Sonda β-galaktozydazy związana ze starzeniem się w kolorze dalekiej czerwieni do identyfikacji i wzbogacania starzejących się komórek nowotworowych za pomocą cytometrii przepływowej

Amy Flor; Joanna Pagacz; DeShawn Thompson; Stephen Kron

doi:10.3791/64176

Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Sonda β-galaktozydazy związana ze starzeniem się w kolorze dalekiej czerwieni do identyfikacji i wzbogacania starzejących się komórek nowotworowych za pomocą cytometrii przepływowej

5.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/64176

⸱

13 września 2022

Amy Flor¹ , Joanna Pagacz¹ , DeShawn Thompson¹ , Stephen Kron¹

¹Department of Molecular Genetics and Cell Biology, University of Chicago

W tym artykule

Podsumowanie

Przedstawiono protokół fluorescencyjnej, cytometrycznej cytometrii przepływowej starzejących się komórek nowotworowych indukowanych przez chemioterapię w hodowli komórkowej lub w mysich modelach nowotworów. Opcjonalne procedury obejmują współbarwienie immunologiczne, utrwalanie próbki w celu ułatwienia analizy dużych partii lub punktów czasowych oraz wzbogacanie żywotnych komórek starczych przez sortowanie metodą cytometrii przepływowej.

Streszczenie

Starzenie się komórek to stan zatrzymania proliferacji wywołany przez uszkodzenia biologiczne, które zwykle narastają przez lata w starzejących się komórkach, ale mogą również szybko pojawić się w komórkach nowotworowych jako odpowiedź na uszkodzenia wywołane przez różne metody leczenia raka. Starzenie się komórek nowotworowych jest ogólnie uważane za niepożądane, ponieważ komórki starcze stają się odporne na śmierć i blokują remisję guza, jednocześnie zaostrzając nowotwór złośliwy i oporność na leczenie. W związku z tym identyfikacja starczych komórek nowotworowych jest przedmiotem ciągłego zainteresowania społeczności badawczej zajmującej się rakiem. Istnieją różne testy starzenia, wiele z nich opiera się na aktywności dobrze znanego markera starzenia, beta-galaktozydazy związanej ze starzeniem się (SA-β-Gal).

Zazwyczaj test SA-β-Gal jest wykonywany przy użyciu chromogenicznego substratu (X-Gal) na stałych komórkach, z powolnym i subiektywnym wyliczaniem "niebieskich" komórek starczych za pomocą mikroskopii świetlnej. Ulepszone testy z wykorzystaniem przepuszczalnych dla komórek, fluorescencyjnych substratów SA-β-Gal, w tym C_12-FDG (zielony) i DDAO-galaktozyd (DDAOG; daleki czerwony), umożliwiły analizę żywych komórek i umożliwiły wykorzystanie wysokoprzepustowych platform analizy fluorescencyjnej, w tym cytometrów przepływowych. C_12-FDG jest dobrze udokumentowaną sondą SA-β-Gal, ale jej emisja zielonej fluorescencji pokrywa się z wewnętrzną autofluorescencją komórkową (AF), która powstaje podczas starzenia się w wyniku akumulacji agregatów lipofuscyny. Wykorzystując dalekoczerwoną sondę SA-β-Gal DDAOG, zielona autofluorescencja komórkowa może być używana jako drugorzędny parametr do potwierdzania starzenia, zwiększając wiarygodność testu. Pozostałe kanały fluorescencyjne można wykorzystać do barwienia żywotności komórek lub opcjonalnego fluorescencyjnego znakowania immunologicznego.

Korzystając z cytometrii przepływowej, demonstrujemy użycie DDAOG i autofluorescencji lipofuscyny jako dwuparametrowego testu do identyfikacji starczych komórek nowotworowych. Przeprowadza się ilościowe określenie procentu żywotnych komórek starczych. W razie potrzeby można uwzględnić opcjonalny etap znakowania immunologicznego w celu oceny antygenów powierzchniowych komórek będących przedmiotem zainteresowania. Zidentyfikowane komórki starcze można również sortować metodą cytometrii przepływowej i pobierać do dalszej analizy. Pobrane komórki starcze mogą być natychmiast poddane lizie (np. do testów immunologicznych lub analizy omicznej) lub poddane dalszej hodowli.

Wprowadzenie

Komórki senescentne zazwyczaj gromadzą się w organizmach na przestrzeni lat podczas normalnego starzenia biologicznego, ale mogą również szybko rozwijać się w komórkach nowotworowych w odpowiedzi na uszkodzenia wywołane różnymi metodami leczenia raka, w tym radioterapią i chemioterapią. Choć nie proliferują one już dalej, indukowane terapią senescentne (TIS) komórki nowotworowe mogą przyczyniać się do oporności na leczenie i napędzać nawroty choroby¹^,²^,³. Czynniki wydzielane przez komórki TIS mogą nasilać złośliwość nowotworu poprzez promowanie unikania odpowiedzi immunologic....