Badanie funkcji i aktywności neuronalnego kotransportera K-Cl KCC2 z wykorzystaniem Western Blotting

Podsumowanie

Obecny protokół podkreśla zastosowanie techniki western blotting do badania funkcji i aktywności kotransportera neuronalnego K-Cl KCC2. Protokół opisuje badanie fosforylacji KCC2 w miejscach regulatora kinazy Thr906/1007 poprzez western blot. W tym tekście pokrótce omówiono również dodatkowe metody potwierdzania aktywności KCC2.

Streszczenie

Kotransportery chlorku potasu 2 (KCC2) należą do rodziny nośników substancji rozpuszczonych 12 (SLC12) kotransporterów chlorku kationu (CCC), znajdują się wyłącznie w neuronach i są niezbędne do prawidłowego funkcjonowania homeostazy Cl^-, a w konsekwencji funkcjonalnego hamowania GABA-ergicznego. Niepowodzenie w prawidłowej regulacji KCC2 jest szkodliwe i wiąże się z występowaniem kilku chorób neurologicznych, w tym padaczki. Poczyniono znaczne postępy w zakresie zrozumienia mechanizmów związanych z regulacją KCC2, co przypisuje się rozwojowi technik umożliwiających naukowcom badanie jego funkcji i działania; albo poprzez bezpośrednie (ocena fosforylacji miejsc regulatorowych kinazy), albo pośrednie (obserwacja i monitorowanie aktywności GABA). W tym miejscu protokół podkreśla, w jaki sposób badać fosforylację KCC2 w miejscach regulatorowych kinaz - Thr906 i Thr1007 - przy użyciu techniki western blotting. Istnieją inne klasyczne metody stosowane do bezpośredniego pomiaru aktywności KCC2, takie jak test wychwytu jonów rubidu i talu. Dalsze techniki, takie jak elektrofizjologia patch-clamp-electrophysiolog, są wykorzystywane do pomiaru aktywności GABA; stąd pośrednie odzwierciedlenie aktywowanego i/lub inaktywowanego KCC2 na podstawie oceny homeostazy wewnątrzkomórkowych jonów chlorkowych. Kilka z tych dodatkowych technik zostanie pokrótce omówionych w tym manuskrypcie.

Wprowadzenie

Kotransportery chlorku potasu 2 (KCC2) należą do rodziny nośników substancji rozpuszczonych 12 (SLC12) kotransporterów chlorku kationu (CCC), znajdują się wyłącznie w neuronach i są niezbędne do prawidłowego funkcjonowania homeostazy Cl^-, a w konsekwencji funkcjonalnego hamowania GABA-ergiczne^1,2,3,4. Utrzymanie niskiego wewnątrzneuronalnego stężenia Cl^- ([Cl^-]_i) na poziomie 4-6 mM przez KCC2 ułatwia hiperpolaryzację kwasu γ-aminomasłowego (GABA)/glicyny i hamowanie synaps w mózgu i rdzeni....

Protokół

UWAGA: Protokół opisuje metodę western blotting do wykrywania konkretnych białek będących przedmiotem zainteresowania.

1. Hodowla komórkowa i transfekcja

1. Ogrzać wszystkie odczynniki w kąpieli perełkowej (37 °C) przed zabiegiem hodowli komórkowej. Przygotuj pożywkę hodowlaną, Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), uzupełnioną 10% płodową surowicą bydlęcą, po 1% 2 mM L-glutaminy, 100 ml aminokwasów endogennych, 100 mM pirogronianu sodu i 100 jednostek/ml penicyliny-streptomycyny.
2. Stabilnie transfekowaną nerkę ludzką zarodkową KCC2b szczura rozmrozić 293 komórki (HEK293^rnKCC2b)

Wyniki

Tutaj reprezentatywny wynik przedstawiony w Rysunek 1 badał wpływ staurosporyny i NEM na fosforylację KCC2 i NKCC1 za pośrednictwem WNK-SPAK/OSR1 w liniach komórkowych HEK293 stabilnie eksprymujących KCC2b (HEK^rnKCC2b)¹⁸ przy użyciu techniki western blotting. Szczegółowe informacje na temat reprezentatywnych wyników są omówione w Zhang et al.¹⁵. Podobnie jak NEM, staurosporyna jest szerokim inhibitorem kinazy, który może zwi.......

Dyskusja

Do pomiaru aktywności SLC12 CCC, które ulegają ekspresji w neuronach, zastosowano wiele metod, w tym KCC2. Udowodniono, że wiele z tych technik poszerza wiedzę naukową na temat analizy funkcjonalnego znaczenia tych transporterów i ich wzorców struktura-funkcja w różnych mutacjach związanych z chorobą. Co najważniejsze, istnieją zalety i zastrzeżenia dotyczące różnych metod²¹. Jednak protokół opisany powyżej nakreślił, w jaki sposób ocenić fosforylację KCC2 w miejscach regulatorowych kinazy, Thr906.......

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
40% akryloamid	Sigma-Aldrich	A2917	Służy do produkcji żelu separującego i układającego w stosy dla SDS-PAGE
Amon Per Sulfate	Sigma-Aldrich	248614	Służy do wytwarzania żelu separującego i układającego w stosy dla SDS-PAGE
anti pSPAK	Dundee University	S670B	Stosowany jako pierwszorzędowe przeciwciało do western blotting
anty-KCC2	Dundee University	S700C Stosowany	jako pierwszorzędowe przeciwciało do western blotting
anty-KCC2 pSer940	Thermo Fisher Scientific	PA5-95678	Stosowany jako pierwszorzędowe
KCC2 pThr1007	Dundee University	S961C	Stosowany jako przeciwciało pierwszorzędowe do western blotting
anty-KCC2 pThr906	Dundee University	S959C	Stosowany jako pierwszorzędowe przeciwciało do western blotting
anty-mysi	Technologia sygnalizacji komórkowej	66002	Stosowany jako przeciwciało drugorzędowe dla western blotting
anty-NKCC1	Dundee University	S841B	Używany jako pierwszorzędowe przeciwciało przeciwko
NKCC1 pThr203/207/212	Dundee University	S763B	Stosowany jako przeciwciało pierwszorzędowe do technologii
sygnalizacji komórkowej	przeciw królikowi	Blotting C29F4	Stosowany jako przeciwciało drugorzędowe do western blotting
anty-owczego	abcam	ab6900	Stosowany jako przeciwciało drugorzędowe do western blotting
anty-SPAK	Dundee University	S669D	Stosowany jako przeciwciało pierwszorzędowe do western blotting
anty-β-tubulina III	Sigma-Aldrich	T8578	Stosowany jako pierwszorzędowe przeciwciało do western blott
Benzamine	Merck UK	135828	Stosowany jako składnik buforu do lizy
Beta-merkaptoetanol	Sigma-Aldrich	M3148	Stosowany jako składnik buforu ładującego i buforu do lizy
Bradford Coomasie	Thermo Scientific	1856209	Stosowany do ilościowego oznaczania białek lizatu
Aparatura odlewnicza	Atto	WSE-1165W	Służy do uruchamiania elektroforezy strony SDS
Wirówka	Eppendorf	5804	Używana do przygotowania lizatu
Wirówka	VWR	MicroStar 17R	Używana do przędzenia próbek
Dimetylosulfotlenek (DMSO)	Sigma-Aldrich	D2650-100ML	Używany do eksperymentu z hodowlą komórkową
Suszone mleko odtłuszczone Marvel		N/A	Służy do blokowania bufor
Dulbecco's Modified Eagle's Medium - wysoki poziom glukozy	Sigma-Aldrich	D6429	Używany do hodowli komórkowych
Odczynnik ECL	Perkin Elmer	ORTT755/2655	Używany do wywoływania obrazu do western blotting
EDTA	Fisher Scientific	D/0700/53	Stosowany jako składnik buforu do lizy
EGTA	Sigma-Aldrich	e4378	Stosowany jako składnik lizy bufor
Elektroforeza Zasilacz	BioRad	PowerPAC HC	Do zasilania do uruchomienia elektroforezy stronicowej SDS
Etanol	ThermoFisher	E/0650DF/17	Służy do przygotowania wysterylizowanych urządzeń i środowiska
Surowica bydlęca płodu -  inaktywowana termicznie	Merck Life Sciences UK	F9665	Używana do hodowli komórkowych
Dymnik	Walker	A7277	Używany do hodowli komórkowych
Blotting żelowy - Whatman	GE Healthcare	10426981	Używany w western blotting do produkcji kanapki transferowej
Glycine	Sigma-Aldrich	15527	Używany do produkcji
GraphPad Prism Software	GraphPad Software, Inc., USA	Wersja 6.0	Używany do kreślenia wykresów i analizowania danych dla  western blotting
HCl	Acros Organics	10647282	Służy do wytwarzania żelu separującego i układającego w stosy dla SDS-PAGE
Blok grzewczy	Grant	QBT1	Służy do podgrzewania próbek ładujących WB
Ogniwa HEK293	Merck UK	12022001-1VL	Linia komórkowa do eksperymentu hodowlanego
ImageJ Software	Wayne Rasband i współpracownicy; NIH, Stany Zjednoczone	ImageJ 1.53e	Służy do pomiaru intensywności pasma z obrazów western blotting
System obrazowania	BioRad	ChemiDoc MP	Służy do wykonywania obrazów western blot
Inkubator	LEEC	LEEC precision 190D	Używany do hodowli komórkowych
Isopropanol	Honeywell	24137	Stosowany w żelu odlewniczym do elektroforezy
Roztwór L-glutaminy	Sigma-Aldrich	G7513	Używany do hodowli komórkowych
Dodecylosiarczan litu (LDS)	Novex	NP0008	Używany jako bufor ładujący do western blotting
MEM Aminokwas endogenny	Merck Life Sciences UK	M7145	Używany do hodowli komórkowych
Mikrowirówka	Eppendorf	5418	Używany do przygotowania lizatów do WB
Czytnik mikropłytek	BioRad	iMark	Używany do odczytu stężenia białka lizatu
Microsoft Powerpoint	Microsoft, USA	PowerPoint2016	Służy do edycji obrazów western blot
Marker	masy cząsteczkowejBioRad	1610373	Używany do western blotting
N-etylomaleimid	Thermo Fisher Scientific	23030	Używany do eksperymentu z hodowlą komórkową
Membrana nitrocelulozowa	Fisher Scientific	45004091	Używany do western blot
Penicylina-Streptomycyna	Gibco	15140122	Używany do hodowli komórkowych
pH-metr	Mettler Toledo	Seven compact s210	Służy do monitorowania pH roztworów buforowych
Fluorek fenylometylosulfonylu (PMSF)	Sigma-Aldrich	P7626	Stosowany jako składnik buforu do lizy
Bufor fosforanowy Sól fizjologiczna	Sigma-Aldrich	D8537	Stosowany do hodowli komórkowych
PKCδ pThr505	Technologia sygnalizacji komórkowej	9374	Stosowany jako pierwszorzędowe przeciwciało do western blotting
Sepharose Protein G	Generon	PG50-00-0002	Stosowany do immunoprecypitacji
Chlorek sodu	Sigma-Aldrich	S7653	Stosowany jako składnik buforu płuczącego
Chlorek sodu	Sigma-Aldrich	S7653	Używany do przygotowania buforu TBS-T
Dodecyl Siarczan sodu	Sigma-Aldrich	L5750	Służy do wytwarzania żelu separującego i układającego w stosy dla SDS-PAGE
orthovanadan sodu	Sigma-Aldrich	S6508	Stosowany jako składnik buforu do lizy
Pirogronian sodu	Sigma-Aldrich	S8636	Stosowany do hodowli komórkowych
sod-β-glicerofosforan Merck	UK	G9422	Stosowany jako składnik buforu do lizy
Staurosporyna (od Streptomyces sp.)	Scientific Laboratory Supplies, UK	S4400-1MG	Używany do eksperymentu z hodowlą komórkową
Sacharoza	Scientifc Laboratory Supplies	S0389	Używany jako składnik buforu do lizy
TEMED	Sigma-Aldrich	T7024	Używany do wytwarzania żelu separującego i układającego w stosy dla SDS-PAGE
Komora transferowa	BioRad	1658005EDU	Stosowana w western blottingu do przenoszenia białka na błonie
Tris	Sigma-Aldrich	T6066	Stosowana do wytwarzania żelu separacyjnego i układającego w stosy dla SDS-PAGE
Triton-X100	Sigma-Aldrich	T8787	Używany jako składnik buforu do lizy
Roztwór trypsyny-EDTA Merck	Life Sciences UK	T4049	Używany do hodowli komórkowej
Tween-20	Sigma-Aldrich	P3179	Używany jako marka bufora TBS-T
Pompa próżniowa	Charles Austen	Dymax 5	Używany do hodowli komórkowych
Vortex	Scientific Industries	K-550-GE	Używany do przygotowania próbek
Mieszalnik wirowy	Scientific Industries Ltd	Vortex-Genie  K-550-GE	Służy do mieszania rozdzielczej próbki
Kąpiel wodna Grant	Instruments Ltd. (JB Academy)	JBA5	Służy do inkubacji roztworów