Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Izolacja i bezpośrednie przeprogramowanie neuronów astrocytów myszy

3.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/64175

⸱

7 lipca 2022

 ,  , 
1Institute of Stem Cell Research, Helmholtz Zentrum München, German Research Center for Environmental Health, 2Department of Physiological Genomics, Biomedical Center Munich, Ludwig-Maximilians University, 3Graduate School of Systemic Neurosciences, BioCenter, Ludwig-Maximilians University

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj opisujemy szczegółowy protokół generowania wysoce wzbogaconych kultur astrocytów pochodzących z różnych regionów ośrodkowego układu nerwowego myszy po urodzeniu i ich bezpośredniej konwersji w funkcjonalne neurony przez wymuszoną ekspresję czynników transkrypcyjnych.

Streszczenie

Bezpośrednie przeprogramowanie neuronów to potężne podejście do generowania funkcjonalnych neuronów z różnych populacji komórek startowych bez przechodzenia przez multipotencjalne produkty pośrednie. Technika ta jest nie tylko bardzo obiecująca w dziedzinie modelowania chorób, ponieważ pozwala na przykład przekształcić fibroblasty u pacjentów cierpiących na choroby neurodegeneracyjne w neurony, ale także stanowi obiecującą alternatywę dla komórkowych terapii zastępczych. W tym kontekście dużym przełomem naukowym było wykazanie, że zróżnicowane komórki nienerwowe w ośrodkowym układzie nerwowym, takie jak astrocyty, mogą zostać przekształcone w funkcjonalne neurony in vitro. Od tego czasu bezpośrednie przeprogramowanie astrocytów w neurony in vitro dostarczyło istotnych informacji na temat mechanizmów molekularnych leżących u podstaw wymuszonej konwersji tożsamości i przeszkód, które uniemożliwiają skuteczne przeprogramowanie. Jednak wyniki eksperymentów in vitro przeprowadzonych w różnych laboratoriach są trudne do porównania ze względu na różnice w metodach stosowanych do izolacji, hodowli i przeprogramowania astrocytów. W tym miejscu opisujemy szczegółowy protokół niezawodnej izolacji i hodowli astrocytów o wysokiej czystości z różnych regionów ośrodkowego układu nerwowego myszy w wieku postnatalnym poprzez magnetyczne sortowanie komórek. Ponadto udostępniamy protokoły przeprogramowania hodowanych astrocytów w neurony poprzez transdukcję wirusa lub transfekcję DNA. Ten uproszczony i ustandaryzowany protokół może być wykorzystany do zbadania mechanizmów molekularnych leżących u podstaw utrzymania tożsamości komórki, ustanowienia nowej tożsamości neuronalnej, a także generowania określonych podtypów neuronów i ich właściwości funkcjonalnych.

Wprowadzenie

Ośrodkowy układ nerwowy (OUN) ssaków jest bardzo złożony, składa się z setek różnych typów komórek, w tym ogromnej liczby różnych podtypów neuronów1,2,3,4,5,6. W przeciwieństwie do innych narządów lub tkanek7,8,9, ośrodkowy układ nerwowy ssaków ma bardzo ograniczoną zdolność regeneracyjną; Utrata neuronów w wyniku urazowego uszkodzenia mózgu lub neurodegeneracji jest nieodwracalna i często prowadzi do deficytów motorycznych i poznawczych10. Dążąc do ratowania funkcji mózgu, różne strategie zastępowania utraconych neuronów są intensywnie badane11. Wśród nich bezpośrednie przeprogramowanie komórek somatycznych w funkcjonalne neurony wyłania się jako obiecujące podejście terapeutyczne12. Bezpośrednie przeprogramowanie lub transdyferencjacja to proces przekształcania jednego zróżnicowanego typu komórki w nową tożsamość bez przechodzenia przez pośredni stan proliferacyjny lub pluripotencjalny13,14,15,16. Zapoczątkowana przez identyfikację MyoD1 jako czynnika wystarczającego do przekształcenia fibroblastów w komórki mięśniowe17,18, metoda ta została z powodzeniem zastosowana do przeprogramowania kilku typów komórek w funkcjonalne neurony19,20,21.

Astrocyty, najliczniejsze makroglej w klasie CNS22,23, są szczególnie obiecującym typem komórek do bezpośredniego przeprogramowania neuronów z kilku powodów. Po pierwsze, są one szeroko i równomiernie rozmieszczone w OUN, zapewniając obfite źródło loco dla nowych neuronów. Po drugie, astrocyty i neurony są blisko spokrewnione rozwojowo, ponieważ mają wspólnego przodka podczas rozwoju embrionalnego, promieniste komórki glejowe24. Wspólne embrionalne pochodzenie tych dwóch typów komórek wydaje się ułatwiać konwersję neuronalną w porównaniu z przeprogramowywaniem komórek z różnych listków rozrodczych19,21. Co więcej, informacje o wzorcach dziedziczone przez astrocyty poprzez ich promieniste pochodzenie glejowe są również utrzymywane w dorosłych astrocytach25,26,27, i wydaje się, że przyczynia się do generowania regionalnie odpowiednich podtypów neuronów28,29,30. W związku z tym badanie i zrozumienie konwersji astrocytów w neurony jest ważną częścią osiągnięcia pełnego potencjału tej techniki w strategiach wymiany opartych na komórkach.

Przekształcenie astrocytów hodowanych in vitro w neurony doprowadziło do kilku przełomów w dziedzinie bezpośredniego przeprogramowania neuronów, w tym: i) identyfikacji czynników transkrypcyjnych wystarczających do generowania neuronów z astrocytów15,19,31, ii) rozwikłanie mechanizmów molekularnych wywołanych przez różne czynniki przeprogramowujące w tym samym kontekście komórkowym32, oraz iii) podkreślając wpływ rozwojowego pochodzenia astrocytów na indukowanie różnych podtypów neuronów28,29,33. Co więcej, bezpośrednia konwersja astrocytów in vitro ujawniła kilka głównych przeszkód, które ograniczają bezpośrednie przeprogramowanie neuronów34,35, takich jak zwiększona produkcja reaktywnych form tlenu (ROS)34 i różnice między proteomem mitochondrialnym astrocytów a neuronami35. W związku z tym obserwacje te zdecydowanie wspierają wykorzystanie pierwotnych kultur astrocytów jako modelu bezpośredniego przeprogramowania neuronów w celu zbadania kilku fundamentalnych pytań w biologii12, związanych z utrzymaniem tożsamości komórki, przeszkodami zapobiegającymi zmianom losu komórki, a także rolą metabolizmu w przeprogramowaniu.

Tutaj prezentujemy szczegółowy protokół izolacji astrocytów od myszy w wieku postnatalnym (P) z bardzo wysoką czystością, czego dowodem jest izolacja astrocytów od mysiego rdzenia kręgowego29. Dostarczamy również protokoły przeprogramowania astrocytów w neurony poprzez transdukcję wirusową lub transfekcję plazmidu DNA. Przeprogramowane komórki mogą być analizowane po 7 dniach od transdukcji (7 DPT) w celu oceny różnych aspektów, takich jak wydajność przeprogramowania i morfologia neuronów, lub mogą być utrzymywane w hodowli przez kilka tygodni, aby ocenić ich dojrzewanie w czasie. Co ważne, protokół ten nie jest specyficzny dla astrocytów rdzenia kręgowego i może być łatwo stosowany do izolowania astrocytów z różnych innych obszarów mózgu, w tym istoty szarej kory mózgowej, śródmózgowia i móżdżku.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Poniższa procedura jest zgodna z wytycznymi Helmholtz Zentrum Monachium dotyczącymi opieki nad zwierzętami zgodnie z dyrektywą 2010/63/UE w sprawie ochrony zwierząt wykorzystywanych do celów naukowych. Upewnij się, że przestrzegasz wytycznych dotyczących opieki nad zwierzętami instytucji, w której przeprowadzana jest sekcja.

1. Przygotowanie materiałów do sekcji, dysocjacji i hodowli

UWAGA: Przygotuj wszystkie odczynniki do hodowli w komorze bezpieczeństwa biologicznego i pracuj używając tylko autoklawowanego lub sterylnego sprzętu. Odczynniki do preparacji i dysocjacji można przygotować poza komorą bezpieczeństwa biologicznego.

  1. Przygotować kolby hodowlane, pokrywając kolbę hodowlaną T25 poli-D-lizyną (roztwór podstawowy 1 mg/ml; roztwór roboczy 20 μg/ml) wH2Oprzez co najmniej 2 godziny. Następnie spłukać 3x H2O i wysuszyć na powietrzu.
  2. Przygotować bufor do rozwarstwiania, dodając 5 ml 1 M roztworu buforowego HEPES do 500 ml zbilansowanego roztworu soli Hanka (HBSS).
  3. Przygotuj jedną rurkę C (patrz tabela materiałów) na sześć rdzeni kręgowych, dodając 1950 μl buforu X z zestawu do dysocjacji tkanek nerwowych (patrz tabela materiałów). Przechowywać na lodzie podczas sekcji. Przygotować główną mieszankę do trawienia enzymatycznego, dodając 20 μl buforu Y i 10 μl buforu A na probówkę C (część zestawu do dysocjacji tkanek nerwowych; patrz tabela materiałów). Dobrze wymieszać i przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu, gdy będzie potrzebny.
  4. Przygotuj 1x sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (1x PBS) z wapniem i magnezem i umieść na lodzie. Przygotować podstawową pożywkę hodowlaną, dodając 5 ml penicyliny-streptomycyny (końcowe stężenie, 100 U/ml), 5 ml 45% D-glukozy i 5 ml suplementu glutaminy (końcowe stężenie 2 mM; patrz tabela materiałów) do 485 ml DMEM/F12. Pożywka zasadowa jest stabilna w temperaturze 4 °C przez 4 tygodnie.
  5. Przygotować pożywkę do hodowli astrocytów, dodając 1 ml suplementu witaminy B27 i 5 ml płodowej surowicy bydlęcej (FBS) do 44 ml podstawowej pożywki hodowlanej. Uzupełnij pożywkę w naskórkowy czynnik wzrostu (EGF) i zasadowy czynnik wzrostu fibroblastów (bFGF) (po 10 ng/ml). Dodać EGF i bFGF tuż przed użyciem do odpowiedniej ilości podłoża.
  6. Do wypreparowania tkanki rdzenia kręgowego użyj pary dużych kleszczy ze zgiętą końcówką, pary małych kleszczy ze zgiętą końcówką, jednej pary małych kleszczy, pary małych nożyczek i małej szpatułki.

2. Izolacja astrocytów

  1. Wyizoluj astrocyty z rdzenia kręgowego myszy po urodzeniu w celu przeprowadzenia ich bezpośredniego przeprogramowania w funkcjonalne neurony (Rysunek 1A). W tym protokole należy pobrać tkankę rdzenia kręgowego od myszy w 2-3 dniu po urodzeniu. Zbierz od sześciu do ośmiu rdzeni kręgowych w celu izolacji astrocytów. Użyj tego samego protokołu, aby wyizolować astrocyty z innych regionów układu nerwowego, takich jak kora mózgowia, śródmózgowie i móżdżek. W przypadku tych regionów należy pobrać komórki w ciągu pięciu do siedmiu dni po urodzeniu.
    UWAGA: Dążąc do wyizolowania astrocytów z regionów, które nie są wymienione w tym protokole, wiek i materiał wejściowy powinny być określone doświadczalnie.

3. Wycięcie tkanki rdzenia kręgowego

UWAGA: Sekcja tkanek może być przeprowadzona poza kabiną bezpieczeństwa biologicznego.

  1. Złóż w ofierze myszy w P2-P3 przez dekapitację bez znieczulenia zwierzęcia. Umieść tułów na szalce Petriego o średnicy 35 mm i trzymaj na lodzie.
  2. Otwórz skórę nożyczkami, usuń kręg małymi nożyczkami, wyciągnij rdzeń kręgowy i umieść go w buforze preparacyjnym na lodzie. Pod stereotaktycznym mikroskopem preparacyjnym z 2-krotnym powiększeniem usuń opony mózgowe z izolowanego rdzenia kręgowego za pomocą kleszczy i przenieś wypreparowaną i oczyszczoną tkankę rdzenia kręgowego do rurki C.

4. Magnetyczne sortowanie komórek aktywowanych (MACS)

  1. Do każdej rurki C dodać 50 μl enzymu P z zestawu do dysocjacji tkanek nerwowych (patrz tabela materiałów) i 30 μl wcześniej przygotowanej mieszanki enzymów. Odwróć rurki C i umieść je na podgrzewanym dysocjatorze (patrz Tabela materiałów), upewniając się, że cała tkanka została zebrana w wieczku probówki.
  2. Uruchom program dysocjacji 37_NTDK_1 o czasie działania około 22 minut. Na krótko przed zakończeniem programu umieść sitko o pojemności 70 μm (patrz Tabela materiałów) na probówkach o pojemności 15 ml równej liczbie użytych probówek C i wstępnie zwilż sitko 2 ml lodowatego PBS. Przechowywać 1x PBS na lodzie podczas całej procedury MACS.
  3. Po zakończeniu programu wyjmij probówki C i krótko je odwiruj, aby zebrać tkankę na dnie probówek. Przenieść zdysocjowaną tkankę z probówek C do probówek o pojemności 15 ml przygotowanych przez przepuszczenie jej przez sitko. Pozostaw sitko na probówkach o pojemności 15 ml.
  4. Przepłucz probówkę C 10 ml 1x PBS, aby zebrać resztki tkanki i zebrać je w tej samej probówce o pojemności 15 ml, ponownie przechodząc przez sitko. Odwirować probówki o pojemności 15 ml zawierające zdysocjowaną tkankę o sile 300 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
    UWAGA: Po tym kroku schłodzić wirówkę do 4 °C.
  5. Usunąć supernatant bez naruszania osadu komórkowego przed ponownym zawieszeniem komórek w 80 μl 1x PBS; dodać 10 μl odczynnika blokującego z mysiego zestawu MicroBead anty-ACSA-2 (patrz Tabela materiałów). Delikatnie wymieszać, pipetując.
  6. Inkubować w temperaturze 4 °C przez 10 minut w ciemności (w lodówce). Dodać 10 μl mikrogranulek sprzężonych z antygenem 2 na powierzchni komórek antyastrocytów (patrz tabela materiałów) i delikatnie wymieszać pipetując. Inkubować przez 15 minut w temperaturze 4 °C w ciemności.
  7. Przemyć komórki, dodając 3 ml 1x PBS i odwirować przy 300 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Podczas wirowania należy zamontować separator magnetyczny (patrz Tabela materiałów), umieszczając odpowiednią liczbę magnetycznych kolumn sortujących (patrz Tabela materiałów) na separatorze z probówką zbiorczą o pojemności 15 ml pod spodem. Przepłukać kolumny 500 μl 1x PBS.
  8. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki w 500 μl 1x PBS przed przeniesieniem zawiesin komórek do kolumn magnetycznych. Pozwól spłynąć grawitacyjnie. Przemyć probówki o pojemności 15 ml 500 μl 1x PBS i nałożyć na kolumnę. Umyj kolumny z 500 μl 1x PBS dla dodatkowych dwóch prań.
  9. Eluować komórki, wyjmując kolumnę z separatora, dodając 800 μl pożywki do hodowli astrocytów i wypychając komórki z kolumny za pomocą dołączonego tłoka.
  10. Komórki płytki w wcześniej przygotowanych kolbach hodowlanych przez dodanie 4,2 ml pożywki do hodowli astrocytów uzupełnionej EGF i bFGF oraz hodowli w temperaturze 37 °C i 5% CO2,
    UWAGA: Powlekanie kolb hodowlanych nie jest konieczne w przypadku astrocytów izolowanych z innych obszarów mózgu, ale zapewnia lepszy substrat dla astrocytów wyizolowanych z rdzenia kręgowego.
  11. Hoduj komórki przez około 7 dni, aż do zbiegu (80%-90%). Jeśli komórki nie zlewają się po 7 dniach, odczekaj do 10 dni przed ich posiewem. Po 10 dniach komórki przestają się namnażać, a wydajność przeprogramowywania spada.

5. Zasiewanie astrocytów w celu przeprogramowania

UWAGA: Następujące kroki muszą być wykonane pod komorą bezpieczeństwa biologicznego o poziomie bezpieczeństwa 1 (SL1).

  1. Przygotować 24-dołkowe płytki z szkiełkami nakrywkowymi ze szkła pokrytego poli-D-lizyną w taki sam sposób, w jaki wcześniej przygotowywano kolby hodowlane. Aby określić liczbę potrzebnych płytek, należy wziąć pod uwagę, że astrocyty są posiane w gęstości 5-5,5 x 104 komórek na dołek na płytce 24-dołkowej. Zwykle wyizolowanie sześciu rdzeni kręgowych od myszy P2 daje około 1 x 106 komórek.
  2. Odessać pożywkę z kolb hodowlanych T25 zawierających wyhodowane astrocyty i przemyć raz 1x PBS. Odłączyć astrocyty od kolby hodowlanej, dodając 0,5 ml 0,05% trypsyny/EDTA i inkubować w temperaturze 37 °C przez 5 minut. Delikatnie postukaj w bok kolby, aby uwolnić komórki z powierzchni kolby hodowlanej i sprawdź oderwanie pod mikroskopem jasnego pola przy użyciu 10-krotnego powiększenia.
  3. Przerwij trypsynizację za pomocą 2,5 ml pożywki do hodowli astrocytów i zbierz zawiesinę komórek w probówkach o pojemności 15 ml. Wirować przy 300 x g przez 5 minut, odsysać supernatant i ponownie zawiesić komórki w 1 ml pożywki do hodowli astrocytów. Oblicz stężenie komórek za pomocą hemocytometru lub automatycznego systemu zliczania komórek.
  4. W zależności od liczby komórek rozcieńczyć zawiesinę komórek świeżą pożywką astrocytów, aby uzyskać roztwór 1-1,1 x 105 komórek na ml. Uzupełnij pożywkę EGF i bFGF w stężeniu 10 ng/ml na czynnik. Dodać 500 μl zawiesiny komórkowej, co odpowiada 5-5,5 x 104 komórek, do każdego dołka z uprzednio przygotowanych 24-dołkowych płytek i komórek hodowlanych w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .

6. Wymuszona ekspresja czynników transkrypcyjnych

UWAGA: Zanim przystąpimy do protokołu, konieczne jest prawidłowe zaprojektowanie eksperymentu. W szczególności ważne jest, aby zawsze uwzględniać kontrolę ujemną dla przeprogramowania, a mianowicie stan, w którym nie wyraża się czynnika przeprogramowania. Na przykład w przypadku stosowania wektorów przenoszących cDNA jako czynnika przeprogramowującego i reportera (np. białka zielonej fluorescencji (GFP), DsRed), kontrola negatywna jest reprezentowana przez ten sam wektor przenoszący tylko reporter. W przypadku wyrażania wielu czynników, w których występują różne osoby zgłaszające, kontrola ujemna powinna być odpowiednio dostosowana.

  1. Dzień po posiewie należy sprawdzić płytki 24-dołkowe, aby upewnić się, że komórki przylegają do szkiełek nakrywkowych.
  2. W oparciu o cel eksperymentu i dostępne zasoby, wymuszoną ekspresję czynników przeprogramowujących można osiągnąć poprzez transdukcję wirusa (patrz krok 6.3) lub transfekcję DNA (patrz krok 6.4).
    UWAGA: Stosowanie retrowirusa lub lentiwirusa wymaga zgody organów rządowych i musi być wykonywane w komorze bezpieczeństwa biologicznego w laboratorium o poziomie bezpieczeństwa 2 (SL2).
  3. Przeprogramuj astrocyty, transdukując komórki za pomocą retrowirusa lub lentiwirusa przenoszącego informację genetyczną w celu ekspresji interesującego czynnika (czynników) przeprogramowania, jak opisano poniżej.
    1. Transdukuj komórki o wysokim mianie wirusa 1 x10 10-1 x 1012 cząstek/ml, dodając 1 μl zawiesiny komórkowej bezpośrednio do pożywki astrocytów. Zapewnia to wysoki wskaźnik infekcji. Hodować komórki za pomocą pożywki astrocytów zawierającej cząsteczki wirusa w temperaturze 37 °C przez 24-36 godzin przed przystąpieniem do sekcji 7 lub sekcji 8, w zależności od celu eksperymentu.
      UWAGA: Różne promotory mogą być używane do kierowania ekspresją transgenów (patrz również Reprezentatywne wyniki). Promotory konstytutywne (np. CMV, CAG) indukują ekspresję transgenu wcześniej niż promotory indukowalne; Jednak oba typy promotorów zostały z powodzeniem wykorzystane do przeprogramowania komórek w neurony.
  4. Plazmidy DNA mogą być również wprowadzane do astrocytów poprzez transfekcję DNA, jak opisano poniżej.
    UWAGA: Można to zrobić w komorze bezpieczeństwa biologicznego zatwierdzonej dla SL1.
    1. Przed transfekcją należy uzyskać odczynnik do transfekcji, plazmidowe DNA pożądanych konstruktów, świeżą pożywkę astrocytów i pożywkę zredukowaną surowicą (patrz Tabela materiałów). Obliczyć wymaganą ilość pożywki o obniżonej zawartości surowicy (patrz Tabela materiałów), biorąc pod uwagę, że każda studzienka na 24-dołkowej płytce wymaga 300 μl pożywki o obniżonej zawartości surowicy. Dodać odpowiednią ilość pożywki o obniżonej zawartości surowicy do probówki o pojemności 50 ml i ogrzać ją do temperatury 37 °C.
    2. Gdy pożywka o obniżonej zawartości surowicy jest ciepła, odessać pożywkę astrocytów ze wszystkich studzienek i zebrać ją w probówce o pojemności 50 ml. Przefiltruj zebrane podłoże astrocytów za pomocą filtra strzykawkowego 0,45 μM, aby usunąć oderwane komórki.
    3. Dodać równą objętość świeżej pożywki astrocytowej do przefiltrowanej pożywki, aby uzyskać roztwór wystarczający do dodania 1 ml pożywki astrocytowej na studzienkę. Utrzymywać pożywkę kondycjonowaną przez astrocyty w inkubatorze w temperaturze 37 °C do momentu użycia (etap 6.4.9).
      UWAGA: Pożywka hodowlana jest ponownie używana, ponieważ zawiera kilka wydzielanych czynników, które wspierają żywotność kultury.
    4. Dodać 300 μl wstępnie podgrzanej pożywki o obniżonej surowicy do każdego dołka i umieścić 24-dołkową płytkę z powrotem w inkubatorze.
    5. Przygotować roztwór A, składający się z DNA i pożywki zredukowanej w surowicy. Do każdego dołka użyj łącznie 0,6 μg DNA i dodaj go do 50 μl pożywki o obniżonej surowicy. Roztwór A należy przechowywać w temperaturze pokojowej do czasu użycia.
      UWAGA: Zazwyczaj rozważana jest techniczna trójka dla każdego warunku. W związku z tym przygotowuje się mieszaninę wystarczającą do 3,5 reakcji (np. 2,1 μg całkowitego DNA rozcieńczonego w 175 μl pożywki zredukowanej surowicą), aby zapewnić wystarczającą ilość materiału do transfekcji trzech dołków 24-dołkowej płytki.
    6. Przygotować roztwór B składający się z odczynnika do transfekcji i pożywki zredukowanej w surowicy. Do każdego dołka dodać 0,75 μl odczynnika do transfekcji do 50 μl pożywki zredukowanej w surowicy. Ponieważ to rozwiązanie jest wspólne dla wszystkich warunków transfekcji, należy je przygotować luzem, aby zmniejszyć zmienność między transfekcjami.
    7. Inkubować roztwór B w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Dodawać roztwór B do roztworu A kropla po kropli w stosunku 1:1 i delikatnie mieszać. Nie wirować. Inkubować roztwór A+B przez 20-30 minut w temperaturze pokojowej pod maską.
    8. Powtórzyć kroki 6.4.5-6.4.7 dla wszystkich warunków transfekcji. Po 20-30 minutach dodawać roztwór A + B do każdej studzienki kropla po kropli, aby uzyskać końcową objętość 100 μl. Delikatnie wstrząsnąć płytką i umieścić komórki z powrotem w inkubatorze w temperaturze 37 °C na 4 godziny.
    9. Po 4 godzinach usunąć pożywkę do transfekcji i dodać 1 ml wstępnie podgrzanej pożywki kondycjonowanej astrocytami, przygotowanej w kroku 6.4.3. Utrzymuj komórki przez 36-48 godzin przed przystąpieniem do sekcji 7 lub sekcji 8, w zależności od celu eksperymentu.

7. Przeprogramowanie astrocytów (analiza 7 dni)

  1. Przygotować pożywkę do różnicowania neuronów, dodając 1 ml suplementu witaminy B27 do 49 ml podstawowej pożywki hodowlanej (patrz krok 1.4). Po 24-48 godzinach, w zależności od tego, czy komórki zostały transdukowane, czy transfekowane (patrz odpowiednio kroki 6.3 i 6.4), zastąp pożywkę astrocytów 1 ml pożywki różnicującej neurony na studzienkę i hoduj komórki w temperaturze 37 °C i 9% CO2,
    UWAGA: Komórki mogą być również utrzymywane na poziomie 5% CO2 , jeśli nie jest dostępny inkubator 9% CO2 . Jednak przeprogramowanie neuronów jest bardziej efektywne w tych warunkach.
  2. Opcjonalnie: Aby zwiększyć wydajność przeprogramowywania, należy uzupełnić pożywkę różnicowania neuronów forskoliną (końcowe stężenie 30 μM) i Dorsomorfiną (końcowe stężenie 1 μM) podczas wymiany pożywki astrocytów na pożywkę różnicującą. Decydując się na leczenie komórek forskoliną i dorsomorfiną, należy podać drugą dawkę Dorsomorphin 2 dni po początkowym leczeniu. Dodaj ten drugi zabieg bezpośrednio do pożywki hodowlanej.
  3. Bezpośrednie przeprogramowanie mysich astrocytów w komórki neuronalne następuje zwykle w ciągu 7 dni po zmianie pożywki. W związku z tym 7 dni po rozpoczęciu przeprogramowania neuronów napraw lub zbierz komórki do dalszej analizy.

8. Przeprogramowanie astrocytów na dojrzałe neurony (hodowle długoterminowe)

  1. Przygotować pożywkę do różnicowania neuronów, dodając 1 ml suplementu witaminy B27 do 49 ml podstawowej pożywki hodowlanej (patrz krok 1.4). Po 24-48 godzinach, w zależności od tego, czy komórki były transdukowane, czy transfekowane (patrz odpowiednio kroki 6.3 i 6.4), zastąp pożywkę astrocytów 1 ml pożywki różnicującej neuronów uzupełnionej forskoliną (końcowe stężenie 30 μM) i Dorsomorfiną (końcowe stężenie 1 μM) na studzienkę i hoduj komórki w temperaturze 37 °C i 9% CO2,
    UWAGA: Komórki mogą być również utrzymywane na poziomie 5% CO2 , jeśli nie jest dostępny inkubator 9% CO2 . Jednak przeprogramowanie neuronów jest bardziej efektywne w tych warunkach.
  2. Powtórz leczenie Dorsomorphiną 2 dni po początkowym leczeniu, dodając ją bezpośrednio do pożywki różnicującej neurony.
  3. Po 7 dniach od rozpoczęcia przeprogramowania neuronów przygotuj pożywkę dojrzewającą, dodając 6 μl N2, 1,2 μl NT3 (zapas 20 μg/ml), 1,2 μl BDNF (zapas 20 μg/ml), 1,2 μl GDNF (zapas 20 μg/ml) i 1,2 μl cAMP (zapas 100 mM) do 189,2 μl pożywki różnicowania neuronów. Uzupełnij pożywkę różnicującą neurony obecną w każdym dołku za pomocą 200 μl pożywki do dojrzewania.
    UWAGA: Pożywkę do dojrzewania uzupełnia się tylko do pierwszego zabiegu. Wszystkie kolejne zabiegi są wykonywane poprzez częściową wymianę ośrodka różnicowania neuronów, jak opisano poniżej.
  4. Powtórz zabieg z małymi cząsteczkami, usuwając 200 μl pożywki różnicującej neurony i dodając 200 μl świeżej pożywki dojrzewającej dwa razy w tygodniu przez okres do 6 tygodni. Podczas dojrzewania należy użyć komórek do eksperymentów elektrofizjologicznych (zazwyczaj w 21 dniu lub później) lub do dalszej analizy (np. immunofluorescencji).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Pierwotne hodowle astrocytów zazwyczaj osiągają 80%–90% konfluencji od 7 do 10 dni po sortowaniu MAC i wysiewaniu (Rysunek 1B). Zazwyczaj pojedyncza kolba hodowlana T25 pozwala uzyskać około 1-1,5 x 106 komórek, co wystarczy na 20–30 szkiełek nakrywkowych przy wysiewaniu komórek z gęstością 5–5,5 x 104 komórek na dołek. Dzień po wysiewaniu komórki zazwyczaj pokrywają 50%–60% powierzchni szkiełka podstawowego (Rycina 1C). Na tym etapie hodow...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Pierwotne hodowle mysich astrocytów są niezwykłym systemem modelowym in vitro do badania bezpośredniego przeprogramowania neuronów. W rzeczywistości, pomimo izolacji na etapie postnatalnym, komórki wyrażają typowe markery astrocytów29, zachowują ekspresję genów wzorcujących28,29 i zachowują zdolność do proliferacji, podobnie jak astrocyty in vivo w porównywalnym wieku38 lat. Po izolacji za pośredni...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

Chcielibyśmy podziękować Ines Mühlhahn za sklonowanie konstrukcji do przeprogramowania, Paulinie Chlebik za produkcję wirusową oraz Magdalenie Götz i Judith Fischer-Sternjak za komentarze do rękopisu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,05% Trypsyna/EDTALife Technologies25300054
4', 6-Diamidino-2-fenyindol, dilactate (DAPI)Sigma-AldrichD9564
anty-mysie IgG1 Alexa 647Thermo FisherA21240
anty-mysia IgG1 BiotynaSouthernbiotechCat# 1070-08; RRID: AB_2794413
anty-mysie IgG2b Alexa 488Thermo FisherA21121
anty-królik Alexa 546Thermo FisherA11010
Aqua Poly/Mount PolysciencesCat# 18606-20
B27 SuplementLife Technologies17504044
BDNFPeprotech450-02
bFGFLife Technologies13256029
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)Sigma-AldrichCat# A9418
cAMPSigma AldrichD0260
C-TubesMiltenyi Biotec130-093-237
DMEM/F12Life Technologies21331020
DorsomorphinSigma AldrichP5499
EGFLife TechnologiesPHG0311
Płodowa surowica bydlęcaPAN BiotechP30-3302
ForskolinSigma AldrichF6886
GDNFPeprotech450-10
gentleMACS Octo DisocatorMiltenyi Biotec130-096-427
GFAPDakoCat# Z0334; RRID: AB_100013482
GlucoseSigma AldrichG8769
GlutaMaxLife Technologies35050038
HBSSLife Technologies14025050
HepesLife Technologies15630056
Lipofectamine 2000 (odczynnik do transfekcji)Thermo FisherCat# 11668019
MACS Filtr siatkowy SmartStrainer 70µ mMiltenyi Biotec130-098-462
Separator MiniMACSMiltenyi Biotec130-042-102
Zestaw MicroBeat myszy anty-ACSA-2 Miltenyi Biotec130-097-678
Mysia IgG1 anty-Synaptophysin 1Systemy synaptyczneCat# 101 011 RRID:AB_887824)
Mysz IgG2b anty-Tuj-1 (β III-tub)Sigma AldrichT8660
MS kolumnyMiltenyi Biotec130-042-201
N2 SuplementLife Technologies17502048
Zestaw do dysocjacji tkanek nerwowych Miltenyi Biotec130-092-628
NT3Peprotech450-03
octoMACS SeparatorMiltenyi Biotec130-042-109
OptiMEM – GlutaMAX (pożywka o obniżonej surowicy)Thermo FisherCat# 51985-026
Penicylina/StreptomycynaLife Technologies15140122
Poly-D-LizynaSigma AldrichP1149
Królik anty-RFPRocklandCat# 600-401-379; RRID:AB_2209751
Królik anty-Sox9Sigma-AldrichCat# AB5535; RRID:AB_2239761
Streptavidin Alexa 405Thermo FisherCat # S32351
Triton X-100Sigma-AldrichCat # T9284

Bibliografia

  1. Johnson, T. S., et al. Spatial cell type composition in normal and Alzheimers human brains is revealed using integrated mouse and human single cell RNA sequencing. Scientific Reports. 10 (1), 18014(2020).
  2. Lake, B. B., et al. Neuronal subtypes and diversity revealed by single-nucleus RNA sequencing of the human brain. Science. 352 (6293), 1586-1590 (2016).
  3. Mayer, C., et al. Developmental diversification of cortical inhibitory interneurons. Nature. 555 (7697), 457-462 (2018).
  4. Nowakowski, T. J., et al. Spatiotemporal gene expression trajectories reveal developmental hierarchies of the human cortex. Science. 358 (6368), 1318-1323 (2017).
  5. Sagner, A., Briscoe, J. Establishing neuronal diversity in the spinal cord: a time and a place. Development. 146 (22), (2019).
  6. Zeisel, A., et al. Molecular architecture of the mouse nervous system. Cell. 174 (4), 999-1014 (2018).
  7. Iismaa, S. E., et al. Comparative regenerative mechanisms across different mammalian tissues. NPJ Regenerative Medicine. 3, 6(2018).
  8. Lange, C., Brand, M. Vertebrate brain regeneration - a community effort of fate-restricted precursor cell types. Current Opinion in Genetics & Development. 64, 101-108 (2020).
  9. Poss, K. D. Advances in understanding tissue regenerative capacity and mechanisms in animals. Nature Reviews Genetics. 11 (10), 710-722 (2010).
  10. Grade, S., Gotz, M. Neuronal replacement therapy: previous achievements and challenges ahead. NPJ Regenerative Medicine. 2, 29(2017).
  11. Barker, R. A., Gotz, M., Parmar, M. New approaches for brain repair-from rescue to reprogramming. Nature. 557 (7705), 329-334 (2018).
  12. Bocchi, R., Masserdotti, G., Gotz, M. Direct neuronal reprogramming: Fast forward from new concepts toward therapeutic approaches. Neuron. 110 (3), 366-393 (2022).
  13. Di Tullio, A., et al. CCAAT/enhancer binding protein alpha (C/EBP(alpha))-induced transdifferentiation of pre-B cells into macrophages involves no overt retrodifferentiation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (41), 17016-17021 (2011).
  14. Fishman, V. S., et al. Cell divisions are not essential for the direct conversion of fibroblasts into neuronal cells. Cell Cycle. 14 (8), 1188-1196 (2015).
  15. Heinrich, C., et al. Directing astroglia from the cerebral cortex into subtype specific functional neurons. PLoS Biology. 8 (5), 1000373(2010).
  16. Treutlein, B., et al. Dissecting direct reprogramming from fibroblast to neuron using single-cell RNA-seq. Nature. 534 (7607), 391-395 (2016).
  17. Tapscott, S. J., et al. MyoD1: a nuclear phosphoprotein requiring a Myc homology region to convert fibroblasts to myoblasts. Science. 242 (4877), 405-411 (1988).
  18. Taylor, S. M., Jones, P. A. Multiple new phenotypes induced in 10T1/2 and 3T3 cells treated with 5-azacytidine. Cell. 17 (4), 771-779 (1979).
  19. Berninger, B., et al. Functional properties of neurons derived from in vitro reprogrammed postnatal astroglia. Journal of Neuroscience. 27 (32), 8654-8664 (2007).
  20. Marro, S., et al. Direct lineage conversion of terminally differentiated hepatocytes to functional neurons. Cell Stem Cell. 9 (4), 374-382 (2011).
  21. Vierbuchen, T., et al. Direct conversion of fibroblasts to functional neurons by defined factors. Nature. 463 (7284), 1035-1041 (2010).
  22. Bass, N. H., Hess, H. H., Pope, A., Thalheimer, C. Quantitative cytoarchitectonic distribution of neurons, glia, and DNa in rat cerebral cortex. The Journal of Comparative Neurology. 143 (4), 481-490 (1971).
  23. Yoon, H., Walters, G., Paulsen, A. R., Scarisbrick, I. A. Astrocyte heterogeneity across the brain and spinal cord occurs developmentally, in adulthood and in response to demyelination. PLoS One. 12 (7), 0180697(2017).
  24. Taverna, E., Gotz, M., Huttner, W. B. The cell biology of neurogenesis: toward an understanding of the development and evolution of the neocortex. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 465-502 (2014).
  25. Batiuk, M. Y., et al. Identification of region-specific astrocyte subtypes at single cell resolution. Nature Communication. 11 (1), 1220(2020).
  26. Boisvert, M. M., Erikson, G. A., Shokhirev, M. N., Allen, N. J. The aging astrocyte transcriptome from multiple regions of the mouse brain. Cell Reports. 22 (1), 269-285 (2018).
  27. Ohlig, S., et al. Molecular diversity of diencephalic astrocytes reveals adult astrogenesis regulated by Smad4. The EMBO Journal. 40 (21), 107532(2021).
  28. Herrero-Navarro, A., et al. Astrocytes and neurons share region-specific transcriptional signatures that confer regional identity to neuronal reprogramming. Science Advances. 7 (15), (2021).
  29. Kempf, J., et al. Heterogeneity of neurons reprogrammed from spinal cord astrocytes by the proneural factors Ascl1 and Neurogenin2. Cell Reports. 36 (3), 109409(2021).
  30. Mattugini, N., et al. Inducing Different Neuronal Subtypes from Astrocytes in the Injured Mouse Cerebral Cortex. Neuron. 103 (6), 1086-1095 (2019).
  31. Heins, N., et al. Glial cells generate neurons: the role of the transcription factor Pax6. Nature Neuroscience. 5 (4), 308-315 (2002).
  32. Masserdotti, G., et al. Transcriptional mechanisms of proneural factors and REST in regulating neuronal reprogramming of astrocytes. Cell Stem Cell. 17 (1), 74-88 (2015).
  33. Rao, Z., et al. Molecular mechanisms underlying Ascl1-mediated astrocyte-to-neuron conversion. Stem Cell Reports. 16 (3), 534-547 (2021).
  34. Gascon, S., et al. Identification and successful negotiation of a metabolic checkpoint in direct neuronal reprogramming. Cell Stem Cell. 18 (3), 396-409 (2016).
  35. Russo, G. L., et al. CRISPR-mediated induction of neuron-enriched mitochondrial proteins boosts direct glia-to-neuron conversion. Cell Stem Cell. 28 (3), 524-534 (2021).
  36. Guo, S., et al. Nonstochastic reprogramming from a privileged somatic cell state. Cell. 156 (4), 649-662 (2014).
  37. Hu, X., et al. Region-restrict astrocytes exhibit heterogeneous susceptibility to neuronal reprogramming. Stem Cell Reports. 12 (2), 290-304 (2019).
  38. Ge, W. P., Miyawaki, A., Gage, F. H., Jan, Y. N., Jan, L. Y. Local generation of glia is a major astrocyte source in postnatal cortex. Nature. 484 (7394), 376-380 (2012).
  39. Price, J. D., et al. The Ink4a/Arf locus is a barrier to direct neuronal transdifferentiation. The Journal of Neuroscience. 34 (37), 12560-12567 (2014).
  40. Heinrich, C., et al. Generation of subtype-specific neurons from postnatal astroglia of the mouse cerebral cortex. Nature Protocols. 6 (2), 214-228 (2011).
  41. Batiuk, M. Y., et al. An immunoaffinity-based method for isolating ultrapure adult astrocytes based on ATP1B2 targeting by the ACSA-2 antibody. The Journal of Biological Chemistry. 292 (21), 8874-8891 (2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Izolacja astrocyt wmagnetyczna separacja kom rekr nicowanie neuronalnetransdukcja wirusowatransfekcja DNAo rodkowy uk ad nerwowymarkery neuronalnefunkcjonalne neurony
Izolacja i bezpośrednie przeprogramowanie neuronów astrocytów myszy
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.