Obrazowanie limfocytów B CD19 + w eksperymentalnym mysim modelu autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia przy użyciu pozytonowej tomografii emisyjnej

Podsumowanie

Ten artykuł szczegółowo opisuje metodologię znakowania radioaktywnego przeciwciała monoklonalnego anty-CD19 specyficznego dla człowieka i jak go używać do ilościowego oznaczania limfocytów B w ośrodkowym układzie nerwowym i tkankach obwodowych mysiego modelu stwardnienia rozsianego przy użyciu obrazowania in vivo PET, zliczania gamma ex vivo i metod autoradiograficznych.

Streszczenie

Stwardnienie rozsiane (MS) jest najczęstszą chorobą demielinizacyjną ośrodkowego układu nerwowego (OUN) dotykającą młodych dorosłych, często powodującą deficyty neurologiczne i niepełnosprawność w miarę postępu choroby. Limfocyty B odgrywają złożoną i kluczową rolę w patologii stwardnienia rozsianego i są celem kilku terapii w badaniach klinicznych. Obecnie nie ma sposobu, aby dokładnie wybrać pacjentów do specyficznych terapii komórkami anty-B lub nieinwazyjnie określić ilościowo wpływ tych terapii na obciążenie limfocytów B w OUN i narządach obwodowych. Obrazowanie za pomocą pozytonowej tomografii emisyjnej (PET) ma ogromny potencjał, aby dostarczyć bardzo szczegółowych, ilościowych informacji dotyczących czasoprzestrzennego rozmieszczenia i obciążenia limfocytów B in vivo u żywych osób.

Ten artykuł opisuje metody syntezy i zastosowania znacznika PET specyficznego dla ludzkich komórek B CD19⁺ w dobrze znanym mysim modelu SM opartym na komórkach B, eksperymentalnym autoimmunologicznym zapaleniu mózgu i rdzenia kręgowego (EAE), które jest indukowane przez ludzką rekombinowaną glikoproteinę oligodendrocytów mieliny 1-125. Opisano tutaj zoptymalizowane techniki wykrywania i ilościowego oznaczania komórek B CD19 ⁺ w mózgu i rdzeniu kręgowym za pomocą obrazowania PET in vivo. Ponadto w artykule przedstawiono uproszczone metody liczenia ex vivo gamma narządów istotnych dla choroby, w tym szpiku kostnego, rdzenia kręgowego i śledziony, wraz z autoradiografią o wysokiej rozdzielczości wiązania znacznika CD19 w tkankach OUN.

Wprowadzenie

Stwardnienie rozsiane jest zaburzeniem neurologicznym o podłożu immunologicznym; unikalna prezentacja u każdego pacjenta może utrudnić leczenie zarówno pacjentom, jak i klinicystom¹. Sama choroba charakteryzuje się obecnością zmian demielinizacyjnych i infiltracji komórek odpornościowych w mózgu i rdzeniu kręgowym, co skutkuje upośledzeniem fizycznym i poznawczym². Tradycyjny paradygmat, zgodnie z którym stwardnienie rozsiane jest chorobą wywoływaną przez limfocyty T, został po raz pierwszy zakwestionowany w przełomowym badaniu klinicznym fazy II rytuksymabu³, terapii ukierunkowanej ^{na podzbiór} limfocytów B CD20+. Od tego czasu opracowano dodatkowe terapie komórkami B, które są ukierunkowane na CD19⁴, biomarker limfocytów B pan, który ulega ekspresji w szerszym zakresie limfocytów B, co może być korzystne zarówno diagnostycznie, jak i terapeutycznie. Co więcej, istniejące metody oceny skuteczności leczenia (tj. monitorowania liczby nawrotów i aktywności rezonansu magnetycznego [MRI]) nie pozwalają na wczesne pomiary odpowiedzi, co naraża pacjentów na znaczne ryzyko uszkodzenia OUN z powodu nieoptymalnego doboru i optymalizacji terapii. W związku z tym istnieje pilna potrzeba opracowania strategii monitorowania określonych komórek odpornościowych, takich jak limfocyty B CD19⁺, w czasie rzeczywistym w OUN i na obrzeżach pacjentów ze stwardnieniem rozsianym.

Obrazowanie PET to solidna technika obrazowania, która pozwala na wizualizację in vivo całego ciała danego celu zainteresowania, takiego jak CD19. Podczas gdy pobieranie krwi, rejestry częstości nawrotów i monitorowanie zmian za pomocą rezonansu magnetycznego dostarczają informacji na temat skuteczności leczenia, obrazowanie PET może umożliwić badaczom i klinicystom monitorowanie skuteczności terapii w całym ciele. To proaktywne podejście do monitorowania terapeutycznego pozwala klinicystom oceniać skuteczność leków w czasie rzeczywistym, umożliwiając szybkie dostosowanie w razie potrzeby. Monitorowanie lokalizacji i gęstości populacji komórek związanych z chorobą umożliwia również długotrwałą ocenę ciężkości choroby przy użyciu informacji anatomicznych specyficznych dla pacjenta. W związku z tym niezbędne jest opracowanie powtarzalnych metod analitycznych, aby niezawodnie wykorzystać pełny potencjał obrazowania PET w warunkach klinicznych i przedklinicznych.

Ten artykuł opisuje metody (Rysunek 1) do wykonywania obrazowania PET, liczenia gamma ex vivo i autoradiografii (ARG) komórek B CD19⁺ z przeciwciałem monoklonalnym (mAb) anty-ludzkim CD19 znakowanym ⁶⁴Cu, znanym jako 16C4-TM (⁶⁴Cu-hCD19-mAb), w eksperymentalnym mysim modelu autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia kręgowego (EAE) wywołanego u myszy transgenicznych z ekspresją ludzkiego CD19 (hCD19) przy użyciu ludzkiej rekombinowanej mieliny glikoproteina oligodendrocytów 1-125 (MOG_1-125). Dostarczamy również metody do dokładnej i powtarzalnej oceny wiązania radioznacznika w mózgu i rdzeniu kręgowym, obu krytycznych miejscach patogenezy, często poważnie dotkniętych w tym i innych modelach neurodegeneracyjnych. Techniki te pozwalają na nieinwazyjne badanie roli limfocytów B w patologii choroby i mają potencjał do klinicznego przełożenia na ocenę skuteczności terapii komórkami anty-B w stwardnieniu rozsianym.

Protokół

Rysunek 1: Projekt badania. Przegląd kluczowych technik w tym artykule. (A) Umieszczenie myszy na łóżku skanowania na plecach zmniejsza ruch kręgosłupa. (B) Obrazowanie PET/CT myszy. (C) Wykonaj nacięcie po grzbietowej stronie zwierzęcia, aby odsłonić kręgosłup. (D) Przeciąć kręgosłup na część szyjną/piersiową i lędźwiową i usunąć sekcje po pięciu wskazanych cięciach. (E) Użyj strzykawki, aby usunąć rdzeń kręgowy z kręgosłupa, wykonując uszczelnienie za pomocą strzykawki i kręgosłupa i spłukując z czaszkowych i ogonowych końców kręgosłupa, jak pokazano. (F) Izolowane odcinki rdzenia kręgowego w odcinku szyjnym/piersiowym i lędźwiowym. Skrót: PET/CT = Pozytonowa tomografia emisyjna/tomografia komputerowa. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Wszystkie badania na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z Panelem Administracyjnym ds. Opieki nad Zwierzętami Laboratoryjnymi (APLAC) na Uniwersytecie Stanforda, programem akredytowanym przez Association for the Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care (AAALAC International). Myszy aklimatyzowano w wiwarium przez co najmniej 7 dni przed rozpoczęciem badania, aby zminimalizować stres u myszy, ponieważ stres może wpływać na indukcję EAE.

1. Indukcja EAE u samic humanizowanych myszy CD19

1. Indukuj humanizowane samice myszy CD19 C57BL/6J w wieku 9-13 tygodni za pomocą EAE, jak opisano wcześniej⁵ za pomocą MOG_1-125.

2. Opieka nad zwierzętami i punktacja w modelu myszy EAE

1. Oceniaj postęp choroby i opiekuj się myszami zgodnie z wcześniejszym opisem⁵. W skrócie, oceń ten model w skali od 1 do 5 w następujący sposób: 1 to osłabienie/utykanie ogona, 2 to osłabienie kończyn tylnych, 3 to paraliż kończyn tylnych, 4 to paraliż kończyn tylnych z osłabieniem kończyn przednich, 5 to stan konający.

3. Koniugacja mAb, radioznakowanie i charakterystyka

1. Sprzęgnąć dwufunkcyjny chelator 1,4,7,10-tetraazacyklododekan-1,4,7,10-mono-N-hydroksysukcynimidu kwasu tetraoctowego (ester DOTA-NHS) z hCD19-mAb do radioznaku ^{za pomocą 64}Cu.
   1. Za pomocą kolumny odsalającej wymienić bufor magazynujący hCD19-mAb na bufor HEPES (pH 8,5-9): kondycjonować kolumnę (kolumny) odsalającą za pomocą HEPES. Obliczyć liczbę potrzebnych kolumn na podstawie objętości próbki kolumny odsalającej pojemność próbki i wymagana objętość mAb: probówki 0,5 ml: 30-130 μl objętości próbki, 300 μl roztworu do płukania; Probówki 2 ml: objętość próbki 200-700 μl, płukanie 1 ml.
   2. Schłodzić wirówkę do temperatury 4 °C w celu wymiany buforu przez kolumnę odsalającą.
   3. Wyjmij kolumnę odsalającą z lodówki. Zdejmij spód kolumny odsalającej, poluzuj nakrętkę i umieść kolumnę w probówce zbiorczej.
   4. Odwirować przy stężeniu 1 500 × g przez 2 minuty w celu usunięcia roztworu do przechowywania; wyrzucić przepływowy roztwór zawierający roztwór do przechowywania i ponownie użyć probówki zbiorczej. Zaznacz linię na kolumnie, w której najwyższy punkt odsalanej zagęszczonej żywicy jest pochylony w górę.
   5. Dodaj bufor HEPES do dolnej części kolumny odsalającej. Umieść kolumnę odsalającą w wirówce z linią skierowaną na zewnątrz; Wirować z prędkością 1 500 × g przez 2 min. Wyrzuć przepływ i ponownie użyj probówki zbiorczej.
   6. Powtórzyć kroki 3.1.4 i 3.1.5 2 razy, używając tej samej probówki zbiorczej i odrzucając przepływ między krokami.
   7. Umieść kondycjonowaną kolumnę odsalającą w nowej probówce zbiorczej i oznacz etykietą; ta probówka będzie zawierać hCD19-mAb.
   8. Dodać hCD19-mAb do górnej części kondycjonowanej kolumny (kolumn) odsalania i użyć buforu HEPES do przepłukania pustej fiolki mAb; dodać ją do górnej części kolumny odsalającej (całkowita objętość zgodnie z zaleceniami producenta). Wirować z prędkością 1 500 × g przez 2 minuty, aby wymyć hCD19-mAb. Utrzymuj przepływ zawierający hCD19-mAb.
   9. Zmierzyć stężenie hCD19-mAb za pomocą spektrofotometru UV/Vis i w razie potrzeby dostosować do 0,5 μg/μL za pomocą buforu HEPES.
   10. Do roztworu hCD19-mAb dodać 1/50^objętości roztworu mAb 0,5 M EDTA, aby uzyskać końcowe stężenie EDTA 0,01 M w roztworze hCD19-mAb. Pozostawić roztwór hCD19-mAb-EDTA w temperaturze pokojowej na 15 minut.
   11. Wyjmij ester DOTA-NHS z zamrażarki i pozwól mu osiągnąć temperaturę pokojową (10-15 min). Oblicz objętość DMSO, którą należy dodać do estru DOTA-NHS, aby uzyskać stężenie DOTA, które pozwoli na dodanie pożądanego stosunku molowego DOTA/mAb (który zwykle jest rzędu 1-2 DOTA/mAb).
       UWAGA: Objętość estru DMSO-DOTA-NHS dodanego do hCD19-mAb nie powinna przekraczać 10% objętości mAb. Należy to zrobić za pomocą arkusza kalkulacyjnego, aby można było to zrobić szybko i wielokrotnie.
   12. Na podstawie pożądanego stosunku DOTA do hCD19-mAb oblicz ilość estru DOTA-NHS, który należy dodać do hCD19-mAb.
       nmol mAb × 10 DOTA/mAb → nmol DOTA → mg DOTA → mg/mL DOTA/DMSO → mL DMSO → współczynnik rozcieńczenia roztworu DOTA/DMSO
   13. Odważyć 1-2 mg estru DOTA-NHS i ostrożnie dodać odpowiednią objętość (obliczoną w kroku 3.1.11) DMSO do estru DOTA-NHS; wymieszać i odwirować.
   14. Odpipetować obliczoną objętość roztworu estru DOTA-NHS (krok 3.1.12) do roztworu hCD19-mAb; przed dodaniem wytrzeć zewnętrzną część końcówki pipety, aby upewnić się, że nie dodano dodatkowego estru DOTA-NHS (bez zmiany ilości w pipecie). Delikatnie wymieszaj i odwiruj.
   15. Wstawić do lodówki (4 °C) do reakcji przez noc (12-16 h).
2. Oczyszczanie i zatężanie
   1. Schłodzić wirówkę do temperatury 4 °C w celu przeprowadzenia etapów wymiany buforu koncentratora odśrodkowego; umieścić metalowy blok probówki do PCR na suchym lodzie w celu natychmiastowego zamrożenia koniugatu.
   2. Wyjmij reakcję DOTA-hCD19-mAb z lodówki i ugasić, dodając biologiczny bufor TRIS klasy biologicznej: 10% całkowitej objętości reakcji. Usunąć 10-20 μg próbki do analizy spektrometrii mas.
   3. Kondycjonować kolumnę(-y) odsalającą(-e) zgodnie z powyższym opisem (etapy 3.1.1-3.1.5), stosując 0,1 M bufor octanu amonu o pH 5.5.
   4. Wymiana buforowa roztworu DOTA-hCD19-mAb na octan amonu (kroki 3.1.1-3.1.8).
   5. Zagęścić roztwór DOTA-hCD19-mAb: dodać roztwór do koncentratora odśrodkowego o masie cząsteczkowej 50 kDa zgodnie z zaleceniami producenta dotyczącymi objętości. Wirować przy 4 000 × g przez 10 minut (lub do momentu, gdy objętość zmniejszy się o 80%-90%); Odrzuć przepływ.
   6. Powtórz jeszcze dziewięć razy (w sumie 10): dodaj tyle octanu amonu, aby przywrócić objętość do maksymalnej zalecanej objętości.
      UWAGA: Suma powinna być tym, co zostało początkowo dodane, w tym tym, co pozostało w kolumnie, zwykle 400-450 μl w przypadku koncentratora odśrodkowego o pojemności 500 μl.
      1. Przepłukać fiolkę reakcyjną buforem octanu amonu w celu odzyskania pozostałości DOTA-hCD19-mAb; dodać popłuczynę do koncentratora odśrodkowego.
      2. Wirować przy 4 000 × g przez 10 min.
         UWAGA: Czas wirowania może ulec skróceniu przy kolejnych obrotach, jeśli głośność zostanie zmniejszona do 80%-90% w krótszym czasie.
   7. Usunąć roztwór białka z koncentratora odśrodkowego. Zwróć uwagę na całkowitą objętość DOTA-hCD19-mAb.
      1. W koncentratorze odśrodkowym 2 dodać wystarczającą ilość buforu octanu amonu do całkowitej objętości 100 μl i odpipetować do wymieszania. Zakryj kolumnę koncentratora odśrodkowego i odwróć. Wirować w temperaturze 4 000 × g przez 2 minuty, aby zebrać roztwór. Przenieś do nowej tuby.
      2. W koncentratorze odśrodkowym 500 za pomocą pipety pobrać roztwór mAb z koncentratora odśrodkowego; dodać do nowej probówki.
   8. Zmierz stężenie za pomocą spektrofotometru UV-Vis. Jeśli stężenie jest większe niż 2 mg/ml, rozcieńczyć octanem amonu do 2 mg/ml.
   9. Podwielokrotność 100 μg na probówkę PCR (około 50 μl); oznaczyć probówki DOTA-hCD19-mAb, datą, masą i stężeniem. Odkręć fiolki.
   10. Zamroź DOTA-hCD19-mAb na schłodzonym bloku PCR na suchym lodzie (lub zamroź na suchym lodzie). Po zamrożeniu wszystkich próbek umieścić je w zamrażarce o temperaturze -80 °C.
   11. Zmierz liczbę DOTA na hCD19-mAb za pomocą spektrometrii mas. Zachowaj próbkę niesprzężonego (czystego) przeciwciała z każdej koniugacji, aby obliczyć stosunek. Skorzystaj z równania (1) podanego poniżej; masa cząsteczkowa jest w skrócie MW.
       (1)
3. Radioznakowanie
   UWAGA: Nosić odpowiednie środki ochrony osobistej (PPE) do pracy z radioaktywnością, w tym fartuch laboratoryjny, rękawice oraz dozymetry osobiste i pierścieniowe, zgodnie z przepisami instytucjonalnymi. Regularnie sprawdzaj i zmieniaj rękawice, aby zapobiec skażeniu radioaktywnemu. Używaj osłony ołowianej i zwiększ odległość od źródła promieniowania, jeśli to możliwe, używając szczypiec.
   1. Przenieść radioaktywność z fiolki transportowej do nowej fiolki za pomocą pipety. Zmierz radioaktywność.
   2. Usunąć podwielokrotność dla pierwszej reakcji znakowania radioizotopowego. Dodać 50 μl octanu amonu (pH 5,5) na 1 mCi z ⁶⁴Cu-CuCl₃. Zmierz pH, pipetując 1 μl na pasek pH o zakresie wychwytującym 5,5 z rozdzielczością wystarczającą do rozróżnienia między 5 a 6.
   3. Jeśli pH nie wynosi 4-5,5, zmień je za pomocą 1 M NaOH lub 0,1 M HCl. Dodaj małe ilości, 1-5 μL, 1 M NaOH, jeśli pH jest mniejsze niż 4 lub 0,1 M HCl, jeśli pH jest większe niż 5,5, aż do osiągnięcia prawidłowego pH. Z każdym dodatkiem dokładnie wymieszaj, odwiruj i zmierz pH zgodnie z powyższym opisem. Zwróć uwagę na każde dodanie i usunięcie dowolnego roztworu (w tym w celu sprawdzenia pH), aby można było obliczyć końcową objętość.
   4. Po osiągnięciu optymalnego pH dodać 10 μg DOTA-hCD19-mAb na 1 mCi z ⁶⁴Cu-CuCl₃. Delikatnie wymieszaj i krótko odwiruj.
   5. Umieścić fiolkę reakcyjną na termomikserze ustawionym na 37 °C i 400 obrotów na minutę (obr./min).
   6. Po 30 minutach wygasić reakcję: podzielić całkowitą objętość reakcji przez 50 i dodać tę objętość 0,5 M EDTA do mieszaniny reakcyjnej.
   7. Określ skuteczność etykietowania za pomocą natychmiastowej chromatografii cienkowarstwowej (ITLC) w celu zmierzenia procentowej zawartości związanej i wolnej miedzi w roztworze.
      1. Wytnij paski papieru TLC o szerokości 1 cm. Oznaczyć 1 cm od góry i od dołu paska i przygotować probówkę (kolbę stożkową o pojemności 50 ml) z fazą ruchomą mniejszą niż 1 cm 0,1 M kwasu cytrynowego (poziom fazy ruchomej powinien być poniżej oznaczenia 1 cm na pasku po umieszczeniu w probówce).
      2. Odpipetować 1 μl roztworu reakcyjnego na pasku na dolnym znaczniku 1 cm (przód rozpuszczalnika) i umieścić pasek w probówce. Obserwuj, aż czoło rozpuszczalnika osiągnie górny znak 1 cm, usuń pasek i zawiń go w kawałek folii plastikowej.
      3. Umieść pasek na platformie i przepuść go przez skaner obrazowania radiowego TLC. Poszukaj znakowanego radioaktywnie mAb w punkcie początkowym i wolnych ⁶⁴Cu, które przemieszczają się z ruchomym frontem fazowym (Rysunek 2). Jeśli procent wolnej miedzi jest mniejszy niż 5% (95% skuteczności etykietowania), należy przystąpić do wstrzykiwania zwierzętom. Jeśli procent wolnej miedzi jest większy niż 5%, przystąp do oczyszczania.
         UWAGA: Procentowa zawartość wolnej miedzi generalnie zależy od stosunku DOTA-mAb do ⁶⁴Cu, czasu reakcji, pH i temperatury. Warunki reakcji powinny być optymalizowane przez każdego użytkownika dla każdego nowego mAb, aby zapewnić spójne wyniki.
4. Oczyszczanie za pomocą jednorazowej kolumny grawitacyjnej klasy DNA
   1. Kondycjonować jednorazową kolumnę przepływową grawitacyjną klasy DNA (kolumna odsalająca/wymiany buforowej) zgodnie ze wskazówkami producenta. Umieść jednorazową kolumnę grawitacyjną klasy DNA na stojaku pierścieniowym lub innym instrumencie za odpowiednią osłoną ołowiu; Upewnij się, że urządzenie jest stabilne i łatwe do przenoszenia. Umieść rurkę pod kolumną.
   2. Odpipetować surową mieszaninę reakcyjną na żywicę kolumny przepływu grawitacyjnego. Poczekaj, aż cały płyn spłynie do żywicy. Odpipetować wystarczającą ilość PBS, aby doprowadzić całą objętość (produkt surowy plus PBS) do 500 μl. Usunąć przepływ.
   3. Umieść kolumnę nad probówkami wirówkowymi o pojemności 1.5 ml oznaczonymi jako 1-10. Dodaj 1 ml PBS do kolumny. Zbierz pięć kropli w każdej probówce, aż przepływ się zatrzyma.
      UWAGA: Może być wymaganych mniej niż 10 probówek.
   4. Zakryj spód kolumny i zmierz pozostałą radioaktywność. Odmierzyć temperaturę każdej fiolki za pomocą przepływu. Dla każdej fiolki zawierającej więcej niż 50 μCi, należy przygotować ITLC zgodnie z krokiem 3.3.7 w celu zmierzenia procentowej zawartości miedzi związanej w każdej frakcji.
      UWAGA: Pierwsza jedna lub dwie frakcje będą zawierały tylko fazę ruchomą; znakowany radioaktywnie mAb zostanie wyeluowany jako pierwszy (zwykle frakcje 2 lub 3 do 5 lub 6), a wolne ⁶⁴Cu wymyją się jako ostatnie (niektóre przykleją się do kolumny). Procent związany ⁶⁴Cu może się różnić w zależności od frakcji.
   5. Połączyć frakcje, które wiążą więcej niż 95% (mniej niż 5% wolnej miedzi); użyć roztworu do wstrzykiwań. W razie potrzeby należy przeprowadzić HPLC z wykluczeniem wielkości, aby potwierdzić znakowanie radioaktywne⁵ i obliczyć aktywność molową. Zapisz podwielokrotność do pomiaru stężenia na spektrofotometrze UV-Vis po upływie 10 okresów półtrwania (127 godzin lub 5,3 dnia).

4. Przygotowanie dawki

UWAGA: Przed podaniem dawki należy założyć odpowiednie środki ochrony osobistej, w tym fartuch laboratoryjny, dozymetry na ciało i palce oraz rękawice.

1. Wstrzyknąć ⁶⁴Cu-DOTA-hCD19-mAb 18-24 godziny przed skanowaniem PET, aby umożliwić odpowiednią cyrkulację radioznacznika w organizmie.
2. Natychmiast umieść pojemnik z ołowianym ⁶⁴Cu-DOTA-hCD19-mAb za osłoną ołowiu. Włącz licznik Geigera, aby monitorować potencjalne zanieczyszczenie.
   UWAGA: Podczas pracy z materiałem radioaktywnym należy często zmieniać rękawice. Zaleca się stosowanie podwójnych rękawic podczas pobierania dawek, aby ułatwić szybką wymianę rękawic. Zawsze umieszczaj zanieczyszczone ostre przedmioty i śmieci w wyznaczonym osłoniętym obszarze na śmieci.
3. Rozcieńczyć ⁶⁴Cu-DOTA-hCD19-mAb do odpowiedniego stężenia w plastikowej probówce wirówkowej o pojemności 1,5 ml o niskiej zawartości wiązania.
   UWAGA: ⁶⁴Cu-DOTA-hCD19-mAb wiąże się z plastikiem, jeśli nie ma niskiego wiązania; ^{Rozdział 64}Cu zwiąże się ze szkłem.
   1. Rozcieńczyć radioznacznik w soli fizjologicznej, aby zapobiec radiolizie i uprościć pobieranie stałych dawek.
   2. Przygotować dawki do podania od 75 do 150 μCi w 100 μl, jeśli to możliwe. Upewnij się, że maksymalna całkowita objętość wstrzykniętej myszy nie przekracza 10% masy ciała.
4. Za pomocą strzykawki insulinowej o pojemności 500 μl (50 cm3) pobrać dawkę z plastikowej probówki o niskim stopniu wiązania. Upewnij się, że w strzykawce nie ma pęcherzyków powietrza, ponieważ będzie ona wstrzykiwana dożylnie.
   1. Wstępnie oznacz strzykawki odpowiednimi numerami zwierząt.
   2. Zapisz aktywność dawki i czas w notatniku laboratoryjnym w celu analizy danych.
   3. Należy przygotować dawki do wstrzyknięcia, gdy tylko zwierzęta zostaną cewnikowane, aby skrócić czas pod narkozą.
5. Po przygotowaniu dawek należy przygotować wzorzec (fantom) do skanowania w celu wygenerowania współczynnika kalibracyjnego.
   1. Napełnij stożkową probówkę o pojemności 15 ml 50-75 μCi aktywności rozcieńczonej w wodzie (lub PBS).
      UWAGA: Zapewnić dokładne wymieszanie roztworu. Standardem może być bezpłatne ⁶⁴Cu pozostałe po etykietowaniu.
      1. Zmierz ilość aktywności w normie i zapisz czas.

5. Kaniulacja i iniekcja

UWAGA: Zobacz wcześniej opisane metody⁶ dla dożylnej kaniulacji myszy w celu wstrzyknięcia radiotracera⁶.

1. Zważyć i ocenić myszy pod kątem ciężkości choroby, jak opisano w punkcie 2.1, przed znieczuleniem myszy w pojemniku wypełnionym 1,5-3% izofluranem w ramach przygotowań do podania radioznacznika.
   UWAGA: Myszy te zostaną wstrzyknięte na blat stołu, a nie na skaner PET, jak opisano wcześniej. Nie ma potrzeby przyklejania cewników do wstrzykiwań, ponieważ myszy nie będą przenoszone między kaniulacją a wstrzyknięciem.
2. Po kaniulacji myszy włóż igłę do końca cewnika i powoli wstrzyknij. Po wstrzyknięciu należy przepłukać cewnik niewielką ilością soli fizjologicznej, aby upewnić się, że cała dawka została wstrzyknięta.
   UWAGA: Objętość powinna być w przybliżeniu równa objętości martwej cewnika, która wynosi 50 μl dla cewników używanych przez autorów.
   1. Wstrzyknąć na kawałek chusteczki laboratoryjnej w celu zebrania wszelkich kropli radioznacznika; należy to uwzględnić podczas odmierzania dawki resztkowej.
   2. Zapisz czas wstrzyknięcia w notatniku laboratoryjnym.
3. Natychmiast po wstrzyknięciu należy wyjąć kaniulę. Zmierz kaniulę, strzykawkę dozującą i tkankę za pomocą kalibratora dawki, aby określić dawkę resztkową, która nie została wstrzyknięta myszy.
   1. Rejestruj aktywność i czas w notatniku laboratoryjnym.
4. Po wstrzyknięciu myszom oznacz ich klatki kartą klatki wskazującą, że myszy są radioaktywne. Rejestruj i rejestruj klatki zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi. Następnie umieść myszy w wyznaczonym obszarze przechowywania radioaktywów.

6. Obrazowanie PET/CT

1. Obrazowanie PET należy wykonać 18-24 godziny po wstrzyknięciu ⁶⁴Cu-DOTA-hCD19-mAb. Zważ i naciąć myszy przed skanowaniem.
   UWAGA: Instrukcja obsługi skanera zależy od używanego skanera.
   1. Upewnij się, że komponent rentgenowski skanera PET/CT jest rozgrzany i gotowy do pobrania.
   2. Otwórz oprogramowanie do akwizycji skanera PET na komputerze.
   3. W menu rozwijanym Logowanie badacza kliknij odpowiednie informacje o laboratorium.
   4. Na stronie Projekt utwórz nowy projekt lub wybierz istniejący projekt z menu rozwijanego.
   5. Gdy na ekranie automatycznie pojawi się monit o inicjalizację, kliknij Łóżko domowe i poczekaj, aż łóżko do domu. Następnie kliknij Warm up CT.
      1. Upewnij się, że drzwiczki ekranujące przekładnika prądowego są zamknięte, aby umożliwić rozgrzanie przekładnika prądowego.
2. Podczas gdy skaner się rozgrzewa, oceń myszy EAE i wstrzyknij im podskórnie 0,2-0,4 ml ciepłej soli fizjologicznej w bok w celu nawodnienia.
3. Po rozgrzaniu skanera wróć do komputera, aby skonfigurować skany PET do badania.
   UWAGA: Można je skonfigurować przed dniem skanowania.
   1. Pod nagłówkiem Ostatnie badania kliknij przycisk Create New Study (Utwórz nowe badanie). Wypełnij nazwę badania, protokół, związek i informacje o uczestniku.
      1. Jeśli wykonujesz PET/CT, najpierw wybierz Protokół PET, a następnie wybierz Protokół CT.
         UWAGA: Zazwyczaj do skanowania modelu myszy EAE wystarcza standardowa tomografia komputerowa. Tomografia komputerowa trwa 1 minutę i jest wykonywana z binningiem przy 2 x 2 przy napięciu 80 kVp, prądzie 150 μA i 720 projekcjach. Obrazy CT są rekonstruowane przy użyciu zmodyfikowanego algorytmu Feldkampa.
      2. W przypadku protokołu PET wybierz 10-15-minutowy statyczny skan 64-miedziany. Jeśli ten skan nie znajduje się jeszcze na liście dostępnych protokołów, dodaj go, klikając zakładkę Protokoły w menu Standard, Utwórz nowy protokół | Menu rozwijane Izotopy. Jeśli żądanego izotopu nie ma na liście, kliknij Więcej | Dodaj z biblioteki i dodaj żądany izotop. Określ czas trwania skanowania, kliknij przycisk radiowy Skanowanie statyczne, nazwij protokół i kliknij Zapisz.
      3. Wróć do zakładki Badania i kontynuuj nazywanie i konfigurowanie wszystkich żądanych skanów na dany dzień.
         UWAGA: Zaleca się również wykonanie jednego badania "CT Test" przy użyciu tylko standardowej tomografii komputerowej w celu sprawdzenia pozycji łóżka pierwszego skanowania, aby zapewnić optymalne umieszczenie. Powinno to być pierwsze uruchomienie skanowania w ramach badania.
4. Gdy skaner będzie gotowy, znieczul myszy w pojemniku, aby przygotować je do skanowania.
   UWAGA: Na tym etapie myszy są prawdopodobnie bardzo chore; Najlepszą praktyką jest zminimalizowanie czasu pod narkozą.
   1. Nałóż żel pod oczy.
5. Upewnij się, że stół skanujący z czterema myszami jest wyposażony w elementy grzejne, takie jak poduszki grzewcze lub ogrzane powietrze, z izofluranem ustawionym na 1,5%-2% i włączoną poduszką grzewczą (Rysunek 3). Umieść myszy w pozycji leżącej na łóżku skanującym.
   1. W miarę postępu choroby EAE kręgosłup myszy staje się mocno zakrzywiony. Skanuj myszy, gdy leżą na plecach, aby jak najbardziej wyprostować kręgosłup, poprawiając dalszą analizę. Delikatnie pociągnij ogon myszy, aby pomóc w wyprostowaniu kręgosłupa.
6. W pozycji leżącej na plecach bezpiecznie przymocuj każdą mysz miękką taśmą mikroskopową. Użyj jednego paska taśmy na głowie, a drugiego delikatnie na brzuchu, aby zminimalizować ruch spowodowany oddychaniem.
   1. Zapisz w notatniku laboratoryjnym, która mysz znajduje się w jakiej pozycji skanowania.
7. Po zabezpieczeniu myszy wróć do komputera skanującego, aby uruchomić skaner.
8. Otwórz menu kontrolera ruchu. Kliknij pole widzenia PET Center, aby przesunąć myszy na stole skanującym do pierścienia PET. Aby wykonać pierwszy skan w ciągu dnia, kliknij CT Center FOV. Po ustaleniu pozycji uruchom test CT, aby upewnić się, że pozycja jest prawidłowa; Powtarzaj, aż pozycja łóżka będzie zadowalająca.
   1. Umieść mały kawałek białej taśmy na stole skanującym, aby zaznaczyć prawidłowe ułożenie łóżka do końca badania.
9. Gdy łóżko znajdzie się na miejscu do skanowania PET, zainicjuj sekwencję skanowania, klikając Uruchom.
   1. Poczekaj, aż skaner automatycznie przesunie się z pierścienia PET do CT.
   2. Zawsze sprawdzaj wzrokowo, czy zwierzęta przesunęły się do właściwej pozycji zarówno dla PET, jak i CT.
   3. Zapisz czas rozpoczęcia skanowania w notatniku laboratoryjnym w celu skorygowania zaniku dawki wstrzykniętej podczas analizy danych.
10. Po zakończeniu skanowania poczekaj, aż obraz zostanie zrekonstruowany. Sprawdź dane przed usunięciem zwierząt.
    UWAGA: Rekonstrukcja podzbiorów uporządkowanych w 3D z myślą o maksymalizacji (OSEM) zajmie około 5 minut w przypadku skanowania statycznego.
11. Sprawdź wzrokowo i zatwierdź dane, używając śledziony jako kontroli pozytywnej, ponieważ tkanka ta zawiera dużą liczbę limfocytów B. Wyjmij zwierzęta z łóżka skanującego i umieść je w pudełku wypełnionym izofluranem w celu przygotowania do perfuzji, a następnie sekcji.
12. Powtórz kroki 6.5-6.12 dla pozostałych myszy w badaniu.
13. Po zeskanowaniu wszystkich myszy lub podczas skanowania grupy, która ma wolne miejsce w stole skanującym, zeskanuj standard przygotowany w kroku 4.6.

7. Sekcja do zliczania promieniowania gamma ex vivo i autoradiografii

1. Przed przystąpieniem do preparacji upewnij się, że wszystkie probówki do liczenia promieniowania gamma i wirówki zostały wstępnie zważone.
2. Przeprowadzić eutanazję przez perfuzję, jak opisano^{wcześniej 6}, z PBS i torakotomią, podczas gdy myszy są głęboko znieczulone (ciągłe wdychanie 4% izofluranu, 2 l/min 100%_O2).
3. Aby usunąć szpik kostny, przetnij obie kości udowe w kolanie i miednicy. Upewnij się, że obie głowy są usunięte z kości udowej.
   1. Umieść obie kości udowe w probówce wirówkowej o pojemności 0,5 ml, która ma otwór na dole (za pomocą igły 20 G) i ma odciętą pokrywkę.
   2. Umieść probówkę o pojemności 0,5 ml zawierającą kości udowe w probówce wirówkowej o pojemności 1,5 ml z odciętą pokrywką.
   3. Umieść cały zestaw probówek w mini wirówce. Wiruj przez 4 minuty przy 4,500 × g.
      UWAGA: Szpik kostny należy usunąć przez otwór w probówce wirówkowej o pojemności 0,5 ml i osiąść na dnie probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml.
      1. Oddziel rurki. Zważyć puste kości udowe w probówce wirówkowej o pojemności 0,5 ml. Zważyć szpik kostny w probówce wirówkowej o pojemności 1,5 ml. Umieść każdą probówkę wirówkową w probówkach zliczających promieniowanie gamma.
4. Usuń mózg za pomocą kleszczy i nożyczek, uważając, aby pień mózgu pozostał nienaruszony. Umieść mózg w probówce zliczającej promienie gamma. Zapisz suchą masę, przepłucz PBS i trzymaj na lodzie, aż będzie gotowy do liczenia.
5. Aby usunąć rdzeń kręgowy, wykonaj następujące czynności.
   1. Usuń skórę i sierść, wykonując nacięcie po grzbietowej stronie zwierzęcia, aby odsłonić kręgosłup (Rysunek 1).
   2. Oddziel odcinek lędźwiowy (L) od odcinka szyjnego (C) i piersiowego, przecinając wzdłuż trzech płaszczyzn poprzecznych wokół i przez kręgosłup: u podstawy szyi (kręg C1) (Rysunek 1D, numer 1); u podstawy klatki piersiowej (kręg L1) (Rysunek 1D, numer 2); u podstawy miednicy (kręg L5) (Rysunek 1D, Numer 3).
   3. Przeciąć pod klatką piersiową (Rysunek 1D, numer 2).
   4. Wytnij bezpośrednio nad kością krzyżową, aby oddzielić odcinek lędźwiowy kręgosłupa. Ostrożnie przyciąć kręgosłup od końca miednicy, aż będzie widoczny lędźwiowy rdzeń kręgowy (Rysunek 1D, numer 3). Odetnij otaczające tkanki, aby odizolować odcinek lędźwiowy i szyjny/piersiowy kręgosłupa (Rysunek 1D, numery 4 i 5).
   5. Aby wydalić rdzeń kręgowy, użyj strzykawki z końcówką (3-10 ml) wypełnionej PBS. Utworzyć uszczelnienie między strzykawką a kręgosłupem za pomocą kciuka i palca wskazującego.
      1. Delikatnie przepchnij PBS przez strzykawkę, aby wypchnąć rdzeń kręgowy na wkładkę chłonną (Rysunek 1E); powtórz dla obu obszarów kręgosłupa. Umieść tkanki rdzenia kręgowego w probówce zliczającej promienie gamma.
      2. Zapisz suchą masę i dodaj PBS, aby upewnić się, że tkanka znajduje się na dnie probówki, aby uniknąć wysuszenia. Umieść probówkę na lodzie, aż będzie gotowa do liczenia.
      3. Wydal rdzeń kręgowy szyjny/piersiowy z końca czaszki i rdzeń kręgowy lędźwiowy z ogonowego końca kręgosłupa (Rysunek 1E).

8. Zliczanie gamma ex vivo

1. Otwórz oprogramowanie licznika gamma. Przejdź do listy roboczej i wybierz żądany protokół, taki jak protokół zliczania 30 s dla ⁶⁴Cu.
2. Przygotuj co najmniej trzy wzorce w oddzielnych probówkach. Uruchom je teraz, aby użyć ich w analizie (krok 10.2). Staraj się wykonać trzy powtórzone objętości i ilości aktywności w trzech oddzielnych probówkach.
   UWAGA: Dobre wyniki daje objętość 500 μL. Podczas gdy aktywność będzie zależała od używanej maszyny, 10 μCi generalnie działa dobrze.
3. Umieść wzorce w stojaku oznaczonym kodem kreskowym odpowiadającym żądanemu protokołowi, który ma zostać uruchomiony. Umieść stojak na liczniku gamma.
4. Po zarejestrowaniu masy narządów, umieść probówki zawierające organy na stojaku do liczenia gamma za probówkami zawierającymi wzorce.
   UWAGA: Narządy będące przedmiotem zainteresowania dla tego modelu mogą obejmować osiowe węzły chłonne, krew, szpik kostny, mózg, węzły chłonne szyjne, kość udową, serce, wątrobę, lędźwiowy rdzeń kręgowy, mięśnie, śledzionę, ogon i rdzeń kręgowy szyjny/piersiowy.
5. Umieść stojak z kodem kreskowym stop z tyłu licznika gamma.
6. Naciśnij przycisk Odtwórz na komputerze. Jeśli to możliwe, nie naciskaj przycisku Play, dopóki nie pojawi się wiele stojaków lub organów do uruchomienia, aby umożliwić ciągłe zliczanie wszystkich lamp w jednym pliku. Upewnij się, że stojak z kodem kreskowym zatrzymania znajduje się z tyłu licznika gamma dla każdego cyklu.
7. Uruchamiać do momentu, aż wszystkie próbki zostaną policzone. Zapisz i wyeksportuj plik.

9. Autoradiografia ex vivo (ARG) tkanki OUN

1. Postępuj zgodnie z wcześniej opublikowanymi krokami zarówno dla mózgu, jak i rdzenia kręgowego ARG (z wyłączeniem kroków 2-6 opisanych przez Chaneya i wsp., ponieważ myszom wstrzyknięto już radioznacznik ze skanu PET)⁶.
   UWAGA: Szczegółowe instrukcje dotyczące przygotowania kasety ARG rdzenia kręgowego znajdują się tutaj⁶.
2. Po zakończeniu liczenia promieniowania gamma dla rdzenia kręgowego lędźwiowego i szyjnego/piersiowego, natychmiast umieść rurki na lodzie, aż wszystkie tkanki OUN zostaną policzone.
   UWAGA: Zapoznaj się z poprzednio opublikowaną metodą ARG klasy brain⁶.
3. Delikatnie przechyl rurki, aby rdzeń kręgowy wypadł na podkładkę chłonną. Jeśli rdzeń kręgowy przylega do boku rurki, delikatnie spłucz zimnym PBS i ponownie przechyl rurkę. Ostrożnie osusz każdy rdzeń kręgowy, delikatnie osuszając go chusteczką laboratoryjną. Umieść wysuszone rdzenie kręgowe w zorganizowany sposób na grubej czarnej kartce papieru.
   1. Oznacz obok rdzenia kręgowego białym długopisem dla łatwej identyfikacji.
   2. Pozostaw miejsce w rogach i na środku czarnego papieru, aby umieścić stosy trzech szkiełek mikroskopowych, które będą działać jako przekładki, aby zapobiec uciskowi rdzenia kręgowego, gdy kaseta ARG jest zamknięta. Użyj 5-7 ładunków.
4. Gdy wszystkie rdzenie kręgowe lędźwiowe i szyjne/piersiowe zostaną umieszczone na czarnym papierze i oznaczone, ostrożnie umieść kartkę papieru w kasecie ARG. Umieść otwartą kasetę na tacy z suchym lodem, aby zamrozić rdzeń kręgowy.
5. Po zamrożeniu delikatnie umieść plastikową folię między cyfrowym ekranem do przechowywania luminoforu a rdzeniem kręgowym i umieść ekran na próbkach. Natychmiast zamknij kasetę i umieść ją w zamrażarce w temperaturze -20 °C na około 10 okresów półtrwania (~127 godzin).
6. Po upływie czasu naświetlania zeskanuj film za pomocą imagera luminoforowego. Przeanalizuj uzyskany obraz cyfrowy (instrukcje znajdują się w sekcji 12).

10. Analiza danych dotyczących biodystrybucji

1. Skonfiguruj arkusz kalkulacyjny "Korekta dawki", aby matematycznie określić poprawkę czasową dla rozpadu promieniotwórczego, normalizując w ten sposób dawki promieniowania i umożliwiając porównania między obiektami.
   1. Skorygować wszystkie dawki do czasu wstrzyknięcia, uwzględniając pozostałą aktywność pozostałą w strzykawce i cewniku po wstrzyknięciu.
   2. Korzystając ze standardów przygotowanych w kroku 8.2, uśrednij ilość aktywności (μCi) i znormalizowane liczby na minutę (CPM). Podziel średni CPM przez średnią kwotę aktywności standardowej, aby uzyskać CPM/μCi.
      UWAGA: Upewnij się, że wielkość aktywności dla każdego wzorca jest skorygowana o zanik do czasu, w którym licznik gamma zlicza CPM wzorców. Licznik gamma powinien normalizować wszystkie wartości CPM do czasu rozpoczęcia protokołu.
2. Skonfiguruj arkusz kalkulacyjny "Wyniki", aby obliczyć ostateczny procent wstrzykniętej dawki na gram tkanki (%ID/g) dla każdej próbki.
   1. Skorygowano o znormalizowany CPM z licznika gamma dla każdej próbki liczonej do czasu wstrzyknięcia zwierzęcia.
      UWAGA: Korekcja zaniku może dotyczyć dowolnego punktu czasowego; upewnij się, że wszystkie dawki i wartości CPM są skorygowane o zanik do tego samego punktu czasowego.
   2. Znormalizuj CPM z korekcją zaniku do masy każdej próbki, aby określić CPM na próbkę. Oblicz łączną ilość wstrzykniętego CPM, odejmując CPM w końcu od obliczonego wstrzykniętego CPM.
      UWAGA: Ogon nie musi być korygowany masowo, ponieważ ta wartość CPM zostanie po prostu odjęta od całkowitej wstrzykniętego CPM, aby uwzględnić wszelkie dodatkowe znaczniki żylne z wstrzyknięcia.
   3. Podziel CPM na masę przez całkowitą ilość wstrzykniętego CPM, aby obliczyć %ID/g.
3. Skonfiguruj arkusz kalkulacyjny "Podsumowanie", aby wyświetlić końcowe wyniki do wprowadzenia do oprogramowania do tworzenia wykresów, a następnie wizualizacji danych i analizy statystycznej.

11. Analiza obrazu PET

1. Otwórz oprogramowanie do analizy PET. lick on Plik |Otwieranie danych lokalnych | Złącze DICOM. Zlokalizuj żądany plik (format DICOM). Otwórz zarówno PET, jak i CT.
2. W Menedżerze danych dostosuj kontrast PET i CT do żądanych poziomów.
3. Zarejestruj i przytnij pojedyncze myszy.
   1. W menu Nawigacja wybierz zakładkę Reorientacja/Rejestracja.
   2. Przejdź do menu Sztywny w tej zakładce. Oznacz tomografię komputerową (0) jako skan stały, a skan PET (1) jako skan ruchomy.
   3. Wybierz sztywne przekształcenie i szybką jakość. Kliknij Zarejestruj się.
   4. Po zakończeniu rejestracji (5-10 min) kliknij znacznik wyboru, aby zapisać rejestrację.
   5. Sprawdź wzrokowo dane, aby upewnić się, że rejestracja zakończyła się pomyślnie. Wyeksportuj sesję, klikając Plik | Sesja | Eksport.
   6. Następnie przytnij każdą mysz w pełnym kadrowaniu: przejdź do menu nawigacyjnego i kliknij Przycinanie. Przeciągnij boki każdego przekroju poprzecznego od zewnętrznej krawędzi do wewnątrz.
   7. Gdy żądana mysz zostanie mocno przycięta, kliknij znacznik wyboru i wyeksportuj sesję, aby ją zapisać.
   8. Następnie przytnij i wyprostuj głowy każdej myszy w celu analizy mózgu za pomocą ręcznej translacji, obrotów i odwróceń w menu Rejestracja/Reorientacja. Eksportuj, aby zapisać.
4. Przeanalizuj rdzeń kręgowy.
   1. Aby rozpocząć analizę obszarów zainteresowania (ROI) w rdzeniu kręgowym, otwórz narzędzie 3D ROI z menu nawigacyjnego.
   2. Pod nagłówkiem ROI użyj znaku plus u dołu menu, aby utworzyć sześć ROI: Odcinek lędźwiowy ROI, ROI w odcinku szyjnym/piersiowym, Szkielet lędźwiowy, Szkielet klatki piersiowej, Rdzeń kręgowy lędźwiowy, Rdzeń kręgowy w odcinku piersiowym.
      UWAGA: Zwroty z inwestycji w odcinek lędźwiowy i szyjny/piersiowy są uogólnionymi dużymi ROI, które zostaną wykorzystane do stworzenia ROI szkieletu (Rysunek 4).
   3. Aby uniknąć zakłóceń wizualnych ze strony sygnału PET na tym etapie, kliknij F3, aby wyłączyć PET.
   4. Przejdź na górę okna Operator narzędzia 3D ROI. Kliknij ciągłą kropkę po prawej stronie symbolu kursora, aby otworzyć tryb malowania 3D i menu Erozja/Rozszerzenie.
   5. Wybierz opcję Sphere (Sfera) i zmień jej rozmiar na 20 pikseli. Ustaw opcję Rozszerz na +5.
      1. Zanim przejdziesz dalej, przejdź na dół menu. Upewnij się, że wybrano zwrot z inwestycji w odcinek lędźwiowy, ponieważ jest to pierwszy zwrot z inwestycji, który zostanie narysowany.
   6. W tomografii komputerowej znajdź kręg L6 kręgosłupa (w miejscu, w którym kręgosłup styka się z biodrami). Zaczynając jeden kręg powyżej L6, narysuj przybliżony ROI Lędźwiowy ROI nad pięcioma kręgami powyżej bioder (kręgi L1-L5). Następnie przełącz się na ROI szyjki macicy/klatki piersiowej i prześledź pozostałą część kręgosłupa do podstawy czaszki.
      UWAGA: Nie musi to być precyzyjne, ponieważ służy do wskazania, gdzie powinno nastąpić progowanie Otsu w kroku 11.4.8.
   7. Po narysowaniu uogólnionych ROI przejdź do górnej części operatora. Wybierz menu Algorytmy segmentacji.
   8. Z menu rozwijanego wybierz opcję Otsu Thresholding. Jako dane wejściowe wybierz opcję Lędźwiowy ROI. U dołu menu upewnij się, że wybrana jest opcja Kręgosłup lędźwiowy. W menu rozwijanym obok opcji Obraz upewnij się, że wybrano skan CT i kliknij Zastosuj. Powtórz dla ROI szyjki macicy/klatki piersiowej i szkieletu klatki piersiowej.
      1. Jeśli progowanie Otsu nie podkreśla wystarczająco kręgosłupa, użyj globalnego progowania i zmień wartość Min na 350, a Max na 3,500 dla ręcznego progowania i dostosuj w razie potrzeby, aby wyizolować kręgi.
   9. Po użyciu Otsu Thresholding do stworzenia szkieletowych ROI, wróć do menu nawigacji (ikona kursora). Usuń lub zaznacz kolumnę H (ukryj) zarówno dla przybliżonych ROI odcinka lędźwiowego, jak i szyjnego/piersiowego, aby je ukryć. Zaznacz kolumnę I (niezmienna) dla obu szkieletowych ROI, aby nie można było ich edytować.
   10. Na koniec wróć na górę narzędzia 3D ROI Tool Operator i przejdź do menu 3D Paint, aby narysować ROI rdzenia kręgowego.
       1. Wybierz ponownie narzędzie Sphere (Sfera) i prześledź rdzeń kręgowy w szkielecie zarówno dla odcinka lędźwiowego, jak i klatki piersiowej, upewniając się, że na dole menu wybrano prawidłowy zwrot z inwestycji.
       2. Aby usunąć dowolny zwrot z inwestycji, kliknij Command/Control i narysuj część, która ma zostać usunięta.
       3. Sprawdź ROI rdzenia kręgowego ze wszystkich trzech płaszczyzn, aby upewnić się, że nie ma ROI rysowanego poza kręgosłupem.
5. Eksport wyników analizy rdzenia kręgowego.
   1. Jeśli sygnał PET został wyłączony w kroku 11.4.3, naciśnij F3 po narysowaniu ROI rdzenia kręgowego, aby ponownie włączyć PET, lub wybierz kontroler wizualny (VC) i kliknij pasek PET.
   2. Wróć do menu Nawigacja (ikona kursora). Kliknij ikonę siatki, aby wyświetlić tabelę. Skopiuj tabelę do arkusza kalkulacyjnego i zapisz.
   3. Na koniec wyeksportuj plik w oprogramowaniu do analizy PET, jak opisano powyżej, aby zapisać narysowane zwroty z inwestycji.
6. Analizuj mózg za pomocą półautomatycznego atlasu 3D.
   1. Otwórz plik przycinania głowicy. Zaimportuj atlas mózgu myszy, przechodząc do menu Moduły zaawansowane i wybierając narzędzie 3D Brain Atlas Tool. Upewnij się, że odniesienie jest ustawione na CT, a opcja przycinania nie jest zaznaczona. Ustaw ścieżkę dla katalogu wyjściowego.
   2. W obszarze Ustawienia zaawansowane zmień wartość Transform (Przekształć) na Versor-Affine. Zachowaj wszystkie inne ustawienia domyślne. Kliknij Uruchom.
   3. Ręcznie dostosuj atlas w menu Reorientacja/Rejestracja i użyj CT czaszki jako wskazówki do dopasowania atlasu.
      1. Zachowaj szczególną ostrożność, jeśli konieczne jest skalowanie, ponieważ może to znacznie wpłynąć na objętość struktury mózgu. Kliknij znacznik wyboru po zakończeniu regulacji.
      2. Uruchom ponownie atlas z zaznaczoną opcją Importuj ROI 3D.
      3. Wyeksportuj plik, aby zapisać atlas dopasowany do przyciętej głowy.
   4. Po narysowaniu i wyeksportowaniu wszystkich ROI z żądanych narządów, oblicz standardową wartość korekcji wiązania. Popraw wszystkie dane i przekonwertuj na %ID/g, jak opisano wcześniej⁶. Normalizuj do narządu, który pasuje do modelu zwierzęcego, takiego jak serce, aby znormalizować się do radioznacznika obecnego w puli krwi.

12. Analiza autoradiograficzna ex vivo

1. Otwórz plik obrazu cyfrowego (.gel) za pomocą oprogramowania do analizy obrazu. Dostosuj jasność i kontrast do żądanego progu. W razie potrzeby zastosuj odpowiednią tabelę wyszukiwania kolorów.
   UWAGA: Królewski lub Szary są zalecane w celu ułatwienia wizualizacji.

Wyniki

hCD19-mAb był sprzężony z DOTA i znakowany radioaktywnie ⁶⁴Cu, jak pokazano w Rysunek 2. EAE i myszy wcześniej przeszły skanowanie PET/CT (Ryc. 3) 18-24 godziny po wstrzyknięciu ⁶⁴Cu-DOTA-hCD19-mAb. Obrazy PET/CT były rejestrowane za pomocą oprogramowania do analizy PET, a tkanki OUN analizowano za pomocą ręcznych ROI lub półautomatycznego atlasu mózgu 3D. Wiązanie radioznacznika w ROI (Figura 4) było wyższe u myszy EAE niż u myszy naiwnych. Liczenie gamma ex vivo i ARG wykazało zwiększone wiązanie w rdzeniu kręgowym (zarówno odcinek lędźwiowy, jak i szyjny klatki piersiowej) i mózgu (tylko ARG) myszy EAE w porównaniu z naiwnymi (Rysunek 5 i Rysunek 6). Liczenie promieniowania gamma ex vivo u myszy z perfuzją wykazało również zmniejszone wiązanie radioznacznika w narządach obwodowych, w tym śledzionie, kości udowej i szpiku kostnym (Ryc. 5), zgodnie z limfocytami B opuszczającymi obwód i infiltrującymi OUN w tym modelu EAE.

Rysunek 2: Schemat koniugacji i znakowania radioaktywnego do generowania ⁶⁴znakowanych Cu przeciwciał monoklonalnych CD19 specyficznych dla człowieka, mAb 16C4-TM (⁶⁴Cu-DOTA-hCD19-mAb), oprócz danych kontroli jakości. (A) Reakcja estru DOTA-NHS z przeciwciałem monoklonalnym hCD19 w celu wytworzenia koniugatu hCD19-DOTA (nie w skali) i znakowanie radioaktywne z ⁶⁴Cu-CuCl₃ w celu wytworzenia ⁶⁴Cu-DOTA-hCD19-mAb. (B) Reprezentatywny chromatograf ITLC. Szczyt na wysokości 40-60 cm to przeciwciało znakowane radioaktywnie; niezwiązany ⁶⁴Cu-CuCl₃ przemieszcza się z fazą ruchomą i byłby obecny od 200 do 240 cm. W tym chromatografie nie ma wykrywalnego wolnego ⁶⁴Cu-CuCl₃. (C) Specyfikacje kontroli jakości przeciwciała znakowanego izotopem. Skróty: ester DOTA-NHS = ester mono-N-hydroksysukcynimidu kwasu 1,4,7,10-tetraazacyklododekan-1,4,7,10-tetraoctowego; ITLC/HPLC = natychmiastowa chromatografia cienkowarstwowa/wysokosprawna chromatografia cieczowa; MALDI/LC-MS = desorpcja laserowa/jonizacja/chromatografia cieczowa wspomagana matrycą-spektrometria mas; CPM = liczby na minutę. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Fotografie pokazujące, jak zabezpieczyć myszy w wydrukowanym w 3D łóżku w skanerze PET, aby umożliwić wysokiej jakości obrazowanie rdzenia kręgowego i mózgu przy jednoczesnej minimalizacji ruchu. (A) Wydrukowane w 3D łóżko skanera czterech myszy (znane również jako "hotel dla myszy") wyposażone w elementy grzewcze i rurki anestezjologiczne. (B) Znieczulone myszy w pozycji leżącej na plecach, aby zmaksymalizować prostoliniowość kręgosłupa; Pozycja łóżka każdej myszy jest rejestrowana. (C) Myszy bezpiecznie przyklejone taśmą do głowy, aby zminimalizować ruch w mózgu i w poprzek brzucha, aby zminimalizować ruch podczas oddychania, bez wpływu na oddychanie. (D) Łoże myszy umieszczone w skanerze i przyklejone taśmą do stołu skanującego. Rurkę anestezjologiczną podłączono od skanera do łóżka i ustawiono izofluran na 2%. Oddech myszy monitorowano w celu zapewnienia odpowiedniego poziomu izofluranu przed zamknięciem drzwiczek skanera. Skrót: PET = Pozytonowa tomografia emisyjna. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Obraz rdzenia kręgowego i analiza mózgu oraz wyniki za pomocą oprogramowania do analizy PET. (A) i) ROI (różowy i podpalany) narysowany na grzbiecie w celu oddzielenia kręgów lędźwiowych od piersiowych i szyjnych oraz przygotowania obrazu do progowania Otsu. ii) Kręgi rdzeniowe (turkusowe i czerwone) zostały podzielone na segmenty za pomocą progowania Otsu. iii) Kręgi stały się następnie niezmienne w menu ROI 3D, a rdzeń kręgowy podzielony na ROI szyjne / piersiowe (fioletowe) i lędźwiowe (granatowe). iv) Kręgowy ROI został usunięty, pozostawiając ROI rdzenia kręgowego i reprezentatywny atlas mózgu. (B) Reprezentatywna analiza wyników PET z różnych regionów OUN reprezentowanych jako %ID/g znormalizowanych do ROI serca u każdego zwierzęcia. Akwizycja PET polegała na 10-minutowym skanowaniu statycznym za pomocą obrazowania PET/CT. Regiony mózgu oznaczone ilościowo za pomocą półautomatycznego atlasu mózgu, pokazane w panelu A. iv) Reprezentatywne wyniki wskazują na znaczenie lub tendencję do znacznego wzrostu wiązania znacznika w mózgu i piersiowym rdzeniu kręgowym. Statystyki wykonane za pomocą testu t-Studenta (*: p < 0,0332). Skróty: PET = Pozytonowa tomografia emisyjna; ROI = regiony zainteresowania; OUN = ośrodkowy układ nerwowy; CT = tomografia komputerowa; %ID/g = procent wstrzykniętej dawki na gram tkanki; EAE = eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie mózgu i rdzenia kręgowego. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5: Reprezentatywna kwantyfikacja liczenia ex vivo gamma w różnych narządach u EAE i niedoświadczonych myszy wyrażona jako %ID/g. Po skanowaniu PET myszy poddano perfuzji PBS w celu usunięcia radioznacznika obecnego we krwi, wolnego lub związanego z rezydującymi we krwi komórkami B CD19 ⁺, a narządy szybko wypreparowano i zważono, aby uzyskać dokładną wagę każdego narządu. Wiązanie znacznika jest znacznie zmniejszone w śledzionie i szpiku kostnym u myszy EAE w porównaniu z myszami nieleczonymi. Zwiększone wiązanie radioznacznika obserwuje się zarówno w odcinkach lędźwiowych, jak i szyjnych/piersiowych rdzenia kręgowego myszy EAE. Mózg nie wykazuje znaczącego wzrostu sygnału radioznacznika, chociaż ma tendencję do znacznego wzrostu. Statystyki wykonane za pomocą testu t-Studenta (*: p < 0,0332; ****: p < 0,0001). Skróty: PET = Pozytonowa tomografia emisyjna; %ID/g = procent wstrzykniętej dawki na gram tkanki; EAE = eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie mózgu i rdzenia kręgowego; PBS = sól fizjologiczna buforowana fosforanami. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 6: Obrazy ex vivo ARG pokazują ⁶⁴wiązania Cu-DOTA-hCD19-mAb w strzałkowych odcinkach mózgu i całych rdzeniach kręgowych z EAE w porównaniu z naiwnymi myszami. Cyfrowe folie do przechowywania luminoforu zeskanowano za pomocą imagera luminoforowego po wystawieniu na działanie radioaktywnych próbek tkanek przez około 10 okresów półtrwania (127 godzin lub 5 dni). Uzyskane obrazy ujawniają wizualnie wyższy sygnał w mózgu myszy EAE w porównaniu z sekcjami mózgu myszy naiwnych, co jest oczekiwane ze względu na regiony, o których wiadomo, że zawierają komórki B w tym modelu⁵. W szczególności występuje zwiększony sygnał znacznikowy w pniu mózgu, móżdżku i komorach sekcji mózgu myszy EAE. Ten wzrost sygnału dla odcinków mózgu myszy EAE odzwierciedla to, co znaleziono w kwantyfikacji PET całego mózgu opisanej powyżej. Podobnie, obserwuje się wzrost wiązania radioznacznika zarówno w odcinku szyjnym/piersiowym, jak i lędźwiowym rdzenia kręgowego w porównaniu z wcześniejszymi rdzeniami kręgowymi, co odzwierciedla to, co stwierdzono za pomocą liczenia promieni gamma ex vivo. Skróty: PET = Pozytonowa tomografia emisyjna; EAE = eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie mózgu i rdzenia kręgowego; Wentylacja = komory; Cb = móżdżek; BS = pień mózgu; TSc = rdzeń kręgowy klatki piersiowej i szyjki macicy łącznie; LSc = lędźwiowy rdzeń kręgowy. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek uzupełniający S1: Barwienie tkanek OUN naiwnej i EAE tkanki mózgowej myszy za pomocą CD45R/B220. Limfocyty B obserwuje się w pniu mózgu, oponach mózgowych i istocie białej myszy EAE (n = 7 EAE, n = 5 myszy nieleczonych, średnio cztery plastry na zwierzę). Ten rysunek pochodzi z ⁵. Podziałka = 5 mm (małe powiększenie [1x]) w strzałkowych obrazach mózgu, 100 μm (duże powiększenie [20x]) w pniu mózgu, oponach mózgowych i istocie białej móżdżku. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

W tym artykule opisano uproszczoną metodę obrazowania ludzkich komórek B CD19 ⁺ w mysim modelu stwardnienia rozsianego przy użyciu CD19-PET. Ze względu na niejednorodny obraz stwardnienia rozsianego i różne odpowiedzi na leczenie, zarządzanie nim w klinice może być trudne i bardzo potrzebne są nowe podejścia do wyboru i monitorowania terapii. Obrazowanie PET może służyć jako potężne narzędzie do monitorowania postępu choroby i indywidualnej odpowiedzi na terapię zubożającą limfocyty B. Oprócz stwardnienia rozsianego, obrazowanie CD19-PET może być stosowane do monitorowania wyczerpania komórek B po leczeniu w podtypach chłoniaków i białaczki lub innych chorób zależnych od komórek B. Ten protokół i reprezentatywne dane pokazują użyteczność obrazowania limfocytów B w chorobach neurologicznych.

Do badania ludzkich limfocytów B CD19 ⁺ w kontekście stwardnienia rozsianego wybraliśmy zależny od limfocytów B MOG_1-125 EAE model⁷. Podobnie jak inne modele EAE, model ten objawia się objawami postępującego paraliżu i infiltracji komórek odpornościowych do OUN. Jednak model MOG_1-125 jest wyjątkowy, ponieważ jest modelem sterowanym przez limfocyty B: myszy zawierają różną liczbę komórek B w przestrzeni podpajęczynówkowej w oponach mózgowych, pniu mózgu, miąższu i komorach. Limfocyty te mogą być słabo rozproszone w tych regionach i/lub tworzyć struktury podobne do pęcherzyków, które obserwuje się również u ludzi ze stwardnieniem^{rozsianym 8,9}. Oprócz używania naiwnych myszy jako kontroli, można użyć kompletnego zestawu do indukcji adiuwanta Freunda (CFA) (tj. identycznej emulsji indukcyjnej do tego, którą podaje się myszom EAE bez białka MOG). W mysim modelu EAE bariera krew-mózg (BBB) jest dysfunkcyjna i umożliwia przekraczanie większych jednostek, takich jak przeciwciała. Radioznacznik CD19-mAb zwiąże się i pozostanie w OUN tylko wtedy, gdy obecne są komórki B; znacznik będzie krążył z powrotem do puli krwi, jeśli limfocyty B nie są obecne. Wykazaliśmy to za pomocą zliczania promieniowania gamma i autoradiografii ex vivo tkanek OUN poprzez perfuzję przed pomiarem poziomu radioaktywności w tkankach. Wykazaliśmy to również we wcześniejszych publikacjach informujących o zastosowaniu radioznaczników PET opartych na mAb (tj. Metod obrazowania immunoPET) do wykrywania komórek B w OUN ^1,2.

Chelator DOTA został użyty, ponieważ był stosowany w klinicznym obrazowaniu PET z peptydami i przeciwciałami znakowanymi miedzią-64, a naszym celem jest translacja hCD19-mAb do obrazowania klinicznego pacjentów ze stwardnieniem rozsianym. DOTA ma odpowiednie powinowactwo wiązania do miedzi-64 in vivo. Stabilność in vivo jest bardzo ważna, ponieważ wolne ⁶⁴Cu trafia do wątroby i może zaciemniać sygnał związanego radioznacznika; Dlatego ważne jest, aby zmierzyć sygnał w wątrobie, aby obliczyć względny sygnał w porównaniu z innymi narządami. Mięśnie są zwykle traktowane jako tkanka kontrolna, ale w przypadku EAE w mięśniach może występować stan zapalny. Okres półtrwania ⁶⁴Cu wynosi 12,7 h, co daje wystarczająco dużo czasu na związanie się DOTA-hCD19-mAb z celem, zapewniając jednocześnie możliwość pomiaru sygnału przez PET. Podczas przygotowywania koniugatu należy przeprowadzić reakcje testowe na małą skalę (75-125 μg) w celu określenia ilości DOTA, którą należy dodać do mAb, aby uzyskać pożądany stosunek DOTA/mAb (np. reakcja 6-10-krotnego nadmiaru estru DOTA-NHS na mol mAb może dać koniugat 1-2 DOTA/mAb). Czas reakcji i temperatura (np. 2-4 godziny lub noc w temperaturze 4 °C lub temperaturze pokojowej) również wpływają na stosunek DOTA/mAb i powinny być zoptymalizowane. Można przeprowadzić miareczkowanie nieradioaktywną miedzią w celu obliczenia liczby DOTA na mAb; jednak zalecamy wykonanie MALDI-MS i/lub LC-MS w celu uzyskania bardziej wiarygodnych i dokładnych wyników.

Obliczony stosunek DOTA/mAb jest średnią wartością dla konkretnej próbki i oczekuje się pewnej zmienności. W przypadku MALDI pobiera się kilka dawek na próbkę dla sprzężonych i niesprzężonych mAb. Następnie obliczamy stosunek sprzężonych do niesprzężonych, aby określić średnią liczbę DOTA/mAb. Stosunek DOTA/mAb jest ważny, ponieważ zbyt wiele chelatorów zakłóci wiązanie przeciwciał, a zbyt mała doprowadzi do niespójnego znakowania radioaktywnego i niskiego sygnału. Stosunek między partiami koniugatu powinien być bardzo zbliżony, aby utrzymać stałą intensywność sygnału i kinetykę wiązania; Idealnie byłoby, gdyby ta sama partia koniugatu była używana do wszystkich eksperymentów w ramach danego badania. Obiecującą techniką zmniejszania potencjalnego wpływu na immunoreaktywność z powodu możliwej nadmiernej koniugacji jest zastosowanie koniugacji specyficznej^{dla miejsca 10} , w której koniugacja chelatora jest selektywna miejscowo na glikanach łańcucha ciężkiego przeciwciała, gwarantując w ten sposób dodanie 1 chelatora na mAb.

Warunki reakcji znakowania radioaktywnego powinny być zoptymalizowane, aby zapewnić najwyższą skuteczność znakowania i wydajność, ponieważ różnice między innymi w przeciwciałach, stosunku DOTA/mAb i aktywności molowej ⁶⁴Cu będą miały wpływ na znakowanie radioaktywne. Zastosowanie optymalnego stosunku ^{koniugatu 64}Cu do mAb może pozwolić na użycie radioznacznika bez oczyszczania, skracając czas potrzebny do znakowania radioaktywnego i strat spowodowanych przepływem grawitacyjnym i rozpadem promieniotwórczym. Stałą i wiarygodną aktywność molową można również osiągnąć, gdy stosuje się ten sam stosunek koniugatu ⁶⁴Cu do mAb, co jest szczególnie ważne przy porównywaniu wyników w wielu kohortach myszy lub badaniach obrazowych. Warunki ITLC mogą być również modyfikowane w celu dopasowania do każdego użytkownika. Jeżeli konieczne jest oczyszczanie, należy zachować podwielokrotność do spektrofotometrii HPLC i/lub UV/Vis, aby można było obliczyć aktywność molową.

Należy zauważyć, że stosowanie przeciwciał znakowanych radioaktywnie do obrazowania może być trudne. Istotne jest, aby przeciwciało użyte w radioznaczniku było biologicznie obojętne, aby nie wywoływało efektu fizjologicznego. Ponadto, ponieważ przeciwciała długo przebywają we krwi, należy czekać wystarczająco długo na krążenie, wiązanie i klirens danego mAb, aby zapewnić odpowiedni sygnał do tła bez pogorszenia jakości obrazu. Zazwyczaj wystarczające jest odczekanie 20-48 godzin na mAb znakowane ⁶⁴Cu, ale należy obrazować po 2, 4, 6, 12, 24, 48 godzinach od wstrzyknięcia podczas oceny nowego znacznika mAb PET, aby określić najlepszy punkt czasowy do obrazowania w danym modelu gryzoni. To samo dotyczy pozyskiwania obrazów ARG o najwyższym stosunku sygnału do tła. Reprezentatywne obrazy w tym protokole zostały wykonane po 18-20 godzinach od wstrzyknięcia, chociaż można użyć innych punktów czasowych w zależności od użytego radioizotopu. Różne przeciwciała wiążące się z różnymi epitopami CD19 dają różne wyniki i powinny być rygorystycznie scharakteryzowane.

Podczas analizy sygnału rdzenia kręgowego ważne jest, aby ułożyć myszy na plecach w łóżku skanującym, aby zmniejszyć ruch spowodowany oddychaniem. Dodatkowo ułożenie na plecach może pomóc wyprostować kręgosłup u myszy, które mają zwiększoną krzywiznę kręgosłupa z powodu postępu choroby EAE. Innym ważnym aspektem, który należy wziąć pod uwagę, dążąc do wykrycia sygnału w kręgosłupie i rdzeniu kręgowym, jest unikanie wstrzykiwania MOG_1-125 w bok, ponieważ miejsca wstrzyknięcia mogą wiązać znacznik ze względu na związaną odpowiedź immunologiczną w tych obszarach. Bliskie sąsiedztwo miejsca wstrzyknięcia może zakłócać analizę rdzenia kręgowego; W związku z tym wstrzyknięcia w klatkę piersiową są preferowane w przypadku zastosowania opisanego w niniejszym dokumencie.

Zastosowane techniki analizy obrazu są specyficzne dla obrazowania OUN. Narzędzie do tworzenia atlasu mózgu w oprogramowaniu do analizy obrazu zapewnia powtarzalne i wiarygodne wyniki, o ile rejestracja PET i CT jest dokładna. Korzystanie z półautomatycznego atlasu mózgu 3D i dostosowywanie go do czaszki każdej myszy pozwala na uzyskanie spójnego zwrotu z inwestycji między zwierzętami. Ponieważ obecnie nie ma zautomatyzowanego lub półautomatycznego podejścia do analizy sygnału w rdzeniu kręgowym, należy ręcznie narysować zwrot z inwestycji. Warto zauważyć, że przy ilościowym określaniu komórek B CD19 ⁺ (lub dowolnego typu komórek obecnych zarówno w szpiku kostnym, jak i rdzeniu kręgowym) bardzo ważne jest wyeliminowanie sygnału powstającego z kręgosłupa i szpiku kostnego w jak największym stopniu. Powodem tego jest to, że wiadomo, że myszy naiwne zawierają więcej komórek B CD19 ⁺ w szpiku kostnym niż myszy EAE, u których komórki B opuszczają obrzeża, aby infiltrować OUN ^5,11. Ten sygnał szpiku kostnego może przesłaniać prawdziwy sygnał w rdzeniu kręgowym.

Aby określić prawdziwy sygnał rdzenia kręgowego przy jednoczesnym zminimalizowaniu udziału sygnału z kręgosłupa i szpiku kostnego, można użyć progowania Otsu obrazu CT w celu uzyskania niezmiennego zwrotu z inwestycji dla kręgosłupa. Oddzielny ROI rdzenia kręgowego można wtedy łatwo narysować w obrębie kręgosłupa. Tę samą technikę można również zastosować do pomiaru szpiku kostnego w kości udowej. Jest to bardzo przydatna metoda uzyskiwania wglądu w wiązanie znaczników w rdzeniu kręgowym. Jednak ze względu na stosunkowo niską rozdzielczość przestrzenną PET i problemy związane z efektem częściowej objętości podczas skanowania małych obszarów anatomicznych myszy, zastosowanie dodatkowych technik potwierdzających ex vivo (np. Zliczanie promieniowania gamma, ARG) umożliwia walidację wiązania radioznacznika w rdzeniu kręgowym bez obecności krwi, płynu mózgowo-rdzeniowego lub sygnału rozlewającego się z kręgosłupa.

Sygnał w rdzeniu kręgowym szyjnym / piersiowym ma tendencję do różnicowania się u myszy EAE w zależności od ciężkości choroby i liczby limfocytów B naciekających podczas adaptacyjnej odpowiedzi immunologicznej. Ta różnica w liczbie naciekających komórek B, a także niewielka ilość komórek B w OUN w porównaniu z tymi w szpiku kostnym miednicy/rdzenia kręgowego nieleczonych myszy, może utrudnić ilościowe określenie tkanki rdzenia kręgowego in vivo u myszy. Biorąc pod uwagę rozdzielczość przestrzenną PET w obrazowaniu małych zwierząt, sygnał ze szpiku kostnego może rozlać się na sygnał rdzenia kręgowego. Wykonana tutaj biodystrybucja ex vivo i autoradiografia pomagają w walidacji sygnału PET kręgów w porównaniu z tkanką rdzenia kręgowego. Myszy są poddawane perfuzji przed sekcją w celu usunięcia niezwiązanego znacznika z puli krwi, tak aby wyniki zliczania promieniowania gamma i autoradiografii odzwierciedlały znacznik, który jest faktycznie związany w każdym narządzie, a nie znacznik, który znajduje się w puli krwi w tym narządzie.

Radioznaczniki krążą we krwi, a w przypadku znaczników przeciwciał często niezwiązany radioznacznik jest obecny we krwi przez kilka tygodni po pierwszym wstrzyknięciu. Ponieważ obrazujemy mózg i rdzeń kręgowy, które mają wiele naczyń krwionośnych, ważne jest, aby zrozumieć, która część sygnału jest naprawdę spowodowana wiązaniem znacznika w mózgu / tkance będącej przedmiotem zainteresowania, a która jest obecna w puli krwi. W związku z tym konieczne jest podzielenie sygnału mózgowego przez sygnał w puli serca/krwi. W warunkach klinicznych do oceny ilościowej można zastosować te same techniki analizy obrazu progów Otsu kręgów i ROI tkanek rdzenia kręgowego. Biorąc pod uwagę większą objętość tkanek u ludzi w porównaniu z myszami, wpływ efektów objętości częściowej powinien być znacznie mniejszy, co prowadzi do poprawy dokładności i eliminuje potrzebę stosowania technik ex vivo w celu potwierdzenia wyników in vivo . Zastosowanie PET w klinice pozwoli klinicystom na spersonalizowanie terapii dla każdego pacjenta w zależności od indywidualnego obciążenia komórkami B.

ARG jest szczególnie przydatny do pozyskiwania obrazów o wysokiej rozdzielczości, aby umożliwić dokładniejsze określenie przestrzennej lokalizacji wiązania znacznika w małych obszarach, takich jak pień mózgu i móżdżek. Te same skrawki i/lub sąsiednie sekcje można zachować do barwienia immunohistochemicznego w celu potwierdzenia obecności limfocytów B. Wcześniej wybarwiliśmy tkanki OUN CD45R / B220 (rysunek uzupełniający S1), aby skorelować liczbę komórek B z sygnałem PET i ARG ^5,9. Barwienie można następnie porównać przestrzennie z wynikami ARG w celu sprawdzenia, czy sygnał radioznacznika pasuje do wzorca barwienia. Limfocyty B mogą być obecne w skupiskach lub dyfuzyjnie w całym pniu mózgu; Czułość PET jest wystarczająco wysoka, aby zmierzyć sygnał, co jest zachęcające do translacji klinicznej. W przypadku rdzenia kręgowego ARG usunięcie rdzenia kręgowego z kręgów zapewnia, że mierzony sygnał jest spowodowany wiązaniem znacznika w tkance rdzenia kręgowego, a nie w szpiku kostnym i/lub krwi, co może zaciemniać obrazy PET z powodu częściowego wpływu objętości.

Podobnie jak w przypadku ARG, zliczanie promieniowania gamma ex vivo umożliwia ilościowe określenie sygnału radioaktywnego w poszczególnych narządach. W przypadku tej konkretnej techniki ważne jest, aby zmierzyć mokrą masę tkanek i upewnić się, że znajdują się one na dnie odpowiednich probówek przed umieszczeniem probówek w liczniku gamma. Probówki muszą być oznaczone numerem myszy i tkanką, tak aby używana była właściwa probówka; Probówkę następnie waży się na skalibrowanej wadze, a narządy umieszcza się z dokładnością do jednej dziesiątej mikrograma (0,0001 mg). Niektóre tkanki są bardzo małe, a różnica w masie probówki przed i po będzie rzędu 0,0001 mg. Tkanki należy zważyć natychmiast po sekcji, aby zapobiec utracie wilgoci, co skutkuje mniejszą masą. Po zważeniu rurki mózgowe i rdzenia kręgowego należy wypełnić PBS, aby zapobiec wysuszeniu przed zamrożeniem tych tkanek do ARG.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
0,5 ml 50 kDa MWCO Filtr odśrodkowy	MiliporeSigma	UFC505008	filtr odśrodkowy
64Cu-CuCl3	Uniwersytet Waszyngtoński w St. Louis; Uniwersytet Wisonsin, Madison; lub innego dostawcy
AR-2000 Skaner obrazowania radiowego TLC	Eckert & Kaseta autoradiograficzna Ziegler	AR-2000
	Cole Palmer	EW-21700-34	Aluminiowa, 8" x 10"
Film autoradiograficzny	GE Life Sciences	28-9564-78	Przechowywanie ekranu fosforowego BAS-IP SR 2025 E Super rozdzielczość, 20 x 25 cm, tylko ekran
Cewnik igłowy motylkowy	SAI Technologie infuzyjne	BLF-24
DOTA-NHS-ester	Makrocykliczny	B-280
EAE	Hooke Laboratories	EK-2160
Licznik Geigera	Ludlum	14C
Skaner GNEXT PET/CT	Sofie	GNEXT
Hidex Automatyczny licznik gamma	Kolumna Hidex	AMG
HPLC	Phenomenex	00H-2146-K0	5 μ m SEC-s3000 400 & Aring;, 300 x 7,8 mm
Illustra NAP-5	kolumna Cytiva	17085301	Kolumna grawitacyjna DNA
Obraz J	NIH		ARG
Probówki do zbierania o niskim poziomie wiązania białek (1,5 ml)	Spektrofotometr Thermo Scientific	PI90410
NanoDrop Lite	Termo Scientific	840281400	Mikro/nanospektrofotometr UV-Vis
Probówki PCR 0,2 ml, do		Eppendorf
Typhoon klasy DNA 9410	GE Healthcare	8149-30-9410
VivoQuant	Invicro	w wersji 4 z łatką 3	należy zakupić dodatek do atlasu mózgu
Kolumny odsalające Zeba Spin, 7K MWCO, 0,5 mL	Thermo Scientific	PI89882	Kolumna odsalająca