Artykuł metodologiczny

Delikatna izolacja jąder od tkanki mózgowej dorosłego afrykańskiego turkusowego Killifisha, naturalnie krótkotrwały model do badań nad starzeniem się

3.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/64165

⸱

9 sierpnia 2022

 ,  ,  , 
1Leonard Davis School of Gerontology, University of Southern California, 2Molecular and Computational Biology Department, USC Dornsife College of Letters, Arts and Sciences, 3Biochemistry and Molecular Medicine Department, USC Keck School of Medicine, 4Epigenetics and Gene Regulation, USC Norris Comprehensive Cancer Center, 5USC Stem Cell Initiative

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół izolowania jąder z mózgów krótkotrwałego modelu kręgowców Nothobranchius furzeri do dalszych zastosowań, takich jak sekwencjonowanie RNA pojedynczego jądra lub test pojedynczego jądra dla chromatyny dostępnej dla transpozazy z sekwencjonowaniem (ATAC-seq).

Streszczenie

Badanie starzenia się mózgu w rozdzielczości pojedynczej komórki w systemach kręgowców pozostaje wyzwaniem ze względu na koszty, czas i ograniczenia techniczne. Tutaj demonstrujemy protokół generowania bibliotek sekwencjonowania jednojądrowego RNA (snRNA-seq) z mózgów naturalnie krótko żyjących kręgowców afrykańskich turkusowych karpiów Nothobranchius furzeri. Afrykański turkusowy killifish żyje od 4 do 6 miesięcy i może być trzymany w opłacalny sposób, zmniejszając w ten sposób bariery kosztowe i czasowe związane z badaniem starzenia się mózgu kręgowców. Potrzebne są jednak dostosowane protokoły, aby wyizolować jądra o jakości wystarczającej do dalszych eksperymentów jednokomórkowych z mózgu młodych i starszych ryb. W tym miejscu demonstrujemy empirycznie zoptymalizowany protokół izolacji wysokiej jakości jąder z mózgu dorosłego afrykańskiego turkusowego killifisha, co jest kluczowym krokiem w generowaniu wysokiej jakości bibliotek omicznych pojedynczych jąder. Ponadto pokazujemy, że kroki mające na celu zmniejszenie zanieczyszczającego tła RNA są ważne dla wyraźnego rozróżnienia typów komórek. Podsumowując, protokół ten pokazuje wykonalność badania starzenia się mózgu w nietradycyjnych organizmach modelowych kręgowców.

Wprowadzenie

Zrozumienie mechanizmów starzenia się mózgu kręgowców jest kluczowe dla rozwiązania problemów związanych z wiekiem chorób neurodegeneracyjnych, takich jak choroba Alzheimera i demencja1. Afrykański turkusowy killifish (Nothobranchus furzeri) jest najkrócej żyjącym kręgowcem, który może być hodowany w niewoli, a ze względu na krótką długość życia i związane z wiekiem upośledzenie funkcji poznawczych jest doskonałym modelem starzenia się mózgu2,3,4,5. Niedawne pojawienie się technologii "omicznych" pojedynczych komórek, takich jak sekwencjonowanie pojedynczych jąder RNA (snRNA-seq) i test pojedynczych jąder dla chromatyny dostępnej dla transpozazy z sekwencjonowaniem (snATAC-seq), pozwoliło naukowcom na zbadanie starzejącego się mózgu w niespotykanej dotąd rozdzielczości6,7,8. Metody te opierają się na izolacji jąder, ponieważ odzyskanie komórek mózgowych, takich jak neurony, jest często zbyt trudne do wyizolowania6,7,8,9,10. Jednak większość opublikowanych protokołów izolacji jąder jest zoptymalizowana pod kątem organizmów modelowych ssaków11,12,13,14,15. W związku z tym, że obecnie istnieje niezaspokojona potrzeba izolowania jąder mózgowych u karpiowatych jako nowego organizmu modelowego w dziedzinie badań nad starzeniem się2, celem tego protokołu jest ustalenie metody izolowania wysokiej jakości jąder z zamrożonej tkanki mózgowej karpia.

Tutaj ustanowiono usprawniony i solidny przepływ pracy, który wykorzystuje powszechnie dostępne materiały do izolowania wysokiej jakości jąder z mózgów karpiów. Protokół ten został zmodyfikowany z 10-krotnego protokołu Genomics dla mózgów myszy, aby uwzględnić niższą zawartość mieliny w mózgach afrykańskich turkusowych karpiów, kruchość zamrożonej tkanki i potrzebę zmniejszenia zawartości zanieczyszczeń otoczenia do zastosowań związanych z sekwencjonowaniem16. Rzeczywiście, wcześniej zoptymalizowane protokoły dla tkanki mózgowej ssaków17,18 prowadzą do złej jakości jąder (tj. nadmiernej lizy) i/lub wysokiej zawartości zanieczyszczeń, gdy są stosowane na zamrożonych mózgach karpiów, co czyni je nieodpowiednimi do stosowania z sekwencją snRNA-seq zgodnie z zaleceniami dla sekwencji RNA pojedynczych jąder przy użyciu mikrofluidyki (rysunek uzupełniający 1).

Oprócz izolacji jąder, pokazujemy, jak oceniać jakość i wydajność jąder za pomocą mikroskopii i cytometrii przepływowej. W tym artykule przedstawiono przykłady zarówno optymalnych, jak i nieoptymalnych wyników oraz omówiono rozwiązywanie problemów. Protokół ten został zaprojektowany i zoptymalizowany dla mrożonych mózgów karpiów, ale może być również stosowany bez większych modyfikacji na świeżo wypreparowanych próbkach karpiów. Jądra mózgu Killifish wyizolowane tą metodą zostały zoptymalizowane do stosowania w sekwencji RNA pojedynczego jądra (snRNA-seq) jako dalsze zastosowanie, ale powinny być również możliwe do użycia w sekwencji snATAC i masowej sekwencji ATAC.

Protokół

Opieka nad zwierzętami i eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z IACUC Uniwersytetu Południowej Kalifornii zgodnie z zatwierdzonymi protokołami #21215. W przypadku wszelkich prac wykorzystujących ten protokół konieczne jest uzyskanie zgody IACUC instytucji przed rozpoczęciem jakichkolwiek prac badawczych na kręgowcach.

UWAGA: Pełne przejście przez protokół, zaczynając od błyskawicznie zamrożonej tkanki mózgowej (zaczynając od kroku 3), powinno zająć ~2,5 godziny dla sześciu próbek (Rysunek 1).

1. Sekcja mózgów karpiowatych

  1. Humanitarną eutanazję karpiów należy przeprowadzić przy użyciu roztworu 1,5 g/l metanosulfonianu/trikainy (MS-222) w wodzie systemowej.
    1. Użyj ostrych nożyczek, aby szybko odciąć głowę killifish po ustaniu wszystkich ruchów ciała i skrzeli.
  2. Rozetnij odciętą głowę na czystej szalce Petriego, jak opisano wcześniej19.
    1. Umieść naczynie pod mikroskopem preparacyjnym (przy użyciu zakresu powiększeń 8x-35x). Obróć głowę tak, aby promienie skrzelowe były skupione
    2. Za pomocą nożyczek przeciąć kość zębową tak, aby odsłoniły się promienie skrzelowe i czaszka.
    3. Za pomocą kleszczy przytrzymaj promienie skrzelowe po obu stronach czaszki. Użyj innej pary kleszczy, aby usunąć wszelkie pozostałe fragmenty tkanek z czaszki. Skrzyżowanie optyczne w kształcie litery V, które łączy mózg i oczy, powinno stać się widoczne.
    4. Przetnij skrzyżowanie optyczne za pomocą nożyczek, aby oderwać oba oczy od mózgu. Użyj kleszczy, aby delikatnie uwolnić czaszkę.
    5. Odwróć czaszkę i użyj kleszczy, aby zeskrobać mięsień z grzbietowej strony czaszki.
    6. Użyj jednej pary kleszczy, aby przytrzymać czaszkę na miejscu, a drugiej pary kleszczy, aby delikatnie usunąć kości czaszki, odsłaniając mózg.
    7. Mózg wydaje się biały i miękki. Po wyświetleniu nie jest wymagane usuwanie wszystkich kości czaszki. Usuń mózg czystymi kleszczami, delikatnie podnosząc i skrobając.
  3. Błyskawicznie zamroź mózg, umieszczając go w probówce mikrowirówkowej przechowywanej na suchym lodzie.
    UWAGA: Zamrożona tkanka mózgowa może być przechowywana w temperaturze -80 °C do momentu zebrania wszystkich próbek do wspólnego przetwarzania, aby ograniczyć efekty wsadowe podczas przetwarzania w celu wygenerowania biblioteki. Podczas gdy próbki przechowywane w temperaturze -80 °C nie mogą być przechowywane w nieskończoność, protokół ten został z powodzeniem przeprowadzony na mózgach karpiów przechowywanych przez okres do 12 miesięcy bez zauważalnego spadku jakości.

2. Przygotuj świeże

  1. Przygotować bufor do płukania jąder (2% albuminy surowicy bydlęcej [BSA] w 1x PBS, sól fizjologiczna buforowana fosforanami pH 7,4 i 0,2 U/μL inhibitora RNazy) i przechowywać na lodzie. Przygotować 250 ml buforu do przemywania jąder na maksymalnie osiem próbek. W przypadku 250 ml należy użyć 50 ml 10% roztworu podstawowego BSA, 25 ml roztworu podstawowego 10x PBS, 1,25 ml zapasu inhibitora RNazy 40 U/μL, a następnie zwiększyć objętość do 250 ml za pomocą wolnego od RNAzy ddH2O.
  2. Przygotować bufor do lizy jąder (10 mM Tris-HCl pH 7,4, 10 mM NaCl, 3 mM MgCl2, 0,01875% v/v NP-40 i 0,2 U/μL inhibitora RNazy) i przechowywać na lodzie. Przygotować 10 ml buforu do lizy jąder na maksymalnie osiem próbek. W przypadku 10 ml należy użyć 100 μl 1 M roztworu podstawowego Tris-HCl pH 7,4, 20 μl roztworu podstawowego 5 M NaCl, 30 μl 1 M roztworu podstawowego MgCl2, 18,75 μl 10% roztworu podstawowego NP-40, 50 μl 40 U/μL inhibitora RNazy, a następnie doprowadzić objętość do 10 ml za pomocą wolnego od RNAzy ddH2O.

3. Izolowanie jąder

  1. W przypadku użycia zamrożonych próbek należy je rozmrażać na lodzie przez 10 minut. Jeśli używasz świeżo wypreparowanych mózgów, przejdź bezpośrednio do kroku 3.2
    UWAGA: Chociaż ten protokół może działać na pojedynczych mózgach, mniejsze próbki od młodych ryb (w wieku 5-6 tygodni) będą miały gorszą wydajność. Wystarczające plony można zawsze uzyskać, przetwarzając dwa mózgi jako jedną próbkę, niezależnie od wieku i płci ryb (tabela 1). Protokół ten z powodzeniem wyizolował wysokiej jakości jądra od ryb w wieku 5-26 tygodni, w tym zwierząt zarówno ze szczepów GRZ, jak i ZMZ1001. Nie przewiduje się żadnych problemów ze stosowaniem tego protokołu do innych szczepów.
  2. Zanurz mózg w 1 ml lodowatego buforu do lizy jąder w homogenizatorze Dounce o pojemności 2 ml. Utrzymuj homogenizator na lodzie i unikaj tworzenia pęcherzyków podczas lizy próbki. Odbijaj się z przybliżoną szybkością 0,5 s/skok w dół i 0,5 s/skok w górę ze skrętem o 180° na cykl. Odbijaj za pomocą luźnego tłuczka przez 15 uderzeń lub do momentu, gdy mieszanina tkanki i buforu do lizy stanie się jednorodna, jeśli potrzebne są dodatkowe pociągnięcia.
    UWAGA: Homogenizatory Dounce należy umyć, spłukać wodą destylowaną i wysterylizować standardowymi cyklami sterylizacji w suchym autoklawie między użyciami.
    1. Odbijaj za pomocą ciasnego tłuczka przez 30 uderzeń z małymi przerwami, od 30 s do 1 minuty, co 10 uderzeń. Odbijaj się z przybliżoną szybkością 0,5 s/skok w dół i 0,5 s/skok w górę ze skrętem o 180° na cykl. Pozostawić próbkę na lodzie w homogenizatorze Dounce przez 2 minuty
      UWAGA: Ten czas inkubacji zapewnia odpowiednią lizę, ale powinien zostać skrócony, jeśli zaobserwuje się nadmierną lizę jądrową.
  3. Przecedzić próbkę przez filtr komórkowy o wielkości 70 μm do stożkowej rurki o pojemności 15 ml wstępnie pokrytej 5% BSA.
  4. Dodać 4 ml buforu do płukania jąder do próbki, pipetując bufor do przemywania przez filtr komórkowy 70 μm z kroku 3.3 i delikatnie wymieszać przez inwersję pięć razy.
    UWAGA: Pozwala to na odzyskanie jąder, które mogą zostać uwięzione na filtrze i poprawia wydajność.
  5. Wirować za pomocą wahliwego wirnika kubełkowego o ciśnieniu 500 x g, 4 °C, przez 10 minut. Wyrzucić supernatant, delikatnie wlewając go do pojemnika na odpady płynne. Ustawić próbkę w pozycji pionowej i usunąć pozostały bufor do płukania za pomocą pipety P1000.
    UWAGA: Osad jądra może być widoczny, gdy zaczyna się od dwóch mózgów w jednej próbce. Jednak podczas przetwarzania pojedynczych mózgów od młodych zwierząt (w wieku 5-6 tygodni) oczekuje się niższej wydajności, a granulki nie zawsze mogą być widoczne. W takim przypadku supernatant należy ostrożnie usunąć, przyjmując położenie osadu na dnie probówki.
  6. Natychmiast zawiesić jądra w 1 ml buforu do przemywania jąder za pomocą końcówki do pipet P1000 o szerokim otworze.
  7. Doprowadzić próbkę do 5 ml przez dodanie 4 ml buforu do przemywania jąder i delikatnie wymieszać przez odwrócenie pięć razy. Odwirować za pomocą wahliwego wirnika kubełkowego o sile 500 x g, 4 °C, przez 10 minut i odrzucić supernatant.
  8. Zawiesić jądra w 1 ml buforu do przemywania jąder za pomocą końcówki pipety o szerokim otworze i przenieść do probówki do cytometrii przepływowej (FACS).
  9. Dodać 300 μl roztworu do usuwania zanieczyszczeń (tabela materiałów) i dokładnie wymieszać, pipetując końcówką o szerokim otworze, aż mieszanina stanie się jednorodna.
  10. Delikatnie nałożyć 1 ml buforu do przemywania jąder na roztwór jąder przygotowany w kroku 3.9 za pomocą pipety P1000 i przytrzymując probówkę pod niewielkim kątem (rysunek uzupełniający 2). Frakcja roztworu do usuwania zanieczyszczeń i frakcja buforowa płucząca jądra powinny tworzyć wyraźną granicę fazy, jeśli są prawidłowo ułożone warstwami.
  11. Wirować w obrotowym wirniku kubełkowym o temperaturze 3000 x g, 4 °C, przez 10 minut. Całkowicie odrzucić dwie górne fazy za pomocą pipety P1000.
    UWAGA: Przezroczysta probówka FACS pozwoli na wizualizację trzech odrębnych faz po wirowaniu (góra, interfaza, dół). Aby ułatwić maksymalne usuwanie zanieczyszczeń, zaleca się bardziej agresywne niż konserwatywne usuwanie dwóch górnych faz (tj. usunięcie niewielkiej ilości dolnej fazy jest lepsze niż przenoszenie którejkolwiek z górnych faz; Rysunek uzupełniający 2). Dodatkowo warstwa interfazowa może być zbyt cienka, aby można ją było uwidocznić. W takim przypadku usuń górną (widoczną) warstwę, która zawiera warstwę międzyfazową. Dolna warstwa, która jest zachowywana, powinna zawierać ~ 1 ml całkowitej objętości.
  12. Przenieś dolną warstwę do stożkowej probówki o pojemności 15 ml wstępnie pokrytej 5% BSA.
  13. W stożkowej probówce doprowadzić objętość do 15 ml za pomocą buforu do płukania jąder i trzykrotnie odwrócić w celu wymieszania.
  14. Wirować w obracającym się wirniku kubełkowym o sile 1000 x g, 4 °C, przez 10 minut. Ostrożnie usunąć supernatant.
  15. Natychmiast zawiesić ponownie w 150 μl buforu do przemywania jąder za pomocą końcówki do pipet o szerokim otworze.
  16. Zmień końcówkę pipety na standardową o pojemności ~300 μl. Pobrać całą próbkę, a następnie umieścić filtr 40 μm na końcówce na końcu końcówki pipety, uważając, aby nie usunąć próbki.
    UWAGA: Filtry na końcówce są niezbędne do uzyskania mniejszych objętości, które są potrzebne do utrzymania wystarczającego stężenia jąder do dalszych zastosowań. Na przykład dla sekwencji snRNA przy użyciu mikrofluidyki zalecane jest minimalne stężenie >300 jąder/μl, chociaż optymalny zakres to 700-1200 jąder/μL18. Wyższe stężenia jąder można również łatwo rozcieńczyć w razie potrzeby.
  17. Przefiltrować próbkę, wytłaczając ją na siłę przez filtr do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml o niskiej wiązalności DNA. Końcowa objętość elucji powinna wynosić 120-150 μL.
    UWAGA: W wyniku filtracji może dojść do spienienia. Wydaje się, że nie wpływa to na jakość jąder.

4. Ocena jakości jąder za pomocą mikroskopii

  1. W oddzielnej probówce do mikrowirówek zmieszać 10 μl przefiltrowanej próbki z 10 μl 0,4% roztworu błękitu trypanowego, delikatnie pipetując. Próbki nie wymagają wydłużonego czasu inkubacji i są gotowe do wizualizacji natychmiast po zmieszaniu z roztworem błękitu trypanowego.
  2. Umieścić 10 μl wybarwionych jąder w komorze szkiełka z komorą liczenia.
    UWAGA: Alternatywnie, nanieść 10 μl barwionej próbki jąder na hemocytometr lub szkiełko mikroskopowe i przykryć szkiełkiem nakrywkowym.
  3. Ocenić jakość jąder za pomocą mikroskopii świetlnej.
    UWAGA: Mniejsze powiększenia powinny być używane tylko do przybliżania jąder, ponieważ defekty jąder będą widoczne wizualnie tylko przy większych powiększeniach (tj. 60x lub wyższych). Ten krok można wykonać szybko, aby ocenić powodzenie przygotowania jąder i nie wymaga wtórnej analizy poza oględzinami. Wysokiej jakości, nienaruszone jądra będą miały ostro zarysowaną granicę20 (Rysunek 2A). Jądra o niskiej jakości będą miały uszkodzone błony jądrowe, niejednolite zabarwienie błękitem trypanowym w pobliżu błony jądrowej wskazujące na potencjalny wyciek kwasu nukleinowego i/lub dowody na pęcherzyki20 (Rysunek 2B). Oczekuje się, że zdrowe jądra będą miały średnicę 10-15 μm.

5. Ilościowe określenie jąder singletowych, szczątków i proporcji wielokrotności za pomocą cytometrii przepływowej

UWAGA: Specyficzna terminologia i interfejs oprogramowania cytometru przepływowego mogą się różnić w zależności od marki urządzenia, ale te kroki powinny być łatwo dostosowane do innych systemów, jeśli jest to wymagane.

  1. W probówce FACS ponownie zawiesić 10 μl przefiltrowanej próbki jąder w 90 μl buforu zalecanego do cytometrii przepływowej w celu rozcieńczenia 1:10. W tym celu w tym badaniu stosuje się filtrowany sterylizowany PBS o 0,22 μm, pH 7,2, z 2 mM EDTA i 0,5% BSA.
    UWAGA: Chociaż to rozcieńczenie będzie działać w przypadku większości preparatów jąder, mniejsze rozcieńczenie (np. 1:5) może być potrzebne do pobrania próbki wystarczającej liczby jąder do oceny jakości w przypadku próbki o niższej wydajności (tj. <30 jąder/μl w rozcieńczonej próbce).
  2. Wybarwić próbki jodkiem propidyny (PI) w końcowym stężeniu 1 μg/ml. Nie jest wymagany czas inkubacji, a jądra mogą być analizowane natychmiast.
    UWAGA: Alternatywnie wybarwić próbki końcowym stężeniem 0,1 μg/ml DAPI. Należy pamiętać, że DAPI powinno być odczytywane na innym kanale fluorescencyjnym niż PI (kanał Vioblue-A V1-A; wzbudzenie przy 405 nm, emisja przy 450/50 nm).
  3. Przeanalizować próbki na cytometrze przepływowym w następujący sposób:
    1. Konfigurowanie obszaru roboczego:
      1. Miej cytometr przepływowy w trybie akwizycji. Kliknij Plik, a następnie wybierz Nowy obszar roboczy z menu rozwijanego. Na karcie Eksperyment w lewym panelu wprowadź nazwę projektu i identyfikator próbki w odpowiednich polach.
      2. W lewym górnym pasku narzędzi kliknij przycisk Nowe okno analizy (ikona wykresu punktowego). Kliknij pole z trzema działkami (Działka 4t) w menu podręcznym. Na ekranie pojawią się trzy działki. Kliknij przycisk Tryb analizy w lewym górnym pasku narzędzi (ikona A), aby był szary, a nie pomarańczowy.
    2. Skonfiguruj wykresy analizy:
      1. Zmień osie trzech wykresów w następujący sposób, uporządkowane odpowiednio jako oś X i oś Y:
        Wykres 1: Oś X: FSC-A, oś Y: SSC-A
        Wykres 2: Oś X: HDR-T, oś Y: SSC-A
        Wykres 3: Oś X: PerCP-Vio700-A B3-A, oś Y: SSC-A
      2. Zmień osie, klikając etykietę osi i wybierając żądany kanał z menu rozwijanego.
      3. Ustaw wykresy tak, aby były oznaczone kolorami zagęszczenia, klikając kwadratową szarą ikonę "i", która pojawia się obok prawego górnego rogu każdej działki. Otworzy się okno Właściwości z panelem przycisków po lewej stronie. W oknie Właściwości kliknij ikonę Wykres rozrzutu (druga od góry po lewej stronie panelu). Kliknij OK.
        UWAGA: Kanał fluorescencyjny PerCP-Vio700-A B3-A odpowiada wzbudzeniu przy 488 nm i emisji w zakresie 650-730 nm.
    3. Skonfiguruj ustawienia instrumentu:
      1. Kliknij zakładkę Kanały w lewym panelu. Pojawi się lista wszystkich kanałów z trzema polami po prawej stronie. Ustaw B3, FSC-A i SSC-A na Hlog, klikając strzałkę w dół w odpowiednich pierwszych polach po prawej stronie i wybierając Hlog z menu rozwijanego. Ustaw napięcie SSC na 640 V, FSC na 300 V i B3 na 480 V, wpisując te liczby w odpowiednich środkowych polach po prawej stronie i naciskając Enter. Zwróć uwagę, że trzecie pole po prawej stronie to przełącznik, którego można używać naprzemiennie do pisania.
      2. Pod nagłówkiem Wyzwalacz ustaw wyzwalacz FSC na 4, a wyzwalacz SSC i B3 na 0, klikając strzałkę w dół, wybierając je z menu rozwijanego po lewej stronie, wpisując liczbę w polu po prawej stronie, a następnie naciskając Enter. Zwróć uwagę, że po prawej stronie znajduje się pole przełączania, którego można użyć zamiast wpisywania .
        UWAGA: Napięcia PMT muszą być zoptymalizowane dla każdej konkretnej maszyny do cytometrii przepływowej, ale wyzwalacz dla jąder musi być niższy niż ten, który jest zwykle używany dla komórek. Ponadto skala osi powinna być ustawiona na h-log.
    4. Wpisz 100 μl w polu tekstowym Objętość próbki i 50 μl w polu tekstowym Objętość absorpcji po lewej stronie okna oprogramowania przepływowego. Sprawdź, czy parametr Mix Sample (Wymieszaj próbkę) jest ustawiony na wartość Mix Gentle (Mieszaj delikatnie), aby uniknąć lizy jąder na tym etapie. Naciśnij trójkąt w okręgu (ikona odtwarzania) w prawym dolnym rogu, aby rozpocząć przepływ.
    5. Sprawdź jakość przepływu:
      1. Użyj obszaru rozproszenia bocznego (SSC-A) w porównaniu z HDR-T, aby sprawdzić, czy w próbce nie ma pęcherzyków powietrza lub grudek. Upewnij się, że ten wykres jest gładkim ciągiem punktów. Pęcherzyki powietrza lub grudki spowodują powstanie pustych obszarów na wykresie SSC-A w porównaniu z HDR-T.
      2. Sprawdź wykres rozproszenia bocznego (SSC-A) w stosunku do rozproszenia do przodu (FSC-A), aby sprawdzić, czy użyte napięcia są prawidłowe dla próbki.
        UWAGA: W przeciwieństwie do komórek, jądra nie rozdzielą się w pełni z gruzów na wykresie rozproszenia bocznego w porównaniu z wykresem rozproszenia do przodu. Jednak w kierunku środka wykresu powinno znajdować się skupisko zdarzeń o dużej gęstości odpowiadające jądrom (cieplejszy kolor) z mniejszą gęstością zdarzeń (chłodniejszy kolor) w tle odpowiadającym szczątkom.
    6. Analiza liczby i jakości jąder:
      1. Kliknij dwukrotnie wykres SSC-A vs. PerCp-Vio-700A, aby wyświetlić powiększony widok. Kliknij przycisk na lewym górnym pasku narzędzi z liniami prostopadłymi (Kwadrant), aby wybrać bramkę kwadrantową. Następnie kliknij w dowolnym miejscu na wykresie SSC-A vs. PerCp-Vio-700A, a kwadranty pojawią się wewnątrz wykresu.
      2. Kliknij w dowolnym miejscu na liniach podziału kwadrantu i przesuń kursor, aby zmodyfikować położenie kwadrantu. Umieść ćwiartki tak, aby lewy górny kwadrant zawierał skrajnie lewą populację (szczątki), a prawy górny kwadrant zawierał kilka skupisk (jąder) w kształcie łzy (zobacz Rysunek 3 dla konfiguracji bramki i przykłady wyników przepływu dla typowych wyników z przygotowaniami obejmującymi lub nieobejmującymi etap usuwania gruzu).
    7. Liczba szczątków w porównaniu z jądrami:
      1. Kliknij kwadratową szarą ikonę "i" w prawym górnym rogu wykresu, aby otworzyć okno Właściwości. Kliknij kartę Funkcje regionu; Pojawią się listy regionów i funkcji kreślenia.
      2. Na liście Regiony upewnij się, że obok górnego elementu znajduje się zielony znacznik wyboru, wskazujący, że zaznaczono cały wykres. Na liście Funkcje kliknij Liczba/μL, aby wyświetlić zielony znacznik wyboru. Kliknij OK, a w każdym kwadrancie pojawi się metryka liczb/μl.
      3. Aby wyświetlić nieprzetworzone liczby i wartości procentowe, w razie potrzeby wybierz pozycję Liczba i %-T na karcie Funkcje regionu. Liczby/μl w lewym i prawym górnym kwadrancie odpowiadają odpowiednio odłamkom i wydajnością jąder.
    8. Liczba singletów:
      1. Skrajna lewa gromada w kształcie łzy w dolnej części prawego górnego kwadrantu reprezentuje singlety. Narysuj wielokątną bramę wokół tej populacji, klikając przycisk wielokąta (Wielokąt) na lewym górnym pasku narzędzi.
      2. Kliknij jeden raz, przesuń mysz, aby rozpocząć rysowanie, a następnie kliknij ponownie, aby zakończyć liniowy segment bramy i rozpocząć następny. Kliknij dwukrotnie, aby zakończyć bramę. Kliknij obramowanie bramy i przesuń mysz, aby zmienić położenie bramy.
      3. Kliknij wierzchołki bramy, aby zmodyfikować kształt. Pojawią się liczby/μL populacji bramkowanej (singletów). Jest to stężenie preparatu jąder z początkowym rozcieńczeniem.
        UWAGA: Liniowa zależność obszaru rozproszenia do przodu w stosunku do wysokości 1:1, powszechnie używana do określania współczynnika singletów podczas przepływu komórek, nie ma zastosowania do jąder i może być pominięta.
    9. Korzystając ze stężenia rozcieńczonego preparatu jądrowego i współczynnika rozcieńczenia, należy obliczyć wstecznie stężenie wstępnego preparatu (np. dla rozcieńczenia 1:10 należy pomnożyć zaobserwowane stężenie przez 10). Stężenia od >300 jąder/μl są odpowiednie dla sekwencjonowania snRNA.

Wyniki

Opisany tutaj protokół izolacji jąder komórkowych z mózgu ryby killifish został zoptymalizowany specjalnie dla tego gatunku i został przedstawiony w podsumowaniu na Rysunku 1. Oprócz ekstrakcji jąder, protokół szczegółowo opisuje różne metody oceny jakości i ilości wyizolowanych jąder. Rysunek 2 przedstawia przykłady jąder zdrowych (Rysunek 2A) oraz niezdrowych (Rysunek 2B) w ocenie mikroskopowej. Zdrowe jądra odpowiednie do dalszych analiz (Rysunek 2A) występują jako pojedyncze jądra z nienaruszoną błoną. Jak pokazano na Rysunku 2B, najczęstszym powodem niepowodzenia tego protokołu (oraz innych protokołów izolacji jąder) jest powstawanie jąder nadmiernie lizowanych, które charakteryzują się uszkodzonymi błonami jądrowymi. Często prowadzi to do agregacji jąder i może przyczyniać się do sygnałów tła w późniejszych zastosowaniach z powodu wycieku kwasów nukleinowych z pękniętych jąder. W przypadku zaobserwowania nadmiernej agregacji zaleca się zachowanie większej ostrożności podczas etapów homogenizacji w homogenizatorze Dounce i/lub skrócenie czasu inkubacji w buforze lizującym.

Niniejszy protokół wykorzystuje cytometrię przepływową do ilościowego oznaczenia liczby wyizolowanych jąder oraz określenia względnej proporcji jąder multipletowych w próbce. Ponadto cytometria przepływowa może być użyta do oceny względnej zawartości zanieczyszczeń w postaci debris, często będących fragmentami pękniętych jąder i innymi szczątkami komórkowymi, które mogą niekorzystnie wpływać na dalsze analizy próbki jąder. Reprezentatywne dane z cytometrii przedstawiono na Rysunku 3. Wysokiej jakości procedura izolacji jąder powinna przynieść: 1) niewielką frakcję debris oraz 2) wysoką frakcję jąder singletowych w stosunku do multipletowych (> 80% frakcji jąder). Zastosowanie barwienia PI, które barwi kwasy nukleinowe, pozwala na oddzielenie jąder singletowych od debris i jąder multipletowych. Rysunek 3A przedstawia przykład preparatu zanieczyszczonego debris, natomiast Rysunek 3B jest przykładem wysokiej jakości eksperymentu.

Schemat sekcji mózgu ryby killifish i izolacji jąder komórkowych; analiza cytometryczna i mikroskopowa.
Rycina 1: Schemat izolacji jąder komórkowych z mózgu ryby killifish. Schemat eksperymentalny izolacji jąder komórkowych z zamrożonych lub świeżych mózgów ryb killifish. Po wyizolowaniu i ocenie, jądra mogą być wykorzystane w różnych analizach typu „omics”. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Proces podziału komórki na obrazie mikroskopowym pokazujący morfologię komórek w skali 10 µM.
Rycina 2: Ocena jakości jąder za pomocą mikroskopii. Jądra zmieszano w stosunku 1:1 z roztworem 0,4% błękitu trypanowego i wizualizowano na mikroskopie Echo Revolve przy użyciu obrazowania w polu jasnym z powiększeniem 60x. (A) Przykład jądra wysokiej jakości. Jądro występuje jako singlet, a błona jądrowa jest nienaruszona. (B) Przykład jąder słabej jakości. Błony jądrowe są uszkodzone, a jądra łączą się w dublety, prawdopodobnie z powodu wycieku lepkiego DNA, który jest widoczny w górnej części najwyższego jądra. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Schematy cytometrii przepływowej przedstawiające detekcję jąder i zanieczyszczeń z usunięciem i bez usuwania zanieczyszczeń.
Rycina 3: Ilościowe oznaczenie jąder i ocena czystości metodą cytometrii przepływowej. Próbki jąder zabarwiono roztworem PI w rozcieńczeniu 1:100 i analizowano na cytometrze przepływowym. Jądra występują w formie singletów i multipletów w prawym górnym kwadrancie (A,B), gdzie singlety stanowią najniższą chmurę zdarzeń, a następnie dublety, triplety itd. w kolejności rosnącej. Zanieczyszczenia są oznaczone zdarzeniami w dwóch lewym kwadrantach. (A) Przykład niskiej jakości preparatu jąder, w którym pominięto etap usuwania zanieczyszczeń, a zanieczyszczenia stanowią >40% zdarzeń. (B) Przykład wysokiej jakości próbki jąder z zastosowanym etapem usuwania zanieczyszczeń. W tym przykładzie zanieczyszczenia stanowią <10% wszystkich zdarzeń zarejestrowanych przez cytometr przepływowy. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Typ próbki (2 mózgi)Średnia wydajność (4 niezależne preparaty)
mózgi 5-tygodniowych samców 3,59 ± 1,76 x 105
Mózgi 10-tygodniowych samców 6,41 ± 1,33 x 105
mózgi 15-tygodniowych samców14,59 ± 2,05 x 105
Mózgi 5-tygodniowych samic 2,54 ± 0,75 x 105
Mózgi 10-tygodniowych samic 4,66 ± 1,29 x 105
Mózgi żeńskie w 15. tygodniu rozwoju 7,95 ± 3,51 x 105

Tabela 1: Średnie oczekiwane wydajności z dwóch mózgów afrykańskiego killifish turquoise w zależności od płci i wieku. Średnie wydajności wyrażone jako 105 jąder ± błąd standardowy średniej z czterech niezależnych preparatów jąder w każdej kategorii.

Rycina uzupełniająca 1: Porównanie jakości izolacji jąder komórkowych przy użyciu standardowych protokołów i naszego zoptymalizowanego protokołu w zamrożonych mózgach ryb z rodzaju killifish. (A) Ocena jakości jąder komórkowych za pomocą mikroskopii. Jądra zmieszano w stosunku 1:1 z roztworem 0,4% Trypan Blue i wizualizowano pod mikroskopem przy użyciu obrazowania w świetle przechodzącym z powiększeniem 60x. (B) Ilościowe oznaczenie jąder komórkowych i zawartości zanieczyszczeń za pomocą cytometrii przepływowej. Próbki jąder zabarwiono rozcieńczeniem 1:100 PI i analizowano na cytometrze przepływowym. (C) Podsumowanie wskaźników oceny jakości w mikroskopii i cytometrii przepływowej dla różnych benchmarkowych protokołów. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rycina uzupełniająca 2: Schematyczne przedstawienie etapów usuwania zanieczyszczeń. (A) Schemat warstwowania przed wirowaniem w celu usunięcia zanieczyszczeń. (B) Schemat usuwania nadsączu po wirowaniu. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Przedstawiony tutaj protokół może być wykorzystany do powtarzalnego generowania wysokiej jakości jąder z mózgów karpiów. Protokół ten musiał zostać specjalnie zaprojektowany dla mózgu karpia, ponieważ typowe protokoły izolacji jąder mózgowych ssaków stosowane do mózgów karpiów konsekwentnie skutkowały niską jakością jąder w naszych rękach. Podejrzewamy, że jest to spowodowane niższą względną zawartością mieliny w mózgu karpiowatego w porównaniu z ich ssaczymi odpowiednikami, które ulegają lizie i zlepiają się w odpowiedzi na trudne warunki wymagane do lizy komórek mózgowych ssaków. Protokół ten stanowi postęp w dziedzinie starzenia się i karpiów, ponieważ ułatwia badanie starzenia się mózgu na poziomie pojedynczej komórki w efektywnym kosztowo i czasowo modelu starzenia się mózgu kręgowców.

Protokół ten jest odporny na świeże lub mrożone próbki, chociaż należy wziąć pod uwagę dalsze zastosowania w przypadku stosowania świeżej lub zamrożonej tkanki. Zamrożona tkanka jest często wygodna, ponieważ można ją zbierać i przechowywać przez wiele miesięcy podczas pobierania próbek. Takie próbki mogą być bezpiecznie wykorzystywane do zastosowań takich jak sekwencja snRNA. Jednak zamrożenie próbek może zakłócić strukturę jądrową, a tym samym zdolność do dokładnego pomiaru krajobrazu chromatyny za pomocą ATAC-seq21. W związku z tym w przypadku dalszych zastosowań, takich jak masowy ATAC-seq lub snATAC-seq, zaleca się używanie świeżo wypreparowanych mózgów zamiast zamrożonych. Ponadto, ponieważ wszystkie etapy po homogenizacji mózgu mogą być wykonywane równolegle, protokół ten umożliwia badanie wielu próbek w rozsądnym czasie, ograniczając w ten sposób degradację RNA spowodowaną długotrwałą inkubacją na lodzie.

Ponadto konieczne jest przygotowanie świeżo (w ciągu kilku godzin) od przeprowadzenia ekstrakcji jąder. Stwierdziliśmy, że detergenty oraz BSA muszą być dodawane do bezpośrednio przed rozpoczęciem stosowania protokołu. zawierające tylko sole (PBS, NaCl itp.) mogą być sporządzane w postaci koncentratów, sterylizowane filtrem (0,22 μm) i przechowywane przez czas nieokreślony w temperaturze pokojowej. Roztwory podstawowe BSA mogą być przygotowywane, sterylizowane i przechowywane w temperaturze 4 °C w ciągu kilku dni od ekstrakcji jąder (jeżeli są przygotowane z proszku), ale zawsze powinny być dodawane do stosowanych w niniejszym protokole bezpośrednio przed zastosowaniem protokołu. Zalecamy jednak przygotowanie rozwiązań BSA w dniu sporządzenia protokołu. W przypadku korzystania z gotowych roztworów BSA od strony trzeciej, zaleca się używanie świeżych, nieotwartych butelek. Stosowanie świeżego BSA zazwyczaj prowadzi do mniejszej zawartości zanieczyszczeń w preparatach jądrowych.

Niezależnie od tego, czy jako dane wejściowe wykorzystywane są świeże, czy mrożone, ważna jest ocena jakości jąder po ich izolacji. Chociaż protokół ten został specjalnie zaprojektowany, aby uniknąć nadmiernej lizy, jest to najczęstsza przyczyna utraty jakości jąder. Nadmierna liza może wynikać ze zbyt długiego czasu spędzonego w buforze do lizy, zbyt ostrożnego obchodzenia się z jądrami, takiego jak nadmierne pipetowanie za pomocą końcówki pipety o standardowym otworze, lub zbyt długiego czasu spędzonego między izolacją jąder a dalszymi aplikacjami (>1 h). Nadmiernie zlizywane jądra często mają uszkodzone peryferie jądrowe, które przeciekają DNA i powodują zlepianie się (ryc. 2B). Doprowadzi to do zwiększenia liczby multipletów i przyczyni się do powstania kwasów nukleinowych w tle, które będą zakłócać dalsze zastosowania, zwłaszcza sekwencję snRNA. Obie cechy można ocenić za pomocą mikroskopii po izolacji jąder. W przypadku zaobserwowania nadmiernego zlepiania się jądra zaleca się skrócenie etapu inkubacji lizy, aby zmniejszyć ryzyko nadmiernej lizy. Jako alternatywna metoda zwiększania singletów jąder, sortowanie komórek wspomagane fluorescencją (FACS) może być stosowane do wzbogacania o pojedyncze miejsca po tym protokole. Zauważamy jednak, że podczas pracy z już kruchymi jądrami z zamrożonej tkanki, naprężenia ścinające występujące podczas sortowania mogą prowadzić do zwiększonego pękania jądra, a tym samym do zwiększenia temperatury RNA/DNA w otoczeniu. Ponadto zauważamy, że czas wymagany do przeprowadzenia sortowania FACS dla jąder podczas przetwarzania wielu próbek wymagałby, aby wszystkie próbki jąder pozostawały na lodzie przez wiele godzin, podczas gdy inne próbki są sortowane. W związku z tym wydłużony czas oczekiwania podczas przetwarzania wielu próbek równolegle z podejściem FACS może również prawdopodobnie prowadzić do ogólnego obniżenia jakości jąder i zwiększyć ryzyko degradacji RNA. Tak więc, jeśli FACS jest pożądany w celu zmniejszenia szybkości dubletów, zalecamy, aby zawartość zanieczyszczeń została ponownie sprawdzona po sortowaniu plonów i aby ewentualnie obniżona jakość RNA została uwzględniona w zastosowaniach sekwencyjnych RNA pojedynczych komórek jako potencjalne zastrzeżenie.

Dokładne oszacowanie liczby jąder i proporcji singletów jest niezbędne dla prawie wszystkich dalszych zastosowań "omicznych" i ma ogromne znaczenie. Ze względu na możliwość łatwego bramkowania i liczenia jąder według wielkości, cytometria przepływowa jest najdokładniejszą metodą liczenia jąder, jaką oceniliśmy. Alternatywnie można określić ilościowo jądra za pomocą liczników komórkowych, takich jak Automatyczny licznik komórek Countess 2 FL firmy Invitrogen lub automatyczny licznik komórek DeNovix CellDrop. Warto zauważyć, że Countess 2 FL Automated Cell Counter firmy Invitrogen, a w znacznie mniejszym stopniu DeNovix, mają tendencję do zawyżania liczby jąder, licząc szczątki jako jądra, co oznacza, że może być wymagane ręczne bramkowanie rozmiaru. Ponadto cytometr przepływowy pozwala w łatwy sposób ocenić czystość jąder. Można dostrzec względną proporcję jąder singletowych w stosunku do jąder wielopletowych w sposób ilościowy, który jest trudny do zbadania przez mikroskopię. Ma to zasadnicze znaczenie dla snRNA-seq i snATAC-seq, ponieważ protokoły te będą cierpieć z powodu nadmiaru próbek wielokrotnych, które należy wykluczyć z dalszych analiz. Oprócz wielokrotności, względna proporcja "śmieci" (rozdrobnione jądra, szczątki komórkowe) może być określona ilościowo za pomocą cytometrii przepływowej i musi być stosunkowo niska, ponieważ materiał ten często zawiera zanieczyszczające kwasy nukleinowe, które mogą przyczyniać się do sygnału tła i zniekształcać dane "omiczne" pojedynczego jądra.

Podobnie jak w przypadku wcześniej opisanych protokołów izolacji jąder, proporcje typów komórek w oryginalnej tkance mogą nie być wiernie odtworzone w preparacji jąder19, a zatem powinny być interpretowane z ostrożnością. Należy zauważyć, że podobnie jak wszystkie teleosty, afrykańskie turkusowe karpiowate mają jądrzaste erytrocyty, które również mają być reprezentowane w przygotowaniu jąder. Jądra te można zidentyfikować w zestawach danych snRNA-seq i snATAC-seq na podstawie wyższej ekspresji/dostępności genów hemoglobiny i w razie potrzeby można je wykluczyć obliczeniowo.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Niektóre panele zostały wygenerowane za pomocą BioRender.com. Prace w naszym laboratorium były wspierane przez NIA T32 AG052374 Postdoctoral Training Grant dla B.T., grant Fundacji Simonsa w ramach Simons Collaboration for Plasticity in the Aging Brain, grant pilotażowy od Navigage Foundation oraz nagrodę Hanson-Thorell Family dla B.A.B.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,4% roztwór błękitu trypanowegoGibco15250061
10x PBSBiolandPBS01-03
15 ml probówka wirówkowa do grzechówek ConicleVWR89039-664
2 ml Młynek do tkanekKimble885300-0002Homogenizator dounce
5 ml polistyrenu Probówka okrągłodennaFalcon352054
5M Chlorek sodu, Biologia molekularna klasyPromegaV4221
autoMACS Roztwór płuczącyMiltenyi Biotec130-091-222Odpowiada to 1x PBS pH 7,2, 2 mM EDTA (używany do cytometrii przepływowej)
Roztwór do usuwania zanieczyszczeńMiltenyi Biotec130-109-398
Rurka DNA LoBInd MikroskopEppendorf22431021
Echo Revolve (wyposażony w obiektyw 60x)EchoNABrak numeru katalogowego; Służy do wizualnej kontroli jąder.
Probówki z polistyrenu Falcon z okrągłym dnem, 5 mlFalcon352052probówka FACS
Sitka komórkowe FLOWMI, 40 μ MSP Bel-Art136800040Określane jako filtry na końcówce w protokole
Kwas solnySigma-Aldrich258146-500 mLSłuży do obniżania pH TRIS z 8,0 do 7,4
Luneta sekcyjna Leica EZ4LeicaNABrak numeru katalogowego
MACS BSA roztwór podstawowyMiltenyi Biotec130091376
MACS SmartStrainers (70 μ M)Miltenyi Biotec130-110-916
MACSQuant Analyzer 10 Cytometr przepływowyMiltenyi BiotecNABrak numeru katalogowego
Chlorek magnezu, sześciowodny, klasa biologii molekularnej (proszek)Millipore442611
Megafuge 16R WirówkaThermoScientific75003629
Micro Cover GlassVWR48393081
Mikroprowadnice Superfrost PlusVWR48311-703
Nonidet P-40 ZamiennikRoche(Roche) 11332473001/ Katalog: 983739 P Kod: -102368106 (Sigma Aldrich)
NP-40 Surfact-Amps Roztwór detergentuThermoFisher85124
Bez nukleaz HyPure Biologia molekularna KlasaHyCloneSH30538.02
NxGen RNaza Inhibitor (50 000 U)Lucigen30281-2
Roztwór jodku propidynyMBLFP00010020
PureBlu DAPI Nuclear Staining DyeBiorad1351303
Końcówki do pipet TipOne RPT (o bardzo niskiej retencji, filtrowane) w 10 i mikro; L, 20 i mikro; L, 200 i mikro; L oraz 1000 i mikro; Rozmiary LUSA Scientific#1181-3810; #1180-1810; #1180-8810; #1182-1830
Tricaine-S (MS 222)SyndelTricaine10GSyndel jest zatwierdzonym przez FDA dostawcą farmaceutycznej Tricaine
TRIS, 1 M, pH 8.0VWRE199-500 mL
Końcówki do pipet o szerokim otworzeAxygenT-1005-WB-C

Bibliografia

  1. Yankner, B. A., Lu, T., Loerch, P. The aging brain. Annual Review of Pathology. 3 (1), 41-66 (2008).
  2. Hu, C. K., Brunet, A. The African turquoise killifish: A research organism to study vertebrate aging and diapause. Aging Cell. 17 (3), 12757(2018).
  3. McKay, A., et al. An automated feeding system for the African killifish reveals effects of dietary restriction on lifespan and allows scalable assessment of associative learning. bioRxiv. , (2021).
  4. Valenzano, D. R., Terzibasi, E., Cattaneo, A., Domenici, L., Cellerino, A. Temperature affects longevity and age-related locomotor and cognitive decay in the short-lived fish Nothobranchius furzeri. Aging Cell. 5 (3), 275-278 (2006).
  5. Vanhunsel, S., et al. The killifish visual system as an in vivo model to study brain aging and rejuvenation. NPJ Aging and Mechanisms of Disease. 7 (1), 22(2021).
  6. Armand, E. J., Li, J., Xie, F., Luo, C., Mukamel, E. A. Single-cell sequencing of brain cell transcriptomes and epigenomes. Neuron. 109 (1), 11-26 (2021).
  7. Bakken, T. E., et al. Single-nucleus and single-cell transcriptomes compared in matched cortical cell types. PLoS One. 13 (12), 0209648(2018).
  8. Ziffra, R. S., et al. Single-cell epigenomics reveals mechanisms of human cortical development. Nature. 598 (7879), 205-213 (2021).
  9. Grindberg, R. V., et al. RNA-sequencing from single nuclei. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (49), 19802-19807 (2013).
  10. Kalish, B. T., et al. Single-nucleus RNA sequencing of mouse auditory cortex reveals critical period triggers and brakes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (21), 11744-11752 (2020).
  11. Slyper, M., et al. A single-cell and single-nucleus RNA-Seq toolbox for fresh and frozen human tumors. Nature Medicine. 26 (5), 792-802 (2020).
  12. Ayhan, F., Douglas, C., Lega, B. C., Konopka, G. Nuclei isolation from surgically resected human hippocampus. STAR Protocols. 2 (4), 100844(2021).
  13. Gaublomme, J. T., et al. Nuclei multiplexing with barcoded antibodies for single-nucleus genomics. Nature Communications. 10 (1), 2907(2019).
  14. Narayanan, A., et al. Nuclei isolation from fresh frozen brain tumors for single-nucleus RNA-seq and ATAC-seq. Journal of Visualized Experiments. (162), e61542(2020).
  15. Saunders, A., et al. Molecular diversity and specializations among the cells of the adult mouse brain. Cell. 174 (4), 1015-1030 (2018).
  16. Genomics, X. Isolation of Nuclei for Single Cell RNA Sequencing & Tissues for Single Cell RNA Sequencing. , Available from: https://support.10xgenomics.com/permalink/1dlB6Z91VqClgUmSC2OM8k (2021).
  17. Martin, C., et al. Frozen tissue nuclei extraction (for 10xV3 snSEQ) V.2. protocols.io. , (2020).
  18. Nuclei Isolation from Adult Mouse Brain Tissue for Single Cell RNA Sequencing. 10xGenomics. , Available from: https://www.10xgenomics.com/support/single-cell-gene-expression/documentation/steps/sample-prep/nuclei-isolation-from-adult-mouse-brain-tissue-for-single-cell-ma-sequencing (2022).
  19. Denisenko, E., et al. Systematic assessment of tissue dissociation and storage biases in single-cell and single-nucleus RNA-seq workflows. Genome Biology. 21 (1), 130(2020).
  20. What are the best practices for working with nuclei samples for 3' single-cell gene expression. 10xGenomics. , Available from: https://kb.10xgenomics.com/hc/en-us/articles/360050780051-What-are-the-best-practices-for-working-with-nuclei-samples-for-3-single-cell-gene-expression- (2022).
  21. Rocks, D., et al. Cell type-specific chromatin accessibility analysis in the mouse and human brain. Epigenetics. 17 (2), 202-219 (2022).

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Izolacja jąder komórkowychsekwencjonowanie pojedynczych jąderwirowanie gradientowecytometria przepływowasekwencjonowanie RNAusuwanie zanieczyszczeńanaliza epigenetyczna
Delikatna izolacja jąder od tkanki mózgowej dorosłego afrykańskiego turkusowego Killifisha, naturalnie krótkotrwały model do badań nad starzeniem się
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.