Izolacja, charakterystyka i zastosowanie terapeutyczne pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z hodowanych ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych

Summary

Obecny protokół opisuje wirowanie różnicowe w celu izolowania i charakteryzowania reprezentatywnych EV (egzosomów i mikropęcherzyków) z hodowanych ludzkich MSC. W tym artykule wyjaśniono również dalsze zastosowania tych pojazdów elektrycznych.

Abstract

Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EVs) to heterogeniczne nanocząsteczki błonowe uwalniane przez większość typów komórek, coraz częściej uznawane za fizjologiczne regulatory homeostazy organizmu i ważne wskaźniki patologii; w międzyczasie pojawia się ich ogromny potencjał do tworzenia dostępnych i kontrolowanych terapii chorób. Mezenchymalne komórki macierzyste (MSC) mogą uwalniać duże ilości EV w hodowli, co daje nadzieję na rozpoczęcie skutecznej regeneracji tkanek i ułatwienie szerokich zastosowań terapeutycznych o dobrej skalowalności i odtwarzalności. Rośnie zapotrzebowanie na proste i skuteczne protokoły zbierania i stosowania MSC-EV. W tym miejscu przedstawiono szczegółowy protokół oparty na wirowaniu różnicowym w celu wyizolowania i scharakteryzowania reprezentatywnych EV z hodowanych ludzkich MSC, egzosomów i mikropęcherzyków do dalszych zastosowań. Zdolność adaptacyjna tej metody jest wykazywana w przypadku szeregu dalszych podejść, takich jak znakowanie, przeszczep miejscowy i wstrzyknięcie ogólnoustrojowe. Wdrożenie tej procedury zaspokoi potrzebę prostego i niezawodnego gromadzenia i stosowania MSC-EVs w badaniach translacyjnych.

Introduction

Komórki macierzyste to niezróżnicowane komórki pluripotencjalne o zdolności do samoodnawiania się i potencjale translacyjnym¹. Mezenchymalne komórki macierzyste (MSC) są łatwo izolowane, hodowane, namnażane i oczyszczane w laboratorium, co pozostaje charakterystyczne dla komórek macierzystych po wielu pasażach. W ostatnich latach coraz więcej dowodów potwierdza pogląd, że MSCs działają w trybie parakrynnym w zastosowaniu terapeutycznym^2,3. Zwłaszcza wydzielanie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) odgrywa kluczową rolę w pośredniczeniu w biologicznych funkcjach MSC. Jako heterogeniczne błoniaste nanocząstki uwalniane z większości typów komórek, EV składają się z podkategorii zwanych egzosomami (Exos), mikropęcherzykami (MV), a nawet większymi ciałami apoptotycznymi^4,5. Wśród nich Exos jest najszerzej przebadanym EV o wielkości 40-150 nm, który jest pochodzenia endosomalnego i aktywnie wydzielany w warunkach fizjologicznych. MV powstają w wyniku zrzucania bezpośrednio z powierzchni błony komórkowej o średnicy 100-1 000 nm, które charakteryzują się wysoką ekspresją fosfatydyloseryny i ekspresją markerów powierzchniowych komórek dawcy⁶. EV zawierają RNA, białka i inne bioaktywne cząsteczki, które pełnią podobne funkcje do komórek macierzystych i odgrywają znaczącą rolę w komunikacji komórkowej, odpowiedzi immunologicznej i naprawie uszkodzeń tkanek⁷. MSC-EV zostały szeroko przebadane jako potężne narzędzie terapeutyczne bezkomórkowe w medycynie regeneracyjnej⁸.

Izolacja i oczyszczanie pojazdów elektrycznych pochodzących od MSC jest częstym problemem w dziedzinie badań i zastosowań. Obecnie ultrawirowanie w gradiencie różnicowym i gęstości⁹, proces ultrafiltracji¹⁰, separacja immunomagnetyczna¹¹, chromatograf wykluczenia molekularnego¹², oraz chip mikroprzepływowy¹³ są szeroko stosowanymi metodami izolacji i oczyszczania pojazdów elektrycznych. Biorąc pod uwagę zalety i wady każdego podejścia, ilość, czystość i aktywność zebranych EV nie mogą być spełnione w tym samym czasie^14,15. W niniejszym badaniu szczegółowo przedstawiono protokół wirowania różnicowego izolacji i charakterystyki EV z hodowanych MSC, co przyczyniło się do skutecznego zastosowania terapeutycznego^{16,17,18,19,20}. Kolejnym przykładem jest możliwość dostosowania tej metody do szeregu dalszych podejść, takich jak znakowanie fluorescencyjne, przeszczep miejscowy i wstrzyknięcie ogólnoustrojowe. Wdrożenie tej procedury zaspokoi potrzebę prostego i niezawodnego gromadzenia i stosowania MSC-EV w badaniach translacyjnych.

Protocol

Wszystkie procedury na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Czwartego Wojskowego Uniwersytetu Medycznego i przeprowadzone zgodnie z Przewodnikiem Narodowych Instytutów Zdrowia dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych. Wykorzystano ośmiotygodniowe myszy C57Bl/6 (bez preferencji ani dla samic, ani samców). Kriokonserwowane MSC pochodzące z ludzkiej pępowiny (UCMSC), wykorzystane w niniejszym badaniu, uzyskano ze źródła komercyjnego (patrz tabela materiałów). Wykorzystanie komórek ludzkich zostało zatwierdzone przez Komisję Etyczną IV Wojskowego Uniwersytetu Medycznego.

1. Hodowla ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych (hMSC)

1. Przygotować akcesoria i roztwory wymagane do pracy doświadczalnej, w tym pipety, końcówki do pipet, 10 cm szalkę Petriego, sprzęt termostatyczny (łaźnia wodna), gumowe rękawice, 75% alkohol, pożywkę hodowlaną (inkubowaną w temperaturze 37 °C), śmiertelną surowicę bydlęcą (FBS) i 100-krotny roztwór penicyliny-streptomycyny (P/S) (patrz Tabela materiałów).
2. Przygotuj dostępne na rynku pożywkę alfa-Minimum Essential Medium (α-MEM), uzupełniając 20% FBS i 1% P/S.
   UWAGA: Rozcieńczyć wszystkie roztwory używane do izolacji i analizy pojazdów elektrycznych w ultraczystej filtrowanej wodzie wykonanej przez ultraczysty system oczyszczania wody filtrowanej (patrz Tabela materiałów).
3. Odzyskaj kriokonserwowane ludzkie MSC pochodzące z pępowiny (UCMSC) z ciekłego azotu poprzez stopienie ich w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
4. Szybko i delikatnie przenieść zawiesinę stopionych komórek do probówki o pojemności 15 ml z 5 ml pożywki hodowlanej (krok 1.2). Wirować w temperaturze 4 °C, 500 x g przez 5 min.
5. Usunąć supernatant za pomocą sterylnej pipety i zatrzymać osad komórkowy. Dodać 2 ml pożywki hodowlanej do probówki wirówkowej i delikatnie zawiesić komórki.
6. Umieść komórki na 10-centymetrowej szalce Petriego i dodaj 8 ml pożywki hodowlanej, co daje w sumie 10 ml.
7. Hodowla MSCs w temperaturze 37 °C w 5% CO₂ w inkubatorze komórkowym.

2. Wirowanie różnicowe do izolacji Exos i MV

1. Gdy MSCs osiągną konfluencję >90%, zastąp pożywkę hodowlaną α-MEM uzupełnioną 20% FBS zubożonym w EV i 1% P/S na 8 ml każdej potrawy.
   UWAGA: Odwirować FBS w temperaturze 4 °C, 1,50,000 x >g przez noc, aby usunąć EV i inne zanieczyszczenia.
2. Po 48 godzinach hodowli zebrać pożywkę (krok 2.1) do probówek wirówkowych o pojemności 50 ml.
3. Odwirować pożywkę hodowlaną MSC w temperaturze 4 °C, 800 x g przez 10 minut.
4. Usunąć fragmenty komórek i resztki komórkowe, przenosząc supernatant do czystych probówek stożkowych o pojemności 1,5 ml.
   UWAGA: Użycie stożkowych probówek o pojemności 1,5 ml jest konieczne, aby zwiększyć wydajność EV.
5. Odwirować supernatant w temperaturze 4 °C, 16 000 x g przez 30 minut. Osad składa się z MVs. MV z każdej płytki komórek zawieszono ponownie w 50 μl PBS.
6. Przenieść supernatant otrzymany przez odwirowanie w kroku 2.5 za pomocą pipety do czystych probówek ultrawirówek. Wirować przy 1 50 000 x g przez 2 godziny w temperaturze 4 °C.
7. Wyrzuć supernatant i zbierz pozostałość, którą jest Exos. Zawiesić Exo z siedmiu szalek komórkowych w 50 μl PBS.
   UWAGA: UCMSC z szóstym pasażem służą do izolacji EV. Aby uzyskać wystarczającą ilość MV i egzowirusów do użytku eksperymentalnego, zwykle potrzeba 7-8 szalek z hodowanymi komórkami. Próbki EV są natychmiast wykorzystywane do następujących etapów charakterystyki lub do zastosowania terapeutycznego, którego lepiej nie przechowywać.
   UWAGA: Unikaj wielokrotnego zamrażania i rozmrażania pojazdów elektrycznych, a najlepiej przechowywać je w temperaturze 4 °C w krótkim okresie, a nie w temperaturze -80 °C.

3. Wykrywanie liczby cząstek i rozkładu wielkości EV z MSC

UWAGA: Do oceny rozkładu wielkości, analiza śledzenia nanocząstek (NTA) jest wykonywana przez dostępny na rynku analizator śledzenia nanocząstek (patrz Tabela materiałów).

1. Rozcieńczyć 1 μl EV (z kroku 2.5 i kroku 2.7) w 1,499 μl PBS i wymieszać wystarczającą ilość w probówce o pojemności 15 ml.
2. Obsługuj analizator śledzenia zgodnie z instrukcjami producenta. Najpierw uruchom kompatybilne oprogramowanie (patrz Spis materiałów).
3. Napełnij celę próbki wodą destylowaną, a następnie pozwól przyrządowi rozpocząć sprawdzanie komórki.
4. Skalibruj przyrząd przygotowanym roztworem wzorcowym. Upewnij się, że liczba cząstek wyświetlana w interfejsie wykrywania oprogramowania mieści się w zakresie 50-400 (najlepiej około 200). Kliknij przycisk OK.
   UWAGA: Przygotować roztwór wzorcowy, rozpuszczając 1 μl roztworu kalibracyjnego (patrz tabela materiałów) w 1 ml wody destylowanej w celu wytworzenia roztworu podstawowego, a następnie pobrać 100 μl roztworu podstawowego i dodać 25 ml wody destylowanej w celu przygotowania roztworu wzorcowego (1:250 000). Przechowywać ten odczynnik roboczy w temperaturze 4 °C przez tydzień.
5. Przepłukać próbkę 5 ml wody destylowanej.
6. Przed analizą próbki przepłukać kanał 1 ml wody destylowanej. Upewnij się, że liczba cząstek wyświetlana w interfejsie wykrywania oprogramowania jest mniejsza niż 10.
7. Wstrzyknąć 1 ml próbki EV przygotowanej w kroku 3.1. Wykonaj test pęcherzykowy zgodnie z instrukcją obsługi przyrządu.
   UWAGA: Próbkę i wodę destylowaną wstrzykuje się za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml ze stałą prędkością 0,5 ml/s pod staranną kontrolą ręczną.

4. Charakterystyka morfologii EV za pomocą transmisyjnego mikroskopu elektronowego (TEM)

1. Rozcieńczyć 1 μl EV z kroku 2.7 w 199 μl PBS i wystarczająco wymieszać. Dodaj 20 μl kropli zawieszenia EV do kwadratowej siatki pokrytej formvarem/węglem (patrz tabela materiałów) i pozostaw na 3 minuty.
2. Usuń nadmiar płynu za pomocą małej bibuły filtracyjnej i pozostaw na 15 sekund, aby lekko wysuszyć powierzchnię.
3. Próbki EV należy barwić ujemnie 1,5% kropelkami kwasu fosfowolframowego przez 40 s.
4. Usuń nadmiar kwasu fosfowolframowego i odstaw na 15 sekund, aby lekko wysuszyć powierzchnię.
5. Umieścić próbkę zawierającą siatkę kwadratową pokrytą formvarem/węglem do czystego naczynia pokrytego bibułą filtracyjną. Obserwuj i rejestruj obrazy za pomocą transmisyjnego mikroskopu elektronowego.
   UWAGA: W tym procesie egzo są brane za przykład.

5. Oznakowanie pojazdów elektrycznych pochodzących od MSC

1. Po ekstrakcji EVs (krok 2.5) ponownie zawiesić z 250 μl PBS w stożkowej probówce o pojemności 1,5 ml.
2. Użyj innej stożkowej probówki o pojemności 1,5 ml do przygotowania roztworu roboczego barwnika PKH26; użyj 1 μl odczynnika do znakowania PKH26 rozcieńczonego 250 μl rozcieńczalnika C (składnik dostępnego na rynku zestawu do znakowania EV używanego w niniejszym badaniu, patrz Tabela materiałów).
   UWAGA: Roztwór roboczy należy przygotować bezpośrednio przed użyciem.
   UWAGA: Nadmierna ilość barwnika PKH26 lub etykietowanie bez wstępnego rozcieńczenia grozi uszkodzeniem pojazdów elektrycznych.
3. Wymieszaj zawieszone EV z roztworem roboczym. Odstawić w temperaturze pokojowej na 5 minut, a następnie dodać 500 μl FBS zubożonego w EV, aby zatrzymać reakcję.
4. W przypadku SN odwirować w temperaturze 4 °C, 16 000 x g przez 30 minut i odrzucić supernatant za pomocą pipety. Dodaj 1 ml PBS, aby spłukać pozostałości.
5. Odwirować w temperaturze 4 °C, 16 000 x g przez 30 minut i odrzucić supernatant w celu usunięcia niezwiązanego barwnika.
6. Zawiesić pozostałość w 200 μl PBS. Upuść 20 μl zawiesiny na szkiełko i obserwuj je pod mikroskopem fluorescencyjnym.
   UWAGA: W tym procesie MV są traktowane jako przykład.

6. Miejscowy przeszczep i ogólnoustrojowe wstrzykiwanie MSC-EVs

UWAGA: Dla następujących procedur, umieść EV na lodzie przed wstrzyknięciem.

1. Wykonaj przeszczep miejscowy, wykonując poniższe czynności.
   1. Znieczulić myszy 4% (obj./obj.) izofluranem. Podczas zabiegu utrzymuj znieczulenie na poziomie 1%-3% izofluranu.
   2. Przed zabiegiem należy podać 5 mg/kg karprofenu (IP) w celu złagodzenia bólu pozabiegowego.
   3. Przed wycięciem rany należy ogolić włosy na grzbiecie i wysterylizować powierzchnię grzbietową, nakładając 3 naprzemienne rundy 10% jodu powidonu i 75% etanolu.
   4. Za pomocą stempla biopsyjnego (patrz Tabela materiałów) utwórz ranę o pełnej grubości o średnicy 1 cm na skórze grzbietowej.
   5. Zawiesić EV pochodzące z MSC z dwóch szalek w 100 μl PBS i podać wstrzyknięcie w warstwę podskórną łożyska rany, wokół każdej rany w czterech miejscach.
      UWAGA: Wstrzykuje się średnio 100 μg EV na mysz (EV z dwóch 10-centymetrowych szalek komórek). Dziesięć 10-centymetrowych szalek MSC jest potrzebnych do uzyskania wystarczającej liczby EV, aby przeprowadzić eksperyment n = 5 w modelu mysim.
   6. Po zabiegu owiń myszy sterylną gazą i umieść je na podkładkach termoizolacyjnych (patrz Tabela materiałów), aż się obudzą.
   7. Upewnij się, że myszy nie są pozostawione bez opieki, dopóki nie odzyskają wystarczającej przytomności. Nie zwracaj myszy do towarzystwa innych zwierząt, dopóki w pełni nie wyzdrowieją.
   8. W razie potrzeby należy podać dodatkowe dawki środka przeciwbólowego w 2. i 3. dniu po operacji.
2. Wykonać wstrzyknięcie ogólnoustrojowe.
   1. Zawiesić EV pochodzące z MSC w 200 μl PBS, a następnie wymieszać z roztworem heparyny w stosunku objętościowym 10:1.
   2. Umieść myszy w systemie obrazowania żył ogonowych (patrz tabela materiałów). Naciśnij przełącznik, aby podnieść dźwignię.
   3. Zdezynfekuj żyłę ogonową za pomocą wacika nasączonego alkoholem przed wstrzyknięciem dożylnym. Następnie należy systematycznie wstrzykiwać myszom zawiesinę przygotowaną w kroku 6.2.1 przez żyłę ogonową. W zabiegu pomaga ilustrator żył ogonowych.
      UWAGA: Zawiesinę EV wstrzyknąć natychmiast po zmieszaniu z heparyną. Wstrzykuje się średnio 100 μg EV na mysz (EV z dwóch 10-centymetrowych szalek komórek). Dziesięć 10-centymetrowych szalek MSC jest potrzebnych do uzyskania wystarczającej liczby EV, aby przeprowadzić eksperyment n = 5 w modelu mysim.
      UWAGA: Iniekcja do żyły ogonowej myszy jest zwykle ograniczona do 200 μl objętości. Wstrzyknięcie powinno przebiegać powoli i zostać przerwane, jeśli zauważysz guzek lub opór, który sugeruje, że igła jest poza żyłą. Jeśli myszy wykazują niepożądane objawy kliniczne, takie jak zwijanie się i drżenie, może to być reakcja szokowa na wstrzyknięcie dużej objętości, szybkie wstrzyknięcie lub toksyczność/anafilaksję.

Results

MV i Exo z hodowanych ludzkich UCMSC są izolowane zgodnie z eksperymentalnym przepływem pracy (Rysunek 1). Wyniki NTA pokazują, że wielkość egzowirusów z ludzkich MSC waha się od 40 nm do 335 nm z rozmiarem piku około 100 nm, a wielkość MV waha się od 50 nm do 445 nm z rozmiarem piku 150 nm (Ryc. 2). Charakterystyka morfologiczna egzoenzymów pochodzących z MSC wykazuje typowy kształt miseczki (Ryc. 3). Pojazdy elektryczne są skutecznie znakowane przez ...

Discussion

Pojawiają się EV, które odgrywają ważną rolę w różnych działaniach biologicznych, w tym w prezentacji antygenu, transporcie materiału genetycznego, modyfikacji mikrośrodowiska komórkowego i innych. Ponadto ich szerokie zastosowanie przynosi nowe podejścia i możliwości w diagnozowaniu i leczeniu chorób²¹. Implementacja terapeutycznych zastosowań EV opiera się na udanej izolacji i charakterystyce. Jednak ze względu na brak ustandaryzowanych metod izolacji i oczyszczania oraz niską wydajność ekstrakc...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% powidon-jod (Betadine)	Weizhenyuan	10053956954292	Dezynfekcja ran
Roztwór kalibracyjny	Particle Metrix	110-0020	Kalibracja instrumentu NTA
Carprofen	Sigma	53716-49-7	Lek przeciwbólowy
Obrazowanie żył ogonowych	KEW Life Science	KW-XXY	Wirówka do obrazowania żył ogonowych
	Eppendorf	5418R	Wirowanie
Śmiertelna surowica bydlęca	Corning	35-081-CV	Hodowla UCMSC
siatce kwadratowej powlekanej farbą/węglem	Nauka	24916-25	Transmisyjny mikroskop elektronowy
Poduszka grzewcza	Zhongke Life Science	Z8G5JBMz	Opieka pozabiegowa zwierząt
Roztwór heparyny	StemCell	7980	Wstrzyknięcie ogólnoustrojowe
Izofluran	RWD Life Science	R510-22	Znieczulenie zwierząt
Minimum Niezbędne podłoże Alpha basic (1x)	Gibco	C12571500BT	Kultura UCMSC
Analizator śledzenia	nanocząstek Particle Metrix	ZetaView PMX120	Analiza śledzenia nanocząstek
PBS (1x)	Meilunbio	MA0015	Ponowne zawieszenie EVs
Penicylina/Streptomycyna	Procell Nauki przyrodnicze	PB180120	Hodowla UCMSC
Kwas fosfowolframowy	Solarbio	12501-23-4	Transmisyjny mikroskop elektronowy
Pipeta	Eppendorf	3120000224
PKH26 Zestaw łącznika komórek czerwonej fluorescencji	Sigma-Aldrich	MINI26	Etykietowanie EVs
Dziurkacz do biopsji skóry	Acuderm	69038-10-50	Wady skóry
Oprogramowanie ZetaView	Particle Metrix	Wersja 8.05.14 SP7
Sprzęt termostatyczny	Grant	v-0001-0005	Łaźnia wodna
Transmisyjny mikroskop elektronowy	HITACHI	HT7800	Transmisyjny mikroskop
elektronowy UCMSC	Bai'ao	UKK220201	Komercyjnie UCMSC
Ultrawirówka	Beckman	XPN-100	Wirowanie
System oczyszczania wody filtrowanej ultraczystej	Milli-Q	IQ 7000	Przygotowanie wody ultraczystej