczanie większych jednostek, takich jak przeciwciała. Radioznacznik CD19-mAb zwiąże się i pozostanie w OUN tylko wtedy, gdy obecne są komórki B; znacznik będzie krążył z powrotem do puli krwi, jeśli limfocyty B nie są obecne. Wykazaliśmy to za pomocą zliczania promieniowania gamma i autoradiografii ex vivo tkanek OUN poprzez perfuzję przed pomiarem poziomu radioaktywności w tkankach. Wykazaliśmy to również we wcześniejszych publikacjach informujących o zastosowaniu radioznaczników PET opartych na mAb (tj. Metod obrazowania immunoPET) do wykrywania komórek B w OUN ^1,2.

Chelator DOTA został użyty, ponieważ był stosowany w klinicznym obrazowaniu PET z peptydami i przeciwciałami znakowanymi miedzią-64, a naszym celem jest translacja hCD19-mAb do obrazowania klinicznego pacjentów ze stwardnieniem rozsianym. DOTA ma odpowiednie powinowactwo wiązania do miedzi-64 in vivo. Stabilność in vivo jest bardzo ważna, ponieważ wolne ⁶⁴Cu trafia do wątroby i może zaciemniać sygnał związanego radioznacznika; Dlatego ważne jest, aby zmierzyć sygnał w wątrobie, aby obliczyć względny sygnał w porównaniu z innymi narządami. Mięśnie są zwykle traktowane jako tkanka kontrolna, ale w przypadku EAE w mięśniach może występować stan zapalny. Okres półtrwania ⁶⁴Cu wynosi 12,7 h, co daje wystarczająco dużo czasu na związanie się DOTA-hCD19-mAb z celem, zapewniając jednocześnie możliwość pomiaru sygnału przez PET. Podczas przygotowywania koniugatu należy przeprowadzić reakcje testowe na małą skalę (75-125 μg) w celu określenia ilości DOTA, którą należy dodać do mAb, aby uzyskać pożądany stosunek DOTA/mAb (np. reakcja 6-10-krotnego nadmiaru estru DOTA-NHS na mol mAb może dać koniugat 1-2 DOTA/mAb). Czas reakcji i temperatura (np. 2-4 godziny lub noc w temperaturze 4 °C lub temperaturze pokojowej) również wpływają na stosunek DOTA/mAb i powinny być zoptymalizowane. Można przeprowadzić miareczkowanie nieradioaktywną miedzią w celu obliczenia liczby DOTA na mAb; jednak zalecamy wykonanie MALDI-MS i/lub LC-MS w celu uzyskania bardziej wiarygodnych i dokładnych wyników.

Obliczony stosunek DOTA/mAb jest średnią wartością dla konkretnej próbki i oczekuje się pewnej zmienności. W przypadku MALDI pobiera się kilka dawek na próbkę dla sprzężonych i niesprzężonych mAb. Następnie obliczamy stosunek sprzężonych do niesprzężonych, aby określić średnią liczbę DOTA/mAb. Stosunek DOTA/mAb jest ważny, ponieważ zbyt wiele chelatorów zakłóci wiązanie przeciwciał, a zbyt mała doprowadzi do niespójnego znakowania radioaktywnego i niskiego sygnału. Stosunek między partiami koniugatu powinien być bardzo zbliżony, aby utrzymać stałą intensywność sygnału i kinetykę wiązania; Idealnie byłoby, gdyby ta sama partia koniugatu była używana do wszystkich eksperymentów w ramach danego badania. Obiecującą techniką zmniejszania potencjalnego wpływu na immunoreaktywność z powodu możliwej nadmiernej koniugacji jest zastosowanie koniugacji specyficznej^{dla miejsca 10} , w której koniugacja chelatora jest selektywna miejscowo na glikanach łańcucha ciężkiego przeciwciała, gwarantując w ten sposób dodanie 1 chelatora na mAb.

Warunki reakcji znakowania radioaktywnego powinny być zoptymalizowane, aby zapewnić najwyższą skuteczność znakowania i wydajność, ponieważ różnice między innymi w przeciwciałach, stosunku DOTA/mAb i aktywności molowej ⁶⁴Cu będą miały wpływ na znakowanie radioaktywne. Zastosowanie optymalnego stosunku ^{koniugatu 64}Cu do mAb może pozwolić na użycie radioznacznika bez oczyszczania, skracając czas potrzebny do znakowania radioaktywnego i strat spowodowanych przepływem grawitacyjnym i rozpadem promieniotwórczym. Stałą i wiarygodną aktywność molową można również osiągnąć, gdy stosuje się ten sam stosunek koniugatu ⁶⁴Cu do mAb, co jest szczególnie ważne przy porównywaniu wyników w wielu kohortach myszy lub badaniach obrazowych. Warunki ITLC mogą być również modyfikowane w celu dopasowania do każdego użytkownika. Jeżeli konieczne jest oczyszczanie, należy zachować podwielokrotność do spektrofotometrii HPLC i/lub UV/Vis, aby można było obliczyć aktywność molową.

Należy zauważyć, że stosowanie przeciwciał znakowanych radioaktywnie do obrazowania może być trudne. Istotne jest, aby przeciwciało użyte w radioznaczniku było biologicznie obojętne, aby nie wywoływało efektu fizjologicznego. Ponadto, ponieważ przeciwciała długo przebywają we krwi, należy czekać wystarczająco długo na krążenie, wiązanie i klirens danego mAb, aby zapewnić odpowiedni sygnał do tła bez pogorszenia jakości obrazu. Zazwyczaj wystarczające jest odczekanie 20-48 godzin na mAb znakowane ⁶⁴Cu, ale należy obrazować po 2, 4, 6, 12, 24, 48 godzinach od wstrzyknięcia podczas oceny nowego znacznika mAb PET, aby określić najlepszy punkt czasowy do obrazowania w danym modelu gryzoni. To samo dotyczy pozyskiwania obrazów ARG o najwyższym stosunku sygnału do tła. Reprezentatywne obrazy w tym protokole zostały wykonane po 18-20 godzinach od wstrzyknięcia, chociaż można użyć innych punktów czasowych w zależności od użytego radioizotopu. Różne przeciwciała wiążące się z różnymi epitopami CD19 dają różne wyniki i powinny być rygorystycznie scharakteryzowane.

Podczas analizy sygnału rdzenia kręgowego ważne jest, aby ułożyć myszy na plecach w łóżku skanującym, aby zmniejszyć ruch spowodowany oddychaniem. Dodatkowo ułożenie na plecach może pomóc wyprostować kręgosłup u myszy, które mają zwiększoną krzywiznę kręgosłupa z powodu postępu choroby EAE. Innym ważnym aspektem, który należy wziąć pod uwagę, dążąc do wykrycia sygnału w kręgosłupie i rdzeniu kręgowym, jest unikanie wstrzykiwania MOG_1-125 w bok, ponieważ miejsca wstrzyknięcia mogą wiązać znacznik ze względu na związaną odpowiedź immunologiczną w tych obszarach. Bliskie sąsiedztwo miejsca wstrzyknięcia może zakłócać analizę rdzenia kręgowego; W związku z tym wstrzyknięcia w klatkę piersiową są preferowane w przypadku zastosowania opisanego w niniejszym dokumencie.

Zastosowane techniki analizy obrazu są specyficzne dla obrazowania OUN. Narzędzie do tworzenia atlasu mózgu w oprogramowaniu do analizy obrazu zapewnia powtarzalne i wiarygodne wyniki, o ile rejestracja PET i CT jest dokładna. Korzystanie z półautomatycznego atlasu mózgu 3D i dostosowywanie go do czaszki każdej myszy pozwala na uzyskanie spójnego zwrotu z inwestycji między zwierzętami. Ponieważ obecnie nie ma zautomatyzowanego lub półautomatycznego podejścia do analizy sygnału w rdzeniu kręgowym, należy ręcznie narysować zwrot z inwestycji. Warto zauważyć, że przy ilościowym określaniu komórek B CD19 ⁺ (lub dowolnego typu komórek obecnych zarówno w szpiku kostnym, jak i rdzeniu kręgowym) bardzo ważne jest wyeliminowanie sygnału powstającego z kręgosłupa i szpiku kostnego w jak największym stopniu. Powodem tego jest to, że wiadomo, że myszy naiwne zawierają więcej komórek B CD19 ⁺ w szpiku kostnym niż myszy EAE, u których komórki B opuszczają obrzeża, aby infiltrować OUN ^5,11. Ten sygnał szpiku kostnego może przesłaniać prawdziwy sygnał w rdzeniu kręgowym.

Aby określić prawdziwy sygnał rdzenia kręgowego przy jednoczesnym zminimalizowaniu udziału sygnału z kręgosłupa i szpiku kostnego, można użyć progowania Otsu obrazu CT w celu uzyskania niezmiennego zwrotu z inwestycji dla kręgosłupa. Oddzielny ROI rdzenia kręgowego można wtedy łatwo narysować w obrębie kręgosłupa. Tę samą technikę można również zastosować do pomiaru szpiku kostnego w kości udowej. Jest to bardzo przydatna metoda uzyskiwania wglądu w wiązanie znaczników w rdzeniu kręgowym. Jednak ze względu na stosunkowo niską rozdzielczość przestrzenną PET i problemy związane z efektem częściowej objętości podczas skanowania małych obszarów anatomicznych myszy, zastosowanie dodatkowych technik potwierdzających ex vivo (np. Zliczanie promieniowania gamma, ARG) umożliwia walidację wiązania radioznacznika w rdzeniu kręgowym bez obecności krwi, płynu mózgowo-rdzeniowego lub sygnału rozlewającego się z kręgosłupa.

Sygnał w rdzeniu kręgowym szyjnym / piersiowym ma tendencję do różnicowania się u myszy EAE w zależności od ciężkości choroby i liczby limfocytów B naciekających podczas adaptacyjnej odpowiedzi immunologicznej. Ta różnica w liczbie naciekających komórek B, a także niewielka ilość komórek B w OUN w porównaniu z tymi w szpiku kostnym miednicy/rdzenia kręgowego nieleczonych myszy, może utrudnić ilościowe określenie tkanki rdzenia kręgowego in vivo u myszy. Biorąc pod uwagę rozdzielczość przestrzenną PET w obrazowaniu małych zwierząt, sygnał ze szpiku kostnego może rozlać się na sygnał rdzenia kręgowego. Wykonana tutaj biodystrybucja ex vivo i autoradiografia pomagają w walidacji sygnału PET kręgów w porównaniu z tkanką rdzenia kręgowego. Myszy są poddawane perfuzji przed sekcją w celu usunięcia niezwiązanego znacznika z puli krwi, tak aby wyniki zliczania promieniowania gamma i autoradiografii odzwierciedlały znacznik, który jest faktycznie związany w każdym narządzie, a nie znacznik, który znajduje się w puli krwi w tym narządzie.

Radioznaczniki krążą we krwi, a w przypadku znaczników przeciwciał często niezwiązany radioznacznik jest obecny we krwi przez kilka tygodni po pierwszym wstrzyknięciu. Ponieważ obrazujemy mózg i rdzeń kręgowy, które mają wiele naczyń krwionośnych, ważne jest, aby zrozumieć, która część sygnału jest naprawdę spowodowana wiązaniem znacznika w mózgu / tkance będącej przedmiotem zainteresowania, a która jest obecna w puli krwi. W związku z tym konieczne jest podzielenie sygnału mózgowego przez sygnał w puli serca/krwi. W warunkach klinicznych do oceny ilościowej można zastosować te same techniki analizy obrazu progów Otsu kręgów i ROI tkanek rdzenia kręgowego. Biorąc pod uwagę większą objętość tkanek u ludzi w porównaniu z myszami, wpływ efektów objętości częściowej powinien być znacznie mniejszy, co prowadzi do poprawy dokładności i eliminuje potrzebę stosowania technik ex vivo w celu potwierdzenia wyników in vivo . Zastosowanie PET w klinice pozwoli klinicystom na spersonalizowanie terapii dla każdego pacjenta w zależności od indywidualnego obciążenia komórkami B.

ARG jest szczególnie przydatny do pozyskiwania obrazów o wysokiej rozdzielczości, aby umożliwić dokładniejsze określenie przestrzennej lokalizacji wiązania znacznika w małych obszarach, takich jak pień mózgu i móżdżek. Te same skrawki i/lub sąsiednie sekcje można zachować do barwienia immunohistochemicznego w celu potwierdzenia obecności limfocytów B. Wcześniej wybarwiliśmy tkanki OUN CD45R / B220 (rysunek uzupełniający S1), aby skorelować liczbę komórek B z sygnałem PET i ARG ^5,9. Barwienie można następnie porównać przestrzennie z wynikami ARG w celu sprawdzenia, czy sygnał radioznacznika pasuje do wzorca barwienia. Limfocyty B mogą być obecne w skupiskach lub dyfuzyjnie w całym pniu mózgu; Czułość PET jest wystarczająco wysoka, aby zmierzyć sygnał, co jest zachęcające do translacji klinicznej. W przypadku rdzenia kręgowego ARG usunięcie rdzenia kręgowego z kręgów zapewnia, że mierzony sygnał jest spowodowany wiązaniem znacznika w tkance rdzenia kręgowego, a nie w szpiku kostnym i/lub krwi, co może zaciemniać obrazy PET z powodu częściowego wpływu objętości.

Podobnie jak w przypadku ARG, zliczanie promieniowania gamma ex vivo umożliwia ilościowe określenie sygnału radioaktywnego w poszczególnych narządach. W przypadku tej konkretnej techniki ważne jest, aby zmierzyć mokrą masę tkanek i upewnić się, że znajdują się one na dnie odpowiednich probówek przed umieszczeniem probówek w liczniku gamma. Probówki muszą być oznaczone numerem myszy i tkanką, tak aby używana była właściwa probówka; Probówkę następnie waży się na skalibrowanej wadze, a narządy umieszcza się z dokładnością do jednej dziesiątej mikrograma (0,0001 mg). Niektóre tkanki są bardzo małe, a różnica w masie probówki przed i po będzie rzędu 0,0001 mg. Tkanki należy zważyć natychmiast po sekcji, aby zapobiec utracie wilgoci, co skutkuje mniejszą masą. Po zważeniu rurki mózgowe i rdzenia kręgowego należy wypełnić PBS, aby zapobiec wysuszeniu przed zamrożeniem tych tkanek do ARG.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
0,5 ml 50 kDa MWCO Filtr odśrodkowy	MiliporeSigma	UFC505008	filtr odśrodkowy
64Cu-CuCl3	Uniwersytet Waszyngtoński w St. Louis; Uniwersytet Wisonsin, Madison; lub innego dostawcy
AR-2000 Skaner obrazowania radiowego TLC	Eckert & Kaseta autoradiograficzna Ziegler	AR-2000
	Cole Palmer	EW-21700-34	Aluminiowa, 8" x 10"
Film autoradiograficzny	GE Life Sciences	28-9564-78	Przechowywanie ekranu fosforowego BAS-IP SR 2025 E Super rozdzielczość, 20 x 25 cm, tylko ekran
Cewnik igłowy motylkowy	SAI Technologie infuzyjne	BLF-24
DOTA-NHS-ester	Makrocykliczny	B-280
EAE	Hooke Laboratories	EK-2160
Licznik Geigera	Ludlum	14C
Skaner GNEXT PET/CT	Sofie	GNEXT
Hidex Automatyczny licznik gamma	Kolumna Hidex	AMG
HPLC	Phenomenex	00H-2146-K0	5 μ m SEC-s3000 400 & Aring;, 300 x 7,8 mm
Illustra NAP-5	kolumna Cytiva	17085301	Kolumna grawitacyjna DNA
Obraz J	NIH		ARG
Probówki do zbierania o niskim poziomie wiązania białek (1,5 ml)	Spektrofotometr Thermo Scientific	PI90410
NanoDrop Lite	Termo Scientific	840281400	Mikro/nanospektrofotometr UV-Vis
Probówki PCR 0,2 ml, do		Eppendorf
Typhoon klasy DNA 9410	GE Healthcare	8149-30-9410
VivoQuant	Invicro	w wersji 4 z łatką 3	należy zakupić dodatek do atlasu mózgu
Kolumny odsalające Zeba Spin, 7K MWCO, 0,5 mL	Thermo Scientific	PI89882	Kolumna odsalająca

zestaw indukcyjny Oprogramowanie do analizy obrazowania luminoforowego 30124707 Oprogramowanie do analizy PET;