Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Przemiana indukowana mediatorem fosfolipidowym w kulturach trójwymiarowych

2.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/64146

⸱

27 lipca 2022

 ,  ,  , 
1Biology Department, Indian Institute of Science Education and Research, 2Department of Biology, Center for Genomics and Systems Biology, New York University, 3Enveda Therapeutics India Pvt Ltd.

W tym artykule

Podsumowanie

Obecny protokół opisuje tworzenie 3D 'na wierzchu' hodowli nieprzekształconej linii komórek nabłonka piersi, MCF10A, która została zmodyfikowana do badania transformacji indukowanej przez czynnik aktywujący płytki krwi (PAF). Do oceny przemiany wykorzystano immunofluorescencję, która została szczegółowo omówiona.

Streszczenie

Do badania raka opracowano kilka modeli, takich jak modele gryzoni i ustalone linie komórkowe. Badania z wykorzystaniem tych modeli dostarczyły cennych informacji na temat kancerogenezy. Linie komórkowe pozwoliły zrozumieć deregulację sygnalizacji molekularnej związanej z nowotworzeniem piersi, podczas gdy modele gryzoni są szeroko stosowane do badania komórkowych i molekularnych cech raka piersi in vivo. Ustanowienie hodowli 3D komórek nabłonkowych i nowotworowych piersi pomaga w wypełnieniu luki między modelami in vivo i in vitro poprzez naśladowanie warunków in vivo in vitro. Model ten można wykorzystać do zrozumienia deregulacji złożonych zdarzeń sygnalizacji molekularnej i charakterystyki komórkowej podczas kancerogenezy piersi. W tym przypadku system hodowli 3D jest modyfikowany w celu zbadania przemiany indukowanej mediatorem fosfolipidowym (czynnik aktywujący płytki krwi, PAF). Immunomodulatory i inne wydzielane cząsteczki odgrywają główną rolę w inicjacji i progresji guza w piersi. W niniejszym badaniu 3D hodowle groniaste komórek nabłonka piersi są wystawione na działanie PAF, wykazywały cechy transformacji, takie jak utrata polarności i zmienione cechy komórkowe. Ten system hodowli 3D pomoże rzucić światło na genetyczne i/lub epigenetyczne perturbacje wywołane przez różne małe cząsteczki w mikrośrodowisku guza. Dodatkowo, system ten będzie również stanowił platformę do identyfikacji nowych, a także znanych genów, które mogą być zaangażowane w proces transformacji.

Wprowadzenie

Dostępnych jest niezliczona liczba modeli służących do badania progresji nowotworów, z których każdy jest unikalny i reprezentuje podtyp tej złożonej choroby. Każdy model dostarcza wyjątkowych i cennych informacji na temat biologii nowotworów oraz usprawnił metody naśladowania rzeczywistego stanu chorobowego. Ugruntowane linie komórkowe hodowane w monowarstwie dostarczyły cennych informacji na temat procesów życiowych in vitro, takie jak proliferacja, inwazyjność, migracja i apoptoza1Choć dwuwymiarowe (2D) hodowle komórkowe stanowią tradycyjne narzędzie do badania odpowiedzi komórek ssaków na szereg zaburzeń środowiskowych, ekstrapolacja tych wyników w celu przewidywania odpowiedzi na poziomie tkanki nie wydaje się wystarczająco przekonująca. Głównym ograniczeniem hodowli 2D jest fakt, że stworzone w nich mikrośrodowisko znacznie różni się od mikrośrodowiska tkanki piersi.2Hodowla 2D nie zapewnia interakcji komórek z macierzą pozakomórkową, która jest niezbędna dla wzrostu każdej tkanki. Ponadto siły rozciągające, którym poddawane są komórki w hodowlach monowarstwy, utrudniają ich polaryzację, co prowadzi do zmiany sygnalizacji i zachowania komórek.3,4,5Trójwymiarowe (3D) systemy hodowli otworzyły nową drogę w badaniach nad rakiem dzięki swojej zdolności do naśladowania in vivo warunki in vitro Wiele kluczowych sygnałów mikrośrodowiskowych, które ulegają utracie w dwuwymiarowych (2D) hodowlach komórkowych, można odtworzyć, stosując trójwymiarowe (3D) hodowle w macierzy zewnątrzkomórkowej bogatej w lamininę (lrECM).6.

Różne badania wykazały znaczenie mikrośrodowiska guza w kancerogenezie7,8. Czynniki związane ze stanem zapalnym stanowią główną część mikrośrodowiska. Czynnik aktywujący płytki krwi (PAF) jest fosfolipidowym mediatorem wydzielanym przez różne komórki odpornościowe, który pośredniczy w wielu odpowiedziach immunologicznych9,10. Wysokie poziomy PAF są wydzielane przez różne linie komórkowe raka piersi i wiążą się ze zwiększoną proliferacją11. Badania prowadzone w naszym laboratorium wykazały, że przedłużona obecność PAF w kulturach acynarnych prowadzi do transformacji komórek nabłonkowych piersi12. PAF aktywuje receptor PAF (PAFR), co prowadzi do aktywacji osi sygnalizacyjnej PI3K/Akt13. Doniesiono również, że PAFR jest powiązany z EMT, inwazją i przerzutowaniem14.

Niniejszy protokół prezentuje model systemu do badania transformacji indukowanej przez PAF, z wykorzystaniem hodowli 3D komórek nabłonkowych piersi, zgodnie z opisem przedstawionym wcześniej przez Chakravarty i wsp.12. Komórki nabłonka piersi hodowane na macierzy zewnątrzkomórkowej (hodowle 3D) wykazują tendencję do tworzenia spolaryzowanych sferoidów z zahamowanym wzrostem. Struktury te nazywane są acini i ściśle przypominają acini tkanki piersi, czyli najmniejszą funkcjonalną jednostkę gruczołu mlekowego in vivo15. Sferoidy te (Rysunek 1A,B) składają się z warstwy pojedynczych, gęsto upakowanych, spolaryzowanych komórek nabłonkowych otaczających pusty lumen i przytwierdzonych do błony podstawnej (Rysunek 1C). Proces morfogenezy ten został dobrze opisany w literaturze16. Po wysianiu na lrECM komórki ulegają podziałom i różnicowaniu, tworząc skupisko komórek, które następnie polaryzują się od 4. dnia hodowli. Do 8. dnia acini składają się z grupy spolaryzowanych komórek będących w bezpośrednim kontakcie z macierzą zewnątrzkomórkową oraz grupy komórek niespolaryzowanych zamkniętych wewnątrz zewnętrznych komórek spolaryzowanych, bez kontaktu z macierzą. Wiadomo, że komórki niespolaryzowane ulegają apoptozie do 12. dnia hodowli, tworząc pusty lumen. Do 16. dnia powstają struktury o zahamowanym wzroście16.

figure-introduction-1
Rysunek 1: Jądra komórek w acynusach zabarwione barwnikiem jądrowym. (A) Rekonstrukcja 3D acynusów. (B) Obraz w kontraście fazowym acynusów MCF10A hodowanych na Matrigelu przez 20 dni. (C) Najbardziej centralny przekrój wykazuje obecność pustego światła. Pasek skali = 20 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

W przeciwieństwie do kultur 2D, kultury acinarne pomagają w rozróżnieniu komórek prawidłowych i przekształconych poprzez wyraźne zmiany morfologiczne. Nieprzekształcone komórki nabłonka piersi tworzą acini z pustym światłem, naśladując prawidłowe acini piersi człowieka. Sferoidy te, po transformacji, wykazują zaburzoną morfologię charakteryzującą się znaczną utratą polarności (jedną z cech charakterystycznych dla nowotworów), brakiem światła lub zaburzeniem pustego światła (wynikającym z unikania apoptozy), co może być indukowane przez deregulację różnych genów17,18,19,20. Transformacje te można badać przy użyciu powszechnie stosowanych technik, takich jak immunofluorescencja. Zatem model 3D hodowli komórkowej może służyć jako prosta metoda badania procesu morfogenezy acinarnej piersi oraz kancerogenezy piersi. Ustanowienie systemu hodowli 3D w celu zrozumienia efektu mediatora fosfolipidowego, PAF, pomoże w wysokoprzepustowym przesiewaniu leków w badaniach przedklinicznych.

W niniejszej pracy zaadaptowano protokół hodowli 3D „on top”16,21 do badania transformacji indukowanej przez PAF22. Zmiany fenotypowe wywołane ekspozycją acini na mediator fosfolipidowy badano przy użyciu immunofluorescencji. W badaniu wykorzystano różne markery polarności oraz przejścia nabłonkowo-mezenchymalnego (EMT)12,16. W Tabeli 1 wskazano ich normalną lokalizację oraz oczekiwany fenotyp po transformacji.

PrzeciwciałaZnacznikiPrawidłowa lokalizacjaFenotyp transformowany
α6-IntegrynaBazolateralnyPodstawne z niemal nieobecnym barwieniem bocznymSilne barwienie lateralne / apikalne
β$\beta$-kateninaZłącze międzykomórkoweBazolateralnyNieprawidłowa lokalizacja jądrowa lub cytoplazmatyczna
WimentynaEMTBrak / słaba obecnośćUp-regulacja

Tabela 1: Markery użyte w badaniu. Różne markery wraz z ich lokalizacją w obecności i przy braku traktowania PAF.

Niniejszą metodę można najlepiej wykorzystać do badania i przesiewania potencjalnych leków oraz genów docelowych dla różnych podtypów raka piersi. Pozwala to na uzyskanie danych dotyczących odpowiedzi na leki, które są bliższe scenariuszowi in vivo, co wspomaga szybszy i bardziej niezawodny rozwój leków. Ponadto system ten może być wykorzystywany do badania sygnalizacji molekularnej związanej z odpowiedzią na leki oraz z lekoopornością.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Umieszczanie komórek MCF10A w lrECM

  1. Utrzymuj komórki MCF10A (przylegające komórki nabłonka piersi) w pożywce wzrostowej. Przenikaj komórki co 4 dni.
    UWAGA: Skład pożywki: DMEM o wysokiej zawartości glukozy bez pirogronianu sodu zawierający surowicę końską (5%), insulinę (10 μg/ml), hydrokortyzon (0,5 μg/ml), naskórkowy czynnik wzrostu, EGF (20 ng/ml), toksyny (100 ng/ml) i penicylinę-streptomycynę (100 jednostek/ml) (patrz tabela materiałów).
  2. Rozmrozić lrECM (patrz tabela materiałów) na lodzie 20 minut przed rozpoczęciem eksperymentu. Dzień wysiewu komórek jest ogólnie uważany za Dzień 0.
  3. W celu trypsynizacji komórek odessać pożywkę i przemyć 2 ml PBS. Dodać 900 μl 0,05% trypsyny-EDTA i inkubować w temperaturze 37 °C przez ~15 minut lub do momentu, gdy komórki zostaną całkowicie trypsynizowane.
  4. Przygotować złoże lrECM w ośmiu studzienkach szklanego szkiełka nakrywkowego z komorą (patrz Tabela Materiałów).
    1. Gdy komórki trypsynizują, pokryj każdą studzienkę 60 μl lrECM i umieść w inkubatorze CO2 o temperaturze 37 °C na maksymalnie 15 minut.
  5. Przygotować zawiesinę komórkową, postępując zgodnie z poniższymi krokami.
    1. Po całkowitym usunięciu komórek dodać 5 ml pożywki do reparacji w celu wygaszenia aktywności trypsyny i wirować komórki w temperaturze 112 x g przez 10 minut w temperaturze 25 °C.
      UWAGA: Skład pożywki do re-zawiesiny: DMEM o wysokiej zawartości glukozy bez pirogronianu sodu, uzupełniony surowicą końską (20%) i penicyliną-streptomycyną (100 jednostek/ml).
    2. Odessać zużytą pożywkę i ponownie zawiesić komórki w 2 ml pożywki testowej. Dobrze wymieszać zawiesinę, aby zapewnić utworzenie zawiesiny jednokomórkowej.
      UWAGA: Skład pożywki testowej: DMEM o wysokiej zawartości glukozy bez pirogronianu sodu, uzupełniony surowicą końską (2%), hydrokortyzonem (0,5 μg/ml), toksyną (100 ng/ml), insuliną (10 μg/ml) i penicyliną-streptomycyną (100 jednostek/ml).
    3. Policz komórki za pomocą hemocytometru i oblicz objętość zawiesiny komórek potrzebną do wysiewu 6 x 103 komórek w każdym dołku.
      UWAGA: Generalnie zaleca się uwzględnienie w obliczeniach jednego dodatkowego dołka w celu uwzględnienia ewentualnych błędów pipetowania.
    4. W zależności od wymaganej liczby studzienek rozcieńczyć zawiesinę komórek w podłożu nakładkowym.
      UWAGA: Skład pożywki nakładającej dla pojedynczego dołka jest następujący: 400 μl pożywki testowej, 8 μl lrECM (2% final) i 0,02 μl 100 μg/ml EGF (5 ng/ml final).
  6. Wykonaj wysiew komórek.
    1. Dodać 400 μl rozcieńczonej zawiesiny komórkowej do przygotowanych łóżek lrECM (krok 1.4), uważając, aby nie naruszyć złoża lrECM. Inkubować w temperaturze 37 °C w nawilżonym inkubatorze o stężeniu 5% CO2 .

2. Leczenie PAF

  1. Dodać PAF 3 godziny po wysianiu komórek. Przygotować 100 μM zapasu PAF w PBS i dodać wymaganą objętość 0,2 μl do każdej studzienki (co odpowiada 200 nM).
  2. Dodawaj takie samo stężenie PAF przy każdej zmianie pożywki.

3. Ponowne karmienie świeżymi pożywkami

  1. Uzupełniaj komórki świeżą pożywką co 4 dni (tj. Dzień 4, Dzień 8, Dzień 12 i Dzień 16).

4. Badanie immunofluorescencyjne w celu wykrycia zmian fenotypowych wywołanych długotrwałą ekspozycją na PAF

  1. Po 20 dniach hodowli ostrożnie odpipetować pożywkę z każdej studzienki i umyć studzienki 400 μl wstępnie podgrzanego PBS.
  2. Utrwal struktury groniaste dodając 400 μl 4% paraformaldehydu (świeżo przygotowanego przez rozcieńczenie 16% paraformaldehydu w 1x PBS) i inkubując przez 20 minut w temperaturze pokojowej.
  3. Przepłukać studzienki raz lodowatym PBS i przepuszczać PBS zawierającym 0,5% Triton X-100 przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
  4. Po 10 minutach natychmiast, ale ostrożnie, odpipetować roztwór Triton-X 100 i spłukać 400 μl PBS-glicyny (świeżo przygotowanej przez dodanie szczypty glicyny do 1x PBS). Powtarza się to trzykrotnie po 15 minut.
  5. Dodać 400 μl podstawowego roztworu blokującego składającego się z 10% surowicy koziej (patrz tabela materiałów) w buforze immunofluorescencyjnym (IF) i inkubować w temperaturze pokojowej przez 60 min.
    UWAGA: Skład buforu IF: 0,05% azydku sodu, 0,1% BSA, 0,2% Triton-X 100 i 0,05% Tween (20 w 1 PBS).
  6. Usunąć pierwszorzędowy roztwór blokujący, dodać 200 μl 2% wtórnego przeciwciała blokującego (F(ab')2 fragment przeciwciała wyhodowanego w kozie przeciwko antygenowi myszy, patrz tabela materiałów) przygotowanego w pierwotnym roztworze blokującym i pozostawić na 45-60 minut w temperaturze pokojowej.
  7. Przygotować przeciwciało pierwszorzędowe (patrz tabela materiałów) w 2% roztworze przeciwciała blokującego w rozcieńczeniu 1:100. Po usunięciu wtórnego roztworu blokującego dodać świeżo przygotowane przeciwciało i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.
  8. Poprzedni krok może wywołać upłynnienie błony podstawnej. Przed przystąpieniem do eksperymentu poczekaj, aż szkiełko osiągnie temperaturę pokojową. Ostrożnie odpipetować pierwszorzędowy roztwór przeciwciała i przemyć go trzykrotnie 400 μl buforu IF.
  9. Podczas ostatniego przemywania buforem IF przygotować rozcieńczenie 1:200 przeciwciała drugorzędowego sprzężonego z fluoroforem (patrz tabela materiałów) w pierwszorzędowym roztworze blokującym. Inkubować szkiełka w roztworze przeciwciał drugorzędowych przez 40-60 minut w temperaturze pokojowej.
  10. Przepłukać szkiełka 400 μl buforu IF przez 20 minut, a następnie dwukrotnie przepłukać PBS przez 10 minut każde.
  11. Przeciwbarwienie jąder PBS zawierającym 0,5 ng/ml barwienia jądrowego (patrz Tabela materiałów) przez 5-6 minut w temperaturze pokojowej. Umyj szkiełka trzykrotnie 400 μl PBS, aby usunąć nadmiar plam
    12. .
  12. Ostrożnie odpipetować cały PBS i upewnić się, że pozostał roztwór. Dodaj jedną kroplę odczynnika montażowego (patrz Tabela materiałów) do każdej studzienki i pozostaw na noc w temperaturze pokojowej.
  13. Przechowuj szkiełka w temperaturze pokojowej i zobrazuj je tak szybko, jak to możliwe.
  14. Obraz w powiększeniu 40x lub 63x w mikroskopie konfokalnym (patrz tabela materiałów), przyjmując optyczne przekroje Z o wielkości kroku 0,6 mm (NA = 1,4).
  15. Otwórz uzyskane obrazy za pomocą oprogramowania do przetwarzania obrazów (patrz tabela materiałów). Zademonstruj różnice morfologiczne za pomocą rzutów 3D.
    UWAGA: Najbardziej środkowy optyczny przekrój Z może być najlepiej wykorzystany do pokazania różnic w lokalizacji znaczników polaryzacji. Można je określić ilościowo ręcznie, aby przedstawić procent sferoid wykazujących ten konkretny wzór barwienia.
  16. Aby zilustrować różnice w ekspresji białek, należy przeprowadzić analizę półilościową mierzącą średnią wartość szarości lub obliczając skorygowaną całkowitą fluorescencję komórek (CTCF)23. Przedstaw dane jako wykresy skrzypiec lub kropkowe.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Komórki MCF10A, po ekspozycji na PAF, tworzą struktury pęcherzykowate o bardzo wyraźnych fenotypach. Stwierdzono błędną lokalizację α6-integryny, z silniejszym barwieniem w części apikalnej. W kilku pęcherzykach zaobserwowano również barwienie nieciągłe (Rycina 2A). Oba te fenotypy wskazują na utratę polarności bazalnej, co potwierdzają doniesienia literaturowe24,25. Wcześniejsze raporty wskazują na kontrowersyjną rolę α6-integryny w...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Sprawdzone modele oparte na liniach komórkowych są szeroko stosowane do badania procesu kancerogenezy. Jednowarstwowe hodowle komórek nadal dostarczają informacji na temat różnych molekularnych szlaków sygnałowych, które pośredniczą w charakterystycznych zmianach w komórkach nowotworowych32. Badania nad rolą dobrze znanych onkogenów, takich jak Ras, Myc i zmutowany p53, zostały po raz pierwszy opisane przy użyciu kultur jednowarstwowych jako systemu modelowego 33,34,35,36.<...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak potencjalnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Dziękujemy IISER Pune Microscopy Facility za dostęp do sprzętu i infrastruktury oraz wsparcie dla eksperymentów. Badanie to było wspierane przez grant z Departamentu Biotechnologii (DBT), rządu Indii (BT/PR8699/MED/30/1018/2013), Science and Engineering Research Board (SERB), rządu Indii (EMR/2016/001974) oraz częściowo z IISER, Pune Core funding. A. K. był finansowany przez stypendium CSIR-SRF, L.A. był finansowany przez stypendium DST-INSPIRE, V.C był finansowany przez DBT (BT/PR8699/MED/30/1018/2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,05% Trypsyna EDTAInvitrogen25300062
16% paraformaldehydAlfa AesarAA433689M
Anti Mouse Mąka Alexa 488InvitrogenA11029
Anti Rabbit Alexa Mąka 488InvitrogenA-11008
BSASigmaA7030
Komora CoverglassNunc
ToksynaSigmaC8052-1MG1 mg / ml w dH2O
Mikroskop konfokalnyLeicaLeica SP8
DMEMGibco11965126
EDTASigmaE6758
EGFSigmaE9644-0.2MG100 mg / ml w dH2O
F(ab')2 Fragment przeciwciała wyhodowanego u kozy przeciwko mysiemu antygenowiJackson Immunoresearch115-006-006
Przeciwciało GM130Abcamab52649
Surowica koziaAbcamab7481
HoechstInvitrogen33258
Surowica koniaGibco16050122
HydrokortyzonSigmaH08881 mg/ml w etanolu
Oprogramowanie do przetwarzania obrazuImageJ
InsulinaSigmaI188210 mg/ml zapas dH2O
lrECM (Matrigel)Corning356231
Odczynnik montażowy (Slow fade Gold Anti-blade)InvitrogenS36937
Nuclear Stain  (Hoechst)Invitrogen33258
PAFCayman Chemicals91575-58-5Metylokarbamyl PAF C-16, pozyskiwany jako 10 mg/ml w etanolu
Penicylina-StreptomycynaLonza17-602E
Azydek soduSigmaS2002
Tris BaseSigmaB9754
Triton X-100SigmaT8787
Tween 20SigmaP9416
Przeciwciało VimentinAbcamab92547
α Przeciwciało 6-integrynoweMilliporeMAB1378
155409

Bibliografia

  1. Lacroix, M., Leclercq, G. Relevance of breast cancer cell lines as models for breast tumours: an update. Breast Cancer Research and Treatment. 83 (3), 249-289 (2004).
  2. Vargo-Gogola, T., Rosen, J. M. Modelling breast cancer: one size does not fit all. Nature Reviews Cancer. 7 (9), 659-672 (2007).
  3. Runswick, S. K., O'Hare, M. J., Jones, L., Streuli, C. H., Garrod, D. R. Desmosomal adhesion regulates epithelial morphogenesis and cell positioning. Nature Cell Biology. 3 (9), 823-830 (2001).
  4. Streuli, C. H., Bailey, N., Bissell, M. J. Control of mammary epithelial differentiation: basement membrane induces tissue-specific gene expression in the absence of cell-cell interaction and morphological polarity. Journal of Cell Biology. 115 (5), 1383-1395 (1991).
  5. Streuli, C. H., et al. Laminin mediates tissue-specific gene expression in mammary epithelia. Journal of Cell Biology. 129 (3), 591-603 (1995).
  6. Bissell, M. J., Kenny, P. A., Radisky, D. C. Microenvironmental regulators of tissue structure and function also regulate tumor induction and progression: the role of extracellular matrix and its degrading enzymes. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 70, 343-356 (2005).
  7. Heinrich, E. L., et al. The inflammatory tumor microenvironment, epithelial mesenchymal transition and lung carcinogenesis. Cancer Microenvironment. 5 (1), 5-18 (2012).
  8. Gonda, T. A., Tu, S., Wang, T. C. Chronic inflammation, the tumor microenvironment and carcinogenesis. Cell Cycle. 8 (13), 2005-2013 (2009).
  9. Berdyshev, E. V., Schmid, P. C., Krebsbach, R. J., Schmid, H. H. Activation of PAF receptors results in enhanced synthesis of 2-arachidonoylglycerol (2-AG) in immune cells. The FASEB Journal. 15 (12), 2171-2178 (2001).
  10. Rola-Pleszczynski, M., Stankova, J. Cytokine gene regulation by PGE(2), LTB(4) and PAF. Mediators of Inflammation. 1 (2), 5-8 (1992).
  11. Bussolati, B., et al. PAF produced by human breast cancer cells promotes migration and proliferation of tumor cells and neo-angiogenesis. The American Journal of Pathology. 157 (5), 1713-1725 (2000).
  12. Chakravarty, V., et al. Prolonged exposure to platelet activating factor transforms breast epithelial cells. Frontiers in Genetics. 12, 634938(2021).
  13. Chen, J., et al. Platelet-activating factor receptor-mediated PI3K/AKT activation contributes to the malignant development of esophageal squamous cell carcinoma. Oncogene. 34 (40), 5114-5127 (2015).
  14. Chen, J., et al. Feed-forward reciprocal activation of PAFR and STAT3 regulates epithelial-mesenchymal transition in non-small cell lung cancer. Cancer Research. 75 (19), 4198-4210 (2015).
  15. Vidi, P. A., Bissell, M. J., Lelievre, S. A. Three-dimensional culture of human breast epithelial cells: the how and the why. Methods in Molecular Biology. 945, 193-219 (2013).
  16. Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures. Methods. 30 (3), 256-268 (2003).
  17. Barcellos-Hoff, M. H., Aggeler, J., Ram, T. G., Bissell, M. J. Functional differentiation and alveolar morphogenesis of primary mammary cultures on reconstituted basement membrane. Development. 105 (2), 223-235 (1989).
  18. Petersen, O. W., Ronnov-Jessen, L., Howlett, A. R., Bissell, M. J. Interaction with basement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal and malignant human breast epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 89 (19), 9064-9068 (1992).
  19. Shaw, K. R., Wrobel, C. N., Brugge, J. S. Use of three-dimensional basement membrane cultures to model oncogene-induced changes in mammary epithelial morphogenesis. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 9 (4), 297-310 (2004).
  20. Weaver, V. M., Fischer, A. H., Peterson, O. W., Bissell, M. J. The importance of the microenvironment in breast cancer progression: recapitulation of mammary tumorigenesis using a unique human mammary epithelial cell model and a three-dimensional culture assay. Biochemistry and Cell Biology. 74 (6), 833-851 (1996).
  21. Lee, G. Y., Kenny, P. A., Lee, E. H., Bissell, M. J. Three-dimensional culture models of normal and malignant breast epithelial cells. Nature Methods. 4 (4), 359-365 (2007).
  22. Bodakuntla, S., Libi, A. V., Sural, S., Trivedi, P., Lahiri, M. N-nitroso-N-ethylurea activates DNA damage surveillance pathways and induces transformation in mammalian cells. BMC Cancer. 14, 287(2014).
  23. Banerjee, A., et al. A rhodamine derivative as a "lock" and SCN− as a "key": visible light excitable SCN− sensing in living cells. Chemical Communications. 49 (25), 2527-2529 (2013).
  24. Ren, G., et al. Reduced basal nitric oxide production induces precancerous mammary lesions via ERBB2 and TGFbeta. Scientific Reports. 9 (1), 6688(2019).
  25. Anandi, L., Chakravarty, V., Ashiq, K. A., Bodakuntla, S., Lahiri, M. DNA-dependent protein kinase plays a central role in transformation of breast epithelial cells following alkylation damage. Journal of Cell Science. 130 (21), 3749-3763 (2017).
  26. Sonnenberg, A., et al. Integrin alpha 6/beta 4 complex is located in hemidesmosomes, suggesting a major role in epidermal cell-basement membrane adhesion. Journal of Cell Biology. 113 (4), 907-917 (1991).
  27. Pignatelli, M., Cardillo, M. R., Hanby, A., Stamp, G. W. Integrins and their accessory adhesion molecules in mammary carcinomas: loss of polarization in poorly differentiated tumors. Human Pathology. 23 (10), 1159-1166 (1992).
  28. Natali, P. G., et al. Changes in expression of alpha 6/beta 4 integrin heterodimer in primary and metastatic breast cancer. British Journal of Cancer. 66 (2), 318-322 (1992).
  29. Davis, T. L., Cress, A. E., Dalkin, B. L., Nagle, R. B. Unique expression pattern of the alpha6beta4 integrin and laminin-5 in human prostate carcinoma. Prostate. 46 (3), 240-248 (2001).
  30. Liu, J. S., Farlow, J. T., Paulson, A. K., Labarge, M. A., Gartner, Z. J. Programmed cell-to-cell variability in Ras activity triggers emergent behaviors during mammary epithelial morphogenesis. Cell Reports. 2 (5), 1461-1470 (2012).
  31. Liu, C. Y., Lin, H. H., Tang, M. J., Wang, Y. K. Vimentin contributes to epithelial-mesenchymal transition cancer cell mechanics by mediating cytoskeletal organization and focal adhesion maturation. Oncotarget. 6 (18), 15966-15983 (2015).
  32. Kapalczynska, M., et al. 2D and 3D cell cultures-a comparison of different types of cancer cell cultures. Archives of Medical Science. 14 (4), 910-919 (2018).
  33. Schulze, A., Lehmann, K., Jefferies, H. B., McMahon, M., Downward, J. Analysis of the transcriptional program induced by Raf in epithelial cells. Genes & Development. 15 (8), 981-994 (2001).
  34. McCarthy, S. A., Samuels, M. L., Pritchard, C. A., Abraham, J. A., McMahon, M. Rapid induction of heparin-binding epidermal growth factor/diphtheria toxin receptor expression by Raf and Ras oncogenes. Genes & Development. 9 (16), 1953-1964 (1995).
  35. Willis, A., Jung, E. J., Wakefield, T., Chen, X. Mutant p53 exerts a dominant negative effect by preventing wild-type p53 from binding to the promoter of its target genes. Oncogene. 23 (13), 2330-2338 (2004).
  36. Haupt, S., Raghu, D., Haupt, Y. Mutant p53 drives cancer by subverting multiple tumor suppression pathways. Frontiers in Oncology. 6, 12(2016).
  37. Langhans, S. A. Three-dimensional in vitro cell culture models in drug discovery and drug repositioning. Frontiers in Pharmacology. 9, 6(2018).
  38. Edmondson, R., Broglie, J. J., Adcock, A. F., Yang, L. Three-dimensional cell culture systems and their applications in drug discovery and cell-based biosensors. ASSAY and Drug Development Technologies. 12 (4), 207-218 (2014).
  39. Lv, D., Hu, Z., Lu, L., Lu, H., Xu, X. Three-dimensional cell culture: A powerful tool in tumor research and drug discovery. Oncology Letters. 14 (6), 6999-7010 (2017).
  40. Jensen, C., Teng, Y. Is it time to start transitioning from 2D to 3D cell culture. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 33(2020).
  41. Saraiva, D. P., Matias, A. T., Braga, S., Jacinto, A., Cabral, M. G. Establishment of a 3D co-culture with MDA-MB-231 breast cancer cell line and patient-derived immune cells for application in the development of immunotherapies. Frontiers in Oncology. 10, 1543(2020).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Modele raka piersistruktury acynarneczynnik aktywujący płytki krwimikrośrodowisko guzatransformacja komórek nabłonkowychbarwienie immunofluorescencyjnemikroskopia konfokalnaprzejście epitelialno-mezenchymalne
Przemiana indukowana mediatorem fosfolipidowym w kulturach trójwymiarowych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.