Artykuł metodologiczny

Awersyjne uczenie się asocjacyjne i tworzenie pamięci poprzez połączenie dwóch substancji chemicznych w Caenorhabditis elegans

DOI:

10.3791/64137

⸱

23 czerwca 2022

 ,  , 
1Information Processing Biology Unit, Okinawa Institute of Science and Technology Graduate University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wcześniej opracowaliśmy protokoły dla Caenorhabditis elegans do tworzenia krótko- i długoterminowych wspomnień asocjacyjnych odpowiednio poprzez trening masowy i rozłożony w odstępach. Tutaj opisano szczegółowe protokoły warunkowania C. elegans poprzez parowanie 1-propanolu i kwasu solnego jako bodźców uwarunkowanych i bezwarunkowych, odpowiednio, w celu utworzenia awersyjnej pamięci asocjacyjnej.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nicień Caenorhabditis elegans jest atrakcyjnym organizmem modelowym do badania uczenia się i pamięci na poziomie molekularnym i komórkowym ze względu na prostotę jego układu nerwowego, którego schematy połączeń chemicznych i elektrycznych zostały całkowicie zrekonstruowane z seryjnych mikrofotografii elektronowych cienkich przekrojów. Tutaj opisujemy szczegółowe protokoły warunkowania C. elegans poprzez zmasowany i rozłożony trening w celu tworzenia odpowiednio pamięci krótkotrwałej (STM) i pamięci długotrwałej (LTM). Łącząc 1-propanol i kwas solny jako odpowiednio bodźce warunkowe i bezwarunkowe, C. elegans został z powodzeniem wyszkolony do tworzenia awersyjnych asocjacyjnych STM i LTM. Podczas gdy naiwne zwierzęta były przyciągane do 1-propanolu, wyszkolone zwierzęta nie były już lub bardzo słabo przyciągane do 1-propanolu. Podobnie jak w przypadku innych organizmów, takich jak Aplysia i Drosophila, "geny uczenia się i pamięci" odgrywają istotną rolę w tworzeniu pamięci. W szczególności receptory glutaminianu typu NMDA, wyrażane tylko w sześciu parach interneuronów u C. elegans, są wymagane do tworzenia zarówno STM, jak i LTM, prawdopodobnie jako czynnik koincydencji. W związku z tym ślad pamięciowy może znajdować się wśród interneuronów.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nauka i pamięć są niezbędne dla przetrwania i rozmnażania zwierząt poprzez efektywne poruszanie się w zmieniającym się środowisku. C. elegans jest atrakcyjnym organizmem modelowym do badania uczenia się i pamięci na poziomie molekularnym i komórkowym ze względu na prostotę jego układu nerwowego, którego schematy połączeń chemicznych i elektrycznych zostały całkowicie zrekonstruowane z szeregowych mikrofotografii elektronowych cienkich przekrojów1,2,3.

C. elegans uczy się kojarzyć temperaturę uprawy z głodem i migruje z dala od temperatury wzrostu z awersyjną pamięcią trwającą kilka godzin4,5. Kondycjonowanie C. elegans chlorkiem sodu (NaCl) przy braku pożywienia prowadzi do zmniejszenia chemotaksji w kierunku NaCl6,7,8. W połączeniu z jedzeniem, atrakcyjność butanonu jest zwiększona w wyniku uczenia się apetytywnego9,10,11. Chociaż zjawiska te są interpretowane jako asocjacyjne uczenie się i pamięć10,12, rozróżnienie między uczeniem się asocjacyjnym a nieasocjacyjnym uwrażliwianiem, habituacją i adaptacją nie jest jasne w paradygmacie uczenia się i pamięci C. elegans13,14. Rzeczywiście, zwierzęta kondycjonowane butanonem i deprywacją pokarmową (warunkowanie awersyjne) wykazywały depresyjne sprzężenie butanonowego neuronu czuciowego AWCON z neuronami docelowymi za pomocą sygnałów insulinowych z innych neuronów, w tym interneuronów AIA, podczas gdy zwierzęta kondycjonowane butanonem i jedzeniem (warunkowanie apetytywne) wykazywały zwiększone sprzężenie AWCON z neuronami docelowymi15. Sygnalizacja insuliny powoduje zmiany ekspresji genów indukowane przez jądrowy EGL-4 i inne regulatory transkrypcji16,17. Tak więc to awersyjne i apetytywne uczenie się i pamięć ma analogie odpowiednio z nieasocjacyjnym habituowaniem i uwrażliwianiem presynaptycznych neuronów czuciowych w odruchu wycofania skrzeli w Aplysia18,19.

Łącząc dwie substancje chemiczne jako bodziec warunkowy (CS) i bodziec bezwarunkowy (US), my i inni opracowaliśmy protokoły warunkowania C. elegans w celu tworzenia asocjacyjnego uczenia się i pamięci bez użycia jedzenia lub głodu, jak US20,21,22,23. W niniejszym badaniu protokoły są modyfikowane w celu kondycjonowania zwierząt za pomocą 1-propanolu i kwasu solnego (HCl, pH 4,0) jako CS i US, odpowiednio, dla awersyjnego uczenia się i pamięci krótkotrwałej (STM) oraz pamięci długotrwałej (LTM). Naiwny C. elegans jest przyciągany przez 1-propanol24 i odpychany przez acid25. Po kondycjonowaniu mieszaniną 1-propanolu i HCl (pH 4,0), C. elegans nie był już lub bardzo słabo przyciągany do 1-propanolu.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przepisy

  1. Płytki agarowe NGM (krok 2.1.)
    1. Aby przygotować 6 cm płytki NGM, rozpuść 2,5 g peptonu, 3 g NaCl i 17 g agaru w 850 ml podwójnie dejonizowanego H2O (ddH2O). Doprowadzić całkowitą objętość do 972 ml za pomocą ddH2O.
    2. Po autoklawowaniu schłodzić do ~65 °C i dodać 1 ml 5 mg/ml cholesterolu rozpuszczonego w etanolu, po 1 ml 1 M CaCl2 i 1 MMgSO4 oraz 25 ml 1 M fosforanu potasu (pH 6,0). Po dokładnym wymieszaniu dozuj po 8 ml na szalki Petriego o średnicy 6 cm.
    3. Przechowuj talerze z pokrywkami na ławce w temperaturze pokojowej (RT) przez 1 dzień, a następnie przechowuj je w plastikowych naczyniach w chłodnym pomieszczeniu do czasu użycia.
  2. Przygotować pożywkę Luria-Bertani (LB) (krok 2.1.), rozpuszczając 10 g tryptonu, 5 g ekstraktu drożdżowego i 10 g NaCl w 1 l ddH2O. Dostosować pH do 7,0 za pomocą 5 N NaOH (kilka kropli) i sterylizować w autoklawie.
    1. Przygotuj płytki LB, dodając 15 g agaru do podłoża LB. Po sterylizacji w autoklawie schłodzić do ~60 °C i dozować po 12 ml na szalki Petriego o średnicy 9 cm. Przechowuj talerze w plastikowych naczyniach w chłodnym pomieszczeniu do czasu użycia.
  3. Aby zrobić kolektor dla zwierząt (krok 2.4.), przymocuj nylonową siatkę (rozmiar oczek 30 μm) do dna przezroczystej akrylowej cylindrycznej rury (3,5 cm długości, 3 cm średnicy zewnętrznej, 2 mm grubości ścianki) za pomocą kleju.
  4. Aby przygotować 0,25% wodny roztwór żelatyny (krok 2.4.), rozpuść 0,25 g żelatyny w 100 ml ddH2O. Sterylizuj w autoklawie.
  5. Płytki do oznaczania chemotaksji (krok 5.1.)
    1. Aby przygotować płytki agarowe do testu chemotaksji, rozpuść 15 g agaru w 993 ml ddH2O przez autoklawowanie i schłodzić roztwór do ~65 °C.
    2. Następnie dodać 5 ml autoklawizowanego 1 M fosforanu potasu (pH 6,0), 1 ml 1 M CaCl2 i 1 ml 1 MMgSO4 do roztworu agaru. Wszystkie te roztwory są oddzielnie sterylizowane w autoklawie.
    3. Rozlać 10 ml zmieszanego roztworu na 6-centymetrową szalkę Petriego. Umieść te talerze z pokrywkami na ławce w RT na dwa dni, a następnie połóż je na mokrych ręcznikach papierowych w plastikowych naczyniach w RT do czasu użycia. Płytki te mogą być używane przez okres do 10 dni.
  6. Aby przygotować bufor do oznaczania chemotaksji (krok 5.4), wymieszaj 5 ml 1 M fosforanu potasu (pH 6,0), 1 ml 1 M CaCl2, 1 ml 1 MMgSO4 i 993 ml ddH2O. Oddzielnie wysterylizuj wszystkie te roztwory przez autoklawowanie.
  7. Aby przygotować 40 ml roztworu mieszaniny CS/US (1% wodny 1-propanol i HCl [pH 4,0]) (etap 3.1. i stopień 4.1.), dodać 0,4 ml bezwzględnego 1-propanolu i 4 μl 5 M HCl (0,1 mM przy stężeniu końcowym) do 39,6 ml ddH2O. Roztwór należy utrzymywać w temperaturze pokojowej tonacji.
  8. Aby zrobić ddH2O, należy uzdatnić wodę z kranu 2 razy za pomocą systemów oczyszczania wody (patrz Tabela materiałów).
  9. Przygotować płynną kulturę (OD600 = ~ 0,7) Escherichia coli OP50, zaszczepiając świeżą kolonię wykałaczką w 10 ml pożywki LB i inkubując w temperaturze 37 °C przez 7-8 godzin. Bakterie hodowane przez dłuższy czas mogą wpływać na wynik kondycjonowania, być może z powodu metabolitów wtórnych.

2. Przygotowanie zsynchronizowanych C. elegans

  1. Korzystając ze standardowych metod26, hoduj zwierzęta na 6 cm płytkach NGM (krok 1.1.). Płytki NGM przygotowuje się przez rozprowadzenie 0,2 ml płynnej kultury E. coli OP50 w pożywce LB (patrz krok 1.9.) i inkubację w temperaturze pokojowej nie dłużej niż 24 godziny (stare bakterie mogą wpływać na wynik kondycjonowania).
    UWAGA: Uczenie się i pamięć C. elegans są niezwykle wrażliwe na stresy mechaniczne, chemiczne i temperaturowe. Dlatego zdecydowanie zaleca się hodowlę zwierząt, konserwację wszystkich odczynników, w tym wody, i wykonywanie wszystkich testów w temperaturze pokojowej w temperaturze od 17 °C do 20 °C. Należy unikać fizycznej i mechanicznej stymulacji, takiej jak wirowanie, pipetowanie zgrubne i wirowanie. Świeży 1-propanol należy stosować najpóźniej co 3 miesiące z niewiadomej przyczyny. Co ważne, zwierzęta muszą być hodowane z dużą ilością pożywienia, ponieważ głód może poważnie wpłynąć na wynik kondycjonowania.
  2. W dniu 1 wybierz i umieść pięć dobrze odżywionych zwierząt ciężarnych (umieść więcej zmutowanych zwierząt, które składają jaja powoli) na każdej z czterech 6-centymetrowych płytek NGM za pomocą platynowego zbieracza robaków i pozwól im złożyć ~ 50 jaj przez 3 godziny w RT, aby uzyskać zsynchronizowaną populację dorosłych zwierząt. Zatrzymaj składanie jaj, usuwając zwierzęta rodzicielskie z płytek za pomocą platynowego zbieracza robaków.
    UWAGA: Talerze z nasionami powinny być trzymane w temperaturze pokojowej, aby zminimalizować stres u zwierząt.
  3. Hoduj zwierzęta w RT przez około 5 dni, co jest czasem potrzebnym zwierzętom, aby osiągnęły dojrzałe stadium dorosłe, a nie stadium młodego dorosłego.
    UWAGA: Okres uprawy od 4,5 dnia do 5,5 dnia powinien być dostosowany w zależności od warunków, ponieważ młodsze dorosłe zwierzęta są bardziej wrażliwe na chemikalia stosowane do kondycjonowania niż dojrzałe dorosłe zwierzęta (rysunek uzupełniający 1). Po kondycjonowaniu młodsze dorosłe zwierzęta mogą wykazywać niższe wartości wskaźnika chemotaksji (CI).
  4. Zbierz ~200 dorosłych zwierząt w kolektorze dla zwierząt (patrz krok 1.4.), myjąc każdą płytkę 1 ml 0,25% wodnej żelatyny (krok 1.4.) Ta wodna żelatyna zapobiega przywieraniu zwierząt do powierzchni tworzyw sztucznych, takich jak końcówki pipet.
  5. Umyj zwierzęta w kolektorze za pomocą ddH2O (krok 1.8.), bardzo delikatnie przesuwając kolektor w górę iw dół 2x w ~10 ml ddH2O. Powtórz ten proces 2x więcej (łącznie 3x) z ~10 ml ddH2O każdy, aby zapobiec skażeniu bakteryjnemu.
    UWAGA: Zanieczyszczenie bakteryjne poważnie wpływa na chemotaksję zwierząt.

3. Masowy trening krótkotrwałego uczenia się asocjacyjnego i pamięci

UWAGA: Zobacz Rysunek 1 dla przepływu pracy w masowym treningu.

  1. Delikatnie zanurzyć pojemnik na zwierzęta zawierający ~200 zwierząt w 40 ml mieszaniny 1% 1-propanolu i HCl (pH 4,0 po zmieszaniu z 1-propanolem; patrz krok 1.7.) w naczyniu krystalizującym na ~1 s.
    UWAGA: W przypadku zwierząt kontrolnych zrób to samo, ale zanurz tylko w 1% wodnym roztworze 1-propanolu. Lepiej byłoby traktować zwierzęta z HCl (pH 4,0) tylko jako kolejną kontrolę.
  2. Umyj zwierzęta w kolektorze, bardzo delikatnie zanurzając kolektor 1x w 10 ml ddH2O w studzience 6-dołkowej płytki do hodowli tkankowej.
    UWAGA: Ten etap prania musi być bardzo delikatny i wykonywany tylko 1 raz, ponieważ intensywne pranie może uniemożliwić naukę.
  3. Powtórz kroki 3.1. i 3.2. 10x bez przerwy (interwał między próbami [ITI], 0 min).
    UWAGA: Używaj świeżego ddH2O za każdym razem w RT.
  4. Umieść kolektor na trawniku E. coli OP50 na 6 cm talerzu NGM na 10 minut w temperaturze pokojowej, aby zwierzęta mogły odpocząć.
  5. Umyj zwierzęta w kolektorze za pomocą ddH2O, bardzo delikatnie przesuwając kolektor w górę iw dół 2x w ~10 ml ddH2O. Powtórz ten proces 2x więcej (łącznie 3x) z ~10 ml ddH2O każdy, aby zapobiec skażeniu bakteryjnemu.
  6. Przejdź do testu chemotaksji zgodnie z opisem poniżej (krok 5).

4. Trening rozłożony w czasie dla długotrwałego uczenia się asocjacyjnego i pamięci

UWAGA: Zobacz Rysunek 2 dla rozłożonego przepływu pracy szkoleniowego.

  1. Delikatnie zanurz pojemnik na zwierzęta zawierający ~200 zwierząt w 40 ml mieszaniny 1% 1-propanolu i HCl (pH 4,0 po zmieszaniu z 1-propanolem; patrz krok 1.7.) w naczyniu krystalizującym dla ~1,0 s.
    UWAGA: Zrób to samo z 1% wodnym 1-propanolem tylko jako kontrolą. Lepiej byłoby traktować zwierzęta z HCl (pH 4,0) tylko jako kolejną kontrolę.
  2. Umyć zwierzęta w kolektorze, bardzo krótko zanurzając kolektor 1x w 10 ml ddH2O w studzience 6-dołkowej płytki do hodowli tkankowej.
    UWAGA: To mycie musi być bardzo krótkie, ponieważ intensywne mycie może uniemożliwić naukę.
  3. Umieść kolektor na trawniku E. coli OP50 na płytce agarowej NGM na szalce Petriego o średnicy 6 cm (średnicy) na 10 minut w temperaturze pokojowej, aby zwierzęta mogły odpocząć.
    UWAGA: Ten odpoczynek przez 10 minut jako ITI ma kluczowe znaczenie dla zwierząt w celu konsolidacji wspomnień w celu utworzenia LTM.
  4. Powtórz kroki 4.1.-4.3. 10x.
  5. Umyj zwierzęta w kolektorze za pomocą ddH2O, bardzo delikatnie przesuwając kolektor w górę iw dół 2x w ~10 ml ddH2O, który jest utrzymywany w temperaturze RT. Powtórz ten proces 2x więcej (łącznie 3x) z ~10 ml ddH2O każdy, aby zapobiec skażeniu bakteryjnemu.
  6. Przejdź do testu chemotaksji zgodnie z opisem poniżej (krok 5.).

5. Test chemotaksji

  1. Przygotować płytki agarowe do testu chemotaksji na plastikowych szalkach Petriego o średnicy 6 cm (patrz krok 1.5).
  2. Przenieść zwierzęta w kolektorze (krok 2.5), który umieszcza się na płaskiej powierzchni plastikowej pokrywki szalki Petriego, do probówki mikrowirówkowej o pojemności 2 ml z 1 ml 0,25% wodnej żelatyny za pomocą odpiłowanej końcówki pipety z otworem o średnicy >1 mm (średnica wewnętrzna).
    UWAGA: Ważne jest, aby używać odpiłowanej końcówki pipety, aby zminimalizować naprężenia ścinające u zwierząt.
  3. Usunąć supernatant z probówki po tym, jak zwierzęta osiądą na dnie probówki grawitacyjnie przez ~1 min (nie odwirowywać).
  4. Delikatnie zawiesić zwierzęta w 1 ml buforu do oznaczania chemotaksji (patrz krok 1.6.) i pozostawić je grawitacyjnie na dnie probówki na ~1 minutę (nie wirować). Usunąć jak najwięcej supernatantu przez pipetowanie.
  5. W międzyczasie umieść po przekątnej po 4 μl 5% wodnego 1-propanolu w dwóch miejscach i po 4 μl ddH2O w dwóch innych miejscach w ten sam sposób, jak pokazano na Rysunek 3A. W przypadku testu chemotaksji mutantów, które mają niższą wrażliwość na 1-propanol, należy wykryć wyższe stężenia wodnego 1-propanolu, które skutkują wartościami wskaźnika chemotaksji (CI) ~0,6 naiwnych mutantów, jak pokazano w tabeli uzupełniającej 1.
    UWAGA: Ważne jest, aby zakończyć procedury wykrywania tak szybko, jak to możliwe. Plamka 5% wodnego 1-propanolu, ponieważ 1% wodny 1-propanol jest zbyt słaby, aby przyciągnąć zwierzęta w teście chemotaksji. Natomiast do kondycjonowania należy użyć 1% wodnego 1-propanolu, ponieważ zwierzęta leczone wyższymi stężeniami wodnego 1-propanolu niż 1% wykazują niższe wartości CI.
  6. Umieścić 6 μl porcji zawiesiny zwierzęcej w buforze do testu chemotaksji (krok 5.4.) zawierającym ~60 zwierząt w środku trzech płytek do testu chemotaksji za pomocą odpiłowanej końcówki pipety z otworem ~1,0 mm (średnica wewnętrzna). Usunąć jak najwięcej płynu za pomocą laboratoryjnego do chusteczek, nie dotykając zwierząt i przykryć pokrywką talerza.
    UWAGA: Ważne jest, aby wykonać te procedury tak szybko, jak to możliwe.
  7. Pozwól zwierzętom swobodnie poruszać się po szalce przez 10 minut w temperaturze pokojowej, a następnie przenieś płytkę na szklaną szalkę Petriego na lodzie na 3 minuty, aby zatrzymać chemotaksję. Następnie przechowuj talerz w lodówce, aż policzysz liczbę zwierząt na talerzu.
  8. Policz liczbę zwierząt w czterech sekcjach, z wyjątkiem tych w środkowym okręgu, pod mikroskopem stereoskopowym i oblicz wskaźnik chemotaksji (C.I.) za pomocą równania pokazanego w Rysunek 3B. Na podstawie wartości CI obliczyć wartości indeksu uczenia się (L.I.) jako różnicę między wartością CI zwierząt referencyjnych a wartością CI zwierząt warunkowanych (LI = CI odniesienie- CI uwarunkowane).
    UWAGA: Wartość C.I. dla zwierząt referencyjnych (C.I. reference) jest średnią wartością wartości C.I. dla zwierząt kondycjonowanych wyłącznie 1% wodnym roztworem 1-propanolu.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

C. elegans został uwarunkowany przez masowy trening w celu wytworzenia krótkotrwałej awersyjnej pamięci asocjacyjnej poprzez sparowanie 1% wodnego 1-propanolu i HCl (pH 4,0) jako odpowiednio CS i US. Zgodnie z opisanym powyżej protokołem, zsynchronizowane zwierzęta były hodowane na stole w temperaturze pokojowej 18 °C przez 5 dni i bardzo delikatnie myte 2x ddH2O w temperaturze pokojowej 18 °C. Następnie zwierzęta kondycjonowano mieszaniną 1% wodnego 1-propanolu i HCl (pH 4,0) przez 1 s. Szkoliliśmy również zwierzęta, u których podawano tylkoddH2O, tylko 1% wodny 1-propanol i HCl (pH 4,0) tylko jako referencje. Po kondycjonowaniu zwierzęta zostały umyte 1x ddH2O. Powtórzyliśmy kondycjonowanie 10 razy bez przerwy (bez ITI). Skuteczne kondycjonowanie osiągnięto poprzez powtórzenie procedury od ponad 7 do 10 razy. Warunkowanie więcej niż 10x skutkowało mniej efektywną nauką21. Po treningu zwierzęta odpoczywały na pokarmie bakteryjnym przez 10 minut w temperaturze suchej (18 °C). Po umyciu ddH2O 3x, zwierzęta przeniesiono do probówki mikrowirówkowej przez zawieszenie w 0,25% wodnej żelatynie i osadzono na dnie pod wpływem grawitacji. Po usunięciu supernatantu w jak największym stopniu, zwierzęta delikatnie zawieszono w buforze do oznaczania chemotaksji, a następnie pozostawiono do osadzenia się na dnie probówki za pomocą grawitacji.

Po usunięciu jak największej ilości supernatantu, zawiesina zwierzęca została zauważona na środkowym okręgu płytki testowej chemotaksji, która była utrzymywana w temperaturze 18 °C, a następnie zwierzęta mogły swobodnie poruszać się po płytce przez 10 minut przy temperaturze 18 °C. Wartości C.I. zostały obliczone za pomocą równania pokazanego w Rysunek 3B. Jak pokazano w Rysunek 4A, zwierzęta kondycjonowane mieszaniną 1% 1-propanolu i HCl nie były już przyciągane do 5% 1-propanolu nakrapianego na płytkach agarowych do testu chemotaksji, podczas gdy zwierzęta naiwne i referencyjne były podobnie przyciągane do 5% 1-propanolu. Po zmasowanym treningu (krok 3.) pamięć nie była już obserwowana w ciągu 3 h20. Co więcej, pamięć utworzona przez zmasowany trening była wrażliwa na szok zimna20. Wyniki te pokazują, że C. elegans z powodzeniem utworzył awersyjny STM poprzez zmasowany trening.

Zwierzęta były również warunkowane przez trening rozłożony 10x z 10-minutowym ITI pomiędzy etapami treningu (krok 4.). Podczas ITI kolektor ze zwierzętami umieszczono na trawniku bakteryjnym na 6 cm płytce NGM w temperaturze 18 °C. Zwierzęta kondycjonowane przez trening rozłożony w czasie mieszaniną 1% wodnego 1-propanolu i HCl (pH 4,0) nie były już przyciągane do 5% 1-propanolu w porównaniu ze zwierzętami, którym podawano tylko 1% 1-propanol, Tylko HCl (pH 4,0) lub tylko ddH2O (Rysunek 4B). Po treningu w odstępach czasu zwierzęta zachowywały pamięć przez ponad 12 h20,21. Co więcej, pamięć nie powstawała, gdy zwierzęta były leczone inhibitorami translacji lub transkrypcji i była odporna na szok zimny20,21. W związku z tym C. elegans z powodzeniem utworzył awersyjny LTM poprzez trening w odstępach czasu.

Zbadaliśmy również wpływ mutacji w "genach uczenia się i pamięci" na powstawanie STM i LTM. Gen crh-1 koduje odpowiednio wszechobecne białko wiążące element odpowiedzi cAMP (CREB) czynnika transkrypcyjnego, glr-1 i nmr-1 kodują odpowiednio podjednostki receptora glutaminianu α-amino-3-hydroksylo-5-metylo-4-izoksazolopropionowego (AMPA) i N-metylo-D-asparaginianu (NMDA), a stau-1 koduje dwuniciowe białko wiążące RNA izoformę Staufen. Geny te odgrywają istotną rolę w klasycznym warunkowaniu u C. elegans, Drosophila, Aplysia i myszy. Stosując mieszaninę 1% wodnego 1-propanolu i HCl (pH 4,0), tworzenie STM i LTM zależało od wszystkich genów (Ryc. 5A,B).

figure-results-1
Rysunek 1: Eksperymentalny schemat treningu masowego. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Eksperymentalny schemat treningu w odstępach. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Test chemotaksji i indeks chemotaksji. (A) Schematyczne przedstawienie płytki testowej chemotaksji. Szalki Petriego (o średnicy 6 cm) podzielono na cztery obszary, jak pokazano, a po 4 μl po 5% wodnego 1-propanolu lub ddH2O nakrapiono po przekątnej w dwóch miejscach, w odległości 2 cm od środka. (B) Wartości indeksu chemotaksji obliczono na podstawie równania pokazanego poprzez zliczenie liczby zwierząt w obszarach "a" i "b" po zakończeniu chemotaksji. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Wartości indeksu chemotaksji zwierząt kondycjonowanych chemikaliami. Zsynchronizowane zwierzęta N2 typu dzikiego były kondycjonowane substancjami chemicznymi wskazanymi przez (A) trening zmasowany 10x lub (B) trening rozłożony 10x. Schematy blokowe stosowanych protokołów treningu zmasowanego i rozłożonego w odstępach są pokazane odpowiednio na Rysunek 1 i Rysunek 2. Po kondycjonowaniu zwierzęta mogły swobodnie poruszać się przez 10 minut na 6-centymetrowej płytce agarowej do testu chemotaksji w temperaturze 18 °C. Wartości CI obliczono przy użyciu równania pokazanego w Rysunek 3B. Dane dla tej liczby znajdują się w tabeli uzupełniającej 1. Dane pochodzące od naiwnych zwierząt zostały ponownie wykreślone w obu panelach rysunkowych. Wykres słupkowy przedstawia 1. kwartyl, medianę i 3. kwartyl. Gwiazdki (*P < 0,05) wskazują na statystycznie istotne różnice wyznaczone przez jednoczynnikową ANOVA, a następnie test wielokrotnych porównań Dunnetta. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-5
Rysunek 5: Uczenie się wartości indeksu uwarunkowanych zmutowanych zwierząt. Zsynchronizowane zwierzęta N2 typu dzikiego i zmutowane kondycjonowano mieszaniną 1% wodnego 1-propanolu i HCl (pH 4,0) przez (A) trening masowy 10x lub (B) trening w odstępach 10x. Schematy blokowe stosowanych protokołów treningu zmasowanego i rozłożonego w czasie są pokazane odpowiednio na Rysunek 1 i Rysunek 2. Po kondycjonowaniu zwierzęta mogły swobodnie poruszać się przez 10 minut na 6 cm płytce agarowej w celu przeprowadzenia testu chemotaksji w temperaturze pokojowej 18 °C. Dane dotyczące tej wartości przedstawiono w tabeli uzupełniającej 2. Wykres słupkowy przedstawia 1. kwartyl, medianę i 3. kwartyl. Gwiazdki (*P < 0,05) wskazują na statystycznie istotne różnice wyznaczone przez jednoczynnikową ANOVA, a następnie test wielokrotnych porównań Dunnetta. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek uzupełniający 1: Młode dorosłe zwierzęta są wrażliwe na obróbkę chemiczną. Dzień 4 i Dzień 5 Zwierzęta N2 typu dzikiego po wykluciu były masowo trenowane 10-krotnie z HCl, pH 4,0, bez przerwy, a następnie badano je pod kątem chemotaksji do 5% wodnego 1-propanolu. Pręty to środki ± S.E.M. (n = 19). Gwiazdki (*P < 0,05) wskazują na statystycznie istotne różnice wyznaczone za pomocą dwukierunkowej ANOVA, a następnie testu post hoc Tukeya-Kramera. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Tabela uzupełniająca 1: Dane odpowiadające Rysunek 4. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela uzupełniająca 2: Dane odpowiadające Rysunek 5. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W niniejszym badaniu wszystkie odczynniki były utrzymywane w temperaturze średniej temperatury ~18 °C, a zwierzęta hodowano na ławce w temperaturze pokojowej, aby uniknąć stresu u zwierząt. Ponadto wszystkie procedury eksperymentalne zostały przeprowadzone w RT. Zwierzęta były początkowo hodowane w inkubatorze w temperaturze 20 °C, a następnie kondycjonowane na stole w temperaturze ~24 °C przy użyciu odczynników w temperaturze pokojowej. W tych warunkach wyniki warunkowania były bardzo zróżnicowane. Przy niskiej wilgotności względnej temperatury C. elegans rośnie powoli i powinien być hodowany dłużej niż w temperaturze 20 °C, dopóki zwierzęta nie osiągną dojrzałości, ponieważ młodsze dorosłe zwierzęta są bardziej wrażliwe na substancje chemiczne stosowane do kondycjonowania niż dojrzałe dorosłe zwierzęta i mogą wykazywać niższe wartości CI.

Najważniejszym krokiem dla skutecznego kondycjonowania jest mycie zwierząt ddH2O natychmiast po każdym zabiegu chemicznym. W związku z tym naprężenia mechaniczne i temperaturowe powinny być zminimalizowane poprzez stosowanie odpiłowanych końcówek pipet, utrzymywanie odczynników w temperaturze pokojowej i bardzo delikatne mycie zwierząt poprzez bardzo powolne przesuwanie pojemnika na odczynniki w górę i w dół w ddH2O. Dokładne mycie zwierząt za każdym razem po kondycjonowaniu może wpływać na uczenie się i pamięć. Warunki na płytkach testowych chemotaksji również mają poważny wpływ na wyniki. Zbyt suche lub zbyt mokre talerze uniemożliwiają płynne poruszanie się zwierząt. Talerze zostały przygotowane zgodnie z opisem w kroku 1.; dobra płytka to taka, w której 4 μl plamki ddH, 2O lub 5% wodnego roztworu 1-propanolu są całkowicie wchłaniane przez agar w ciągu około 5 minut po plamieniu. Jak opisano powyżej, wiek zwierząt ma również kluczowe znaczenie dla skutecznego kondycjonowania. Młode dorosłe zwierzęta są wrażliwe na obróbkę mechaniczną i chemiczną, co skutkuje różnymi wynikami, chociaż bardzo stare zwierzęta również mogą nie nadawać się do kondycjonowania.

Okres trwałości 1-propanolu zależy od marek i partii i wynosi mniej niż 3 miesiące w RT. Gdy wartości CI u nieleczonych zwierząt pogarszają się, zaleca się stosowanie świeżego 1-propanolu do testu kondycjonowania i chemotaksji.

Na tworzenie pamięci przez trening masowy nie miało wpływu leczenie zwierząt inhibitorami translacji (cykloheksymid i anizomycyna) oraz inhibitorem transkrypcji (aktynomycyna D), podczas gdy tworzenie pamięci przez trening rozłożony w czasie było znacznie hamowane przez inhibitory20,21. Ponadto pierwsza pamięć uległa zniszczeniu przez szok zimna, podczas gdy druga była zachowywana przez dłuższy okres czasu niż pierwsza i była odporna na szok zimny. Wyniki te pokazują, że pierwszy z nich to STM, a drugi to LTM, odpowiednio20,21. Jednak pamięć utworzona przez zmasowany trening może składać się z STM i pamięci średniotrwałej (średniotrwałej), ponieważ STM jest słabo zależny od czynnika transkrypcyjnego CREB (ryc. 5A). Jest to zgodne z wynikiem, w którym STM był przechowywany przez ponad 1 godzinę20,21. Tworzenie zarówno STM, jak i LTM jest silnie zależne od nmr-1, który ulega ekspresji tylko w sześciu parach neuronów (AVA, AVD, AVE, RIM, AVG i PVC) u C. elegans27,28. W związku z tym w tych neuronach receptory NMDA mogą działać jako molekularny detektor koincydencji 1% wodnych sygnałów 1-propanolu i HCl (pH 4,0) dla plastyczności synaptycznej, gdzie wzmocnienie synaptyczne wymagane zarówno dla STM, jak i LTM może wynikać z przypadkowego wystrzelenia neuronów pre- i postsynaptycznych 29,30,31,32,33. Dlatego awersyjna pamięć asocjacyjna może tworzyć się wśród interneuronów.

Metody opisane w niniejszym badaniu powinny mieć zastosowanie do apetytywnego uczenia się węchowego oraz krótkotrwałej i długotrwałej pamięci asocjacyjnej przy użyciu 1-nonanolu jako CS i chlorku potasu jako US21. Interesujące jest porównanie obwodów neuronalnych, które biorą udział w tworzeniu wspomnień apetytywnych i awersyjnych.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jesteśmy wdzięczni Takashi Murayama, Ei-ichiro Saita, Iou Ven Chang i Hitomi Ohtaki za ich pomoc techniczną i komentarze do manuskryptu. Szczepy zostały dostarczone przez Caenorhabditis Genetics Center, które jest finansowane przez NIH National Center for Research Resources (NCRR). Prace te zostały sfinansowane przez Okinawa Institute of Science and Technology Graduate University.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Zlewka 500 mlHARIOB-500-H32
10 µ Końcówki do pipet LThermo Fisher ScientificH-104-96RS-Q
0,2 mlThermo Fisher ScientificTTW110RS-Q
1,0 mlThermo Fisher ScientificH-111-R100NS-Q
1,5 ml plastikowe rurkiEppendorf0030120086
2 mlEppendorf0030120094
10 ml Pipety serologiczneAs One2-5237-04
50 ml Pipety serologiczneAs One2-5237-06
6-dołkowa płytka do hodowli komórkowychCostar3516
Aron Alpha (klej do plastiku)Autoklaw ToagoseiHigh Speed EX
Tomy Digital BiologySX-300
Agar BactoBD214010
Bacto peptonBD211677
Nakrętka do butelki 0,2 & mikro; m jednostki filtracyjneThermo Fisher Scientific566-0020
Palnik BunsenaEISCOSKU 
Dwuwodny chlorek wapniaNacalai Tesque06730-15
C. elegans zmutowane szczepyCentrum
CholesterolWako Pure Chemical Industries034-03002
Przezroczysta akrylowa rura cylindrycznaAsahi Kasei3,5 cm (długość), 30 mm (średnica zewnętrzna), 2 mm (grubość)
Naczynie krystalizującePyrex3140-80
Palnik dentystycznyPhoenix-DentAPT-3
Wodorofosforan di-potasuNacalai Tesque28726-05
E. coli OP50Genetyki Caenorhabditis
Pikulator elektrycznyDrummond Scientific4-000-101
ŻelatynaWako Pure Chemical Industries073-06295
Szklane szalki Petriego (o średnicy 10 cm)Jako jedność Trade FLAT Mark
Podgrzewanie mieszadła magnetycznegoThermo Fisher ScientificSP131324
Kwas solnyNacalai Tesque37345-15
InkubatorSANYOMIR-553
Kimwipes S-200Nippon Paper Crecia62011
Fartuch laboratoryjnyTOYO LINT FREEFH240C
Siarczan magnezu siedmiowodnyNacalai Tesque21002-85
Mieszadło magnetyczneSANSYO93-5412
Szpatułka metalowaFUJIFILM Wako647-06531
Rękawice nitryloweKimberly-ClarkKC100
Siatka nylonowa (rozmiar oczek: 30 μ m)Pikuler SEFARNY30-HD
P10 PikulatorGilsonF144802
Pikulator P200 PikulatorGilsonF123600
P1000 PikulatorGilsonF123602
pH-metrHORIBA Navi F-52
Plastikowe szalki Petriego (9 cm średnicy)IWAKISH90-15E
Plastikowe szalki Petriego (6 cm średnicy)SARSTEDT82.1194.500
Plastikowe łodzie wagoweAs One1-5233-01
Drut platynowy do pickaślimakowego NilacoPT-351265
1-PropanolSIGMA-ALDRICH279544
Diwodorofosforan potasuNacalai Tesque28721-55
Okulary ochronneKimberly-Clark#25646
Chlorek soduNacalai Tesque31320-05
Mikroskop stereoskopowyOlympusSZX16
Wykałaczki
System oczyszczania wodyMerckElix Essential 10
UV System uzdatniania wodyMerckMilli-Q Synthesis A10
Waga wagowaMETTLER TOREDO
Dziki typ C. elegans szczep N2Genetyki Caenorhabditis
końcówki do pipet CH0089AGenetyki Caenorhabditis Centrum Centrum

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 314 (1165), 1(1986).
  2. Cook, S. J., et al. Whole-animal connectomes of both Caenorhabditis elegans sexes. Nature. 571 (7763), 63-71 (2019).
  3. Witvliet, D., et al. Connectomes across development reveal principles of brain maturation. Nature. 596, 257-261 (2021).
  4. Hedgecock, E. M., Russell, R. L. Normal and mutant thermotaxis in the nematode Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 72 (10), 4061-4065 (1975).
  5. Mohri, A., et al. Genetic control of temperature preference in the nematode Caenorhabditis elegans. Genetics. 169 (3), 1437-1450 (2005).
  6. Wen, J. Y. M., et al. Mutations that prevent associative learning in C. elegans. Behavioral Neuroscience. 111 (2), 354-368 (1997).
  7. Saeki, S., Yamamoto, M., Iino, Y. Plasticity of chemotaxis revealed by paired presentation of a chemoattractant and starvation in the nematode Caenorhabditis elegans. Journal of Experimental Biology. 204 (10), 1757-1764 (2001).
  8. Tomioka, M., et al. The insulin/PI3-kinase pathway regulates salt chemotaxis learning in Caenorhabditis elegans. Neuron. 51 (5), 613-625 (2006).
  9. Torayama, I., Ishihara, T., Katsura, I. Caenorhabditis elegans integrates the signals of butanone and food to enhance chemotaxis to butanone. Journal of Neuroscience. 27 (4), 741-750 (2007).
  10. Kaufman, A. L., Ashraf, J. M., Corces-Zimmerman, M. R., Landis, J. N., Murphy, C. T. Insulin signaling and dietary restriction differentially influence the decline of learning and memory with age. PLoS Biology. 8 (5), 1000372(2010).
  11. Stein, G. M., Murphy, C. T. C. elegans positive olfactory associative memory is a molecularly conserved behavioral paradigm. Neurobiology of Learning and Memory. 115, 86-94 (2014).
  12. Rahmani, A., Chew, Y. L. Investigating the molecular mechanisms of learning and memory using Caenorhabditis elegans. Journal of Neurochemistry. 159 (3), 417-451 (2021).
  13. Bargmann, C. I. Chemosensation in C. elegans. WormBook. 25, 1-29 (2006).
  14. Gray, J. M., Hill, J. J., Bargmann, C. I. A circuit for navigation in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (9), 3184-3191 (2005).
  15. Cho, C. E., Brueggemann, C., L'Etoile, N. D., Bargmann, C. I. Parallel encoding of sensory history and behavioral preference during Caenorhabditis elegans olfactory learning. eLife. 5, 14000(2016).
  16. Juang, B. T., et al. Endogenous nuclear RNAi mediates behavioral adaptation to odor. Cell. 154 (5), 1010-1022 (2013).
  17. Neal, S. J., et al. Feeding state-dependent regulation of developmental plasticity via CaMKI and neuroendocrine signaling. eLife. 4, 10110(2015).
  18. Castellucci, V. F., Kandel, E. R. A quantal analysis of the synaptic depression underlying habituation of the gill-withdrawal reflex in Aplysia. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 71 (12), 5004-5008 (1974).
  19. Klein, M., Kandel, E. R. Mechanism of calcium current modulation underlying presynaptic facilitation and behavioral sensitization in Aplysia. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 77 (11), 6912-6916 (1980).
  20. Amano, H., Maruyama, I. N. Aversive olfactory learning and associative long-term memory in Caenorhabditis elegans. Learning & Memory. 18 (10), 654-665 (2011).
  21. Nishijima, S., Maruyama, I. N. Appetitive olfactory learning and long-term associative memory in Caenorhabditis elegans. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 11, 80(2017).
  22. Morrison, G. E., Wen, J. Y. M., Runciman, S., vander Kooy, D. Olfactory associative learning in Caenorhabditis elegans is impaired in lrn-1 and lrn-2 mutants. Behavioral Neuroscience. 113 (2), 358-367 (1999).
  23. Morrison, G. E., vander Kooy, D. A mutation in the AMPA-type glutamate receptor, glr-1, blocks olfactory associative and nonassociative learning in Caenorhabditis elegans. Behavioral Neuroscience. 115 (3), 640-649 (2001).
  24. Bargmann, C. I., Hartwieg, E., Horvitz, H. R. Odorant-selective genes and neurons mediate olfaction in C. elegans. Cell. 74 (3), 515-527 (1993).
  25. Sambongi, Y., et al. Caenorhabditis elegans senses protons through amphid chemosensory neurons: Proton signals elicit avoidance behavior. Neuroreport. 11 (10), 2229-2232 (2000).
  26. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).
  27. Brockie, P. J., Madsen, D. M., Zheng, Y., Mellem, J., Maricq, A. V. Differential expression of glutamate receptor subunits in the nervous system of Caenorhabditis elegans and their regulation by the homeodomain protein UNC-42. Journal of Neuroscience. 21 (5), 1510-1522 (2001).
  28. Brockie, P. J., Mellem, J. E., Hills, T., Madsen, D. M., Maricq, A. V. The C. elegans glutamate receptor subunit NMR-1 is required for slow NMDA-activated currents that regulate reversal frequency during locomotion. Neuron. 31 (4), 617-630 (2001).
  29. Gustafsson, B., Wingstrom, H. Physiological mechanisms underlying long-term potentiation. Trends in Neuroscience. 11 (4), 156-162 (1988).
  30. Kauer, J. A., Malenka, R. C., Nicoll, R. A. A persistent postsynaptic modification mediates long-term potentiation in the hippocampus. Neuron. 1 (10), 911-917 (1988).
  31. Bliss, T. V. P., Collingridge, G. L. A synaptic model of memory: Long-term potentiation in the hippocampus. Nature. 361 (6407), 31-39 (1993).
  32. Bailey, C. H., Giustetto, M., Huang, Y. Y., Hawkins, R. D., Kandel, E. R. Is heterosynaptic modulation essential for stabilizing Hebbian plasticity and memory. Nature Reviews Neuroscience. 1 (1), 11-20 (2000).
  33. Miyashita, T., et al. Mg2+ block of Drosophila NMDA receptors is required for long-term memory formation and CREB-dependent gene expression. Neuron. 74 (5), 887-898 (2012).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

test chemotaksjipami kr tkotrwa apami d ugotrwa awarunkowanie klasycznereceptory NMDAobrazowanie wapniaanaliza behawioralna

Powiązane artykuły