Artykuł metodologiczny

Określanie skuteczności dezynfekcji wirusowej podczas prania gorącą wodą

3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/64164

⸱

21 czerwca 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Office of Research and Development, Center for Environmental Solutions and Emergency Response, Homeland Security and Materials Management Division, U.S. Environmental Protection Agency, 2Jacobs Technology Inc., 3Science Systems and Applications Inc., 4CSS Inc.

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

W odpowiedzi na pandemię koronawirusa zespołu ciężkiej ostrej niewydolności oddechowej 2 (SARS-CoV-2), opracowano protokół laboratoryjny w celu przetestowania skuteczności dezynfekcji wirusowej za pomocą prania gorącą wodą osłon twarzy, bawełnianych fartuchów i spodni dżinsowych. Wirus Phi6 (bakteriofag) został wykorzystany jako organizm do zbadania skuteczności dezynfekcji.

Streszczenie

Ten protokół stanowi przykład procesu laboratoryjnego do przeprowadzania badań nad praniem, które generują dane na temat dezynfekcji wirusów. Chociaż protokół został opracowany na potrzeby badań podczas pandemii choroby koronawirusowej 2019 (COVID-19), ma on stanowić ramę, którą można dostosować do innych badań nad dezynfekcją wirusów; Przedstawiono w nim etapy przygotowania testowego wirusa, zaszczepiania materiału testowego, oceny zmian wizualnych i integralności umytych rzeczy w wyniku procesu prania oraz ilościowego określenia redukcji wiremii. Ponadto w protokole określono niezbędne próbki kontroli jakości, aby zapewnić, że eksperymenty nie są stronnicze z powodu zanieczyszczenia i pomiarów/obserwacji, które powinny być rejestrowane w celu śledzenia integralności materiałowej elementów środków ochrony osobistej (PPE) po wielu cyklach prania. Reprezentatywne wyniki przedstawione w protokole wykorzystują bakteriofag Phi6 zaszczepiony na bawełnianym peelingu, dżinsie i bawełnianych materiałach do pokrywania twarzy i wskazują, że proces prania i suszenia gorącą wodą osiągnął ponad 3-logarytmiczną (99,9%) redukcję wiremii dla wszystkich próbek (redukcja o 3 log to wskaźnik wydajności środka dezynfekującego w wytycznych Agencji Ochrony Środowiska USA dotyczących testów wydajności produktów 810.2200). Zmniejszenie wiremii było jednakowe w różnych miejscach na środkach ochrony indywidualnej. Wyniki tego protokołu testowania skuteczności dezynfekcji wirusowej powinny pomóc społeczności naukowej w zbadaniu skuteczności prania w domu w przypadku innych rodzajów wirusów testowych i procedur prania.

Wprowadzenie

Pandemia koronawirusa 2019 (COVID-19) spowodowała bezprecedensowe zakłócenia w globalnym łańcuchu dostaw i doprowadziła do krytycznego niedoboru wielu artykułów, w tym niezbędnych środków ochrony osobistej (PPE)1,2,3. Osoby wykonujące zawody wysokiego ryzyka musiały dostosować się do zalecanych strategii zdolności kryzysowych, a społeczeństwo przyjęło stosowanie niespecjalistycznych przedmiotów, takich jak osłony twarzy z materiału tkaninowego, głównie w celu kontroli źródła, ale także w celu zapewnienia użytkownikom pewnej ochrony dróg oddechowych. W Stanach Zjednoczonych specjalistyczna ochrona dróg oddechowych (tj. maski filtrujące maski oddechowe (FFR), takie jak N95) była zarezerwowana dla niektórych z tych zawodów wysokiego ryzyka (np. opieka zdrowotna) podczas niedoborów zaopatrzenia4. Kiedy niewiele było wiadomo o transmisji koronawirusa zespołu ciężkiej ostrej niewydolności oddechowej 2 (SARS-Cov-2), na początku pandemii rozważano również różne inne rodzaje materiałów odzieżowych jako ochronę barierową5. Wraz z różnorodnością tkanin używanych do ochrony użytkowników, pojawiły się pytania dotyczące użytkowania, ponownego użycia i dezynfekcji/odkażania tych przedmiotów. Podczas gdy w Stanach Zjednoczonych powszechnie akceptowano, że rutynowe pranie w domu zakryć twarzy i innych elementów odzieży sprawia, że wirusy na tych powierzchniach stają się niezakaźne, istnieje niewiele danych potwierdzających to twierdzenie i brakuje opublikowanych protokołów laboratoryjnych do testów. Celem przedstawionego tutaj protokołu badawczego jest przedstawienie przykładowego procesu laboratoryjnego do przeprowadzania badań prania, które generują dane na temat dezynfekcji wirusowej. Chociaż protokół został opracowany na potrzeby badań podczas pandemii COVID-19, ma on stanowić ramy, które można dostosować do innych badań nad dezynfekcją wirusów.

Rola odzieży w przenoszeniu chorób jest trudna do oszacowania. Międzynarodowe Forum Naukowe ds. Higieny Domowej podjęło się tego trudnego zadania, przeprowadzając przegląd roli odzieży w rozprzestrzenianiu się chorób zakaźnych w połączeniu z oceną ryzyka praktyk higieny domowej6. W pracy tej uwzględniono przegląd kilku badań naukowych, w których badano przeżywalność różnych szczepów wirusa na różnych rodzajach tkanin, takich jak wełna i bawełna7,8,9,10,11. Każde badanie koncentrowało się na innym typie wirusa, w tym krowiance, wirusie polio, syncytialnym wirusie oddechowym, wirusie opryszczki i wirusie grypy. Czas przeżycia różnych wirusów na tkaninach wynosił od 30 minut do 5 miesięcy, w zależności od kombinacji wirusa i materiału. Kilka badań wykazało również przenoszenie skażenia wirusowego z materiału na ręce. W ramach publikacji omówiono skuteczne pranie pieniędzy jako ważną technikę zarządzania mającą na celu ograniczenie transmisji, ale uznano, że skala wpływu prania pieniędzy na zmniejszenie obciążenia chorobami zależy od konkretnego zanieczyszczenia wirusowego i jest trudna do określenia ilościowego7,8,9,10,11.

Proces prania niszczy mikroorganizmy za pomocą procesów chemicznej, fizycznej i termicznej. Na przykład mydła i detergenty mogą oddzielać zabrudzenia i mogą nadawać pewne chemiczne działanie przeciwdrobnoustrojowe. Fizycznie rozcieńczanie i mieszanie może pomóc w zmniejszeniu miana wirusa. Badanie oceniające trwałość ludzkiego koronawirusa HCoV-OC43 na próbkach bawełny przy użyciu przemysłowych i domowych cykli prania z temperaturą i detergentem oraz bez nich, nie wykazało wykrywalnego wirusa podczas prania w nieogrzewanej wodzie bez detergentu, ale w obecności obciążenia glebą (sztuczna ślina) cykle prania w gospodarstwie wymagały detergentu, aby próbki nie zawierały niewykrywalnych ładunków wirusa12. Gorąca woda sama w sobie może również stanowić skuteczny sposób na zniszczenie niektórych mikroorganizmów13,14.

W niedawnej publikacji podsumowującej stan obecnych praktyk pralniczych, wiele czynników, takich jak skład tkaniny, warunki przechowywania, obciążenie brudem, temperatura i czas prania oraz temperatura suszenia, zostało zidentyfikowanych jako różne w globalnych praktykach prania15. Chociaż pranie jest powszechną metodą czyszczenia dla dużego odsetka populacji, ta duża różnica w istniejących praktykach sprawia, że wydanie szczegółowych wskazówek, jak robić to bezpiecznie i skutecznie, gdy przedmiot może być skażony wirusem, jest trudne i rzadkie. Podczas pandemii COVID-19 amerykańskie Centra Kontroli i Prewencji Chorób (CDC) wydały wytyczne dotyczące prania przedmiotów dla właścicieli domów16,17. Wiele z tych wytycznych dotyczących prania zostało opartych na kilku starszych badaniach dotyczących dezynfekcji bakteryjnej18,19 i poparte kilkoma badaniami laboratoryjnymi, które wykazały, że wirusy otoczkowe są inaktywowane w wodzie z detergentami20,21. Wskazówki można podsumować następująco: 1) postępuj zgodnie z instrukcjami producenta detergentu, 2) używaj najcieplejszej odpowiedniej dawki wody oraz 3) całkowicie wysusz rzeczy. Uzasadnieniem tych zaleceń było to, że pranie w możliwie najcieplejszym cyklu z detergentem w połączeniu z całkowitym wysuszeniem (w miarę możliwości ciepłem) zabije wirusa SARS-CoV-2.

Sama liczba możliwych wariantów procesu prania wymaga jednolitego protokołu, takiego jak przedstawiony tutaj, aby móc izolować zmienne i testować skuteczność dezynfekcji wirusowej określonych procesów. Celem tego protokołu w połączeniu z filmem instruktażowym jest zademonstrowanie laboratoryjnego procesu prania gorącej wody w celu replikacji w innych badaniach naukowych. Ponadto wyniki tych testów skuteczności dezynfekcji wirusowej powinny zbudować zaufanie konsumentów do skuteczności prania brudnych pieniędzy w domu podczas pandemii wirusowych.

Protokół

Wirus Phi6 został otrzymany z laboratorium współpracującego w formie zamrożonej alikwoty o objętości ~1 mL i przechowywany w temperaturze -80 °C do momentu użycia. Początkowo wykorzystano go do namnożenia większych zapasów wirusa, które następnie przechowywano w -80 °C do czasu użycia. Wybrano wirusa Phi6 jako model demonstracyjny, ponieważ jest on powszechnie stosowany jako modelowy wirus otoczkowy, można go namnożyć do wysokich mian oraz do przeprowadzenia testów wymagane jest laboratorium o niskim poziomie bezpieczeństwa biologicznego22,23,24.

1. Przygotowanie roztworu zapasowego wirusa

  1. Namnożyć bakteriofaga Phi6 w gospodarzu bakteryjnym Pseudomonas syringae, stosując zmodyfikowaną metodę przygotowania podłoża Tryptic Soy Agar oraz metodę nakładki z miękkiego agaru, zgodnie z poniższym opisem.
    1. Przygotować zmodyfikowany Tryptic Soy Agar, odważając i mieszając składniki wymienione w Tabeli 1 w wodzie dejonizowanej.
    2. Przygotować kulturę nocną P. syringae, dodając 1 mL aalikwotu P. syringae o gęstości optycznej (OD600) od 0,9 do 1,5 do 100 mL zmodyfikowanego bulionu Tryptic Soy Broth (Tabel 1) i inkubując w inkubatorze wytrząsowym przy ~260 rpm w temperaturze pokojowej (20-26 °C).
    3. Przygotować probówki z miękkim agarem, wlewając zmodyfikowany Tryptic Soy Agar (~6 mL) do probówek i zakręcając autoklawowalnymi nakrętkami. Przechowywać w temperaturze 4 °C do momentu użycia. Autoklawować probówki z miękkim agarem w temperaturze 121 °C przez 15 min w celu stopienia agaru. Utrzymywać w temperaturze 48 °C aż do wysiewu. Równoważenie temperatury w 48 °C jest istotne, w przeciwnym razie wirus może ulec inaktywacji w analizie.
    4. Do miękkiego agaru dodać 1 mL nierozcieńczonego, stężonego alikwotu wirusa oraz 100 µL kultury P. syringae w fazie logarytmicznej (OD600 między 0,9 a 1,5). Wylać miękki agar na powierzchnię zestalonej płytki z zmodyfikowanym agarem Tryptic Soy o średnicy 100 mm. Aby zapobiec powstawaniu pęcherzyków powietrza i/lub rozlewaniu, delikatnie zakręcić płytkami, aby równomiernie rozprowadzić miękki agar na powierzchni stałego agaru, a następnie inkubować przez noc w temperaturze pokojowej.
    5. Delikatnie zebrać25 zawartość trzech płytek za pomocą sterylnego rozpylacza komórkowego do sterylnej probówki stożkowej o pojemności 50 mL zawierającej 15 mL buforu SM. Mieszać probówki w wodotryskach (vortex) na maksymalnych ustawieniach przez 1-2 min w celu rozbicia agaru, a następnie odwirować przy 7 000 x g przez 15 min.
    6. Oddzielić supernatant i przefiltrować przez filtr strzykawkowy 0,2 µm. Alikwoty o objętości 1 mL przechowywać w krioprobówkach w temperaturze -80 °C do momentu użycia.

2. Przeprowadzenie wstępnej oceny wizualnej elementu ŚOI

  1. Umieść każdy element Środków Ochrony Indywidualnej (PPE) na czystej, gładkiej powierzchni (np. blacie laboratoryjnym pokrytym jednorazową wyściółką papierową). Oceń każdy element PPE w trzech powtórzeniach.
  2. Zapewnij odpowiednie oświetlenie podczas badania PPE. Zmierz i zapisz długość oraz szerokość niepranych elementów w różnych miejscach (Rysunek 1).

Schemat pomiaru odzieży; pomiary spodni, koszuli, skarpet; szerokość z przodu, szyja, pętle.
Rysunek 1. Miejsca pomiarów podczas oceny wstępnej Środków Ochrony Indywidualnej. Miejsca pomiarów dla tkanin dżinsowych, odzieży medycznej oraz masek ochronnych, w których zarejestrowano długość w celu śledzenia zmian materiałowych wynikających z procesu prania. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

3. Przygotowanie kuponów

  1. Przygotować kupony testowe o wymiarach 2 cm x 4 cm poprzez wycięcie fragmentów PPE; należy przygotować dwa kupony z każdej maski ochronnej (testowano trzy maski), pięć kuponów z każdych spodni jeansowych (testowano trzy pary spodni jeansowych) oraz trzy kupony z każdej bluzki z zestawu scrubs (testowano trzy bluzki).
  2. Przygotować zestaw ślepych kuponów proceduralnych o wymiarach 2 cm x 4 cm (zestaw odpowiadający jednemu pełnowymiarowemu elementowi PPE) dla każdego rodzaju materiału, które nie będą inokulowane, ale zostaną poddane praniu. Należy przygotować dwa kupony na każdy dzień eksperymentów z maskami ochronnymi, pięć kuponów na każdy dzień eksperymentów z denimem oraz trzy kupony na każdy dzień eksperymentów z bluzkami scrubs.
  3. Przygotować zestaw kuponów kontroli pozytywnej o wymiarach 2 cm x 4 cm, które zostaną zainokulowane, ale nie zostaną wyprane. Należy przygotować dwa kupony na każdy dzień eksperymentów z maskami ochronnymi (testowano trzy maski), pięć kuponów na każdy dzień eksperymentów z denimem (testowano trzy pary spodni jeansowych) oraz trzy kupony na każdy dzień eksperymentów z bluzkami scrubs (testowano trzy bluzki) oraz trzy kupony ze stali nierdzewnej.
    UWAGA: Liczba powtórzeń została dobrana w zależności od rozmiaru elementu. Na przykład fizycznie trudno jest przymocować pięć kuponów do maski ochronnej, natomiast dwa kupony reprezentowałyby zbyt ograniczony obszar spodni jeansowych. Miejsca zostały wybrane tak, aby zmaksymalizować pokrycie i objąć strefy, które mogą zostać zagięte podczas prania i być trudniejsze do oczyszczenia.

4. Wykonaj inokulację

  1. Przygotuj 10% roztwór ekstraktu wołowego, rozpuszczając 1 g ekstraktu wołowego w końcowej objętości 10 ml 1-krotnego soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS). Całą objętość poddaj sterylizacji przez filtrowanie za pomocą 0.2 µm filtr strzykawkowy.
  2. Rozmrozić w temperaturze pokojowej roztwór zapasowy wirusa przygotowany w sekcji 1. W dniu użycia dodać 100 µL roztworu stokowego rozmrożonego Phi6 do 900 µL 10% roztworu ekstraktu z wołowiny.
  3. Zaszczepić kupony testowe oraz kupony kontroli dodatniej w ilości ~107 PFU/próbkę poprzez pipetowanie a 10 µL naniesienie kropli roztworu na element Środków Ochrony Indywidualnej (PPE) i rozprowadzenie kropli za pomocą końcówki pipety. W zależności od materiału PPE krople będą się różnie rozdzielać i reagregować.
  4. Pozostawić zaszczepione próbki do wyschnięcia w komorze z laminarnym przepływem powietrza. Wyznaczone czas(y) suszenia. poprzez obserwacja w zależności od zastosowanych materiałów. W przypadku przedstawionych tutaj wyników zastosowano następujące czasy: odzież medyczna = 30 min czasu schnięcia; osłona twarzy = 60 min czasu schnięcia; denim = 30 min czasu schnięcia; stal nierdzewna = 120 min czasu schnięcia.
  5. Przymocuj zaszczepione kupony do pełnowymiarowych elementów Środków Ochrony Indywidualnej (ŚOI) zgodnie z Rysunek 2 przy użyciu szpilek angielskich i technik aseptycznych.

Schemat odzieży pokazujący rozmieszczenie etykiet na dżinsach, koszulach i maskach dla procesu produkcyjnego.
Rysunek 2. Lokalizacja próbek testowych na materiale denimowym, odzieży medycznej i maskach na twarz. Litery A-D odpowiadają unikalnym identyfikatorom próbek dla wszystkich eksperymentów prania. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

5. Przeprowadzenie prania

  1. Przygotuj detergent do prania w następujący sposób.
    1. Sterylizuj wodę z kranu, która będzie używana w pralce, i pobierz 10 mL wody autoklawowanej do kontroli sterylności. W tym protokole autoklawuj 7 L wody z kranu w 60 min cyklu dla cieczy.
    2. Przygotuj roztwór do prania zgodnie z instrukcją rozcieńczania producenta. W tym protokole rozpuść 1,54 mL detergentu w 3,5 L sterylnej wody z kranu. Podgrzej roztwór do prania do 50 °C, używając płyty grzejnej i mieszadła magnetycznego. Zmierz i zapisz pH oraz temperaturę roztworu do prania. Pobierz 10 mL roztworu do kontroli sterylności.
  2. Wlej roztwór do prania do wysterylizowanej pralki (3,25 L). Przed testami wstępnie sterylizuj pralki, stosując cykl nadtlenku wodoru w formie par 250 ppm-4 h.
  3. Umieść elementy ŚOI w wysterylizowanej pralce. Do każdej pralki włóż jedne spodnie dżinsowe i jedną koszulę medyczną. Do każdej pralki dodaj jedną zaszczepioną maseczkę ochronną i cztery niezakażone maseczki wypełniające; do maseczek wypełniających nie przymocowano kuponów.
  4. Perz elementy ŚOI przez 18 min (dwa 9 min cykle prania z normalnym mieszaniem). Opróżnij pralkę z wody i trzykrotnie wypłucz wodą z kranu o temperaturze pokojowej (po 5 L każdego razu), aby usunąć pianę. Wlej do pralki sterylną wodę z kranu o temperaturze pokojowej (3,25 L) i przeprowadź 9 min cykl płukania.
  5. Przenieś elementy ŚOI do bębna wirowego pralki i wiruj przez 5 min. Przenieś elementy ŚOI do suszarki i susz przez 80 min w ustawieniu wysokiej temperatury (93 °C).
  6. Przenieś ŚOI z suszarki do sterylnego obszaru roboczego, a następnie aseptycznie usuń kupony z każdego elementu i umieść je w probówkach stożkowych. Wcześniej napełnij probówki 10 mL 10% buforu ekstrakcyjnego do pożywki Dey-Engley i przykryj folią aluminiową.

6. Ekstrakcja i wyliczanie miana wirusa na kuponach

  1. Wyodrębnij materiał z kuponów w 10 mL 10% neutralizującego bulionu Dey-Engley, mieszając w wortexerze przez 2 min na maksymalnym ustawieniu urządzenia.
  2. Nanieś wyodrębnione próbki na płytki, stosując konwencjonalną metodę nakładki z miękkiego agaru górnego26.
    1. Przygotuj probówki z miękkim modyfikowanym agarem sojowo-tryptykowym oraz kulturę P. syringae zgodnie z opisem w sekcji 1. W dniu badania poddaj probówki z miękkim agarem autoklawowaniu w temperaturze 121 °C przez 15 min w celu stopienia agaru. Utrzymuj miękki agar w temperaturze 48 °C aż do momentu wysiewania. Utrzymanie temperatury 48 °C jest istotne, w przeciwnym razie wirus może ulec inaktywacji termicznej podczas testu.
    2. Przygotuj serię rozcieńczeń dziesięciokrotnych w 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanowo dla każdej próbki testowej użytej w badaniu prania. Do wysiewania wykorzystaj zarówno alikwoty rozcieńczone szeregowo (100 µL), jak i nierozcieńczone (1 mL i 100 µL).
    3. Dodaj alikwoty próbek testowych do probówki z miękkim agarem zawierającej 6 mL miękkiego agaru i 100 µL kultury P. syringae w fazie logarytmicznej (OD600 w zakresie 0,9-1,5). Wylej miękki agar na powierzchnię zestalonej płytki z modyfikowanym agarem sojowo-tryptykowym. Równomiernie rozprowadź miękki agar po powierzchni stałego agaru, obracając płytkę.
    4. Inkubuj płytki przez noc w temperaturze pokojowej, a następnego dnia dokonaj manualnego przeliczenia, ustalając liczbę jednostek tworzących plaki na każdej płytce.

7. Przeprowadź wizualną ocenę elementów Środków Ochrony Indywidualnej (ŚOI) po teście

  1. Odnotuj w przypadku poszczególnych elementów Środków Ochrony Indywidualnej (PPE) użytych do testów: oznaki blaknięcia, odbarwienia i/lub uszkodzenia (np. rozdarcia, rozciągnięcia); zapachy; małe otwory, nacięcia lub pęknięcia (użyj małej latarki do poszukiwania uszkodzeń); rozwarstwienia, brakujące nici, obszary z uszkodzonym obramowaniem; uszkodzenia szwów lub zamków błyskawicznych; zmierz i zapisz stopień rozciągnięcia elementów elastycznych.

Wyniki

Po zakończeniu tego protokołu generowanych jest kilka różnych rodzajów danych i wyników kontroli jakości. Liczba jednostek tworzących placki (PFU) na płytkach, wraz z objętością ekstrahowanej próbki, umożliwia obliczenie liczby PFU na jeden kupon testowy. Tabela 2 stanowi przykład arkusza zapisu danych dla wyników rozcieńczeń seryjnych/posiewów. Wykorzystując czynnik rozcieńczenia, objętość próbki i liczbę kolonii z Tabeli 1, Tabela 3 przedstawia reprezentatywne wyniki odzysku wirusa dla testu maski ochronnej. Należy zauważyć, że dane te obejmują kupony testowe oraz próbki kontroli jakości dla inokulum, kuponów i wody płuczącej (z detergentem i bez detergentu). Próba ślepa procedury oraz próbki kontroli sterylności są istotne dla potwierdzenia, że roztwory wodne i materiały PPE nie zostały zanieczyszczone Phi6. Wykazanie zanieczyszczenia spowodowałoby błędne obliczenia skuteczności dezynfekcji i wymagałoby powtórzenia testu. Próbki kontroli dodatniej mają na celu weryfikację, czy roztwór zapasowy wirusa nie uległ degradacji środowiskowej/naturalnej podczas eksperymentów, co mogłoby sztucznie zawyżyć efekt procesu prania w redukcji ładunku wirusowego. Próbki te powinny utrzymywać się w granicach 1 log PFU względem kontroli inokulum, aby wyniki z kuponów testowych zostały zaakceptowane. Znaczna redukcja PFU w próbkach kontroli dodatniej wskazuje również na konieczność dokładnego przeanalizowania wszystkich etapów inokulacji kuponów, aby upewnić się, że analityk wykonuje protokół przy użyciu właściwych technik pipetowania i rozprowadzania próbki.

Niniejszy protokół dostarcza również informacji na temat oceny zmian właściwości materiałowych elementów odzieży wynikających z prania oraz informacji dotyczących kontroli jakości w ramach protokołu (Tabela 4 oraz Rysunek 3). Dane te są przydatne z kilku powodów. Rejestrowanie trendów w pomiarach elementów ŚOI pozwala na identyfikację produktu z wadą produkcyjną. Taka identyfikacja może pomóc w wyjaśnieniu wartości odstających w danych mikrobiologicznych i osadzeniu w kontekście zmienności zachowania produktu. Notowanie zapachów lub uszkodzeń może również wskazać, czy pralka lub suszarka działały nieoptymalnie podczas eksperymentu i czy testy powinny zostać powtórzone, a sprzęt poddany serwisowi. Ponadto, jeśli plan testów przewiduje wiele cykli prania tego samego elementu ŚOI, dane te mogą pomóc ustalić, jak długo elementy ŚOI zachowują swoją integralność podczas prania. Prowadzenie rejestru pH roztworu detergentu pozwala wykryć zmiany w źródle wody lub w samym produkcie detergentu. Prowadzenie dziennika czasowego etapów prania zapewnia, że timer w pralce i suszarce nie spowoduje odchyleń od protokołu eksperymentalnego.

Ostatecznie dane te są wykorzystywane do raportowania skuteczności dezynfekcji procedury prania w gorącej wodzie przeciwko surrogatowi patogenów wirusowych. Skuteczność dezynfekcji podczas prania (Równ. 1) oblicza się poprzez odjęcie średniej wartości log10 odzyskanych wirusów z kuponu testowego ŚOI od średniej wartości log10 odzyskanych wirusów z wyników dodatniej kontroli ŚOI (Rysunek 4). W przypadku wyników kuponów testowych poniżej granicy wykrywalności, w obliczeniach skuteczności dezynfekcji stosuje się wartość log10 granicy wykrywalności. Powszechną praktyką jest raportowanie skuteczności dezynfekcji jako wartości logarytmicznych w celu porównania z innymi technikami i standardami dezynfekcji wirusowej.

Skuteczność dezynfekcji = Średnia log10 (Kontrole pozytywne) - Średnia log10 (Próbki testowe) (Równ. 1)

Wykres zmian pomiarów po praniu dla osłon twarzy, denimu, odzieży medycznej; porównanie powtórzeń.
Rycina 3. Zmiana wymiarów ŚOI w zależności od lokalizacji. Δ = pomiar przed testem - pomiar po teście. Ujemna wartość Δ odpowiada rozciągnięciu przedmiotu w określonej lokalizacji, a wartość dodatnia odpowiada kurczeniu się. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wykres skuteczności dezynfekcji; ładunek wirusowy log PFU; osłony twarzy, denim, odzież medyczna; wirus Phi6.
Rycina 4Skuteczność prania w gorącej wodzie w dezynfekcji materiałów z osłon twarzy, jeansu i odzieży operacyjnej z wirusa Phi6. Gwiazdki oznaczają pełną dezynfekcję (brak wykrycia na kuponach testowych). Słupki błędów wskazują odchylenie standardowe (n = 3). Litery lokalizacji odpowiadają rozmieszczeniu przedstawionemu w Rysunek 2. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.

Tabela 1. Przepisy na roztwory. Składniki i ilości niezbędne do przygotowania agaru sojowego z tryptonem, bulionu sojowego z tryptonem oraz roztworów ekstraktu wołowego. Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 2. Przykładowy fragment arkusza wyników rozcieńczeń seryjnych/płytkowań. Szablon do raportowania surowych danych mikrobiologicznych. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 3. Wyniki mikrobiologiczne dla osłon twarzy.Przykładowy arkusz podsumowania dla przetworzonych danych o jednostkach tworzących placki (PFU). Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 4. Dziennik kontroli jakości i oceny materiałów odzieży ochronnej.Szablon raportowania kalibracji sondy pH, pH roztworu detergentu, pomiarów przed i po praniu oraz czasów cykli prania. Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Dyskusja

Protokół ten został opracowany w celu przeprowadzania systematycznych testów laboratoryjnych w celu oceny skuteczności prania wirusowej dezynfekcji z pełnowymiarowych środków ochrony indywidualnej/odzieży. Procedury określają kluczowe etapy przygotowania wirusa, zaszczepienia materiału testowego, oceny zmian w produktach spowodowanych procesem prania oraz ilościowego określenia zmniejszenia wiremii w wyniku procesu prania (prania i suszenia w pralce). Ponadto w protokole określono niezbędne próbki kontroli jakości, aby zapewnić, że eksperymenty nie są stronnicze z powodu zanieczyszczenia i pomiarów/obserwacji, które powinny być rejestrowane w celu śledzenia integralności materiałowej elementów ŚOI po wielu cyklach prania. Wyniki przy użyciu Phi6 wskazują, że proces prania gorącej wody zastosowany w tym protokole osiągnął ponad 3-logarytmiczną redukcję wiremii dla wszystkich próbek (zakrycie twarzy, fartuchy i spodnie dżinsowe). Redukcja wiremii była również jednolita w różnych miejscach na środkach ochrony indywidualnej/odzieży. Aby wykazać redukcję o 3 logarytmy, protokół ten wymaga użycia wysokiego miana wirusa i środka stabilizującego (ekstraktu z wołowiny), który może nie być reprezentatywny dla obciążenia gleby we wszystkich sytuacjach.

Minipralki i kompaktowe suszarki zostały wybrane w celu optymalizacji liczby powtórzonych eksperymentów, które można przeprowadzić w warunkach ograniczonej przestrzeni, oraz w celu utrzymania sterylizacji sprzętu i ilości wody używanej podczas eksperymentów w sposób możliwy do opanowania przez personel laboratoryjny. W wyniku korzystania z mini pralki, etapy płukania były ręczne w porównaniu z większością aplikacji do prania w domu, które są w pełni zautomatyzowane. Należy również pamiętać, że w krajach rozwiniętych dominuje pranie w pralce, ale mycie rąk jest nadal praktykowane na całym świecie15. Ponadto niektórzy mogą nie mieć dostępu do gorącej wody do prania, a inni ręcznie suszą ubrania na powietrzu zamiast suszyć w pralce. Te różnice w praktykach prania nie zostały uwzględnione w obecnym protokole, ale można je łatwo zbadać przy niewielkich modyfikacjach, takich jak zastąpienie etapów prania i suszenia przy użyciu wiadra i bliskiej linii

W literaturze naukowej w pełnym zakresie poświęcono minimalny nacisk na czyszczenie/dezynfekcję skażonych wirusem osłon twarzy i odzieży ulicznej. Częściej badania oceniają skuteczność filtracji osłon twarzy po wielokrotnym praniu i suszeniu, ale nie oceniają skuteczności dezynfekcji wirusowej27,28. Na przykład Clapp i in. ocenili dopasowaną skuteczność filtracji masek z tkaniny i zmodyfikowanych masek zabiegowych i stwierdzili duże różnice w wydajności, przy czym proste modyfikacje zapewniają lepsze dopasowanie i skuteczność filtracji29. W innym badaniu przyjrzano się skuteczności filtracji czterech masek z tkaniny wykonanych z różnych materiałów30, ponownie koncentrując się na kontroli źródła lub ochronie osobistej. Może to wynikać z braku specjalizacji zarówno w zakresie części mikrobiologicznej, jak i testów mechanicznych w tym samym laboratorium. Przedstawiony tutaj protokół zapewnia ocenę skuteczności dezynfekcji, a także degradacji materiału.

W ostatnim czasie w literaturze naukowej 31,32,33 opublikowano szereg metod odkażania/dezynfekcji jednorazowej ochrony dróg oddechowych (głównie N95). Główny nacisk na FFR (np. N95) wynika z krytycznej ochrony dróg oddechowych, jaką zapewniają pracownikom służby zdrowia i innym zawodom na pierwszej linii. Podstawowe technologie odkażania respiratorów obejmowały odparowany nadtlenek wodoru (VHP), ultrafioletowe promieniowanie bakteriobójcze (UVGI) i wilgotne ciepło (parę) do inaktywacji wirusa. Viscusi i wsp. ocenili pięć metod dekontaminacji FFR i UVGI; Tlenek etylenu i VHP uznano za najbardziej obiecujące metody odkażania31. Fischer i in. ocenili cztery różne metody odkażania - światło UV, suche ciepło, 70% etanol i VHP - pod kątem ich zdolności do zmniejszania zanieczyszczenia SARS-CoV-2 i ich wpływu na funkcję respiratora N9532. Istnieje wiele dodatkowych badań dotyczących skutecznych technologii dekontaminacji FFR, które zostały podsumowane i opublikowane w 2020 r.33 . Jednak te specjalistyczne metody nie są dostępne ani zaprojektowane tak, aby mogły być bezpiecznie używane przez przeciętnego właściciela domu lub małej firmy.

Protokół ten został opracowany przy użyciu Phi6, bakteriofaga otoczkowego, który jest podobny do SARS-CoV-2, ma białka kolców i ma podobną wielkość (80-100 nm)34 dla wszystkich testów. Ponieważ Phi6 nie jest znanym patogenem, można nim manipulować w laboratorium ogólnego poziomu bezpieczeństwa biologicznego 1 (BSL-1). Skuteczność przeciwko Phi6 może wskazywać na skuteczność innych wirusów otoczkowych, jednak konieczna jest empiryczna weryfikacja dla każdego wirusa będącego przedmiotem zainteresowania35. Dzięki zastosowaniu podobnego, niepatogennego czynnika wirusowego, istnieje nadzieja, że protokół ten będzie można powtórzyć w innym miejscu i wykorzystać do badania przyszłych epidemii/pandemii wirusowych. Przyszłe badania mogą obejmować stosowanie środków dezynfekujących (np. wybielaczy) oprócz detergentów oraz ustandaryzowany protokół mycia rąk i suszenia na linii.

Oświadczenia

Nie są znane żadne konflikty interesów, które można by ujawnić.

Podziękowania

Amerykańska Agencja Ochrony Środowiska (EPA) poprzez swoje Biuro Badań i Rozwoju kierowała badaniami opisanymi tutaj pod EP-C-15-008 z Jacobs Technology Inc. Został on poddany przeglądowi przez Agencję, ale niekoniecznie odzwierciedla poglądy Agencji. Nie należy wnioskować o żadnym oficjalnym poparciu. EPA nie popiera zakupu ani sprzedaży jakichkolwiek komercyjnych produktów lub usług. Autorzy chcieliby podziękować wykonawcom EPA: Denise Aslett za nadzór nad mikrobiologią EPA RTP, Brianowi Fordowi, Rachael Baartmans i Lesley Mendez Sandoval za ich pracę nad tym projektem w laboratorium mikrobiologicznym EPA RTP, Ramonie Sherman za dostarczenie przeglądu zapewnienia jakości EPA oraz Worth Calfee i Shannon Serre za dostarczenie przeglądów technicznych EPA.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
  Zamrażarka (- 80 ° C)ThermoFisher ScientificFDE30086FA
  Płyta grzejnaVWR97042-714
  Agrafki (stalowe)Singer319921
  ShakerLab-Line Instruments, Inc.3525
  Bufor SMTeknova,  Hollister, CAS0249
  Filtr strzykawkowy (0,2 μ m)Filtry strzykawkowe Corning, Corning, NY
1X Sól fizjologiczna buforowana fosforanamiTeknova, Hollister, CAP0196, 10X roztwór
AgarBecton Dickinson214010
Nasadki do sterylizacji w autoklawieDWK Life Sciences, Millville, NJKIM-KAP Caps, 73663-18
AutoklawSterisSterylizator parowy AMSCO 250LS Model 20VS
Ekstrakt z wołowinySigma-Aldrich, Millipore Sigma, St. Louis, MO, USAP / N B4888-100g
Chlorek wapniaSigma-Aldrich793639
Rozsiewacze komórekBusse Szpital Busse Jednorazowe23600894
WirówkaThermoFisher Scientific75004271Heraeus MegaFuge 16R
Certyfikowany zegarhttps://nist.time.gov/Nie dotyczy Probówki
stożkowe (50 ml)Corning Life Sciences352098Falcon 50-mililitrowe stożkowe probówki wirówkowe z polipropylenu o wysokiej przejrzystości
Kriowialne ThermoFisher Scientific, Waltham, MAAY509X33
DżinsyWranglerRustler Regular Fit Dżinsy z prostymi nogawkami Dżinsy z czterema kieszeniami i przednimi kieszeniami Scoop, PN:87619PW
DetergentProctor and GambleTide Oryginalny zapach płynnego detergentu do prania Numer produktu (PN): 003700023068
DekstrozaFisherBP350
Dey-Engley Rosół neutralizującyBecton DickinsonDF0819172
DryerMagic ChefMCSDRY15W
Osłony twarzyFelinaWielorazowe maseczki na twarz z bawełny organicznej, PN: 990121P4
Inkubator (agar górny)Symphony414004-596
Notatnik laboratoryjnyNotatnik naukowy Firma2001
Chlorek magnezuSigma-AldrichM9272
System sterylizacji i dozowania pożywekIntegraMedia Clave/Media Jet
Szalki Petriego (100 mm)VWR25384-342
pH-metrOrion/OaktonSTARA1110/EW-35634-35
Sonda pHOrion8157BNUMD
Wzorce pHOakton00654-(00/04/08)
Phi 6 i Pseudomonas syringaeBattelle Memorial Institute, Columbus, OHNie dotyczy
Pipeta i KońcówkiRainin(pipety) 17014391, 17002921; (Końcówki do pipet) 30389239, 17014382
LodówkaTrue Manufacturing Co., Inc.GDM-33
PeelingiGogreen coolPN: WS19100PT
Chlorek soduSigma-Aldrich57656
Stir BarFisherbrand16-800-512
Taśma mierniczaLufkinPS3425
Probówki do miękkiego agaru (14 mL)Corning, Corning, NY352059
TermometrFisherbrand14-983-19B
TryptoneSigma-AldrichT9410
Worki do sterylizacji parowego nadtlenku wodoruSTERIS62020TW
Vortex (podczas procesu galwanizacji)Daigger Scientific, Inc3030AVortex Genie 2
Vortex (do ekstrakcji próbki)Branson Ultrasonics58816-115Multi-Tube vortexer
MyjkaKuppetKP1040600A
Pralka SterylizacjaSterisSTERIS VHP ED1000 generator
Ekstrakt drożdżowyGibco212750
PES, 431229 PBS

Bibliografia

  1. Emanuel, E. J., et al. Fair allocation of scarce medical resources in the time of Covid-19. The New England Journal of Medicine. 382 (21), 2049-2055 (2020).
  2. Cohen, J., van der Meulen Rodgers, Y. Contributing factors to personal protective equipment shortages during the COVID-19 pandemic. Preventive Medicine. 141, 106263(2020).
  3. Burki, T. Global shortage of personal protective equipment. The Lancet Infectious Diseases. 20 (7), 785-786 (2020).
  4. Optimizing Personal Protective Equipment (PPE) Supplies. CDC. , Available from: https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/hcp/ppe-strategy/index.html (2020).
  5. Livingston, E., Desai, A., Berkwits, M. Sourcing personal protective equipment during the COVID-19 pandemic. Jama. 323 (19), 1912-1914 (2020).
  6. Bloomfield, S. F., Exner, M., Signorelli, C., Nath, K. J., Scott, E. A. The infection risks associated with clothing and household linens in home and everyday life settings, and the role of laundry. International Scientific Forum on Home Hygiene. , (2011).
  7. Hall, C. B., Douglas, R. G., Geiman, J. M. Possible transmission by fomites of respiratory syncytial virus. Journal of Infectious Diseases. 141 (1), 98-102 (1980).
  8. Turner, R., Shehab, Z., Osborne, K., Hendley, J. O. Shedding and survival of herpes simplex virus from 'fever blisters'. Pediatrics. 70 (4), 547-549 (1982).
  9. Bean, B., et al. Survival of influenza viruses on environmental surfaces. Journal of Infectious Diseases. 146 (1), 47-51 (1982).
  10. Brady, M. T., Evans, J., Cuartas, J. Survival and disinfection of parainfluenza viruses on environmental surfaces. American Journal of Infection Control. 18 (1), 18-23 (1990).
  11. Sidwell, R. W., Dixon, G. J., Mcneil, E. Quantitative studies on fabrics as disseminators of viruses: I. Persistence of vaccinia virus on cotton and wool fabrics. Applied Microbiology. 14 (1), 55-59 (1966).
  12. Owen, L., Shivkumar, M., Laird, K. The stability of model human coronaviruses on textiles in the environment and during health care laundering. Msphere. 6 (2), 00316-00321 (2021).
  13. Sehulster, L., et al. Guidelines for environmental infection control in health-care facilities. Recommendations from CDC and the Healthcare Infection Control Practices Advisory Committee (HICPAC). American Society for Healthcare Engineering/American Hospital Association. , (2004).
  14. Chen, H., et al. Influence of different inactivation methods on severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 RNA copy number. Journal of Clinical Microbiology. 58 (8), e00958(2020).
  15. Abney, S. E., Ijaz, M. K., McKinney, J., Gerba, C. P. Laundry hygiene and odor control-state of the science. Applied and Environmental Microbiology. 87 (14), 0300220(2021).
  16. COVID-19 Cleaning and Disinfecting Your Home. CDC. , Available from: https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/prevent-getting-sick/disinfecting-you-home.html (2021).
  17. COVID-19 Your Guide to Masks - How to select, properly wear, clean, and store masks. CDC. , Available from: https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/prevent-getting-sick/about-face-coverings.html (2021).
  18. Walter, W. G., Schillinger, J. E. Bacterial survival in laundered fabrics. Applied Microbiology. 29 (3), 368-373 (1975).
  19. Blaser, M. J., Smith, P. F., Cody, H. J., Wang, W. -L. L., LaForce, F. M. Killing of fabric-associated bacteria in hospital laundry by low-temperature washing. Journal of Infectious Diseases. 149 (1), 48-57 (1984).
  20. Gerhardts, A., et al. Testing of the adhesion of herpes simplex virus on textile substrates and its inactivation by household laundry processes. Journal of Biosciences and Medicines. 4 (12), 111(2016).
  21. Heinzel, M., Kyas, A., Weide, M., Breves, R., Bockmühl, D. P. Evaluation of the virucidal performance of domestic laundry procedures. International Journal of Hygiene and Environmental Health. 213 (5), 334-337 (2010).
  22. Casanova, L. M., Weaver, S. R. Inactivation of an enveloped surrogate virus in human sewage. Environmental Science & Technology Letters. 2 (3), 76-78 (2015).
  23. Aquino de Carvalho, N., Stachler, E. N., Cimabue, N., Bibby, K. Evaluation of Phi6 persistence and suitability as an enveloped virus surrogate. Environmental Science & Technology. 51 (15), 8692-8700 (2017).
  24. Ye, Y., Chang, P. H., Hartert, J., Wigginton, K. R. Reactivity of enveloped virus genome, proteins, and lipids with free chlorine and UV254. Environmental Science & Technology. 52 (14), 7698-7708 (2018).
  25. Bacteriology Culture Guide. ATCC. , Available from: https://www.atcc.org/resources/culture-guides/bacteriology-culture-guide (2022).
  26. Kropinski, A. M., Mazzocco, A., Waddell, T. E., Lingohr, E., Johnson, R. P. Bacteriophages. , Springer. 69-76 (2009).
  27. Sankhyan, S., et al. Filtration performance of layering masks and face coverings and the reusability of cotton masks after repeated washing and drying. Aerosol and Air Quality Research. 21 (11), 210117(2021).
  28. Kumar, A., Bhattacharjee, B., Sangeetha, D., Subramanian, V., Venkatraman, B. Evaluation of filtration effectiveness of various types of facemasks following with different sterilization methods. Journal of Industrial Textiles. , (2021).
  29. Clapp, P. W., et al. Evaluation of cloth masks and modified procedure masks as personal protective equipment for the public during the COVID-19 pandemic. JAMA Internal Medicine. 181 (4), 463-469 (2021).
  30. Lu, H., Yao, D., Yip, J., Kan, C. -W., Guo, H. Addressing COVID-19 spread: development of reliable testing system for mask reuse. Aerosol and air quality research. 20 (11), 2309-2317 (2020).
  31. Viscusi, D. J., Bergman, M. S., Eimer, B. C., Shaffer, R. E. Evaluation of five decontamination methods for filtering facepiece respirators. Annals of Occupational Hygiene. 53 (8), 815-827 (2009).
  32. Fischer, R. J., et al. Effectiveness of N95 respirator decontamination and reuse against SARS-CoV-2 virus. Emerging Infectious Diseases. 26 (9), 2253(2020).
  33. Derraik, J. G., Anderson, W. A., Connelly, E. A., Anderson, Y. C. Rapid review of SARS-CoV-1 and SARS-CoV-2 viability, susceptibility to treatment, and the disinfection and reuse of PPE, particularly filtering facepiece respirators. International Journal of Environmental Research and Public Health. 17 (17), 6117(2020).
  34. Fedorenko, A., Grinberg, M., Orevi, T., Kashtan, N. Survival of the enveloped bacteriophage Phi6 (a surrogate for SARS-CoV-2) in evaporated saliva microdroplets deposited on glass surfaces. Scientific Reports. 10 (1), 1-10 (2020).
  35. Calfee, M. W., et al. Virucidal efficacy of antimicrobial surface coatings against the enveloped bacteriophage Φ6. Journal of Applied Microbiology. 132 (3), 1813-1824 (2022).

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Skuteczność praniaosobiste środki ochrony indywidualnejbakteriofag Phi6metoda plackowaintegralność materiałutechnika aseptycznaredukcja ładunku wirusowegopróbki kontroli jakości
Określanie skuteczności dezynfekcji wirusowej podczas prania gorącą wodą
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.