Artykuł metodologiczny

Mikroiniekcja zygoty do tworzenia alleli knock-in i flox kasety genów u myszy

5.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/64161

⸱

24 czerwca 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory Animal Resource Center and Trans-Border Medical Research Center, University of Tsukuba, 2Ph.D. Program in Human Biology, School of Integrative and Global Majors, University of Tsukuba

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Obecny protokół opisuje mikroiniekcję zygoty z CRISPR-Cas9 i DNA dawcy w celu efektywnej produkcji myszy z kasetą z genami i myszami z klapkami.

Streszczenie

Technologia CRISPR-Cas umożliwiła szybkie i bezproblemowe generowanie genetycznie zmodyfikowanych myszy. W szczególności myszy i myszy z mutacją punktową są łatwo wytwarzane przez elektroporację czynników CRISPR (i jednoniciowych donorów oligo DNA) do zygoty. W przeciwieństwie do tego, myszy z kasetą genową (>1 kb) knock-in i floxed są generowane głównie przez mikrowstrzyknięcie czynników CRISPR i dwuniciowych dawców DNA do zygot. Technologie edycji genomu zwiększyły również elastyczność produkcji genetycznie modyfikowanych myszy. Obecnie możliwe jest wprowadzenie zamierzonych mutacji w docelowych regionach genomu w wielu korzystnych szczepach myszy wsobnych. Nasz zespół wyprodukował ponad 200 linii myszy knock-in z kasetą genową i ponad 110 linii myszy z floksami przez mikrowstrzyknięcie zygoty CRISPR-Cas9 w odpowiedzi na prośby z kilku krajów, w tym z Japonii. Niektóre z tych edycji genomu wykorzystywały szczepy wsobne BALB/c, C3H/HeJ i C57BL/6N, jednak większość używała C57BL/6J. W przeciwieństwie do metody elektroporacji, edycja genomu poprzez mikroiniekcję zygoty w różnych wsobnych szczepach myszy nie jest taka łatwa. Jednak myszy z kasetą z genami knock-in i floxed na pojedynczym wsobnym tle genetycznym są tak samo krytyczne, jak genetyczne humanizowane, fluorescencyjne modele myszy reporterowe i myszy z warunkowym nokautem. W związku z tym w niniejszym artykule przedstawiono protokół mikroiniekcji zygoty czynników CRISPR i dawców dwuniciowego DNA u myszy C57BL/6J w celu generowania myszy z kasetą genową knock-in i floxed. Ten artykuł skupia się wyłącznie na iniekcji jądrowej, a nie na iniekcji cytoplazmatycznej. Oprócz mikroiniekcji zygoty nakreślamy harmonogram procesu produkcji oraz techniki peryferyjne, takie jak indukcja superowulacji i transfer zarodków.

Wprowadzenie

Myszy typu knock-in, w których zamierzone geny egzogenne są wprowadzane do docelowych loci, są szeroko stosowane w wielu badaniach in vivo jako myszy humanizowane z genami, fluorescencyjne myszy reporterowe i myszy kierowców Cre1,2. Gdy mutacje knock-in są indukowane przez edycję genomu w zygotach myszy, jednoniciowy DNA (jednoniciowi dawcy oligo DNA, ssODN) lub dwuniciowy DNA (dsDNA) jest używany jako DNA dawcy2,3. ssODN jest używany głównie do wbijania stosunkowo krótkich fragmentów genów o wielkości mniejszej niż 200 bp4. Możliwe jest wbijanie fragmentów dłuższych niż 1 kb DNA za pomocą długich ssODNs (lsODN)5,6, jednak ich przygotowanie jest czasochłonne. Gdy używane są dawcy dsDNA, kaseta genowa (>1 kb) myszy knock-in mogą być generowane bez pracochłonnego przygotowania DNA dawcy7.

Główną zaletą korzystania z ssODNs jest to, że electroporation8 może generować myszy typu knock-in. Jednak dawcy dsDNA muszą być wprowadzani bezpośrednio do jądra przez mikroiniekcję zygoty. Jednoczesne knock-in w dwóch miejscach jest wymagane do stworzenia myszy floksowanych, w których każda sekwencja loxP jest wbijana przed i za docelowym genem. Istnieją dwa sposoby generowania myszy z floksami poprzez edycję genomu u mysich zygot - przy użyciu dwóch niezależnych ssODN, z których każdy zawiera pojedyncze miejsce loxP, lub przy użyciu pojedynczego dsDNA (lub lsDNA) z sekwencją floxed; Ten pierwszy jest bardzo nieefektywny9,10,11. Edycja genomu przy użyciu dawców dsDNA jest najprostszym podejściem do produkcji myszy z kasetą genową knock-in i floxedem, jeśli środowisko sprzyja mikroiniekcji zygoty.

Początkowo mieszaniny mRNA Cas9 i sgRNA lub wektory DNA kodujące sgRNA i Cas9 są używane do edycji genomu u mysich zygot12,13. Ponieważ wysokiej jakości i stabilne białka Cas9 są obecnie dostępne po niskich kosztach, wprowadzenie rybonukleoproteiny crRNA-tracrRNA-Cas9 (RNP) do mysich zygot 14 stało się popularne. Ostatnio myszy knock-in zostały wygenerowane z wysoką wydajnością poprzez wprowadzenie crRNA-tracrRNA-Cas9 RNP i DNA dawcy do obu przedjądrzy mysich zygot w fazie cyklu komórkowego, w której najbardziej prawdopodobne jest wystąpienie knock-in15. Dlatego w niniejszym protokole opisano techniki produkcji różnych typów myszy knock-in tą metodą.

Istnieje wiele użytecznych szczepów myszy laboratoryjnych16. Modyfikacja genetyczna w tle wsobnym może pomijać wpływ tła genetycznego na fenotyp. W tym artykule opisano metodę indukowania mutacji kasety genów knock-in i floxed w zygocie najczęściej używanej linii myszy wsobnych, klasy C57BL/6J17. Ponadto omówiono harmonogram generowania genetycznie zmodyfikowanych myszy i stosowane techniki peryferyjne, w tym indukcję superowulacji i transfer zarodków.

Protokół

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone w sposób humanitarny za zgodą Instytucjonalnego Komitetu Eksperymentów na Zwierzętach Uniwersytetu w Tsukubie, zgodnie z Regulaminem Eksperymentów na Zwierzętach Uniwersytetu w Tsukubie oraz Podstawowymi Wytycznymi dla Prawidłowego Prowadzenia Doświadczeń na Zwierzętach i Powiązanych Działań w Akademickich Instytucjach Badawczych pod jurysdykcją Ministerstwa Edukacji, Kultura, sport, nauka i technologia Japonii. Myszy C57BL/6J obu płci w wieku 10-25 tygodni zostały użyte jako dawca zygoty. Myszy ICR (starsze niż 10 tygodni) zostały użyte jako myszy biorcze. Myszy pozyskano ze źródeł komercyjnych (patrz tabela materiałów).

1. Potwierdzenie aktywności rozszczepienia crRNA w systemie bezkomórkowym

  1. Rozpuścić 2 nmol crRNA (na sucho) i 20 nmol tracrRNA (na sucho) odpowiednio w 25 μl i 250 μl wody wolnej od RNaz (patrz tabela materiałów).
    UWAGA: Sekwencje docelowe CRISPR, które zgodnie z przewidywaniami będą miały wysoką aktywność rozszczepienia i jak najmniej niedocelowych sekwencji, są wybierane za pomocą CRISPOR (patrz tabela materiałów). W przypadku knock-in kasety genowej, należy celować w sekwencję w poprzek miejsca insercji. Eksony do floksowania zostały wybrane za pomocą KOnezumi (patrz Tabela Materiałów).
  2. Amplifikować fragment DNA (około 0,5-1 kb) zawierający miejsce docelowe za pomocą genomowego PCR9. Oczyść ten amplikon PCR za pomocą zwykłego zestawu do ekstrakcji produktu PCR (patrz Tabela materiałów).
  3. Przygotuj 10 μl mieszaniny CRISPR (100 ng/μl crRNA, 150 ng/μL tracrRNA i 1 ng/μL Cas9 w buforze reakcyjnym nukleazy Cas9, patrz tabela materiałów). Aby zbudować kompleks CRISPR-Cas9, umieść mieszaninę CRISPR w bloku grzewczym o temperaturze 37 °C na 30 minut.
  4. Dodać całkowitą objętość (10 μl) mieszaniny CRISPR do produktu PCR (10 μl, 20 ng/μl) opisanego w kroku 1.2 i inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę. Dodać 1 μl RNazy (500 ng/μl) w celu degradacji crRNA i tracrRNA w temperaturze 37 °C przez 30 min, ponieważ RNA muszą być nieobecne podczas elektroforezy. Przeprowadzić elektroforezę powyższych próbek przy użyciu barwnika ładującego zawierającego dodecylosiarczan sodu (2% w/v).
    UWAGA: W rzadkich przypadkach obserwuje się crRNA bez aktywności rozszczepienia. W takich przypadkach zaleca się przeprojektowanie projektu edycji genomu.

2. Przygotowanie mieszaniny crRNA, tracrRNA, białka Cas9 i DNA dawcy do mikroiniekcji zygoty

  1. Przygotuj roztwór CRISPR (50 ng/μL crRNA, 200 ng/μL tracrRNA i 200 ng/μL Cas9 w wodzie wolnej od RNaz). Przygotować roztwór DNA dawcy (20 ng/μl samodzielnie skonstruowanego plazmidowego wektora DNA).
    1. Przefiltruj roztwór DNA dawcy przez sterylny filtr strzykawkowy o wielkości porów 0,22 μm. Wymieszaj równe objętości roztworu CRISPR i przefiltrowanego roztworu DNA dawcy. Upewnij się, że końcowe stężenie każdego z nich wynosi 25 ng/μl crRNA, 100 ng/μL tracrRNA, 100 ng/μL Cas9 i 10 ng/μL DNA dawcy. Mieszanina ta będzie zwana dalej RNPD.
      UWAGA: Podczas cięcia w dwóch miejscach, na przykład podczas produkcji myszy z floksami, stężenie każdego crRNA musi wynosić 25 ng / μl. DNA dawcy jest kolistym plazmidowym DNA i można je oczyścić za pomocą zwykłego zestawu mini kolumn wirujących do przygotowania preparatu (patrz tabela materiałów). Przygotowany roztwór należy jak najszybciej umieścić na lodzie i użyć do mikroiniekcji.

3. Pozyskiwanie zygot myszy przez naturalne krzyżowanie

  1. Wstrzyknąć 5 j.m. gonadotropiny surowicy ciężarnej klaczy (PMSG, patrz tabela materiałów) podskórnie samicom myszy C57BL/6J (w wieku 10-25 tygodni) na 3 dni przed mikroiniekcją. Około 46-48 godzin później podać dootrzewnowo 5 j.m. ludzkiej gonadotropiny kosmówkowej (hCG, patrz tabela materiałów). Samice myszy leczone PMSG i hCG należy trzymać razem z samcami myszy C57BL/6J i sprawdzić zatyczki dopochwowe następnego ranka.
    UWAGA: Z jednej samicy myszy C57BL/6J można uzyskać około 15-25 zygot. Oś czasu jest pokazana w Rysunek 1.
  2. Przygotuj dwie szalki Petriego o średnicy 35 mm do hodowli zygoty, jak pokazano na Rysunek 2. Umieścić je w inkubatorze (37 °C, 5% CO2) do czasu użycia. Można je przechowywać przez noc.
  3. Poddać eutanazji samice myszy z potwierdzonymi czopami pochwowymi przez zwichnięcie szyjki macicy i za pomocą małych nożyczek naciąć skórę brzucha i warstwę mięśniową od linii środkowej dolnej części brzucha poniżej żeber.
    UWAGA: Postępuj zgodnie z zaleceniami lokalnej komisji etyki zwierząt dotyczącymi eutanazji.
  4. Zebrać jajowody i umieścić je w 20 μl kropli pożywki M2 zawierającej 0,75 mg/ml hialuronidazy (patrz Tabela materiałów) na pokrywie szalki Petriego. Pobrać jeden jajowód za pomocą kleszczyków z cienką końcówką i przepuścić około 50 μl podłoża M2 z hialuronidazą przez fimbrie.
    UWAGA: W tym czasie zygoty są luźno otoczone licznymi komórkami wzgórka.
  5. Po 30 s podnieś morfologicznie normalne zygoty niewielką ilością pożywki za pomocą szklanej kapilary i umyj je, przenosząc je do świeżych kropelek pożywki M16. Przenieś umyte zygoty na szalkę Petriego (Rysunek 2) w celu zebrania.
    UWAGA: Oś czasu jest pokazana w Rysunek 1. Morfologicznie normalne zygoty mają męskie i żeńskie przedjądrze oraz dwa ciała biegunowe, które nie naruszyły poważnie kulistego kształtu15. Morfologia zygoty różni się znacznie w zależności od szczepów i gatunków.
  6. Powtarzaj kroki 3.3 i 3.4, aż wszystkie zygoty zostaną pobrane. Około 100 zygot można zebrać w jednej kropli M16 w naczyniu hodowlanym. Przechowywać naczynie w inkubatorze (37 °C, 5% CO2 ) do momentu mikroiniekcji.

4. Przygotowanie igły do mikroiniekcji

  1. Wyciągnij kilka szklanych pipet za pomocą programowalnego ściągacza do pipet (patrz Tabela materiałów).
    UWAGA: Igły do mikroiniekcji muszą mieć cienką końcówkę i długi stożek. Jeśli ściągacz posiada program do wykonywania igieł do docytoplazmatycznego wstrzykiwania plemników, ten sam program może być użyty do wykonania igieł do mikroiniekcji.
  2. Złamać końcówkę igły do mikroiniekcji, uderzając w szklaną kulkę przymocowaną do końcówki mikrokuźni. Upewnij się, że rozmiar końcówki igły do mikroiniekcji wynosi około 1 μm. Sprawdź rozmiar końcówki pod mikroskopem przy powiększeniu 1000x.
  3. Zegnij igłę do mikroiniekcji w odległości około 2-3 mm od końcówki za pomocą mikrokuźni.
    UWAGA: Kąt zgięcia zależy od ustawienia mikromanipulatora. Zbyt duże zginanie zmniejszy skuteczność impulsu piezoelektrycznego.

5. Mikroiniekcja zygoty

  1. Wstrzyknąć 1-1,5 cm płynu roboczego (korpus bezwładności, który jest potrzebny do uzyskania efektu piezoelektrycznego do wykonania otworów jako alternatywa dla rtęci, patrz Tabela materiałów) do środka igły do mikroiniekcji i przymocować ją do ręcznego uchwytu mikrowtryskiwacza za pomocą siłownika piezoelektrycznego.
    1. Następnie przymocuj igłę przytrzymującą do przeciwległego ręcznego uchwytu mikrowtryskiwacza. Stopniowo przenosić płyn operacyjny na końcówkę igły do mikroiniekcji. Zamocuj oba ręczne uchwyty mikrowtryskiwaczy na mikromanipulatorze.
      UWAGA: Płyn operacyjny wydostający się z końcówki igły do mikroiniekcji można obserwować pod mikroskopem w 50-krotnym powiększeniu. Po dostosowaniu ilości emitowanej cieczy, po zastosowaniu impulsów piezoelektrycznych można zaobserwować rozpryskiwanie cieczy, co potwierdza, że impulsy piezoelektryczne są skuteczne. Jeśli nie można tego potwierdzić, należy ponownie przygotować igłę do mikroiniekcji.
  2. Przygotować komorę iniekcyjną z trzema kroplami: (1) 10 μL M2 podłoża; (2) 5 μl 12% poliwinylopirolidonu (PVP) w pożywce M2; oraz (3) mieszaninę 5 μl crRNA, tracrRNA, białka Cas9 i roztworu DNA dawcy (RNPD). Przykryj kropelki olejem mineralnym w taki sam sposób, jak w kroku 3.2 i ustaw komorę iniekcyjną na stoliku z odwróconym mikroskopem.
    1. Pod odwróconym mikroskopem przy 50-krotnym powiększeniu opuść pipetę do mikroiniekcji do 12% spadku PVP. Odessać i dozować 12% PVP, aby oczyścić wnętrze końcówki igły do mikroiniekcji i przenieść ją do kropli RNPD.
  3. Umieścić ręczny mikrowstrzykiwacz pod podciśnieniem i zassać roztwór RNPD do igły do mikroiniekcji. Poczekaj kilka minut, aż zostanie zassana wystarczająca objętość; Pod mikroskopem powiększonym 50x napełnij całe wnętrze igły do mikroiniekcji płynem.
    1. Zatrzymaj wlot i pozwól, aby roztwór RNPD był stopniowo wydalany, ustawiając ręczny mikrowtryskiwacz na nadciśnienie. Wsunąć końcówkę igły do mikroiniekcji do oleju.
      UWAGA: Obróć pokrętło ręcznego mikrowstrzykiwacza w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara w celu inhalacji. Aby zatrzymać wdychanie, obracaj pokrętło zgodnie z ruchem wskazówek zegara i stopniowo zwiększaj ciśnienie podczas obserwacji pod mikroskopem. Roztwór RNPD będzie stopniowo opróżniany. Ruch poziomu płynu w igle do mikroiniekcji pozwala na potwierdzenie odpływu.
  4. Umieść 50 zygot w kropli M2 i delikatnie opuść pipetę trzymającą do tej samej kropli. Przenieść igłę do mikroiniekcji do kropli M2 zawierającej zygoty. Przełącz się na obiektyw 20x i skup się na końcówce pipety do mikroiniekcji.
    UWAGA: Umieść tyle zygot, ile można wstrzyknąć w ciągu 10 minut.
  5. Przytrzymaj zygotę i skup się na przedjądrzu, poruszając mikromanipulatorem. Włóż igłę do mikroiniekcji do zygoty i zbliż końcówkę do przedjądrza. Gdy końcówka dotrze do błony przedjądrza, zastosuj impuls piezoelektryczny (intensywność: 6-10, prędkość: 1) do przebicia.
    1. Gdy igła do mikroiniekcji nakłuje przedjądrze, wstrzyknij roztwór RNPD i obserwuj obrzęk przedjądrza. Gdy przedjądrze zostanie całkowicie napompowane, szybko wyciągnij igłę. Wykonaj tę samą procedurę zarówno na przedjądrzu żeńskim, jak i męskim.
      UWAGA: Nadmuchanie przedjądrza przez wstrzyknięcie można wyraźnie zobaczyć pod mikroskopem. Stopień tej inflacji jest trudny do zwerbalizacji, ale można go potwierdzić, odwołując się do poprzednich raportów15.
  6. Przenieś wstrzykniętą zygotę w inne miejsce w kropli M2, aby zidentyfikować zygoty przed i po wstrzyknięciu.
  7. Powtarzaj kroki 5.5-5.6, aż wszystkie zygoty w kropli M2 zostaną wstrzyknięte. Po wstrzyknięciu przenieść zygoty do świeżego naczynia M16.
  8. Zygoty, które przeżyły, należy wybrać po 10 minutach od wstrzyknięcia. Usunąć zlizowane zygoty, które zostały uszkodzone przez wstrzyknięcie i rozprowadzić ocalałe zygoty do każdej kropli w szalce M16. Każda kropla musi zawierać 20-24 zygoty na jedną samicę w ciąży rzekomej. Skraca to czas, w którym szalka M16 jest wystawiona na działanie środowiska na zewnątrz inkubatora podczas transferu zarodków.
    UWAGA: W optymalnych warunkach iniekcji wskaźnik przeżycia wynosi 90%-95%. Zależy to od wielkości końcówki igły, siły impulsu piezoelektrycznego i ciśnienia odpływu roztworu RNPD.

6. Transfer zarodków do jajowodu

  1. Aby uzyskać myszy w ciąży rzekomej, połącz każdą samicę myszy ICR w fazie proestrus z naczynioligowanym samcem myszy ICR. Sprawdź wtyczki następnego dnia.
    UWAGA: Około 15 pseudociężarnych myszy uzyskuje się z 20 par godowych.
  2. Samicom myszy w ciąży rzekomej należy podawać trzy rodzaje mieszanych środków znieczulających (0,2 mg/kg medetomidyny, 4,0 mg/kg mc. midazolamu i 2,5 mg/kg butorfanolu, patrz tabela materiałów). Potwierdź odpowiednie znieczulenie poprzez zmniejszenie częstości oddechów i zanik odruchów szczypania ogona i odruchu wycofania pedału kończyn tylnych. Zastosuj maść okulistyczną, aby nawilżyć oczy zgodnie z zaleceniami lokalnej komisji etyki zwierząt.
  3. Po ogoleniu brzytwą okolicy grzbietowej myszy w pozycji leżącej i trzykrotnej dezynfekcji obszaru operacyjnego, na przemian za pomocą peelingu na bazie jodu lub chlorheksydyny i alkoholu, naciąć skórę grzbietową około 1 cm wzdłuż kręgosłupa małymi nożyczkami preparacyjnymi.
  4. Przesuń ranę po nacięciu grzbietowym na bok brzusznie, naciąć warstwę mięśniową, przez którą widać jajnik, chwyć tłuszcz nad jajnikiem pęsetą i wycofaj jajnik, jajowód i macicę.
    1. Zabezpiecz tłuszcz za pomocą zacisku serrefine (patrz Tabela materiałów). Umieść tkanki rozrodcze na sterylnej gazie, aby uniknąć bezpośredniego kontaktu z sierścią.
  5. W następującej kolejności umieść niewielką ilość pożywki hodowlanej (M2 lub M16), kilka pęcherzyków powietrza jako znacznik, a zygoty w pipecie do transferu.
    UWAGA: Przenieś około 10-12 zygot na jajowód.
  6. Wykonaj nacięcie za pomocą mikronożyc (patrz Tabela materiałów) między bańką a fimbriami jajowodu (wystarczająco długie, aby umożliwić wejście szklanej pipety), wprowadź zygoty do nacięcia i jednocześnie potwierdź, że pęcherzyk powietrza został wprowadzony.
  7. W podobny sposób należy przeprowadzić implantację do drugiego jajowodu (krok 6.6).
  8. Zszyj zewnętrzną skórę za pomocą automatycznych klipsów (patrz Tabela materiałów).
    UWAGA: Nie należy zszywać naciętej warstwy mięśniowej, chyba że rana po nacięciu jest nieuchronnie duża. Idealny rozmiar naciętej warstwy mięśniowej powinien być mniejszy niż 2-3 mm. Jeśli nacięcie jest większe niż 5 mm, warstwę mięśniową należy zszyć za pomocą wysterylizowanej igły do szycia i nici (patrz tabela materiałów).

7. Odzyskiwanie zwierząt

  1. Podawać myszom chlorowodorek atipamezolu (0,3 mg/kg) podskórnie.
    UWAGA: Postępuj zgodnie z zaleceniami lokalnej komisji etycznej ds. zwierząt dotyczącymi analgezji pooperacyjnej.
  2. Następnie umieść myszy w klatkach i utrzymuj je w cieple na gorącej płycie w temperaturze 37 °C.
  3. Po obudzeniu myszy utrzymuj je w cieple przez około 2 godziny. Po potwierdzeniu, że myszy nie zachowują się nieprawidłowo, zwróć klatki do stojaka hodowlanego.

Wyniki

Wyniki produkcji myszy z wbudowanymi kasety genowymi i myszy z floxed przy użyciu tego protokołu przedstawiono w Tabeli 1 i Tabeli 2. Geny docelowe nie zostały podane, ponieważ każda linia myszy z modyfikowanym genomem jest obecnie wykorzystywana w niezależnym, nieopublikowanym projekcie. Zamiast tego opisano docelowe regiony chromosomowe.

Analizy genotypowania przeprowadzono za pomocą wcześniej opisanej metody18. W tej metodzie genotypowania myszy, u których DNA dawcy zostało wstawione w niezamierzone miejsca chromosomowe, nie uznaje się za osobniki pozytywne, nawet jeśli doszło do żądanego edycji genomu. W związku z tym przedstawiono skuteczność otrzymywania myszy fundatorów rzeczywiście przydatnych do praktycznych zastosowań, a nie samą skuteczność edycji genomu.

Mediana skuteczności produkcji 13 niezależnych myszy z wprowadzonym kasety genowej wyniosła 20,8%, przy maksymalnej wartości 39,5% i minimalnej 7,9% (Tabela 1). Uznano, że skuteczność ta jest wystarczająco praktyczna. Podczas wprowadzania kasety genowej nie kierowano się genami powodującymi śmiertelność w stadium embrionalnym. Mediana częstości urodzeń w warunkach kierowania do genów niepowodujących śmiertelności wyniosła 34,0% (maksymalnie 43,3%, minimalnie 15,9%). Ponieważ wartość ta jest porównywalna z częstością urodzeń po transferze embrionów bez ingerencji genetycznej, uznano, że toksyczność wprowadzonych elementów edycji genomu oraz uszkodzenia mechaniczne spowodowane mikroiniekcją w zygocie mało prawdopodobne jest, by wpływały na rozwój embrionalny.

Średnia skuteczność produkcji 10 niezależnych myszy z floxed wyniosła 7,7%, przy maksymalnej wartości 20,7% i minimalnej 2,1% (Tabela 2). Chociaż funkcje kilku badanych genów były nieznane, średnia częstość urodzeń wyniosła 30,2%, przy maksymalnej wartości 43,8% i minimalnej 17,3%. Wskaźnik ten był porównywalny do myszy z wbudowaną kasety genową, co sugeruje, że mikroiniekcja ma znikomy wpływ na rozwój embrionalny myszy z floxed.

Harmonogram manipulacji zarodkami, dzienne harmonogramy przeszczepiania zarodków w doświadczeniu rozrodu myszy.
Rycina 1: Harmonogram mikroiniekcji zarodków. Biały i ciemny kolor oznaczają odpowiednio cykl światła i ciemności. Myszy utrzymywano w cyklu 14 godzin światła / 10 godzin ciemności. PMSG: gonadotropina ciężarnych klaczyc; hCG: gonadotropina kosmówkowa człowieka Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Diagram Petri z hodowlą komórkową w pożywce M16, z warstwą oleju mineralnego, porównanie warunków.
Rycina 2: Przygotowanie szalek hodowlanych. (A) Szalka hodowlana dla zarodków przed iniekcją. Umieścić dwie krople pożywki M16 (po 20–25 µL każda) w szalce Petriego o średnicy 35 mm wykonanej z tworzywa sztucznego. (B) Szalka hodowlana dla zarodków po iniekcji. Umieścić dziesięć kropli pożywki M16 (po 10–20 µL każda) w szalce Petriego o średnicy 35 mm wykonanej z tworzywa sztucznego. Krople pokryć warstwą oleju mineralnego (3 mL). Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Docelowy region chromosomowyLiczbaDługość insercji typu knock-in (kb)Długość ramion homologii (kb)
EmbriówNoworodkówPrzebadanych (odstawienie od mleka)Knock-in bez rTGrTGc
wstrzykniętychprzeniesionychramię 5’ramię 3’
2qE2349331114 (34,4%)a1149 (7,9%)b5 (4,4%)d1,01,01,0
2qE223121578 (36,3%)a7415 (20,3%)b23 (31,1%)d2,21,01,1
5qG228826290 (34,4%)a8119 (23,5%)b18 (22,2%)d1,62,02,0
6qB127825958 (22,4%)a4611 (23,9%)b11 (23,9%)d4,21,21,0
6qE3 [ROSA26]29527797 (35,0%)a232 (8,7%)b4 (17,4%)d6,51,13,0
6qE3 [ROSA26]24621987 (39,7%)a8322 (26,5%)b18 (21,7%)d5,81,13,0
7qF5279268116 (43,3%)a11445 (39,5%)b44 (38,6%)d1,43,11,0
11qB440535356 (15,9%)a478 (17,0%)b12 (25,5%)d1,71,00,8
11qD310294100 (34,4%)a9815 (15,3%)b76 (77,6%)d1,01,82,4
12qE36832086 (26,9%)a8412 (14,3%)b19 (22,6%)d3,41,11,3
12qF131526576 (28,7%)a7217 (23,6%)b28 (38,9%)d1,01,11,1
14qE525621548 (22,3%)a4811 (22,9%)b21 (43,8%)d3,11,00,9
14qE528728585 (29,8%)a7215 (20,8%)b19 (26,4%)d2,61,00,9

Tabela 1: Produkcja myszy z wprowadzonym genem metodą mikroiniekcji. W tabeli przedstawiono wskaźnik urodzeń oraz skuteczność otrzymywania myszy noszących zamierzony allel wprowadzony bez (W/O) losowej integracji (rTG) DNA dawcy. Uzyskanie myszy z zamierzonym allelem wprowadzonym było możliwe we wszystkich projektach. a: Liczba urodzonych myszy / liczba przeniesionych embrionów; b: Liczba myszy noszących allel wprowadzony / liczba przebadanych myszy; c: niepewność co do obecności zamierzonego allelu; d: Liczba myszy noszących allel rTG / liczba przebadanych myszy; rTG: losowa integracja wektora dawcy. W/O: bez.

Docelowy region chromosomowyLiczbadługość floxed (kb)Długość ramion homologii (kb)
EmbriówNoworodkówPrzebadanych (odstawienie od piersi)floxed bez rTG
wstrzykniętychprzeniesionych5' ramię3' ramię
3qC32531393 (29,7%)a879 (10,3%)b1,31,21,1
4qB121020036 (18,0%)a296 (20,7%)b1,61,20,9
4qC4272256112 (43,8%)a1005 (5,0%)b2,41,01,4
5qF14313740 (29,2%)a406 (15,0%)b1,81,01,1
5qF25522780 (35,2%)a762 (2,6%)b1,31,10,9
9qE3.128926180 (30,7%)a779 (11,7%)b1,21,21,2
10qB328426988 (32,7%)a783 (3,8%)b1,31,10,9
10qC124323140 (17,3%)a384 (10,5%)b2,11,01,3
14qE5390372139 (37,4%)a1355 (3,7%)b1,10,80,9
17qA3.338337499 (26,5%)a952 (2,1%)b2,10,60,8

Tabela 2: Produkcja myszy z floxowanym genem metodą mikropostrzelenia. W tabeli przedstawiono wskaźnik urodzeń oraz skuteczność otrzymywania myszy noszących zamierzony allel flox bez (W/O) losowej integracji (rTG) DNA dawcy. Udało się uzyskać myszy z zamierzonym allelem flox we wszystkich projektach. a: Liczba noworodków/liczba przeniesionych embrionów; b: liczba myszy noszących allel flox/liczba przebadanych myszy. rTG: losowa integracja wektora dawcy; W/O: bez.

Dyskusja

W niniejszym badaniu świeże (nie mrożone i rozmrożone) mysie zygoty C57BL/6J, uzyskane z naturalnego krycia, zostały użyte do produkcji myszy edytujących genom. Poprzez wstrzyknięcie crRNA-tracrRNA-Cas9 i DNA dawcy (RNPD) do obu przedjądrzy tych zygot w fazie cyklu komórkowego, w której najprawdopodobniej wystąpi knock-in, wygenerowano myszy knock-in kasety genowej i myszy floxed o wysokim wskaźniku urodzeń i wystarczającej wydajności edycji genomu. Obecne badania wzmacniają rozszerzalność metody SPRINT-CRISPR15, w której zapewnia ona wystarczającą skuteczność knock-in nawet w tle genetycznym C57BL/6J i może być stosowana do produkcji myszy z floksami.

Elektroporacja jest wysoce uogólnioną metodą produkcji myszy z edytowanym genomem ze względu na niski koszt urządzeń eksperymentalnych i łatwość nauczenia się tej techniki8. Ponadto metoda i-GONAD19, w której edycja genomu odbywa się na zarodkach preimplantacyjnych istniejących w jajowodzie, nie wymaga myszy biorcy. W porównaniu z tymi metodami, przedstawiona tu metoda jest kosztowna i czasochłonna przy przygotowaniu i utrzymaniu środowiska eksperymentalnego zarówno pod względem sprzętowym, jak i programowym. Jednak po skonfigurowaniu urządzeń eksperymentalnych, złożone myszy z kasetą genową knock-in i floxed mogą być produkowane tylko z dostępnymi na rynku elementami CRISPR (crRNA, tracrRNA i białko Cas9) oraz prostą, niewielką ilością kolistego wektora plazmidowego, który ma być używany jako DNA dawcy. Oznacza to, że wiele złożonych linii myszy z edytowanym genomem można wyprodukować bez konieczności przygotowania czasochłonnych (lub stosunkowo drogich) lsODN 5,6 lub wektorów wirusa związanego z adenowirusem20.

W przeciwieństwie do oryginalnej metody SPRINT-CRISPR15, użyto świeżych (mrożono-rozmrożonych) zygot. W przypadku uzyskiwania świeżych zygot przez naturalne krycie można zignorować błędy techniczne, które mogą wystąpić podczas zapłodnienia in vitro lub zamrażania i rozmrażania. Ponadto proces manipulacji zarodkami można zakończyć w ciągu około pół dnia (ryc. 1) zgodnie z obecnym podejściem. Z drugiej strony, niektóre ograniczenia obecnej metody obejmują wymóg wielu samców myszy, luźną kontrolę czasu zapłodnienia oraz ograniczoną zdolność do całkowitego przewidzenia liczby zygot do mikroiniekcji. W porównaniu z oryginalną metodą SPRINT-CRISPR, metoda ta może charakteryzować się wyższym wskaźnikiem urodzeń (Tabela 1). Mimo to nie można stwierdzić, że obecna metoda jest lepsza pod względem przyrostu naturalnego ze względu na różnice w przewodnikach eksperymentu, genach docelowych, tle genetycznym i czasie potwierdzenia zarodka.

Jak pokazano w Tabeli 1, duża liczba myszy w większości projektów knock-in kasety genowej miała losowe allele integracyjne. Przypadkowa integracja musi zostać wyeliminowana, ponieważ może prowadzić do niezamierzonego zakłócenia endogennych genów i ektopowej ekspresji transgenów. Wyzwaniem na przyszłość jest znalezienie warunków eksperymentalnych, które zmniejszą liczbę losowych zdarzeń integracyjnych przy jednoczesnym zachowaniu wystarczającej wydajności efektu dominacji.

Prawie cała edycja genomu zygoty myszy przy użyciu efektorów edycji genomu, które powodują pęknięcia podwójnej nici DNA, prawdopodobnie wywoła niezamierzone mutacje w miejscach docelowych 9,21. Wyniki tych niezamierzonych mutacji docelowych nie są tutaj opisane, ponieważ nie jesteśmy w sytuacji, w której można zarządzać następnym pokoleniem myszy w celu przedstawienia wyraźnych dowodów na ich istnienie. Najlepszym sposobem na wykluczenie obaw związanych z zamieszaniem spowodowanym niezamierzoną mutagenezą docelową jest uzyskanie następnego pokolenia myszy poprzez kojarzenie założycieli z myszami typu dzikiego, a nie krzyżowanie założycieli. Zasadniczo myszy N1 powstałe w wyniku tej krzyżówki są typem dzikim (WT) po jednej stronie allelu, więc jeśli zostanie wykryty zamierzony allel knock-in (KI), są one heterozygotyczne WT / KI. W związku z tym mutageneza celowa nie stanowi krytycznego problemu u myszy laboratoryjnej, która ma stosunkowo szybki cykl życiowy i jest płodnym zwierzęciem. Konieczne będzie jednak dalsze doskonalenie, gdy technologia ta zostanie zastosowana do stosunkowo dużych ssaków.

Potwierdzono, że technologia ta może produkować myszy z kasetą genową knock-in w szczepach wsobnych innych niż C57BL/6J, ale wystarczająca liczba projektów nie jest zabezpieczona, a dane są bardzo zmienne. Z tego powodu informacje te nie zostały uwzględnione w niniejszym badaniu. Uważa się, że konieczne będą dalsze badania na ten temat, aby posunąć naprzód genetykę myszy i badania nad modelami chorób.

Oświadczenia

Autorzy zadeklarowali brak sprzecznych interesów.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Badania Naukowe (B) (19H03142: do SM), Badania Naukowe (A) (20H00444: do FS), Badania Naukowe (A) (21H04838: do SM) oraz Badania Naukowe w Obszarach Innowacyjnych "Platforma Zaawansowanego Wsparcia Modeli Zwierzęcych" (16H06276: do ST) z Ministerstwa Edukacji, Kultury, Sportu, Nauki i Technologii. Fundatorzy nie odgrywali żadnej roli w projektowaniu badań, gromadzeniu i analizie danych, podejmowaniu decyzji o publikacji ani przygotowywaniu manuskryptów. Jesteśmy wdzięczni Ryoichi Mori za jego pomocną dyskusję na temat projektowania edycji genomu.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Chlorowodorek atypamezoluZENOAQ-Autoclip
Wound ClipBD427631
Autoclip Wound Clip ApplierBD427630
ButorfanolMeiji Seika
/6J myszyJackson Laboratory Japonia-starsze niż 10 tygodni
Kalibrowany pipet, 100ulDrummond Scientific Company2-000-100do zbierania zygoty i transferu zarodków
Cas9Thermo Fisher ScientificA36499
Cas9 Bufor reakcyjny nukleazyNEBB7203
CellTram 4r  olejEppendorf5196000030
CRISPORhttp://crispor.tefor.net/web narzędzie do eksperymentów edycji genomu z System CRISPR-Cas9
crRNAZestawIDT-Gel
/PCRFastGeneFG-91302
hCGASKA Animal
Merck Sigma-AldrichH3884
ICR myszyJackson Laboratory Japonia-starsze niż 10 tygodni, waga 28 G lub więcej
Mikroskop odwróconyLeica
KOnezumihttps://www.md.tsukuba.ac.jp/LabAnimalResCNT/KOanimals/konezumi.htmlaplikacja internetowa do automatyzacji strategii rozrywania genów w celu generowania myszy z nokautem
M16 mediumMerck Sigma-AldrichM7292
M2 mediumMerck Sigma-AldrichM7167
MedetomidineZENOAQ-
MikronożyceNatsume SeisakushoMB-54-1
MicroforgeNarishigeMF-900do polerowania ogniowego pipety trzymającej i zginania igły do mikroiniekcji
Jednostki mikromanipulacyjneŚciągacz do mikropipet Narishige
Programowalny ściągacz do pipetSutter InstrumentP-1000
MidazolamMaruishi Pharmaceutical-
MILLEX-GV 0,22 &mikro; m filtrMerck MilliporeSLGV033R
Olej mineralnyNacalai26114-75do hodowli zygoty i komory iniekcyjnej
szalka Petriego (35 mm, nieobrobiona)Iwaki1000-035do hodowli zygoty
Mikromanipulator PIEZOPRIME TECHPMM-150
Plasmid Mini KitFastGeneFG-90502zestaw mini kolumny wirującej do przygotowania
Płyn operacyjny PMMPRIME TECHKIT-APłyn operacyjny do mikroiniekcji
PMSGASKA Animal
Merck Sigma-AldrichP5288
RNazaQIAGEN19101
Woda wolna od RNazIDT-tracrRNADodatkowe odczynniki
Zacisk SerrefineNatsume SeisakushoC-18
Dodecylosiarczan soduSIGMA151-21-3
Igła do szwów z gwintemNatsume SeisakushoC11-60B2
Cienkościenne szkło borokrzemianowe
bez filamentu		Sutter InstrumentB100-75-10do igły do mikroiniekcji i pipety przytrzymującej
tracrRNAIDT-
Pharma-C57BL do ekstrakcji Health-Hialuronidaza Health-Polyvinylopirolidon

Bibliografia

  1. Suzuki, H., et al. Generation of bicistronic reporter knockin mice for visualizing germ layers. Experimental Animals. 68 (4), 499-509 (2019).
  2. Le, H. T., et al. Generation of B6-Ddx4(em1(CreERT2)Utr) , a novel CreERT2 knock-in line, for germ cell lineage by CRISPR/Cas9. Genesis. 58 (7), 23367(2020).
  3. Osawa, Y., et al. EXOC1 plays an integral role in spermatogonia pseudopod elongation and spermatocyte stable syncytium formation in mice. Elife. 10, 59759(2021).
  4. Funato, H., et al. Forward-genetics analysis of sleep in randomly mutagenized mice. Nature. 539 (7629), 378-383 (2016).
  5. Yoshimi, K., et al. ssODN-mediated knock-in with CRISPR-Cas for large genomic regions in zygotes. Nature Communications. 7, 10431(2016).
  6. Miura, H., Gurumurthy, C. B., Sato, T., Sato, M., Ohtsuka, M. CRISPR/Cas9-based generation of knockdown mice by intronic insertion of artificial microRNA using longer single-stranded DNA. Scientific Reports. 5, 12799(2015).
  7. Murata, K., et al. Efficient induction of proximity-dependent labelling by biotin feeding in BMAL1-BioID knock-in mice. The Journal of Biochemistry. 170 (4), 453-461 (2021).
  8. Kaneko, T., Mashimo, T. Simple genome editing of rodent intact embryos by electroporation. PLoS One. 10 (11), 0142755(2015).
  9. Kuno, A., et al. DAJIN enables multiplex genotyping to simultaneously validate intended and unintended target genome editing outcomes. PLOS Biology. 20 (1), 3001507(2022).
  10. Miyasaka, Y., et al. CLICK: one-step generation of conditional knockout mice. BMC Genomics. 19 (1), 318(2018).
  11. Gurumurthy, C. B., et al. Reproducibility of CRISPR-Cas9 methods for generation of conditional mouse alleles: a multi-center evaluation. Genome Biology. 20 (1), 171(2019).
  12. Yang, H., et al. One-step generation of mice carrying reporter and conditional alleles by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 154 (6), 1370-1379 (2013).
  13. Hasegawa, Y., et al. Generation of CRISPR/Cas9-mediated bicistronic knock-in ins1-cre driver mice. Experimental Animals. 65 (3), 319-327 (2016).
  14. Aida, T., et al. Cloning-free CRISPR/Cas system facilitates functional cassette knock-in in mice. Genome Biology. 16, 87(2015).
  15. Abe, T., Inoue, K. I., Furuta, Y., Kiyonari, H. Pronuclear Microinjection during S-phase increases the efficiency of CRISPR-Cas9-assisted knockin of large DNA donors in mouse zygotes. Cell Reports. 31 (7), 107653(2020).
  16. Lilue, J., et al. Sixteen diverse laboratory mouse reference genomes define strain-specific haplotypes and novel functional loci. Nature Genetics. 50 (11), 1574-1583 (2018).
  17. Birling, M. C., et al. A resource of targeted mutant mouse lines for 5,061 genes. Nature Genetics. 53 (4), 416-419 (2021).
  18. Mizuno-Iijima, S., et al. Efficient production of large deletion and gene fragment knock-in mice mediated by genome editing with Cas9-mouse Cdt1 in mouse zygotes. Methods. 191, 23-31 (2021).
  19. Ohtsuka, M., et al. i-GONAD: a robust method for in situ germline genome engineering using CRISPR nucleases. Genome Biology. 19 (1), 25(2018).
  20. Mizuno, N., et al. Intra-embryo gene cassette knockin by CRISPR/Cas9-mediated genome editing with adeno-associated viral vector. iScience. 9, 286-297 (2018).
  21. Burgio, G., Teboul, L. Anticipating and identifying collateral damage in genome editing. Trends in Genetics. 36 (12), 905-914 (2020).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Edycja CRISPR-Cas9myszy modyfikowane genetyczniemikroiniekcja pronuklearnadwuniciowy donor DNAindukcja superowulacjitransfer zarodkówinbredowe linie myszy
Mikroiniekcja zygoty do tworzenia alleli knock-in i flox kasety genów u myszy
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.