Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Sonda β-galaktozydazy związana ze starzeniem się w kolorze dalekiej czerwieni do identyfikacji i wzbogacania starzejących się komórek nowotworowych za pomocą cytometrii przepływowej

5.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/64176

⸱

13 września 2022

 ,  ,  , 
1Department of Molecular Genetics and Cell Biology, University of Chicago

W tym artykule

Podsumowanie

Przedstawiono protokół fluorescencyjnej, cytometrycznej cytometrii przepływowej starzejących się komórek nowotworowych indukowanych przez chemioterapię w hodowli komórkowej lub w mysich modelach nowotworów. Opcjonalne procedury obejmują współbarwienie immunologiczne, utrwalanie próbki w celu ułatwienia analizy dużych partii lub punktów czasowych oraz wzbogacanie żywotnych komórek starczych przez sortowanie metodą cytometrii przepływowej.

Streszczenie

Starzenie się komórek to stan zatrzymania proliferacji wywołany przez uszkodzenia biologiczne, które zwykle narastają przez lata w starzejących się komórkach, ale mogą również szybko pojawić się w komórkach nowotworowych jako odpowiedź na uszkodzenia wywołane przez różne metody leczenia raka. Starzenie się komórek nowotworowych jest ogólnie uważane za niepożądane, ponieważ komórki starcze stają się odporne na śmierć i blokują remisję guza, jednocześnie zaostrzając nowotwór złośliwy i oporność na leczenie. W związku z tym identyfikacja starczych komórek nowotworowych jest przedmiotem ciągłego zainteresowania społeczności badawczej zajmującej się rakiem. Istnieją różne testy starzenia, wiele z nich opiera się na aktywności dobrze znanego markera starzenia, beta-galaktozydazy związanej ze starzeniem się (SA-β-Gal).

Zazwyczaj test SA-β-Gal jest wykonywany przy użyciu chromogenicznego substratu (X-Gal) na stałych komórkach, z powolnym i subiektywnym wyliczaniem "niebieskich" komórek starczych za pomocą mikroskopii świetlnej. Ulepszone testy z wykorzystaniem przepuszczalnych dla komórek, fluorescencyjnych substratów SA-β-Gal, w tym C12-FDG (zielony) i DDAO-galaktozyd (DDAOG; daleki czerwony), umożliwiły analizę żywych komórek i umożliwiły wykorzystanie wysokoprzepustowych platform analizy fluorescencyjnej, w tym cytometrów przepływowych. C12-FDG jest dobrze udokumentowaną sondą SA-β-Gal, ale jej emisja zielonej fluorescencji pokrywa się z wewnętrzną autofluorescencją komórkową (AF), która powstaje podczas starzenia się w wyniku akumulacji agregatów lipofuscyny. Wykorzystując dalekoczerwoną sondę SA-β-Gal DDAOG, zielona autofluorescencja komórkowa może być używana jako drugorzędny parametr do potwierdzania starzenia, zwiększając wiarygodność testu. Pozostałe kanały fluorescencyjne można wykorzystać do barwienia żywotności komórek lub opcjonalnego fluorescencyjnego znakowania immunologicznego.

Korzystając z cytometrii przepływowej, demonstrujemy użycie DDAOG i autofluorescencji lipofuscyny jako dwuparametrowego testu do identyfikacji starczych komórek nowotworowych. Przeprowadza się ilościowe określenie procentu żywotnych komórek starczych. W razie potrzeby można uwzględnić opcjonalny etap znakowania immunologicznego w celu oceny antygenów powierzchniowych komórek będących przedmiotem zainteresowania. Zidentyfikowane komórki starcze można również sortować metodą cytometrii przepływowej i pobierać do dalszej analizy. Pobrane komórki starcze mogą być natychmiast poddane lizie (np. do testów immunologicznych lub analizy omicznej) lub poddane dalszej hodowli.

Wprowadzenie

Komórki senescentne zazwyczaj gromadzą się w organizmach na przestrzeni lat podczas normalnego starzenia biologicznego, ale mogą również szybko rozwijać się w komórkach nowotworowych w odpowiedzi na uszkodzenia wywołane różnymi metodami leczenia raka, w tym radioterapią i chemioterapią. Choć nie proliferują one już dalej, indukowane terapią senescentne (TIS) komórki nowotworowe mogą przyczyniać się do oporności na leczenie i napędzać nawroty choroby1,2,3. Czynniki wydzielane przez komórki TIS mogą nasilać złośliwość nowotworu poprzez promowanie unikania odpowiedzi immunologicznej lub przerzutowania4,5. Komórki TIS wykazują złożone, specyficzne dla kontekstu fenotypy, zmienione profile metaboliczne oraz unikalne odpowiedzi immunologiczne6,7,8. W związku z tym identyfikacja i charakterystyka komórek nowotworowych TIS indukowanych różnymi podejściami do leczenia raka jest tematem budzącym stałe zainteresowanie społeczności badawczej zajmującej się onkologią.

Do wykrywania komórek nowotworowych w stanie TIS powszechnie stosuje się konwencjonalne testy starzenia, opierające się przede wszystkim na wykrywaniu zwiększonej aktywności enzymu będącego markerem starzenia – lizosomalnej beta-galaktozydazy GLB19. Wykrywanie przy niemal neutralnym (a nie kwaśnym) pH lizosomów pozwala na specyficzne wykrycie beta-galaktozydazy związanej ze starzeniem (SA-β-Gal)10. Standardowy test SA-β-Gal, stosowany od kilku dekad, wykorzystuje X-Gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside), niebieski chromogenny substrat beta-galaktozydazy, do wykrywania SA-β-Gal w utrwalonych komórkach za pomocą mikroskopii świetlnej11. Test X-Gal umożliwia jakościowe potwierdzenie TIS przy użyciu powszechnie dostępnych odczynników i sprzętu laboratoryjnego. Jedynym wymaganym instrumentem do oceny obecności niebieskiego chromogenu jest podstawowy mikroskop świetlny. Jednak procedura barwienia X-Gal może charakteryzować się niską czułością, a wywołanie koloru wymaga czasem więcej niż 24 h. Po barwieniu następuje niskoprzepustowa, subiektywna ocena poszczególnych komórek starzejących się, oparta na zliczaniu komórek wykazujących określony poziom intensywności niebieskiego chromogenu pod mikroskopem świetlnym. Ponieważ X-Gal nie przenika przez błony komórkowe, test ten wymaga komórek utrwalonych w rozpuszczalniku, których nie można odzyskać do dalszych analiz. W przypadku pracy z ograniczoną ilością próbek od zwierząt lub pacjentów może to być znaczną wadą.

Ulepszone testy SA-β-Gal z wykorzystaniem przenikających przez błony komórkowe fluorescencyjnych substratów enzymatycznych, w tym C12-FDG (5-dodekanoyloaminofluoresceiny Di-β-D-galaktopiranozyd, zielony) oraz DDAOG (9H-(1,3-dichloro-9,9-dimetyloakrydyn-2-on-7-yl) β-D-galaktopiranozyd, daleka czerwień), zostały wcześniej opisane w literaturze12,13,14,15. Struktura chemiczna sondy oraz charakterystyka optyczna DDAOG przedstawione są na Rysunku uzupełniającym S1. Te przenikające przez błony komórkowe sondy umożliwiają analizę żywych (a nie utrwalonych) komórek, a zastosowanie sond fluorescencyjnych zamiast chromogennych ułatwia korzystanie z szybkich platform fluorescencyjnej analizy wysokoprzepustowej, w tym urządzeń do przesiewania wysokotreściowego (high-content screening) oraz cytometrów przepływowych. Cytometry przepływowe z funkcją sortowania pozwalają na odzyskanie wzbogaconych populacji żywych komórek senescentnych z hodowli komórkowych lub guzów do dalszych analiz (np. western blotting, ELISA lub analiza omiczna). Analiza fluorescencji zapewnia również sygnał ilościowy, co pozwala na dokładniejsze określenie odsetka komórek senescentnych w danej próbce. Do analizy multipleksowej celów innych niż SA-β-Gal można łatwo dodać dodatkowe sondy fluorescencyjne, w tym sondy żywotności oraz przeciwciała znakowane fluoroforami.

Podobnie jak DDAOG, C12-FDG jest sondą fluorescencyjną dla SA-β-Gal, jednak jej zielona emisja fluorescencyjna nakłada się na wewnątrzkomórkową autofluorescencję (AF), która pojawia się podczas starzenia z powodu gromadzenia się w komórkach agregatów lipofuscyny16. Dzięki zastosowaniu sondy DDAOG emitującej w dalekiej czerwieni, zielona AF komórkowa może służyć jako wtórny parametr potwierdzający starzenie17. Zwiększa to niezawodność testu poprzez wykorzystanie drugiego markera oprócz SA-β-Gal, który jako pojedynczy marker starzenia często może być niewiarygodny18. Ponieważ wykrywanie endogennej AF w komórkach starzejących się jest metodą bezznakową, stanowi ono szybki i prosty sposób na zwiększenie specyficzności naszego testu opartego na DDAOG.

W niniejszym protokole demonstrujemy zastosowanie DDAOG i AF jako szybkiego, dwuparametrowego testu cytometrycznego do identyfikacji żywych komórek nowotworowych TIS z hodowli in vitro lub wyizolowanych z guzów indukowanych u myszy i leczonych farmakologicznie (Rycina 1). Protokół wykorzystuje fluorofory kompatybilne z szerokim zakresem standardowych komercyjnych analizatorów i sorterów cytometrycznych (Tabela 1). Możliwe jest ilościowe określenie odsetka żywych komórek senescentnych przy użyciu standardowej analizy cytometrycznej. W razie potrzeby można przeprowadzić opcjonalny etap immunoznakowania w celu jednoczesnej oceny interesujących antygenów powierzchniowych komórek oraz ich senescencji. Zidentyfikowane komórki senescentne mogą zostać również wzbogacone przy użyciu standardowej metody sortowania komórek aktywowane fluorescencją (FACS).

Schemat procesu leczenia lekiem; in vitro/in vivo; cytometria przepływowa; początek TIS; układ eksperymentalny.
Rycina 1: Schemat postępowania eksperymentalnego. Schemat podsumowujący kluczowe etapy testu DDAOG. (A) Lek indukujący TIS jest dodawany do hodowli komórek ssaków lub podawany myszom z nowotworem. Następnie pozostawiono czas na wystąpienie TIS: w przypadku komórek 4 dni po leczeniu; w przypadku myszy łącznie 22 dni, z trzema zabiegami co 5 dni oraz 7 dniami rekonwalescencji. Komórki są zbierane, a guzy dysocjowane do postaci zawiesiny. (B) Próbki są traktowane Baf w celu dostosowania pH lizosomów do detekcji SA-β-Gal przez 30 min; następnie dodaje się sondę DDAOG na 60 min w celu detekcji SA-β-Gal. Próbki są płukane 2x w PBS, a następnie krótko dodaje się barwnik żywotności (15 min). Opcjonalnie próbki można barwić przeciwciałami fluorescencyjnymi w wolnych kanałach fluorescencji i/lub utrwalać do późniejszej analizy. (C) Próbki są analizowane przy użyciu standardowego cytometru przepływowego. Żywe komórki są wizualizowane na wykresach kropkowych przedstawiających czerwoną fluorescencję DDAOG (wskazującą na SA-β-Gal) względem zielonej autofluorescencji (lipofuscyny). Bramka służąca do wyznaczenia procentowego udziału komórek TIS jest ustalana na podstawie nieleczonych próbek kontrolnych (nie pokazano). W przypadku użycia cytometru sortującego (FACS), komórki TIS mogą zostać zebrane i przeniesione z powrotem do hodowli w celu dalszych analiz in vitro lub poddane lizie i przetworzone do analiz biologii molekularnej. Skróty: DDAO = 9H-(1,3-dichloro-9,9-dimethylacridin-2-one); DDAOG = DDAO-Galactoside; TIS = starzenie indukowane terapią; FL-Ab = przeciwciało sprzężone z fluoroforem; Baf = bafilomycyna A1; SA-β-Gal = beta-galaktozydaza związana ze starzeniem; PBS = roztwór soli fizjologicznej buforowany fosforanowo; FACS = sortowanie komórek aktywowane fluorescencją. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

FluoroforWykrywaEx/Em (nm)Laser cytometru (nm)Detektor cytometru / filtr pasmowy (nm)
DDAOGSA-β-Gal645/6601640670 / 30
AFLipofuscyna< 600488525 / 50
CV450Żywotność408/450405450 / 50
PEPrzeciwciało/marker powierzchniowy565/578561582 / 15

Tabela 1: Fluorofory i specyfikacje optyczne cytometru. Specyfikacje cytometru wykorzystanego w tym protokole zostały podane dla instrumentu wyposażonego w łącznie 4 lasery i 15 detektorów emisji. DDAOG wykrywany przy 645/660 nm jest formą sondy rozszczepionej przez SA-β-Gal1. Nierozszczepiony DDAOG może wykazywać niski poziom fluorescencji przy 460/610 nm, jednak jest on usuwany podczas etapów płukania w protokole. Skróty: DDAO = 9H-(1,3-dichloro-9,9-dimethylacridin-2-one); DDAOG = DDAO-galaktozyd; AF = autofluorescencja; PE = fikoerytryna; SA-β-Gal = beta-galaktozydaza związana ze starzeniem.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie opisane prace nad zwierzętami zostały zatwierdzone przez Instytucjonalną Komisję ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt na Uniwersytecie w Chicago.

1. Przygotowanie i przechowywanie roztworów podstawowych

UWAGA: Jeśli komórki mają być sortowane przepływowo, wszystkie roztwory powinny być przygotowane przy użyciu sterylnych technik i przefiltrowane przez urządzenie filtrujące 0,22 μm.

  1. Przygotować roztwór podstawowy DDAO-galaktozydu w dawce 5 mg/ml w DMSO. Podwielokrotność w ilości 50 μl na probówkę (lub pożądana objętość). Przechowywać w temperaturze -20 °C w ciemności przez okres do 1 roku.
  2. Przygotować roztwór podstawowy bafilomycyny A1 o stężeniu 1 mM w DMSO. Podwielokrotność w ilości 50 μl na probówkę (lub pożądana objętość). Przechowywać w temperaturze -20 °C do 6 miesięcy.
  3. Przygotować roztwór podstawowy Calcein Violet 450 AM o stężeniu 1 mM w DMSO. Podwielokrotność w ilości 50 μl na probówkę (lub pożądana objętość). Przechowywać w temperaturze -20 °C w ciemności przez okres do 1 roku.
  4. Do obróbki komórek hodowanych in vitro należy przygotować 10 mM stężone roztwory podstawowe czynnika(-ów) wywołującego starzenie w odpowiednim rozpuszczalniku i sterylizować przy użyciu filtrów strzykawkowych 0,2 μm. Przechowywać w temperaturze -20 °C lub zgodnie z zaleceniami producenta.
    UWAGA: W przypadku dostarczania chemioterapii indukujących starzenie in vivo (myszom z ustalonymi nowotworami), środki powinny być klasy USP i rozcieńczone do soli fizjologicznej ze skoncentrowanego bulionu tuż przed wstrzyknięciem.
  5. Przygotować kompletną pożywkę hodowlaną dla używanej linii komórkowej (linii komórkowych).
    UWAGA: Na przykład przygotuj pożywkę dla komórek B16-F10 lub A549 z DMEM 1x + 10% FBS + 1x substytut glutaminy + 1x penicylina/streptomycyna. Pożywki muszą być utrzymywane w sterylnej formie. Można stosować inne preparaty pożywek specyficzne dla linii komórkowej. Niektóre składniki, takie jak glutation, mogą w niektórych przypadkach zakłócać początek starzenia się. Badania empiryczne różnych preparatów pożywek należy przeprowadzić, jeśli początek starzenia jest niższy niż oczekiwano lub nie obserwuje się go w przypadku kontrolnych środków chemioterapeutycznych.
  6. Przygotuj do barwienia i mycia.
    1. Przygotować 1% albuminę surowicy bydlęcej (BSA) w 1x PBS do stosowania w procedurach barwienia. Rozpuścić 2 g BSA w 200 ml PBS i mieszać przez 10 minut lub do całkowitego rozpuszczenia w temperaturze pokojowej.
    2. Przygotować 0,5% BSA w 1x PBS jako bufor do płukania. Rozcieńczyć 100 ml 1% BSA przygotowanego w kroku 1.6.1 w 100 ml 1x PBS dla 0,5% BSA.
    3. należy przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do 1 miesiąca.
  7. Przygotuj 4% paraformaldehydu w 1x PBS. Dla wygody i stabilności należy używać dostępnych, szczelnie zamkniętych ampułek paraformaldehydowych (np. 16% v/v): 2,5 ml 16% PFA + 7,5 ml 1x PBS (= 10 ml 4% PFA). Dostosuj przygotowaną objętość w zależności od całkowitej objętości potrzebnej na eksperyment.
    UWAGA: Przygotuj się w razie potrzeby tylko do utrwalenia komórek; Za każdym razem przygotuj świeże.
  8. Przygotować bufor sortujący FACS: 1x PBS, 1 mM EDTA, 25 mM HEPES, 1% BSA (pH 7,2). Sterylny filtr przepuszczać przez urządzenie filtrujące 0,22 μm i przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do 1 miesiąca.
    UWAGA: Przygotuj się w razie potrzeby tylko do sortowania FACS. Formuły do sortowania przepływowego mogą się różnić w zależności od urządzeń FACS. Powyższa formuła jest kompatybilna z instrumentem użytym w tym badaniu (patrz tabela materiałów). Zapoznaj się z wytycznymi producenta.
  9. Przygotuj roztwór dysocjacji guza: 20 μg/ml Liberase TL + 100 μg/mL DNAzy I w pożywce RPMI-1640 (bez FBS lub innych suplementów). Roztwory podstawowe są przydatne do posiadania pod ręką Liberazy TL (przygotowanej i przechowywanej zgodnie z zaleceniami producenta) i DNAzy I (100 mg/ml w wodzie podwójnie destylowanej [ddH2O], przechowywanej w temperaturze -20 °C).
    UWAGA: Przygotuj się w razie potrzeby, jeśli używasz tylko guzów; Za każdym razem przygotuj świeże.

2. Indukcja starzenia się przez leki chemioterapeutyczne w hodowanych komórkach nowotworowych

UWAGA: Wszystkie kroki manipulacji komórkami w tej sekcji powinny być wykonywane w komorze bezpieczeństwa biologicznego przy użyciu sterylnych praktyk. Ta sekcja jest napisana dla przylegających typów komórek. Ogniwa zawiesinowe mogą być używane z odpowiednimi modyfikacjami, jak wspomniano.

  1. Hoduj linię(-y) komórek rakowych zgodnie ze standardowym protokołem dostawcy lub laboratorium, które dostarczyło konkretną użytą linię (linie) komórkową.
    UWAGA: Komórki o niskim pasażu (p < 10) są ogólnie preferowane, ponieważ w próbkach komórek niepoddanych działaniu substancji będą występować niższe poziomy starzenia replikacyjnego, tj. niższe tło.
  2. Na dzień przed indukcją starzenia przez leki należy pobrać komórki z trypsyną-EDTA 0,25% (lub zgodnie z zaleceniami). Zneutralizować trypsynę, dodając równą objętość kompletnej pożywki hodowlanej i przenieść zawiesinę komórkową do sterylnej stożkowej probówki.
    UWAGA: Ten krok nie jest potrzebny w przypadku ogniw zawiesinowych.
  3. Policz komórki za pomocą standardowej metody hemacytometru i zapisz komórki/ml. Płytki po 1 × 10 3-10 × 103 komórki/cm2 w standardowych 6-dołkowych plastikowych naczyniach hodowlanych.
    UWAGA: Optymalna gęstość posiewu zależy od szybkości proliferacji komórek i powinna być określana przez użytkownika. Komórki powinny znajdować się w fazie logarytmicznej wzrostu przy około 10%-20% zbiegu w czasie leczenia (tj. po 18-24 godzinach inkubacji po posiewie). Gęstość początkowa (komórki/ml) komórek zawiesiny powinna być określona przez użytkownika. Płytki sześciodołkowe zazwyczaj dają wystarczającą ilość komórek starczych na studzienkę na jedną standardową próbkę do analizy cytometrii przepływowej. W przypadku sortowania przepływowego należy użyć znacznie większej powierzchni (np. wielu płytek P150), aby umożliwić odzyskanie wystarczającej liczby komórek starczych do dalszych testów (≥1 × 106).
  4. Inkubować posiane komórki przez noc (18-24 godziny) w inkubatorze o temperaturze 37 °C z 5% CO2 i szalką do pomiaru wilgotności.
  5. Potraktuj posiałe komórki lekami chemioterapeutycznymi wywołującymi starzenie. Obejmują co najmniej jedną kontrolę dodatnią, np. etopozyd (ETO) lub bleomycynę (BLM). Przygotuj zduplikowane studzienki na lek. Dołącz jeden zestaw traktowany jako kontrola, gdy pojazd jest tylko w pojeździe.
    UWAGA: Użytkownik powinien przetestować krzywą dawkowania dla każdego czynnika doświadczalnego w celu określenia optymalnego stężenia dla indukcji starzenia się w używanej linii komórkowej (liniach komórkowych).
  6. Inkubować komórki przez 4 dni w inkubatorze o temperaturze 37 °C z 5% CO2 i wilgotnością miski, aby umożliwić początek starzenia. Codziennie badaj pod kątem oczekiwanych zmian morfologicznych za pomocą mikroskopu świetlnego.
    UWAGA: Czas inkubacji od 3 do 5 dni może być dopuszczalny w zależności od tempa starzenia. Pożywka może być zmieniana, a środek ponownie stosowany (lub nie), zgodnie z życzeniem, w celu promowania zdrowych warunków wzrostu przy jednoczesnym osiągnięciu akceptowalnego odsetka komórek starczych.
  7. Po rozpoczęciu starzenia się należy zebrać komórki, dodając trypsynę-EDTA 0,25% przez 5 minut w temperaturze 37 °C. Gdy komórki są dysocjowane do zawiesiny, zneutralizuj trypsynę równą objętością kompletnej pożywki.
    UWAGA: Ten krok nie jest potrzebny w przypadku komórek rosnących w zawiesinie. Jeśli będzie przeprowadzane barwienie markerami powierzchniowymi, unikaj stosowania trypsyny-EDTA, ponieważ może ona tymczasowo zniszczyć antygeny powierzchniowe na komórkach. Zamiast tego delikatnie zdysocjuj monowarstwę za pomocą sterylnego plastikowego skrobaka do komórek (lub alternatywnego odczynnika dysocjacyjnego zaprojektowanego w celu zachowania antygenów powierzchniowych).
  8. Policz komórki w każdej próbce za pomocą hemacytometru. Oblicz komórki/ml dla każdej próbki.
    UWAGA: Błękit trypanowy można dodać w celu oceny procentu martwych komórek w tym momencie (tj. z powodu leczenia farmakologicznego), ale śmierć komórki zostanie również określona za pomocą fluorescencyjnego barwnika żywotności podczas procesu barwienia DDAOG.
  9. Podwielokrotność ≥0,5 × 106 komórek na próbkę do probówek mikrowirówek o pojemności 1,7 ml.
    UWAGA: Liczba komórek w próbce powinna być ustandaryzowana dla wszystkich próbek.
  10. Odwirować probówki przez 5 minut w temperaturze 1 000 × g w mikrowirówce w temperaturze 4 °C. Usunąć supernatant.
    UWAGA: Jeśli mikrowirówka z chłodzeniem jest niedostępna, dopuszczalne może być wykonywanie wirowania w temperaturze otoczenia dla niektórych odpornych typów komórek.
  11. Przejdź do barwienia DDAOG w sekcji 4.

3. Indukcja starzenia się przez leki chemioterapeutyczne w guzach powstałych u myszy

UWAGA: Jeśli komórki nowotworowe będą sortowane metodą FACS, zapewnij sterylność na każdym etapie, pracując w komorze bezpieczeństwa biologicznego i pracując ze sterylnymi narzędziami, procedurami i odczynnikami.

  1. Twórz mysie modele guzów, wstrzykując komórki rakowe podskórnie, zgodnie ze standardowymi metodami (np. Appelbe et al.19).
    UWAGA: Liczba komórek rakowych do wstrzyknięcia, miejsce wstrzyknięcia i odpowiedni szczep myszy powinny być zoptymalizowane dla każdego protokołu. W tym przypadku komórki B16-F10 wstrzykiwano podskórnie w ilości 1 × 106 komórek w 0,1 ml soli fizjologicznej (1 × 107 komórek/ml).
    1. Przed wykonaniem wstrzyknięć należy sprawdzić, czy żywotność komórek przy użyciu błękitu trypanowego wynosi >90%. Znieczulić myszy izofluranem.
    2. Znieczulić 6-7-tygodniowe samice myszy C57/BL6 mieszanką 3% izofluranu i powietrza i utrzymywać w tych warunkach w komorze indukcyjnej umieszczonej w sterylnej komorze bezpieczeństwa biologicznego. Potwierdź znieczulenie, delikatnie szczypiąc stopę myszy. Nałóż sterylną maść weterynaryjną na oba oczy, aby zapobiec wysuszeniu rogówki podczas zabiegu. Podczas zabiegu utrzymuj temperaturę ciała myszy za pomocą lampy grzewczej.
    3. Pracując w sterylnej komorze bezpieczeństwa biologicznego, wyjmij mysz z komory indukcyjnej i umieść ją w kontakcie ze stożkiem nosowym zapewniającym 3% dopływ izofluranu. Ogolić obszar boku w miejscu wstrzyknięcia za pomocą czystej elektrycznej maszynki do golenia. Przygotować przygotowaną zawiesinę komórkową należy krótko wymieszać, ręcznie odwracając probówkę tuż przed wstrzyknięciem, a następnie wstrzyknąć zawiesinę komórek podskórnie w ogolony bok (boki) za pomocą sterylnej strzykawki o pojemności 0,5 ml wyposażonej w sterylną igłę o masie 27 G. Zdejmij mysz z kaptura i przenieś ją do klatki odzyskiwania.
    4. W klatce ratunkowej należy stale monitorować parametry życiowe myszy, dopóki nie odzyskają one wystarczającej świadomości, aby utrzymać pozycję leżącą mostka, zademonstrować odruch prostowania i być w stanie bezpiecznie poruszać się w klatce. Nie pozostawiaj myszy bez opieki ani nie zwracaj zwierząt, które przeszły inokulację komórek nowotworowych, do towarzystwa innych zwierząt, dopóki w pełni nie wyzdrowieją. Codziennie monitoruj wszystkie zaszczepione myszy pod kątem utraty wagi, zmniejszonej aktywności/mobilności i objawów neurologicznych; Poddaj eutanazji myszy wykazujące poważne objawy w dowolnej kategorii. W przypadku myszy wykazujących objawy bólowe po inokulacji należy podać buprenorfinę (0,1-0,2 mg/kg) jednorazowo podskórnie.
      UWAGA: Myszy wykazujące uporczywy ból po buprenorfinie powinny zostać poddane eutanazji.
  2. Począwszy 5-7 dni po inokulacji komórek rakowych, mierz wzrost guza suwmiarką co 2-3 dni. Rozpocznij leczenie prozaiczne, gdy guz osiągnie 50 mm3 ± 10 mm3 objętości.
    UWAGA: W tej pracy dawki chlorowodorku doksorubicyny klasy USP (DOX) lub pegylowanej liposomalnej doksorubicyny (PLD) w dawce 10 mg/kg podawano w 0,9% roztworze chlorku sodu do wstrzykiwań (USP). Leki wstrzykiwano dootrzewnowo 3 razy, raz na 5 dni, zaczynając od momentu, gdy guzy osiągnęły 50 mm3 ± 10 mm3. Myszy wracały do zdrowia przez 7 dni po ostatnim leczeniu, aby umożliwić wystąpienie TIS w guzach. Należy zoptymalizować dawki indukcji starzenia i warunki dla innych metod leczenia i/lub modeli nowotworów.
  3. Po 7 dniach od ostatniego leczenia farmakologicznego należy złożyć myszy w ofierze przez przedawkowanie CO2 i zwichnięcie szyjki macicy lub inne zatwierdzone metody zgodnie z wytycznymi dotyczącymi pracy na zwierzętach laboratoryjnych. Wytnij guzy i zbierz je w sterylnych probówkach lub 6-dołkowych płytkach wypełnionych sterylną pożywką wzrostową RPMI (w celu zachowania żywotności podczas przetwarzania).
    UWAGA: W przypadku wykonywania badania histologicznego (np. X-Gal lub immunohistochemii), guzy można tutaj przeciąć na pół, z połową zatrzaskowo zamrożoną w pożywce do zatapiania OCT i poddać kriosekcji przy użyciu standardowych procedur histologii zamrożonych tkanek. Pozostała połowa guza powinna dać obfity materiał do dysocjacji i barwienia DDAOG.
  4. Przenieś jeden guz do plastikowego naczynia P100 zawierającego 5 ml pożywki RPMI. Zmiel guz na kawałki za pomocą skalpela.
  5. Przenieść 5 ml zawiesiny fragmentów guza zawierających zawieszone komórki i szczątki do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Użyć szerszej końcówki pipety serologicznej o pojemności 25 ml do przenoszenia tej zawiesiny, jeśli obecne są duże zanieczyszczenia. Opłucz naczynie dodatkową objętością sterylnego RPMI, aby zebrać materiały. Zakryj i umieść stożkową rurkę na lodzie.
  6. Powtórz kroki 3,45-3,5 dla pozostałych guzów. Użyj osobnej płytki i skalpela dla każdego guza, aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego, lub dobrze spłucz PBS między guzami. Użyj 5 ml świeżej pożywki do mielenia każdego guza.
  7. Przygotuj roztwór dysocjacji guza: 20 μg/ml Liberazy TL + 100 μg/ml DNAzy I w pożywce RPMI-1640 (bez FBS).
    UWAGA: Istnieje wiele skutecznych preparatów do leczenia dysocjacji nowotworów, które mogą zawierać różne enzymy i inne składniki od różnych producentów. Optymalne stężenia składników mogą się znacznie różnić w zależności od typu nowotworu. Jeśli czerwone krwinki są silnie obecne w guzie, można dodatkowo przeprowadzić lizę czerwonych krwinek; Jeśli problemem są martwe komórki, można użyć zestawu do usuwania martwych komórek. Zdecydowanie zaleca się, aby użytkownik samodzielnie określił optymalne warunki dysocjacji guza, które zapewniają wysoką żywotność i niską obecność zanieczyszczających komórek, materiału łącznego i zanieczyszczeń.
  8. Odwirować wszystkie próbki guza w stożkowych probówkach przez 5 minut w temperaturze 1 000 × g (4 °C). Usunąć supernatant.
  9. Dodaj 1-5 ml roztworu dysocjacji guza do każdej próbki guza, w zależności od objętości materiału nowotworowego. Upewnij się, że w probówce znajduje się 1-2 ml nadwyżki materiału nowotworowego. Wiruj z umiarkowaną prędkością, aby wymieszać.
  10. Umieścić próbki w inkubatorze o temperaturze 37 °C z szybką rotacją na 45 minut. Krótko wirować co 15 minut.
  11. Przefiltrować każdą próbkę przez sitko o wielkości 100 μm do stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Jeśli próbki są zbyt lepkie, aby przejść przez filtr, dodaj 10 ml pożywki RPMI-1640 w celu rozcieńczenia. Przepłucz filtry pożywką RPMI, aby zebrać resztki komórek.
  12. Użyj hemekytometru, aby policzyć komórki/ml dla każdej próbki.
  13. Podwielokrotność dwóch lub więcej powtórzeń po 5 × 106 komórek na próbkę guza.
  14. Wirować przez 5 minut w temperaturze 1 000 × g (4 °C). Usunąć supernatant.
  15. (Opcjonalnie) W razie potrzeby należy zakonserwować próbki guza do późniejszego barwienia DDAOG.
    1. Zawiesić zdysocjowany osad komórek nowotworowych w podłożu do kriokonserwacji: 50% FBS, 40% RPMI-1640, 10% DMSO, przygotowanym w sterylnych warunkach w 5 × 106 komórek/ml.
    2. Podwielokrotność 1 ml zawiesiny komórkowej do każdego kriowialu.
    3. Zamrażać kriowiale przez 24 godziny w pojemniku do zamrażania komórek izopropanolowych w temperaturze -80 °C, a następnie przenieść do kriomagazynu ciekłym azotem w celu dłuższego przechowywania (>1 tydzień).
    4. Gdy pożądane jest barwienie, rozmrozić kriowiale na lodzie i przejść do barwienia DDAOG w sekcji 4.
      UWAGA: Niektóre nowotwory mogą nie zachować żywotności poprzez krioprezerwację, a odporność na ten proces powinna być oceniana przez użytkownika dla interesującego go modelu guza.
  16. Przejdź do sekcji 4 dotyczącej barwienia DDAOG.

4. Barwienie DDAOG SA-β-Gal w próbkach komórek lub guzów

  1. Rozcieńczyć 1 mM bafilomycyny A1 w stosunku 1:1 000x w pożywce DMEM (bez FBS) do uzyskania końcowego stężenia 1 μM.
  2. Dodać przygotowany roztwór Baf-DMEM do próbek osadów komórkowych (z kroku 2.11 lub kroku 3.16) w stężeniu 1 × 106 komórek/ml.
    UWAGA: Na przykład, jeśli używasz 0,5 × 106 komórek na próbkę, dodaj 0,5 ml Baf-DMEM. W przypadku nowotworów 5 × 106 komórek można wybarwić w 5 ml Baf-DMEM.
  3. Inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C (bez CO2 ) na rotatorze/wytrząsarce ustawionej na małą prędkość.
    UWAGA: Unikaj inkubatorów CO2 w procesie barwienia, ponieważ mogą zakwaszać roztwory, a tym samym zakłócać barwienie Baf i DDAOG.
  4. Bez przemywania dodać roztwór podstawowy DDAOG (5 mg/ml) w proporcji 1:500x (10 μg/ml wersja ostateczna) do każdej próbki. Odpipetować do mieszania. Wymieniać na rotatorze/wytrząsarce w temperaturze 37 °C (bez CO2 ) przez 60 minut. Chronić przed bezpośrednim światłem.
  5. Odwirowywać probówki przez 5 minut w temperaturze 1 000 x g w temperaturze 4 °C. Usunąć supernatant.
  6. Przemyć 1 ml lodowatego 0,5% BSA na probówkę i odpipetować do wymieszania. Odwirować probówki przez 5 minut w temperaturze 1 000 x g w temperaturze 4 °C i usunąć supernatant. Powtórz ten krok 2x, aby dokładnie umyć komórki. Usunąć supernatant i kontynuować.
    UWAGA: Ważne jest, aby wykonać kroki mycia opisane w kroku 4.6 w celu usunięcia nienaruszonego DDAOG, który może wykazywać niepożądaną emisję fluorescencji (460/610 nm).
    UWAGA: W przypadku barwienia immunologicznego markerów powierzchniowych komórek przejdź do sekcji 5 poniżej.
  7. (Opcjonalnie) Utrwalanie i przechowywanie komórek barwionych DDAOG do późniejszej analizy
    1. Do każdej umytej próbki dodać kroplami 0,5 ml lodowatego 4% paraformaldehydu. Odpipetować do mieszania.
    2. Inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
    3. Umyj komórki 2x 1 ml PBS.
    4. Próbki należy przechowywać do 1 tygodnia w temperaturze 4 °C przed analizą metodą cytometrii przepływowej.
      UWAGA: W przypadku próbek stałych pomiń krok 4.8.
  8. Rozcieńczyć bulion Calcein Violet 450 AM (1 mM) w proporcji 1:1,000x do 1% BSA-PBS (1 μM final). Dodać 300 μl (dla próbek hodowanych komórek) lub 1 000 μl (dla próbek guza) do przemytych granulek komórek z kroku 4.6. Inkubować przez 15 minut na lodzie w ciemności.
  9. Przejdź do ustawień cytometrii przepływowej (sekcja 6).

5. (Opcjonalnie) Barwienie immunologiczne markerów powierzchniowych komórek w połączeniu z DDAOG

UWAGA: Podobnie jak w przypadku każdego eksperymentu z cytometrią przepływową, pojedyncze barwione próbki kontrolne tylko z DDAOG i tylko przeciwciałami fluorescencyjnymi powinny być przygotowane do określenia przesłuchów (jeśli występują) w kanałach fluorescencyjnych. W przypadku zaobserwowania przesłuchu należy wykonać standardową kompensację cytometrii przepływowej20.

  1. Zawiesić osady komórkowe otrzymane w kroku 4.6 w 100 μl buforu barwiącego (1% BSA w 1x PBS).
  2. Dodać odczynnik blokujący receptor Fc odpowiedni dla gatunku komórek (myszy lub człowieka) przy miareczkowaniu zalecanym przez producenta. Inkubować przez 10 minut w temperaturze 24 °C.
  3. Dodać przeciwciała sprzężone z fluoroforem przy miareczkowaniu zalecanym przez producenta (lub określonym przez użytkownika). Inkubować przez 20 minut na lodzie, chronić przed światłem.
  4. Odwirować probówki przez 5 minut w temperaturze 1 000 × g w temperaturze 4 °C. Usunąć supernatant.
  5. Przemyć 1 ml lodowatego buforu do przemywania (0,5% BSA-PBS) na probówkę i pipetę do wymieszania. Odwirować probówki przez 5 minut w temperaturze 1 000 × g w temperaturze 4 °C i usunąć supernatant. Powtórz ten krok 2x, aby dokładnie umyć komórki.
  6. Rozcieńczyć 1 mM Calcein Violet 450 AM w stosunku 1:1,000x do 1% BSA-PBS. Dodać 300 μl do przemytych granulek komórek z kroku 5.5. Inkubować przez 15 minut na lodzie w ciemności.
  7. Przejdź do analizy cytometrii przepływowej (sekcje 6-7).

6. Konfiguracja cytometru przepływowego i akwizycja danych

  1. Przenieść próbki komórek do probówek kompatybilnych z przyrządem do cytometrii przepływowej. Umieść probówki na lodzie i chroń je przed światłem.
    UWAGA: Jeśli w zawiesinach komórek obserwuje się agregaty, przed analizą przepuść zawiesinę przez sitka do komórek o wielkości 70-100 μm. Nie używaj filtrów siatkowych 40 μm, ponieważ mogą one wykluczyć niektóre z większych komórek starczych.
  2. W oprogramowaniu, do którego się odwołuje (patrz Tabela materiałów), otwórz następujące wykresy: 1) wykres punktowy FSC-A vs SSC-A, 2) histogram kanału fioletowego, 3) kanał dalekiego czerwonego (np. APC-A) kontra kanał zielony (np. FITC-A) wykres punktowy.
    UWAGA: Można również użyć wykresów wykluczenia dubletów i histogramów jednokanałowych, ale nie są one bezwzględnie wymagane.
  3. Zainicjuj akwizycję danych cytometru.
    1. Umieścić próbkę kontrolną znajdującą się wyłącznie w pojeździe zabarwioną DDAOG w porcie wlotowym. Przy niskiej prędkości pobierania rozpocznij pobieranie danych próbki.
    2. Dostosuj napięcia FSC i SSC tak, aby >90% zdarzeń znajdowało się na wykresie. Jeśli komórki nie mieszczą się dobrze na wykresie, zmniejsz ustawienie skalowania obszaru do 0,33–0,5 jednostki.
    3. Usunąć próbkę znajdującą się wyłącznie w pojeździe bez rejestrowania danych.
    4. (Opcjonalnie) Dodaj jedną kroplę tęczowych mikrosfer kalibracyjnych do probówki cytometru z 1 ml PBS. Umieść rurkę w porcie wlotowym cytometru. Rozpocznij pobieranie przykładowych danych.
    5. Dostosuj napięcia kanału fioletowego, zielonego i dalekiego czerwonego tak, aby górny pik tęczowej mikrosfery mieścił się w zakresie 104-10 5 jednostek względnej fluorescencji w każdym kanale, a wszystkie piki były dobrze oddzielone w każdym kanale. Rekord 10 000 wydarzeń. Wyjmij rurkę.
  4. Umieścić dodatnią próbkę kontrolną (np. BLM, ETO) zabarwioną DDAOG w porcie wlotowym. Przy niskiej prędkości uzyskaj przykładowe dane. Obserwuj zdarzenia w kanałach FSC, SSC, fioletowym, zielonym i dalekim czerwonym, aby upewnić się, że ponad 90% zdarzeń jest zawartych na wszystkich wykresach. Zwróć uwagę na wzrost sygnału AF i DDAOG w porównaniu ze sterowaniem tylko pojazdem.
  5. Jeśli używasz cytometru sortującego, rozpocznij sortowanie na tym etapie.
    1. Do celów ewidencji należy zapisać 10 000 komórek dla próbki kontrolnej i każdej posortowanej próbki.
    2. Posortuj żądaną ilość komórek (zwykle odpowiednie jest ≥1 × 106) do odpowiedniej dla danego narzędzia probówki zbiorczej z 3-5 ml pożywki hodowlanej.
    3. Po sortowaniu przejdź do dalszej hodowli lub analizy.
    4. Przejść do sekcji 7 dotyczącej rutynowej analizy posortowanych próbek.
  6. W przypadku stosowania przeciwciał fluorescencyjnych należy zoptymalizować napięcia kanałów, używając próbek niebarwionych, barwionych pojedynczo i podwójnie barwionych przygotowanych w sekcji 5.
    UWAGA: W przypadku skalibrowanego cytometru przepływowego zastosowanego w niniejszym dokumencie optymalne napięcia kanału zwykle mieściły się w przedziale od 250 do 600 (średni zakres), ale optymalne napięcia i zakresy napięcia kanału będą się różnić w zależności od przyrządu. Unikaj używania voltage w bardzo niskich lub wysokich zakresach, które mogą tłumić sygnał lub wzmacniać szumy.
  7. Po wykonaniu kroków 6.1-6.5 i dokonaniu niezbędnych korekt ustawień cytometru, należy zapisać dane dla wszystkich próbek. Upewnij się, że ustawienia pozostają jednolite dla wszystkich nagrań próbki. Rejestruj ≥10 000 zdarzeń na próbkę hodowanej komórki lub ≥100 000 zdarzeń na próbkę komórki nowotworowej.
    UWAGA: Chociaż bramkowanie i analizę można przeprowadzić za pomocą oprogramowania do akwizycji danych (np. FACSDiva), kompletny przepływ pracy bramkowania i analizy, który należy przeprowadzić po akwizycji przy użyciu oddzielnego oprogramowania do analizy (FlowJo), opisano w sekcji 7 poniżej. Preferowana jest analiza po akwizycji w celu skrócenia czasu pracy przy stacji roboczej cytometru i skorzystania z dodatkowych narzędzi zawartych w dedykowanym oprogramowaniu do analizy.
  8. Zapisz przykładowe dane w formacie pliku .fcs. Eksportuj pliki do komputera stacji roboczej wyposażonej w oprogramowanie do analizy cytometrii przepływowej (np. FlowJo). Przejdź do sekcji 7.

7. Analiza danych cytometrii przepływowej

UWAGA: Prezentowany przepływ pracy korzysta z oprogramowania FlowJo. Alternatywne oprogramowanie do analizy danych cytometrii przepływowej może być stosowane, jeśli w podobny sposób przestrzegane są kluczowe kroki opisane w tej sekcji.

  1. Korzystając z oprogramowania FlowJo, otwórz pliki danych .fcs z kroku 6.7.
  2. Otwórz okno układu.
  3. Przeciągnij i upuść wszystkie próbki do okna układu.
  4. Bramka żywotnych komórek.
    1. Najpierw kliknij dwukrotnie przykładowe dane dla kontrolki tylko pojazdu, aby otworzyć jej okno danych.
    2. Wizualizuj dane jako histogram kanału fioletowego. Zidentyfikuj żywe komórki wybarwione przez CV450 na podstawie ich jaśniejszej fluorescencji niż martwe komórki.
    3. Narysuj bramkę za pomocą narzędzia histogramu pojedynczej bramki, aby uwzględnić tylko żywe komórki. Nazwij bramę żywotną.
    4. Następnie z okna układu próbki przeciągnij żywotną bramkę na inne próbki komórek, aby równomiernie zastosować bramkę.
    5. W oknie układu zwizualizuj wszystkie próbki jako histogramy kanału fioletowego (żywotności). Przed kontynuowaniem sprawdzić, czy bramkowanie żywotnych komórek jest odpowiednie dla wszystkich próbek; Jeśli nie, wprowadź odpowiednie poprawki.
      UWAGA: Barwienie żywotności może wykazywać różnice w zależności od leczenia lub guzów.
  5. Brama komórek starczych.
    1. Kliknij dwukrotnie dane bramkowanej żywotnej komórki, aby wyświetlić element sterujący tylko pojazdem, aby otworzyć okno danych.
    2. Wizualizuj dane jako wykres punktowy dla kanału dalekiego czerwonego (DDAOG) i kanału zielonego (AF).
    3. Narysuj bramkę za pomocą narzędzia do bramkowania prostokąta, aby uwzględnić <5% komórek DDAOG+ i AF+ (prawy górny kwadrant). Nazwij bramę starczą.
    4. Następnie z okna układu próbki przeciągnij starczą bramkę na żywotne podzbiory innych próbek komórek, aby równomiernie zastosować bramkę.
    5. Do okna układu przeciągnij i upuść wszystkie żywotne podzbiory komórek bramkowane w sekcji 7.4. Wizualizuj wszystkie żywe próbki jako wykresy punktowe kanału dalekiego czerwonego (np. APC-A) i zielonego kanału (np. FITC-A).
    6. Upewnij się, że bramka starzenia narysowana w kroku 7.5.3 jest widoczna na wszystkich powierzchniach i że bramka do kontroli tylko dla pojazdu wykazuje ≤5%-10% komórek starczych.
  6. Po określeniu procentu starzejących się komórek za pomocą powyższych kroków, przedstaw wynikowe dane za pomocą wykresów FlowJo, podsumowane w tabeli danych i/lub przeanalizowane statystycznie za pomocą standardowego oprogramowania.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Przeprowadzono kilka eksperymentów, aby wykazać porównywalność DDAOG z X-Gal i C12-FDG w wykrywaniu starzenia za pomocą SA-β-Gal. Po pierwsze, X-Gal wykorzystano do barwienia starzejących się komórek czerniaka B16-F10 indukowanych przez ETO (Rycyna 2A). W podgrupie komórek traktowanych ETO pojawił się intensywny niebieski kolor, podczas gdy inne komórki wykazywały mniej intensywne niebieskie barwienie. W większości komórek traktowanych ETO zaobserwowano powiększenie morfologii. Ba...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W ciągu ostatniej dekady cytometria przepływowa stała się bardziej powszechną platformą testową w badaniach nad rakiem ze względu na rosnącą popularność immunologii nowotworów, rozwój tańszych cytometrów przepływowych oraz poprawę wspólnych urządzeń do oprzyrządowania w instytucjach akademickich. Testy wielokolorowe są obecnie standardem, ponieważ większość nowszych instrumentów jest wyposażona w matryce optyczne w kolorze fioletowym, niebiesko-zielonym i czerwonym do dalekiej czerwieni. W związku z tym ten protokół DDAO...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają żadnych konfliktów interesów, które mogliby zadeklarować w odniesieniu do tego badania.

Podziękowania

Dziękujemy Ośrodkowi Cytometrii i Przeciwciał na Uniwersytecie w Chicago za wsparcie w zakresie oprzyrządowania do cytometrii przepływowej. Centrum Badań nad Zwierzętami na Uniwersytecie w Chicago zapewniło pomieszczenia dla zwierząt.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Bafilomycyna A1Research Products InternationalB40500
Siarczan bleomycyny Kajmany13877
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)US BiologicalA1380
Calcein Violet 450 AM barwnik żywotnościThermoFisher Scientific65-0854-39eBioscience
Przeciwciało DPP4, koniugat PEBiolegend137803Klon H194-112
Linia komórkowa: A549 ludzki gruczolakorak płucAmerykańska kolekcja kultur typuCCL-185
Linia komórkowa: B16-F10 czerniak myszyKolekcja kultur typu amerykańskiegoCRL-6475
Skrobak do komórekCorning3008
Sitka komórkowe, 100 i mikro; mFalcon352360
DDAO-GalactosideLife TechnologiesD6488
DMEM medium 1xLife Technologies11960-069
DMSOSigmaD2438
DNAzyda ISigmaDN25
Doksorubicyna, chlorowodorek do wstrzykiwań (USP)PfizerNDC 0069-3032-20
Doksorubicyna, pegylowana liposomalna (USP)Sun PharmaceuticalNDC 47335-049-40
EDTA 0,5 MLife Technologies15575-038
Etopozyd Kajman12092
FBSOmega FB-11
Odczynnik blokujący receptor FcBiolegend101320anty-mysi CD16/32
(analizator komórek)Becton Dickinson (BD)RóżneLSRFortessa
Cytometr przepływowy (sorter komórek)Becton Dickinson (BD)RóżneFACSAria
GlutaMax 100xLife Technologies35050061
HEPES 1 MLonzaBW17737
Liberase TLSigma5401020001
Roche Paraformaldehyd 16%Mikroskopia elektronowa15710
Penicylina/Streptomycyna 100xLife Technologies15140122
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) 1xCorningMT21031CVDulbecco's PBS (bez wapnia i magnezu)
Tęczowe cząstki kalibracyjne, zestaw ultraSpheroTechUCRP-38-2K3,5-3,9 i mikro; m, 2E6/mL
RPMI-1640 medium 1xLife Technologies11875-119
Chlorek sodu 0,9% (USP)Baxter Healthcare Corporation2B1324
Oprogramowanie do akwizycji danych cytometru, "FACSDiva"BectonDickinson (BD)n/aSkontaktuj się z BD w celu uzyskania licencji
Oprogramowanie do analizy danych cytometru, "FlowJo"TreeStarn/aSkontaktuj się z TreeStar w celu uzyskania licencji
Trypsin-EDTA 0.25%Life Technologies25200-114
Cytometr przepływowy

Bibliografia

  1. Saleh, T., Tyutyunyk-Massey, L., Gewirtz, D. A. Tumor cell escape from therapy-induced senescence as a model of disease recurrence after dormancy. Cancer Research. 79 (6), 1044-1046 (2019).
  2. Wang, B., Kohli, J., Demaria, M. Senescent cells in cancer therapy: friends or foes. Trends in Cancer. 6 (10), 838-857 (2020).
  3. Prasanna, P. G., et al. Therapy-induced senescence: Opportunities to improve anticancer therapy. Journal of the National Cancer Institute. 113 (10), 1285-1298 (2021).
  4. Velarde, M. C., Demaria, M., Campisi, J. Senescent cells and their secretory phenotype as targets for cancer therapy. Interdisciplinary Topics in Gerontology and Geriatrics. 38, 17-27 (2013).
  5. Ou, H. L., et al. Cellular senescence in cancer: from mechanisms to detection. Molecular Oncology. 15 (10), 2634-2671 (2021).
  6. Hernandez-Segura, A., Nehme, J., Demaria, M. Hallmarks of cellular senescence. Trends in Cell Biology. 28 (6), 436-453 (2018).
  7. Bojko, A., Czarnecka-Herok, J., Charzynska, A., Dabrowski, M., Sikora, E. Diversity of the senescence phenotype of cancer cells treated with chemotherapeutic agents. Cells. 8 (12), 1501(2019).
  8. Mikuła-Pietrasik, J., Niklas, A., Uruski, P., Tykarski, A., Książek, K. Mechanisms and significance of therapy-induced and spontaneous senescence of cancer cells. Cellular and Molecular Life Sciences. 77 (2), 213-229 (2020).
  9. Lee, B. Y., et al. Senescence-associated beta-galactosidase is lysosomal beta-galactosidase. Aging cell. 5 (2), 187-195 (2006).
  10. Itahana, K., Itahana, Y., Dimri, G. P. Colorimetric detection of senescence-associated β galactosidase. Methods in Molecular Biology. 965, 143-156 (2013).
  11. Dimri, G. P., et al. A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (20), 9363-9367 (1995).
  12. Debacq-Chainiaux, F., Erusalimsky, J. D., Campisi, J., Toussaint, O. Protocols to detect senescence-associated beta-galactosidase (SA-betagal) activity, a biomarker of senescent cells in culture and in vivo. Nature Protocols. 4 (12), 1798-1806 (2009).
  13. Noppe, G., et al. Rapid flow cytometric method for measuring senescence associated beta-galactosidase activity in human fibroblasts. Cytometry A. 75 (11), 910-916 (2009).
  14. Tung, C. -H., et al. In vivo imaging of β-galactosidase activity using far red fluorescent switch. Cancer Research. 64 (5), 1579-1583 (2004).
  15. Gong, H., et al. beta-Galactosidase activity assay using far-red-shifted fluorescent substrate DDAOG. Analytical Biochemistry. 386 (1), 59-64 (2009).
  16. Terman, A., Brunk, U. T. Lipofuscin: Mechanisms of formation and increase with age. APMIS. 106 (2), 265-276 (1998).
  17. Georgakopoulou, E. A., et al. Specific lipofuscin staining as a novel biomarker to detect replicative and stress-induced senescence. A method applicable in cryo-preserved and archival tissues. Aging. 5 (1), 37-50 (2013).
  18. Wang, B., Demaria, M. The quest to define and target cellular senescence in cancer. Cancer Research. 81 (24), 6087-6089 (2021).
  19. Appelbe, O. K., Zhang, Q., Pelizzari, C. A., Weichselbaum, R. R., Kron, S. J. Image-guided radiotherapy targets macromolecules through altering the tumor microenvironment. Molecular Pharmaceutics. 13 (10), 3457-3467 (2016).
  20. Maciorowski, Z., Chattopadhyay, P. K., Jain, P. Basic multicolor flow cytometry. Current Protocols in Immunology. 117, 1-38 (2017).
  21. Fan, Y., Cheng, J., Zeng, H., Shao, L. Senescent cell depletion through targeting BCL-family proteins and mitochondria. Frontiers in Physiology. 11, 593630(2020).
  22. Kim, K. M., et al. Identification of senescent cell surface targetable protein DPP4. Genes and Development. 31 (15), 1529-1534 (2017).
  23. Flor, A. C., Kron, S. J. Lipid-derived reactive aldehydes link oxidative stress to cell senescence. Cell Death Discovery. 7 (9), 2366(2016).
  24. Jochems, F., et al. The Cancer SENESCopedia: A delineation of cancer cell senescence. Cell reports. 36 (4), 109441(2021).
  25. Fallah, M., et al. Doxorubicin and liposomal doxorubicin induce senescence by enhancing nuclear factor kappa B and mitochondrial membrane potential. Life Sciences. 232, 116677(2019).
  26. Kasper, M., Barth, K. Bleomycin and its role in inducing apoptosis and senescence in lung cells - modulating effects of caveolin-1. Current Cancer Drug Targets. 9 (3), 341-353 (2009).
  27. Muthuramalingam, K., Cho, M., Kim, Y. Cellular senescence and EMT crosstalk in bleomycin-induced pathogenesis of pulmonary fibrosis-an in vitro analysis. Cell Biology International. 44 (2), 477-487 (2020).
  28. Flor, A. C., Wolfgeher, D., Wu, D., Kron, S. J. A signature of enhanced lipid metabolism, lipid peroxidation and aldehyde stress in therapy-induced senescence. Cell Death Discovery. 3, 17075(2017).
  29. Burd, C. E., et al. Monitoring tumorigenesis and senescence in vivo with a p16(INK4a)-luciferase model. Cell. 152 (1-2), 340-351 (2013).
  30. Liu, J. Y., et al. Cells exhibiting strong p16 (INK4a) promoter activation in vivo display features of senescence. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (7), 2603-2611 (2019).
  31. Wang, L., Lankhorst, L., Bernards, R. Exploiting senescence for the treatment of cancer. Nature Reviews Cancer. 22 (6), 340-355 (2022).
  32. Baek, K. -H., Ryeom, S. Detection of oncogene-induced senescence in vivo. Methods in Molecular Biology. 1534, 185-198 (2017).
  33. González-Gualda, E., Baker, A. G., Fruk, L., Muñoz-Espín, D. A guide to assessing cellular senescence in vitro and in vivo. The FEBS Journal. 288 (1), 56-80 (2021).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Analiza aktywno ci beta galaktozydazyfluorescencja dalekoczerwonasonda DDAOGstarzenie kom rkowestarzenie indukowane terapisortowanie kom rekdetekcja autofluorescencjilinie kom rkowe raka
Sonda β-galaktozydazy związana ze starzeniem się w kolorze dalekiej czerwieni do identyfikacji i wzbogacania starzejących się komórek nowotworowych za pomocą cytometrii przepływowej
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.