Artykuł metodologiczny

Przemiana indukowana mediatorem fosfolipidowym w kulturach trójwymiarowych

DOI:

10.3791/64146

⸱

27 lipca 2022

 ,  ,  , 
1Biology Department, Indian Institute of Science Education and Research, 2Department of Biology, Center for Genomics and Systems Biology, New York University, 3Enveda Therapeutics India Pvt Ltd.

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obecny protokół opisuje tworzenie 3D 'na wierzchu' hodowli nieprzekształconej linii komórek nabłonka piersi, MCF10A, która została zmodyfikowana do badania transformacji indukowanej przez czynnik aktywujący płytki krwi (PAF). Do oceny przemiany wykorzystano immunofluorescencję, która została szczegółowo omówiona.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Do badania raka opracowano kilka modeli, takich jak modele gryzoni i ustalone linie komórkowe. Badania z wykorzystaniem tych modeli dostarczyły cennych informacji na temat kancerogenezy. Linie komórkowe pozwoliły zrozumieć deregulację sygnalizacji molekularnej związanej z nowotworzeniem piersi, podczas gdy modele gryzoni są szeroko stosowane do badania komórkowych i molekularnych cech raka piersi in vivo. Ustanowienie hodowli 3D komórek nabłonkowych i nowotworowych piersi pomaga w wypełnieniu luki między modelami in vivo i in vitro poprzez naśladowanie warunków in vivo in vitro. Model ten można wykorzystać do zrozumienia deregulacji złożonych zdarzeń sygnalizacji molekularnej i charakterystyki komórkowej podczas kancerogenezy piersi. W tym przypadku system hodowli 3D jest modyfikowany w celu zbadania przemiany indukowanej mediatorem fosfolipidowym (czynnik aktywujący płytki krwi, PAF). Immunomodulatory i inne wydzielane cząsteczki odgrywają główną rolę w inicjacji i progresji guza w piersi. W niniejszym badaniu 3D hodowle groniaste komórek nabłonka piersi są wystawione na działanie PAF, wykazywały cechy transformacji, takie jak utrata polarności i zmienione cechy komórkowe. Ten system hodowli 3D pomoże rzucić światło na genetyczne i/lub epigenetyczne perturbacje wywołane przez różne małe cząsteczki w mikrośrodowisku guza. Dodatkowo, system ten będzie również stanowił platformę do identyfikacji nowych, a także znanych genów, które mogą być zaangażowane w proces transformacji.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dostępna jest niezliczona ilość modeli do badania postępu raka, a każdy z nich jest unikalny i reprezentuje podtyp tej złożonej choroby. Każdy model dostarcza unikalnych i cennych informacji na temat biologii nowotworów i udoskonalił środki do naśladowania rzeczywistego stanu chorobowego. Sprawdzone linie komórkowe hodowane jako monowarstwa dostarczyły cennych informacji na temat istotnych procesów in vitro, takich jak proliferacja, inwazyjność, migracja i apoptoza1. Chociaż dwuwymiarowa (2D) hodowla komórkowa jest tradycyjnym narzędziem do badania reakcji komórek ssaków na kilka zaburzeń środowiskowych, ekstrapolacja tych wyników w celu przewidywania odpowiedzi na poziomie tkanki nie wydaje się wystarczająco przekonująca. Głównym ograniczeniem kultur 2D jest to, że utworzone mikrośrodowisko różni się znacznie od środowiska samej tkanki piersi2. Hodowla 2D nie ma interakcji komórek z macierzą zewnątrzkomórkową, która jest niezbędna do wzrostu każdej tkanki. Ponadto siły rozciągające, których doświadcza komórka w kulturach jednowarstwowych, utrudniają polaryzację tych komórek, zmieniając w ten sposób sygnalizację i zachowanie komórki3,4,5. Trójwymiarowe (3D) systemy hodowli otworzyły nową drogę w dziedzinie badań nad rakiem dzięki swojej zdolności do naśladowania warunków in vivo in vitro. Wiele kluczowych sygnałów mikrośrodowiskowych, które są tracone w hodowli komórkowej 2D, można przywrócić za pomocą kultur 3D bogatej w lamininę macierzy zewnątrzkomórkowej (lrECM)6.

Różne badania wykazały znaczenie mikrośrodowiska guza w kancerogenezie7,8. Czynniki związane ze stanem zapalnym są główną częścią mikrośrodowiska. Czynnik aktywujący płytki krwi (PAF) jest mediatorem fosfolipidowym wydzielanym przez różne komórki odpornościowe, który pośredniczy w wielu odpowiedziach immunologicznych9,10. Wysoki poziom PAF jest wydzielany przez różne linie komórkowe raka piersi i jest związany ze zwiększoną proliferacją11. Badania przeprowadzone w naszym laboratorium wykazały, że przedłużająca się obecność PAF w hodowlach ziarniaków prowadzi do transformacji komórek nabłonka piersi12. PAF aktywuje receptor PAF (PAFR), aktywując oś sygnalizacyjną PI3K/Akt13. Doniesiono również, że PAFR jest związany z EMT, inwazją i przerzutami14.

Obecny protokół demonstruje modelowy system do badania transformacji wywołanej przez PAF, przy użyciu kultur 3D komórek nabłonka piersi, jak to zostało wcześniej opisane przez Chakravarty et al.12. Komórki nabłonka piersi wyhodowane na macierzy zewnątrzkomórkowej (kultury 3D) mają tendencję do tworzenia spolaryzowanych sferoid zatrzymanych we wzroście. Nazywa się je acini i są bardzo podobne do acini tkanki piersi, najmniejszej jednostki funkcjonalnej gruczołu sutkowego, in vivo15. Te sferoidy (Rysunek 1A,B) składają się z monowarstwy ściśle upakowanych spolaryzowanych komórek nabłonkowych otaczających puste światło i przymocowanych do błony podstawnej (Rysunek 1C). Ten proces morfogenezy został dobrze opisany w literaturze16. Po wysiewie na lrECM komórki ulegają podziałowi i różnicowaniu, tworząc skupisko komórek, które następnie polaryzują się od 4 dnia. Do 8 dnia acini składają się z grupy spolaryzowanych komórek, które są w bezpośrednim kontakcie z macierzą zewnątrzkomórkową i skupiska niespolaryzowanych komórek zamkniętych w zewnętrznych spolaryzowanych komórkach, bez kontaktu z macierzą. Wiadomo, że te niespolaryzowane komórki ulegają apoptozie do 12 dnia hodowli, tworząc puste światło. Do dnia 16 tworzone są struktury zatrzymane przez wzrost16.

figure-introduction-1
Rysunek 1: Jądra komórek w acini wybarwione barwnikiem jądrowym. (A) Konstrukcja 3D acini. (B) Obraz z kontrastem fazowym MCF10A acini uprawianej na Matrigel przez 20 dni. (C) Najbardziej środkowa sekcja pokazuje obecność pustego światła. Podziałka = 20 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

W przeciwieństwie do kultur 2D, hodowle groniaste pomagają w odróżnianiu normalnych i przekształconych komórek poprzez pozorne zmiany morfologii. Nieprzekształcone komórki nabłonka piersi tworzą acini z pustym światłem, naśladując normalne acini piersi ludzkiej. Te sferoidy, po transformacji, wykazują zaburzoną morfologię charakteryzującą się znaczną utratą polaryzacji (jedną z cech charakterystycznych raka), brakiem światła lub zakłóceniem pustego światła (z powodu uniknięcia apoptozy), które mogą być wywołane z powodu deregulacji różnych genów17,18,19,20. Przemiany te można badać przy użyciu powszechnie stosowanych technik, takich jak immunofluorescencja. W ten sposób model hodowli komórkowej 3D może funkcjonować jako prosta metoda badania procesu morfogenezy ziarniastej piersi i kancerogenezy piersi. Stworzenie systemu hodowli 3D w celu zrozumienia wpływu mediatora fosfolipidowego, PAF, pomoże w wysokoprzepustowych przedklinicznych badaniach przesiewowych leków.

Ta praca zaadaptowała protokół hodowli 3D 'na wierzchu'16,21 do badania transformacji wywołanej przez PAF22. Zmiany fenotypowe wywołane ekspozycją acini na mediator fosfolipidowy badano za pomocą immunofluorescencji. W badaniu wykorzystano różne markery polaryzacji i przejścia nabłonkowego do mezenchymalnego (EMT) 12,16. Tabela 1 wspomina o ich normalnej lokalizacji i oczekiwanym fenotypie po transformacji.

przeciwciałaZnakiNormalna lokalizacjaPrzekształcony fenotyp
α6-IntegrynaPodstawno-bocznyPodstawowy ze słabą plamą bocznąSilna plama boczna / wierzchołkowa
β-CateninPołączenie komórka-komórkaPodstawno-bocznyNieprawidłowa / lokalizacja jądrowa lub cytoplazmatyczna
VimentinEmtNieobecna/słaba obecnośćRegulacja w górę

Tabela 1: Znaczniki użyte w badaniu. Stosowane różne markery z ich lokalizacją w obecności i braku leczenia PAF.

Ta metoda może być najlepiej wykorzystana do badania/badania przesiewowego prawdopodobnych leków i genów docelowych dla różnych podtypów raka piersi. Może to dostarczyć danych o odpowiedzi na lek bliższych scenariuszowi in vivo, pomagając w szybszym i bardziej niezawodnym opracowywaniu leków. System ten może być również wykorzystywany do badania sygnalizacji molekularnej związanej z reakcją na lek i opornością na leki.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Umieszczanie komórek MCF10A w lrECM

  1. Utrzymuj komórki MCF10A (przylegające komórki nabłonka piersi) w pożywce wzrostowej. Przenikaj komórki co 4 dni.
    UWAGA: Skład pożywki: DMEM o wysokiej zawartości glukozy bez pirogronianu sodu zawierający surowicę końską (5%), insulinę (10 μg/ml), hydrokortyzon (0,5 μg/ml), naskórkowy czynnik wzrostu, EGF (20 ng/ml), toksyny (100 ng/ml) i penicylinę-streptomycynę (100 jednostek/ml) (patrz tabela materiałów).
  2. Rozmrozić lrECM (patrz tabela materiałów) na lodzie 20 minut przed rozpoczęciem eksperymentu. Dzień wysiewu komórek jest ogólnie uważany za Dzień 0.
  3. W celu trypsynizacji komórek odessać pożywkę i przemyć 2 ml PBS. Dodać 900 μl 0,05% trypsyny-EDTA i inkubować w temperaturze 37 °C przez ~15 minut lub do momentu, gdy komórki zostaną całkowicie trypsynizowane.
  4. Przygotować złoże lrECM w ośmiu studzienkach szklanego szkiełka nakrywkowego z komorą (patrz Tabela Materiałów).
    1. Gdy komórki trypsynizują, pokryj każdą studzienkę 60 μl lrECM i umieść w inkubatorze CO2 o temperaturze 37 °C na maksymalnie 15 minut.
  5. Przygotować zawiesinę komórkową, postępując zgodnie z poniższymi krokami.
    1. Po całkowitym usunięciu komórek dodać 5 ml pożywki do reparacji w celu wygaszenia aktywności trypsyny i wirować komórki w temperaturze 112 x g przez 10 minut w temperaturze 25 °C.
      UWAGA: Skład pożywki do re-zawiesiny: DMEM o wysokiej zawartości glukozy bez pirogronianu sodu, uzupełniony surowicą końską (20%) i penicyliną-streptomycyną (100 jednostek/ml).
    2. Odessać zużytą pożywkę i ponownie zawiesić komórki w 2 ml pożywki testowej. Dobrze wymieszać zawiesinę, aby zapewnić utworzenie zawiesiny jednokomórkowej.
      UWAGA: Skład pożywki testowej: DMEM o wysokiej zawartości glukozy bez pirogronianu sodu, uzupełniony surowicą końską (2%), hydrokortyzonem (0,5 μg/ml), toksyną (100 ng/ml), insuliną (10 μg/ml) i penicyliną-streptomycyną (100 jednostek/ml).
    3. Policz komórki za pomocą hemocytometru i oblicz objętość zawiesiny komórek potrzebną do wysiewu 6 x 103 komórek w każdym dołku.
      UWAGA: Generalnie zaleca się uwzględnienie w obliczeniach jednego dodatkowego dołka w celu uwzględnienia ewentualnych błędów pipetowania.
    4. W zależności od wymaganej liczby studzienek rozcieńczyć zawiesinę komórek w podłożu nakładkowym.
      UWAGA: Skład pożywki nakładającej dla pojedynczego dołka jest następujący: 400 μl pożywki testowej, 8 μl lrECM (2% final) i 0,02 μl 100 μg/ml EGF (5 ng/ml final).
  6. Wykonaj wysiew komórek.
    1. Dodać 400 μl rozcieńczonej zawiesiny komórkowej do przygotowanych łóżek lrECM (krok 1.4), uważając, aby nie naruszyć złoża lrECM. Inkubować w temperaturze 37 °C w nawilżonym inkubatorze o stężeniu 5% CO2 .

2. Leczenie PAF

  1. Dodać PAF 3 godziny po wysianiu komórek. Przygotować 100 μM zapasu PAF w PBS i dodać wymaganą objętość 0,2 μl do każdej studzienki (co odpowiada 200 nM).
  2. Dodawaj takie samo stężenie PAF przy każdej zmianie pożywki.

3. Ponowne karmienie świeżymi pożywkami

  1. Uzupełniaj komórki świeżą pożywką co 4 dni (tj. Dzień 4, Dzień 8, Dzień 12 i Dzień 16).

4. Badanie immunofluorescencyjne w celu wykrycia zmian fenotypowych wywołanych długotrwałą ekspozycją na PAF

  1. Po 20 dniach hodowli ostrożnie odpipetować pożywkę z każdej studzienki i umyć studzienki 400 μl wstępnie podgrzanego PBS.
  2. Utrwal struktury groniaste dodając 400 μl 4% paraformaldehydu (świeżo przygotowanego przez rozcieńczenie 16% paraformaldehydu w 1x PBS) i inkubując przez 20 minut w temperaturze pokojowej.
  3. Przepłukać studzienki raz lodowatym PBS i przepuszczać PBS zawierającym 0,5% Triton X-100 przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
  4. Po 10 minutach natychmiast, ale ostrożnie, odpipetować roztwór Triton-X 100 i spłukać 400 μl PBS-glicyny (świeżo przygotowanej przez dodanie szczypty glicyny do 1x PBS). Powtarza się to trzykrotnie po 15 minut.
  5. Dodać 400 μl podstawowego roztworu blokującego składającego się z 10% surowicy koziej (patrz tabela materiałów) w buforze immunofluorescencyjnym (IF) i inkubować w temperaturze pokojowej przez 60 min.
    UWAGA: Skład buforu IF: 0,05% azydku sodu, 0,1% BSA, 0,2% Triton-X 100 i 0,05% Tween (20 w 1 PBS).
  6. Usunąć pierwszorzędowy roztwór blokujący, dodać 200 μl 2% wtórnego przeciwciała blokującego (F(ab')2 fragment przeciwciała wyhodowanego w kozie przeciwko antygenowi myszy, patrz tabela materiałów) przygotowanego w pierwotnym roztworze blokującym i pozostawić na 45-60 minut w temperaturze pokojowej.
  7. Przygotować przeciwciało pierwszorzędowe (patrz tabela materiałów) w 2% roztworze przeciwciała blokującego w rozcieńczeniu 1:100. Po usunięciu wtórnego roztworu blokującego dodać świeżo przygotowane przeciwciało i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.
  8. Poprzedni krok może wywołać upłynnienie błony podstawnej. Przed przystąpieniem do eksperymentu poczekaj, aż szkiełko osiągnie temperaturę pokojową. Ostrożnie odpipetować pierwszorzędowy roztwór przeciwciała i przemyć go trzykrotnie 400 μl buforu IF.
  9. Podczas ostatniego przemywania buforem IF przygotować rozcieńczenie 1:200 przeciwciała drugorzędowego sprzężonego z fluoroforem (patrz tabela materiałów) w pierwszorzędowym roztworze blokującym. Inkubować szkiełka w roztworze przeciwciał drugorzędowych przez 40-60 minut w temperaturze pokojowej.
  10. Przepłukać szkiełka 400 μl buforu IF przez 20 minut, a następnie dwukrotnie przepłukać PBS przez 10 minut każde.
  11. Przeciwbarwienie jąder PBS zawierającym 0,5 ng/ml barwienia jądrowego (patrz Tabela materiałów) przez 5-6 minut w temperaturze pokojowej. Umyj szkiełka trzykrotnie 400 μl PBS, aby usunąć nadmiar plam
    12. .
  12. Ostrożnie odpipetować cały PBS i upewnić się, że pozostał roztwór. Dodaj jedną kroplę odczynnika montażowego (patrz Tabela materiałów) do każdej studzienki i pozostaw na noc w temperaturze pokojowej.
  13. Przechowuj szkiełka w temperaturze pokojowej i zobrazuj je tak szybko, jak to możliwe.
  14. Obraz w powiększeniu 40x lub 63x w mikroskopie konfokalnym (patrz tabela materiałów), przyjmując optyczne przekroje Z o wielkości kroku 0,6 mm (NA = 1,4).
  15. Otwórz uzyskane obrazy za pomocą oprogramowania do przetwarzania obrazów (patrz tabela materiałów). Zademonstruj różnice morfologiczne za pomocą rzutów 3D.
    UWAGA: Najbardziej środkowy optyczny przekrój Z może być najlepiej wykorzystany do pokazania różnic w lokalizacji znaczników polaryzacji. Można je określić ilościowo ręcznie, aby przedstawić procent sferoid wykazujących ten konkretny wzór barwienia.
  16. Aby zilustrować różnice w ekspresji białek, należy przeprowadzić analizę półilościową mierzącą średnią wartość szarości lub obliczając skorygowaną całkowitą fluorescencję komórek (CTCF)23. Przedstaw dane jako wykresy skrzypiec lub kropkowe.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Komórki MCF10A, po ekspozycji na leczenie PAF, tworzą struktury groniaste o bardzo wyraźnych fenotypach. Okazało się, że α6-integryna jest błędnie zlokalizowana z większą ilością barwienia wierzchołkowego. Kilka acini wykazało również nieciągłe barwienie (Rysunek 2A). Oba te fenotypy wskazują na utratę podstawowej polaryzacji, o czym świadczy literatura24,25. Wcześniejsze doniesienia wskazują na kontrowersyjną rolę α6-integryny w przerzutach n...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sprawdzone modele oparte na liniach komórkowych są szeroko stosowane do badania procesu kancerogenezy. Jednowarstwowe hodowle komórek nadal dostarczają informacji na temat różnych molekularnych szlaków sygnałowych, które pośredniczą w charakterystycznych zmianach w komórkach nowotworowych32. Badania nad rolą dobrze znanych onkogenów, takich jak Ras, Myc i zmutowany p53, zostały po raz pierwszy opisane przy użyciu kultur jednowarstwowych jako systemu modelowego 33,34,35,36.<...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak potencjalnych konfliktów interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy IISER Pune Microscopy Facility za dostęp do sprzętu i infrastruktury oraz wsparcie dla eksperymentów. Badanie to było wspierane przez grant z Departamentu Biotechnologii (DBT), rządu Indii (BT/PR8699/MED/30/1018/2013), Science and Engineering Research Board (SERB), rządu Indii (EMR/2016/001974) oraz częściowo z IISER, Pune Core funding. A. K. był finansowany przez stypendium CSIR-SRF, L.A. był finansowany przez stypendium DST-INSPIRE, V.C był finansowany przez DBT (BT/PR8699/MED/30/1018/2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,05% Trypsyna EDTAInvitrogen25300062
16% paraformaldehydAlfa AesarAA433689M
Anti Mouse Mąka Alexa 488InvitrogenA11029
Anti Rabbit Alexa Mąka 488InvitrogenA-11008
BSASigmaA7030
Komora CoverglassNunc
ToksynaSigmaC8052-1MG1 mg / ml w dH2O
Mikroskop konfokalnyLeicaLeica SP8
DMEMGibco11965126
EDTASigmaE6758
EGFSigmaE9644-0.2MG100 mg / ml w dH2O
F(ab')2 Fragment przeciwciała wyhodowanego u kozy przeciwko mysiemu antygenowiJackson Immunoresearch115-006-006
Przeciwciało GM130Abcamab52649
Surowica koziaAbcamab7481
HoechstInvitrogen33258
Surowica koniaGibco16050122
HydrokortyzonSigmaH08881 mg/ml w etanolu
Oprogramowanie do przetwarzania obrazuImageJ
InsulinaSigmaI188210 mg/ml zapas dH2O
lrECM (Matrigel)Corning356231
Odczynnik montażowy (Slow fade Gold Anti-blade)InvitrogenS36937
Nuclear Stain  (Hoechst)Invitrogen33258
PAFCayman Chemicals91575-58-5Metylokarbamyl PAF C-16, pozyskiwany jako 10 mg/ml w etanolu
Penicylina-StreptomycynaLonza17-602E
Azydek soduSigmaS2002
Tris BaseSigmaB9754
Triton X-100SigmaT8787
Tween 20SigmaP9416
Przeciwciało VimentinAbcamab92547
α Przeciwciało 6-integrynoweMilliporeMAB1378
155409

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lacroix, M., Leclercq, G. Relevance of breast cancer cell lines as models for breast tumours: an update. Breast Cancer Research and Treatment. 83 (3), 249-289 (2004).
  2. Vargo-Gogola, T., Rosen, J. M. Modelling breast cancer: one size does not fit all. Nature Reviews Cancer. 7 (9), 659-672 (2007).
  3. Runswick, S. K., O'Hare, M. J., Jones, L., Streuli, C. H., Garrod, D. R. Desmosomal adhesion regulates epithelial morphogenesis and cell positioning. Nature Cell Biology. 3 (9), 823-830 (2001).
  4. Streuli, C. H., Bailey, N., Bissell, M. J. Control of mammary epithelial differentiation: basement membrane induces tissue-specific gene expression in the absence of cell-cell interaction and morphological polarity. Journal of Cell Biology. 115 (5), 1383-1395 (1991).
  5. Streuli, C. H., et al. Laminin mediates tissue-specific gene expression in mammary epithelia. Journal of Cell Biology. 129 (3), 591-603 (1995).
  6. Bissell, M. J., Kenny, P. A., Radisky, D. C. Microenvironmental regulators of tissue structure and function also regulate tumor induction and progression: the role of extracellular matrix and its degrading enzymes. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 70, 343-356 (2005).
  7. Heinrich, E. L., et al. The inflammatory tumor microenvironment, epithelial mesenchymal transition and lung carcinogenesis. Cancer Microenvironment. 5 (1), 5-18 (2012).
  8. Gonda, T. A., Tu, S., Wang, T. C. Chronic inflammation, the tumor microenvironment and carcinogenesis. Cell Cycle. 8 (13), 2005-2013 (2009).
  9. Berdyshev, E. V., Schmid, P. C., Krebsbach, R. J., Schmid, H. H. Activation of PAF receptors results in enhanced synthesis of 2-arachidonoylglycerol (2-AG) in immune cells. The FASEB Journal. 15 (12), 2171-2178 (2001).
  10. Rola-Pleszczynski, M., Stankova, J. Cytokine gene regulation by PGE(2), LTB(4) and PAF. Mediators of Inflammation. 1 (2), 5-8 (1992).
  11. Bussolati, B., et al. PAF produced by human breast cancer cells promotes migration and proliferation of tumor cells and neo-angiogenesis. The American Journal of Pathology. 157 (5), 1713-1725 (2000).
  12. Chakravarty, V., et al. Prolonged exposure to platelet activating factor transforms breast epithelial cells. Frontiers in Genetics. 12, 634938(2021).
  13. Chen, J., et al. Platelet-activating factor receptor-mediated PI3K/AKT activation contributes to the malignant development of esophageal squamous cell carcinoma. Oncogene. 34 (40), 5114-5127 (2015).
  14. Chen, J., et al. Feed-forward reciprocal activation of PAFR and STAT3 regulates epithelial-mesenchymal transition in non-small cell lung cancer. Cancer Research. 75 (19), 4198-4210 (2015).
  15. Vidi, P. A., Bissell, M. J., Lelievre, S. A. Three-dimensional culture of human breast epithelial cells: the how and the why. Methods in Molecular Biology. 945, 193-219 (2013).
  16. Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures. Methods. 30 (3), 256-268 (2003).
  17. Barcellos-Hoff, M. H., Aggeler, J., Ram, T. G., Bissell, M. J. Functional differentiation and alveolar morphogenesis of primary mammary cultures on reconstituted basement membrane. Development. 105 (2), 223-235 (1989).
  18. Petersen, O. W., Ronnov-Jessen, L., Howlett, A. R., Bissell, M. J. Interaction with basement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal and malignant human breast epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 89 (19), 9064-9068 (1992).
  19. Shaw, K. R., Wrobel, C. N., Brugge, J. S. Use of three-dimensional basement membrane cultures to model oncogene-induced changes in mammary epithelial morphogenesis. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 9 (4), 297-310 (2004).
  20. Weaver, V. M., Fischer, A. H., Peterson, O. W., Bissell, M. J. The importance of the microenvironment in breast cancer progression: recapitulation of mammary tumorigenesis using a unique human mammary epithelial cell model and a three-dimensional culture assay. Biochemistry and Cell Biology. 74 (6), 833-851 (1996).
  21. Lee, G. Y., Kenny, P. A., Lee, E. H., Bissell, M. J. Three-dimensional culture models of normal and malignant breast epithelial cells. Nature Methods. 4 (4), 359-365 (2007).
  22. Bodakuntla, S., Libi, A. V., Sural, S., Trivedi, P., Lahiri, M. N-nitroso-N-ethylurea activates DNA damage surveillance pathways and induces transformation in mammalian cells. BMC Cancer. 14, 287(2014).
  23. Banerjee, A., et al. A rhodamine derivative as a "lock" and SCN− as a "key": visible light excitable SCN− sensing in living cells. Chemical Communications. 49 (25), 2527-2529 (2013).
  24. Ren, G., et al. Reduced basal nitric oxide production induces precancerous mammary lesions via ERBB2 and TGFbeta. Scientific Reports. 9 (1), 6688(2019).
  25. Anandi, L., Chakravarty, V., Ashiq, K. A., Bodakuntla, S., Lahiri, M. DNA-dependent protein kinase plays a central role in transformation of breast epithelial cells following alkylation damage. Journal of Cell Science. 130 (21), 3749-3763 (2017).
  26. Sonnenberg, A., et al. Integrin alpha 6/beta 4 complex is located in hemidesmosomes, suggesting a major role in epidermal cell-basement membrane adhesion. Journal of Cell Biology. 113 (4), 907-917 (1991).
  27. Pignatelli, M., Cardillo, M. R., Hanby, A., Stamp, G. W. Integrins and their accessory adhesion molecules in mammary carcinomas: loss of polarization in poorly differentiated tumors. Human Pathology. 23 (10), 1159-1166 (1992).
  28. Natali, P. G., et al. Changes in expression of alpha 6/beta 4 integrin heterodimer in primary and metastatic breast cancer. British Journal of Cancer. 66 (2), 318-322 (1992).
  29. Davis, T. L., Cress, A. E., Dalkin, B. L., Nagle, R. B. Unique expression pattern of the alpha6beta4 integrin and laminin-5 in human prostate carcinoma. Prostate. 46 (3), 240-248 (2001).
  30. Liu, J. S., Farlow, J. T., Paulson, A. K., Labarge, M. A., Gartner, Z. J. Programmed cell-to-cell variability in Ras activity triggers emergent behaviors during mammary epithelial morphogenesis. Cell Reports. 2 (5), 1461-1470 (2012).
  31. Liu, C. Y., Lin, H. H., Tang, M. J., Wang, Y. K. Vimentin contributes to epithelial-mesenchymal transition cancer cell mechanics by mediating cytoskeletal organization and focal adhesion maturation. Oncotarget. 6 (18), 15966-15983 (2015).
  32. Kapalczynska, M., et al. 2D and 3D cell cultures-a comparison of different types of cancer cell cultures. Archives of Medical Science. 14 (4), 910-919 (2018).
  33. Schulze, A., Lehmann, K., Jefferies, H. B., McMahon, M., Downward, J. Analysis of the transcriptional program induced by Raf in epithelial cells. Genes & Development. 15 (8), 981-994 (2001).
  34. McCarthy, S. A., Samuels, M. L., Pritchard, C. A., Abraham, J. A., McMahon, M. Rapid induction of heparin-binding epidermal growth factor/diphtheria toxin receptor expression by Raf and Ras oncogenes. Genes & Development. 9 (16), 1953-1964 (1995).
  35. Willis, A., Jung, E. J., Wakefield, T., Chen, X. Mutant p53 exerts a dominant negative effect by preventing wild-type p53 from binding to the promoter of its target genes. Oncogene. 23 (13), 2330-2338 (2004).
  36. Haupt, S., Raghu, D., Haupt, Y. Mutant p53 drives cancer by subverting multiple tumor suppression pathways. Frontiers in Oncology. 6, 12(2016).
  37. Langhans, S. A. Three-dimensional in vitro cell culture models in drug discovery and drug repositioning. Frontiers in Pharmacology. 9, 6(2018).
  38. Edmondson, R., Broglie, J. J., Adcock, A. F., Yang, L. Three-dimensional cell culture systems and their applications in drug discovery and cell-based biosensors. ASSAY and Drug Development Technologies. 12 (4), 207-218 (2014).
  39. Lv, D., Hu, Z., Lu, L., Lu, H., Xu, X. Three-dimensional cell culture: A powerful tool in tumor research and drug discovery. Oncology Letters. 14 (6), 6999-7010 (2017).
  40. Jensen, C., Teng, Y. Is it time to start transitioning from 2D to 3D cell culture. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 33(2020).
  41. Saraiva, D. P., Matias, A. T., Braga, S., Jacinto, A., Cabral, M. G. Establishment of a 3D co-culture with MDA-MB-231 breast cancer cell line and patient-derived immune cells for application in the development of immunotherapies. Frontiers in Oncology. 10, 1543(2020).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Modele raka piersistruktury acynarneczynnik aktywuj cy p ytki krwimikro rodowisko guzatransformacja kom rek nab onkowychbarwienie immunofluorescencyjnemikroskopia konfokalnaprzej cie epitelialno mezenchymalne

Powiązane artykuły