Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Ocena uszkodzeń termicznych spowodowanych kraniotomią z nawierceniem przez robota w chirurgii okienka czaszkowego u myszy

2.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/64188

⸱

11 listopada 2022

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Case Western Reserve University, 2Advanced Platform Technology Center, Louis Stokes Cleveland VA Medical Center

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Okna czaszkowe stały się powszechnie stosowaną techniką chirurgiczną, która umożliwia obrazowanie przyżyciowe u myszy transgenicznych. Protokół ten opisuje użycie robota chirurgicznego, który wykonuje półautomatyczne wiercenie kości w oknach czaszki i może pomóc zmniejszyć zmienność między chirurgami i częściowo złagodzić termiczne uszkodzenie bariery krew-mózg.

Streszczenie

Chirurgia okna czaszkowego pozwala na obrazowanie tkanki mózgowej u żywych myszy za pomocą technik obrazowania wielofotonowego lub innych technik obrazowania przyżyciowego. Jednak podczas ręcznego wykonywania kraniotomii często dochodzi do termicznego uszkodzenia tkanki mózgowej, które jest z natury zmienne w zależności od operacji i może być zależne od indywidualnej techniki chirurga. Wdrożenie robota chirurgicznego może ustandaryzować operację i doprowadzić do zmniejszenia uszkodzeń termicznych związanych z operacją. W tym badaniu przetestowano trzy metody wiercenia zrobotyzowanego w celu oceny uszkodzeń termicznych: poziome, punkt po punkcie i impulsowe punkt po punkcie. Wiercenie poziome wykorzystuje schemat wiercenia ciągłego, podczas gdy punkt po punkcie wierci kilka otworów obejmujących okno czaszki. Impulsowanie punkt po punkcie dodaje schemat wiercenia "2 s wł., 2 s wyłączone", aby umożliwić chłodzenie między wierceniami. Obrazowanie fluorescencyjne barwnika Evans Blue (EB) wstrzykniętego dożylnie mierzy uszkodzenie tkanki mózgowej, podczas gdy termopara umieszczona pod miejscem wiercenia mierzy uszkodzenia termiczne. Wyniki termopar wskazują na znaczny spadek zmiany temperatury w grupie pulsacyjnej punkt po punkcie (6,90 °C ± 1,35 °C) w porównaniu z grupami poziomymi (16,66 °C ± 2,08 °C) i punkt-po punkcie (18,69 °C ± 1,75 °C). Podobnie, grupa pulsująca punkt po punkcie wykazała również znacznie mniejszą obecność EB po wierceniu okna czaszkowego w porównaniu z metodą poziomą, co wskazuje na mniejsze uszkodzenia naczyń krwionośnych w mózgu. W związku z tym metoda wiercenia pulsacyjnego punkt po punkcie wydaje się być optymalnym schematem redukcji uszkodzeń termicznych. Wiertarka zrobotyzowana jest przydatnym narzędziem, które pomaga zminimalizować szkolenie, zmienność i zmniejszyć uszkodzenia termiczne. Wraz z rosnącym zastosowaniem obrazowania wielofotonowego w laboratoriach badawczych ważne jest, aby poprawić rygor i odtwarzalność wyników. Metody, o których tu mowa, pomogą innym w informowaniu innych o tym, jak lepiej wykorzystać te roboty chirurgiczne do dalszego rozwoju tej dziedziny.

Wprowadzenie

Okna czaszkowe stały się powszechnie stosowane w dziedzinach neuronauki, inżynierii neuronalnej i biologii, aby umożliwić bezpośrednią wizualizację i obrazowanie kory u żywych zwierząt1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11. Potężne połączenie myszy transgenicznych i obrazowania wielofotonowego dostarczyło niezwykle cennych informacji na temat aktywności obwodów oraz innych aspektów biologicznych w mózgu in vivo12,13,14,15,16,17,18. Miniaturowe mikroskopy montowane na czaszce dodatkowo rozszerzyły te możliwości, umożliwiając rejestracje u zwierząt w stanie czuwania, swobodnie poruszających się19. Proces tworzenia okna czaszkowego wymaga wiercenia mechanicznego w celu ścienienia lub całkowitego usunięcia kości czaszki, aby wykonać kraniotomie wystarczająco duże do zamocowania przezroczystego kawałka szkła nad korą20. Polidimetylosiloksan (PDMS) i inne polimery były również testowane jako materiały do okien czaszkowych9,21. W idealnym przypadku okno czaszkowe nie powinno zmieniać ani zakłócać normalnej aktywności endogennej pod nim. Powszechnie przyjmuje się jednak, że wiercenie okna czaszkowego drażni leżące poniżej tkanki, co prowadzi do uszkodzeń mózgu, zaburzenia środowiska oraz wpływa na opony mózgowe do stopnia ograniczającego głębokość obrazowania wielofotonowego22. Wynikająca z tego neuroinflamacja wywołuje szereg efektów, od zmiany przepuszczalności bariery krew-mózg (BBB), po aktywację i rekrutację komórek glejowych wokół miejsca implantacji23. Dlatego też opracowanie bezpieczniejszych i bardziej powtarzalnych metod wiercenia okien czaszkowych jest kluczowe dla zapewnienia spójnej jakości obrazowania i ograniczenia czynników zakłócających.

Mimo zachowania ostrożności w celu zminimalizowania urazów tkanek podścielistych, proces wiercenia w kości może powodować zarówno termiczne, jak i mechaniczne zaburzenia w obrębie mózgu24,25. Uraz mechaniczny wynikający z przypadkowego przebicia opony twardej wiertłem może dodatkowo prowadzić do różnego stopnia uszkodzenia kory mózgowej24. W badaniu przeprowadzonym przez Shoffstalla i wsp.25 ciepło powstające podczas wiercenia kości doprowadziło do zwiększenia przepuszczalności BBB, o czym świadczyła obecność barwnika Evans Blue (EB) w miąższu mózgu25. Barwnik EB, podawany dożylnie, wiąże się z albuminą krążącą w krwiobiegu, przez co w normalnych warunkach nie przenika przez zdrową BBB w znaczących stężeniach. W związku z tym barwnik EB jest powszechnie stosowany jako czuły marker przepuszczalności BBB26,27. Choć w ich badaniu nie mierzono bezpośrednio wpływu przepuszczalności BBB na późniejsze badane następstwa biologiczne, wcześniejsze prace wykazały korelację między przepuszczalnością BBB a nasiloną odpowiedzią neurozapalną na chronicznie wszczepione mikroelektrody oraz zmianami w funkcjach motorycznych28.

W zależności od celów badania, skala uszkodzeń termicznych i mechanicznych może stanowić źródło błędu eksperymentalnego, negatywnie wpływając na rygor i powtarzalność badania. Istnieją dziesiątki opisanych metod wykonywania okien czaszkowych, z których każda wykorzystuje inny sprzęt wiertniczy, prędkości, techniki oraz operatorów1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11. Shoffstall i wsp.25 zgłosili, że obserwowana zmienność wyników nagrzewania wynikała z różnic w sile nacisku wiertła, prędkości posuwu oraz kącie aplikacji, obok innych aspektów, których nie można kontrolować podczas wiercenia ręcznego25. Istnieje przekonanie, że zautomatyzowane systemy wiercenia i inny sprzęt stereotaktyczny mogą poprawić powtarzalność i spójność wyników, jednak opublikowane badania metodologiczne nie oceniły rygorystycznie temperatury ani przepuszczalności BBB jako jednego z parametrów końcowych. W związku z tym istnieje potrzeba opracowania bardziej powtarzalnych i spójnie stosowanych metod wykonywania okien czaszkowych, a także metod rygorystycznie stosowanych w celu oceny wpływu wiercenia okna czaszkowego na leżącą poniżej tkankę neuronalną.

Celem niniejszej pracy jest określenie i opracowanie spójnych i bezpiecznych metod wiercenia okien czaszkowych. Rozmiar kraniotomii niezbędnej do instalacji okna czaszkowego jest znacznie większy niż w przypadku standardowych kraniotomii wykonywanych pod implantowane mikroelektrody mózgowe. Przy użyciu standardowego sprzętu takich kraniotomii nie można wykonać za pomocą jednego otworu wiertniczego, co wprowadza większą zmienność techniki między chirurgami w przypadku wykonywania zabiegu ręcznie20. W dziedzinie tej wprowadzono chirurgiczne roboty wiertnicze, jednak nie zostały one powszechnie przyjęte1,6,29. Automatyzacja wiercenia zapewnia kontrolę nad zmiennymi przyczyniającymi się do obserwowanej różnicy między próbami, co sugeruje, że zastosowanie tego sprzętu może zredukować efekty międzyoperatorskie i wewnątrzoperatorskie. Jest to szczególnie istotne ze względu na dodatkowe trudności związane z większą kraniotomią wymaganą do umieszczenia okna czaszkowego. Choć można by założyć, że kontrola zapewniana przez automatyzację wiercenia przynosi wyraźne korzyści, przeprowadzono niewiele ocen wdrożenia tego sprzętu. Pomimo że nie zaobserwowano widocznych zmian chorobowych5, pożądane jest przeprowadzenie testu o wyższej czułości z użyciem EB.

W niniejszej pracy przepuszczalność BBB jest mierzona przy użyciu dostępnego komercyjnie robota do wiercenia chirurgicznego z odpowiednim oprogramowaniem, które umożliwia programowanie współrzędnych stereotaktycznych, planowanie i mapowanie kraniotomii oraz wybór trybów wiercenia („punkt po punkcie” lub „poziomo”), odnoszących się do wyznaczonej ścieżki wiertła. Początkowo wierci się osiem punktów „bazowych” (Rysunek 1A), wyznaczających obrys okna czaszkowego. Następnie przestrzeń między punktami bazowymi jest wycinana przy użyciu metody wiercenia „punkt po punkcie” lub „poziomej”. Metoda „punkt po punkcie” polega na wykonywaniu pionowych nacięć otworów prowadzących (podobnie jak w wiertarce CNC), natomiast metoda „pozioma” polega na wykonywaniu cięć poziomych wzdłuż obwodu okna czaszkowego wyznaczających otwór (podobnie jak w frezarce CNC). Wynikiem obu metod jest fragment czaszki, który można usunąć, aby odsłonić okno czaszkowe. Aby odizolować uszkodzenia wynikające z samego wiercenia, okno czaszkowe nie jest fizycznie usuwane, co pozwala uniknąć dodatkowych obrażeń. Do pomiaru przepuszczalności BBB po wykonaniu kraniotomii u myszy stosuje się kombinację barwnika EB wraz z obrazowaniem fluorescencyjnym, a do bezpośredniego pomiaru temperatury powierzchni mózgu podczas wiercenia używa się wstawionej termopary (Rysunek 1B,C). Wcześniejsze obserwacje wykazały, że pulsacyjne włączanie i wyłączanie wiercenia w odstępach 2 s było wystarczające, aby ograniczyć nagrzewanie wiertła25, dlatego rozwiązanie to zostało włączone do podejścia eksperymentalnego dla robota chirurgicznego.

Celem przedstawionej pracy jest zaprezentowanie metod oceny uszkodzeń termicznych powstałych podczas wiercenia otworu trepanacyjnego. Choć metody te są przedstawione w kontekście wiercenia zautomatyzowanego, mogą one zostać zastosowane również do schematów wiercenia ręcznego. Metody te mogą posłużyć do walidacji wykorzystywanego sprzętu i/lub schematów wiercenia przed ich przyjęciem jako standardowej procedury.

Schemat procesu inżynierii genetycznej myszy, obejmujący wstrzykiwanie, hodowlę komórkową i inkubację.
Rysunek 1: Schemat przebiegu eksperymentu. Schemat przedstawiający proces, któremu poddano zwierzęta w celu ilościowego oznaczenia EB po procedurze wykonania okna czaszkowego. (A) Schemat rozmieszczenia myszy w aparacie stereotaksycznym z chirurgicznym wiertłem robotycznym. Przedstawiono przykład okna czaszkowego nad korą ruchową z punktami inicjującymi (zielone) i punktami krawędziowymi (niebieskie). (B) Układ do perfuzji obejmuje wstrzyknięcie 1x roztworu PBS (Phosphate Buffered Saline) do całego organizmu zwierzęcia w celu usunięcia krwi, a następnie wyjęcie mózgu. (C) Następnie mózg jest umieszczany w komorze systemu obrazowania fluorescencyjnego EB w celu przeprowadzenia obrazowania fluorescencyjnego barwnika Evans Blue. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie procedury i praktyki opieki nad zwierzętami zostały sprawdzone, zatwierdzone i wykonane zgodnie z Instytucjonalnym Komitetem ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Louis Stokes Cleveland Department of Veterans Affairs Medical Center.

1. Konfiguracja sprzętowa robota chirurgicznego

  1. Przed zabiegiem postępuj zgodnie z instrukcją obsługi robota chirurgicznego (patrz tabela materiałów) i przewodnikiem, aby skonfigurować sprzęt i oprogramowanie. Wykonaj kalibrację ramy zgodnie z opisem w instrukcji. Jeśli wiertło lub rama są poruszane, zaleca się ponowną kalibrację wiertła w celu zapewnienia dokładności.

2. Przygotowanie oprogramowania

  1. Przejdź do oprogramowania chirurgicznego (patrz Spis materiałów) i utwórz nowy projekt, wybierając opcję Rozpocznij od czystego projektu. Ustaw temat jako Mysz u góry, aby wyznaczyć współrzędne wiercenia, które mają być używane.
  2. Wybierz pozycję Rozpocznij nowy projekt.
  3. W tym miejscu kliknij Planowanie w lewym dolnym rogu, aby przejść do ekranu planowania współrzędnych wiercenia. Utwórz schemat wiercenia dla techniki okna czaszkowego, która ma zostać wykonana.
    1. Aby to zrobić, kliknij w dowolnym miejscu atlasu stereotaktycznego. Użyj Bregmy jako odniesienia i wprowadź następujące współrzędne kory ruchowej: AP = 1,50, ML = 1,25, DV = 0,00. Naciśnij Enter na klawiaturze, aby zaktualizować wybrane współrzędne.
      UWAGA: Współrzędne grzbietowo-brzuszne (DV) oznaczają głębokość wiercenia, a więc nie wymagają tutaj wprowadzania danych.
    2. Kliknij przycisk Zapisz cel, aby zapisać te współrzędne i wprowadzić odpowiednią nazwę. W tym miejscu kliknij przycisk Przenieś w lewym dolnym rogu, aby wrócić do głównego ekranu drążenia.
  4. Kliknij pozycję Narzędzia > Project > Zapisz jako, aby ponownie użyć tego projektu szablonu w późniejszych projektach. Spowoduje to automatyczne zachowanie współrzędnych wiercenia do późniejszego wykorzystania.

3. Przygotowanie do zabiegu

  1. Znieczulenie myszy PrismPlus 30,31 (patrz Tabela materiałów) w komorze izofluranowej (3,5% w 1,5 l/min O2). Nałóż lubrykant do oczu, aby zapobiec wysuszeniu oczu, ogol głowę za pomocą maszynki do strzyżenia i przytnij paznokcie, aby myszy nie drapały szwów.
    UWAGA: Myszy PrismPlus to rodzaj transgenicznych gatunków fluorescencyjnych stosowanych w obrazowaniu wielofotonowym. Heterozygotyczne myszy PrismPlus nie mają genów fluorescencyjnych i dlatego zostały tutaj wykorzystane w celu zmniejszenia ilości odpadów zwierzęcych z innych trwających badań, a także dlatego, że w tym badaniu nie ma obrazowania wielofotonowego. Oczekuje się, że myszy typu dzikiego wykażą podobne wyniki.
  2. Znieczulonym myszom należy podawać podskórne zastrzyki z antybiotykiem cefazoliną (24 mg / kg), przeciwbólowym karprofenem (5 mg / kg) i buprenorfiną (0,05-0,10 mg / kg). Przed każdym nacięciem należy podać pojedyncze podskórne wstrzyknięcie marcainy (0,25%, 100 μl) poniżej miejsca nacięcia (1 cal wzdłuż linii środkowej czaszki, zaczynając za oczami).
    UWAGA: Stosowane tu leki są zgodne z wcześniej ustalonymi protokołami IACUC. Zaleca się jednak rozważenie kremu EMLA jako środka miejscowo znieczulającego o działaniu multimodalnym przed zabiegiem chirurgicznym i iniekcją do żyły ogonowej, a także Meloksykam SR zamiast karprofenu. EMLA i Meloksykam SR mogą być podawane przed znieczuleniem izofluranem.
  3. Zamontuj zwierzę na stereotaktycznej ramie robota chirurgicznego za pomocą dołączonych nauszników i utrzymuj znieczulenie 0,5%-2% izofluranu poprzez inhalację przez stożek nosowy.
  4. Upewnij się, że głębokość znieczulenia jest ściśle monitorowana przez przeszkolonego technika weterynarii lub personel, w oparciu o reakcję myszy, oddychanie (~55-65 oddechów/min), tętno (300-450 uderzeń na minutę) i kolor (różowy). Wąsy i regularne szczypanie palców u nóg mogą być również używane jako miara do określenia głębokości znieczulenia. Wartości parametrów życiowych są określane przez instytucjonalne przepisy IACUC.
  5. Utrzymuj temperaturę ciała zwierzęcia na podkładce z krążącą wodą i monitoruj parametry życiowe za pomocą systemu pomiaru tlenu we krwi i tętna.
  6. Wyszoruj obszar operacyjny glukonianem chlorheksydyny (CHG) i 70% izopropanolem do sterylizacji. Aby zachować sterylność podczas zabiegu, umieść sterylną folię na myszy i ramce stereotaktycznej.
    UWAGA: Chociaż protokoły te zostały opracowane dla operacji przetrwania, przedstawione dane odzwierciedlają wykorzystanie zwierząt niebędących w stanie przeżyć, ponieważ skupiono się na przetestowaniu i określeniu odpowiednich metod protokołu wiercenia.

4. Przygotowanie czaszki

  1. Za pomocą ostrza skalpela wykonaj 1-calowe nacięcie na linii środkowej czaszki, zaczynając od tylnej części oczu.
  2. Odciągnij skórę do tyłu, aby odsłonić czaszkę i (opcjonalnie) użyj retraktorów, aby utrzymać okno operacyjne. Usuń wszelkie resztki tkanki i błony za pomocą sterylnych aplikatorów z bawełnianą końcówką.
  3. Osusz i oczyść czaszkę za pomocą 3% nadtlenku wodoru za pomocą aplikatorów z bawełnianą końcówką.
    UWAGA: Spowoduje to, że szwy czaszki będą widoczne. Bregma i Lambda powinny być dobrze widoczne. Jeśli nie, zastosuj więcej nadtlenku wodoru lub zwiększ rozmiar nacięcia.
  4. Zezwól na funkcję "automatycznego zatrzymania", podłączając zacisku krokodylkowego z zestawu wiercenia robota chirurgicznego do myszy, zgodnie z zaleceniami producenta. "Auto-stop" działa poprzez wykrycie zmiany impedancji, więc gdy wiertło zetknie się z płynem mózgowo-rdzeniowym (CSF) zamiast kością, wiertło przestanie wiercić, zapobiegając w ten sposób uszkodzeniu mózgu.

5. Wstrzyknięcie żyły niebieskiego ogona Evansa

UWAGA: EB jest potencjalnym czynnikiem rakotwórczym. Podczas obsługi należy używać rękawiczek.

  1. Aby przygotować ogon do łatwego wstrzyknięcia, należy przetrzeć go wacikiem nasączonym alkoholem. Opcjonalnie olejek wintergrinowy może być stosowany miejscowo w celu rozszerzenia żyły35.
  2. Chwycić ogon jedną ręką, a drugą trzymać strzykawkę zawierającą EB. Używając kciuka i palca wskazującego, zegnij ogon, aby odsłonić żyłę ogonową na zgięciu ogona. Włożyć strzykawkę (1 lub 2 ml, strzykawka insulinowa 30 g) równolegle do żyły i powoli wstrzykiwać objętość EB. EB (4% w/v) podaje się w stężeniu 2 ml/kg masy ciała we wstrzyknięciu do żyły ogonowej.
    UWAGA: Opór przepływu ze strzykawki do ogona może być odczuwalny minimalny lub żaden, jeśli igła jest prawidłowo włożona. Jeśli występuje opór lub barwnik EB pojawia się na ogonie, przesuń się w dół na ogonie i spróbuj ponownie.
  3. Po wstrzyknięciu odczekaj 5 minut, aby EB mógł krążyć po myszy przed rozpoczęciem wiercenia. Pomyślne wstrzyknięcie jest natychmiast weryfikowane, ponieważ kończyny myszy i okienko chirurgiczne zmieniają kolor na niebieski.

6. Procedura wiercenia robota chirurgicznego

  1. Gdy czaszka jest przygotowana do wiercenia, wróć do oprogramowania chirurgicznego. Otwórz projekt szablonu zdefiniowany w kroku 2.4, w którym zostały wyznaczone współrzędne wiercenia.
    1. Postępuj zgodnie z instrukcjami Narzędzia > > Nowy > Wybierz projekt szablonu i wybierz projekt szablonu, który został wyznaczony w kroku 2 (przygotowanie oprogramowania).
    2. Wybierz te same elementy protokołu > Planowanie (punkty docelowe) > Parametry wiercenia, aby przenieść je do tego nowego projektu.
    3. Kliknij Rozpocznij nowy projekt.
  2. Następnie popraw wiertło i ramkę, aby uwzględnić nachylenie i skalowanie czaszki myszy bieżącego zwierzęcia. Kliknij przycisk Narzędzia i wybierz opcję Popraw nachylenie i skalowanie..., aby otworzyć ekran korekcji. U góry ekranu upewnij się, że wiertło jest aktywne (nie strzykawka), klikając jasnoczerwony przycisk Wiertarka.
    UWAGA: Po aktywacji przycisk Wiertarka zmieni kolor na ciemnoczerwony/jaskrawoczerwony. Przycisk strzykawki można zignorować, ponieważ nie jest on używany w tym protokole.
    1. Najpierw popraw skalę, wysokość i odchylenie, ustawiając miejsce, w którym znajdują się Bregma i Lambda na bieżącym zwierzęciu. Użyj elementów sterujących za pomocą klawiatury lub elementów sterujących na ekranie, aby przesunąć wiertło. Gdy wiertło znajdzie się nad Bregmą, opuść je, aż dotknie czaszki i kliknij Ustaw Bregmę. Powtórz to dla Lambda.
    2. Następnie dostosuj do konkretnego rzutu czaszki. Kliknij przycisk Przejdź do punktu środkowego, aby automatycznie ustawić wiertło do środka czaszki. Kliknij 2 mm w lewo, a następnie powoli opuść wiertło, aż dotknie czaszki. Kliknij opcję Ustaw punkt po lewej stronie.
    3. Powtórz krok 6.2.2 dla prawej półkuli mózgu. Teraz system jest skonfigurowany dla tej konkretnej czaszki.
      UWAGA: Korekta w tym miejscu ma kluczowe znaczenie dla zapewnienia prawidłowych współrzędnych i głębokości wiercenia. Mysz musi być zamontowana jak najbliżej linii prostej, aby jak najbardziej zmniejszyć potrzebę korekty. Jeśli potrzebne są duże korekty, może to skutkować słabą dokładnością wiercenia.
  3. Po wykonaniu korekty wyjdź z okna korekty, klikając przycisk Zamknij w dolnej środkowej części ekranu. Przejdź do ekranu drążenia, klikając Narzędzia, a następnie wybierając opcję Wiercenie..., aby rozpocząć procedurę wiercenia.
    1. Upewnij się, że Kształt kraniotomii jest wybrany z listy rozwijanej Wiercenie u góry ekranu. Następnie kliknij Wybierz środek wiercenia i kształt i wybierz wstępnie zdefiniowany cel, który został nazwany w kroku 2.3.1. Na tym ekranie wybierz Okrąg jako kształt celu i wprowadź 2,60 mm jako średnicę2 okręgu. Kliknij przycisk Show.
      UWAGA: Średnica okna czaszki jest tworzona przy użyciu środka wiertła jako środka punktów wysiewu. Małe wiertło (średnica = 0,6 mm lub zalecany rozmiar wiertła dostarczony przez dostawcę) służy do zminimalizowania dodatkowej średnicy dodanej w wyniku użycia większego wiertła. Specjalne wiertła są używane specjalnie do robota chirurgicznego. Osiem punktów początkowych i punktów krawędziowych będzie teraz widocznych na czaszce odpowiednio jako zielone i niebieskie kropki.
    2. Kliknij okno główne i użyj skrótu klawiaturowego Control + Shift + D, aby wyświetlić menu Drill Points po prawej stronie ekranu. Pozwala to na przeglądanie określonych głębokości i statusów punktów wiercenia.
    3. Przed rozpoczęciem wiercenia dostosuj funkcję automatycznego zatrzymywania, jeśli jest to wymagane, klikając przycisk obok pola wyboru Automatyczne zatrzymanie. Ten przycisk jest domyślnie ustawiony na Średni, co odpowiada czułości funkcji automatycznego zatrzymywania.
      UWAGA: Można to wcześniej przetestować, aby znaleźć odpowiednią czułość dla zwierząt. W tym protokole zastosowano najwyższą czułość, aby zapewnić minimalne wiercenie w mózgu.
    4. Po włączeniu i dostosowaniu funkcji automatycznego zatrzymywania rozpocznij wiercenie punktu siewu. Kliknij przycisk Auto Scan (Automatyczne skanowanie), aby wiercenie automatycznie rozpoczęło się od elementu siewnego 1. Gdy wiertło dotknie płynu mózgowo-rdzeniowego, funkcja automatycznego zatrzymania wykryje zmianę impedancji, co doprowadzi do zatrzymania wiercenia i wycofania wiertła z czaszki.
    5. Uważnie obserwuj wiercenie na wypadek, gdyby automatyczne zatrzymanie nie wykryło żadnych zmian. Można nacisnąć Escape, aby ręcznie anulować wiercenie. Różowe kółko znajdujące się na dole menu Wiertło i po prawej stronie wartości impedancji można również kliknąć, aby rozpocząć lub zatrzymać wiercenie.
      UWAGA: Wiertło automatycznie nawierci na głębokość równą szacowanej grubości czaszki (lub do momentu aktywacji funkcji automatycznego zatrzymania).
    6. Jeśli automatyczne zatrzymywanie nie zostanie aktywowane przed osiągnięciem szacowanej głębokości, pojawi się ekran z prośbą o następujące czynności: 1) Kontynuuj wiercenie i schodzenie # mm dalej, 2) Zaznacz aktualną głębokość i kontynuuj, 3) Pomiń bieżący punkt i kontynuuj lub 4) Zatrzymaj proces (może być kontynuowany później). Wybierz jedną z opcji zgodnie z poniższym opisem.
      1. W polu Kontynuuj wiercenie i schodzenie # mm dalej wprowadź odległość, na jaką wiertło ma się posunąć. Domyślnie używana jest wartość 0,1 mm. Można zasugerować mniejszą odległość, aby zapobiec przypadkowej penetracji mózgu.
      2. Jeśli uważa się, że opona twarda została osiągnięta na tym ekranie, wybierz opcję Oznacz na bieżącej głębokości i kontynuuj, aby system oznaczył oponę twardą na tej głębokości i przeszedł do następnego ziarna.
      3. Użyj opcji Pomiń bieżący punkt i kontynuuj oraz Zatrzymaj proces (może być kontynuowany później), aby rozwiązać problem lub wyczyścić wiertło i wrócić, gdy automatyczne zatrzymanie znów będzie działać.
    7. Po wywierceniu wszystkich punktów wysiewu, jeśli któryś z nich nie został zakończony za pomocą funkcji automatycznego zatrzymania, sprawdź głębokość otworu ręcznie za pomocą kilofa do opony twardej. Zapewni to, że wywiercona głębokość przeniknie przez czaszkę.
    8. Przed rozpoczęciem wiercenia punktowego należy zdecydować, jaki typ "cięcia krawędziowego" jest pożądany, wybierając listę rozwijaną obok tekstu Krawędź cięcia w menu Wiertło. Dostępne są dwie opcje: Punkt po punkcie i Poziomo.
      1. Wybierz opcję Punkt po punkcie, aby wiercić każdy punkt krawędziowy oddzielnie i na głębokość określoną przez sąsiednie głębokości punktu początkowego. W razie potrzeby dostosuj skalowanie za pomocą przycisku Skalowanie krawędzi poniżej, chociaż domyślna wartość Brak skalowania jest zwykle wystarczająca.
      2. Wybierz opcję Poziomo, aby rozpocząć wiercenie w punkcie krawędzi 1 i użyj ciągłego ruchu wiercenia, aby obejść cały obwód okręgu wiercenia. Domyślnie cięcie poziome będzie ciąć w odstępach 100 μm, przechodząc przez cały obwód okna, zanim przesunie się o kolejne 100 μm głębiej. W razie potrzeby zmień głębokość interwału i prędkość wiercenia pod przyciskiem Opcje cięcia... poniżej.
      3. Użyj korekcji automatycznego cięcia (poniżej pola Cięcie krawędziowe), aby dostosować głębokość automatycznego cięcia poprzez pobranie wcześniej określonego odsunięcia od sąsiednich punktów początkowych. W tym protokole zastosowano przesunięcie automatycznego cięcia o wartości 20 μm. Można przeprowadzić dalsze badania w celu określenia optymalnego offsetu w przeliczeniu na zwierzę.
    9. Po ustaleniu ustawień cięcia krawędzi rozpocznij wiercenie punktowe krawędzi, klikając przycisk Automatyczne cięcie w środku menu Wiertło. W przypadku wiercenia punkt po punkcie, po wywierceniu ostatniej krawędzi, procedura wiercenia jest zakończona. W przypadku wiercenia poziomego kontynuuj, aż czaszka zostanie wywiercona na tyle, aby zwolnić okno czaszki.
      UWAGA: Chociaż wiercenie jest wykonywane do momentu zwolnienia okna, okienko nie jest tutaj fizycznie zwalniane, aby zapobiec uszkodzeniu tkanki znajdującej się pod spodem. Ważne jest, aby wyizolować uszkodzenia powstałe w wyniku samego wiercenia, aby ocenić różne schematy wierceń.
      1. Gdy wiercenie poziome osiągnie głębokość jednego punktu początkowego, kliknij prawym przyciskiem myszy na tym ziarnie (lub najpierw wybierz wiele punktów) w menu Punkty wiercenia i kliknij Zablokuj głębokość. Pozwoli to na kontynuowanie cięcia poziomego bez głębszego cięcia w tym obszarze (unikając w ten sposób penetracji mózgu).
        UWAGA: Jeśli istnieją punkty wysiewu o różnej głębokości opony twardej, może to powodować różnice w głębokości potrzebnej do procedury wiercenia poziomego.
    10. Jeśli funkcja automatycznego zatrzymywania nie działa prawidłowo, upewnij się, że wiertło jest całkowicie oczyszczone z wszelkich zanieczyszczeń lub potencjalnej krwi, soli fizjologicznej itp., ponieważ mogą one wpłynąć na impedancję podstawy wiertła. Dodatkowo wybierz jedną z kilku opisanych poniżej opcji ręcznego wiercenia na wypadek, gdyby automatyczne zatrzymanie nie działało konsekwentnie.
      1. W menu Drill (Przejmij) przejdź ręcznie do każdego elementu, klikając prawym przyciskiem myszy seed lub krawędź i wybierając polecenie Go to Entry (Przejdź do wejścia). Istnieją również opcje czyszczenia zaznaczonych głębokości, resetowania otworu i innych opcji, które mogą pomóc w procedurze wiercenia.
      2. Ręcznie kontroluj postęp głębokości wiercenia, wybierając głębokość z listy rozwijanej znajdującej się obok tekstu Advance: w górnej części menu Drill. Kliknij przycisk Advance bezpośrednio poniżej, aby przesunąć wiertło o ustawioną odległość.
        UWAGA: Ta funkcja może być używana w połączeniu z przyciskami Set Dura i Set Surface poniżej przycisku Advance, aby ręcznie poinformować system, gdzie znajduje się zarówno powierzchnia czaszki, jak i opona twarda. Tam, gdzie to możliwe, korzystaj z funkcji automatycznego zatrzymywania, ale w razie potrzeby te opcje ręczne również wystarczą.
      3. W przypadku wiercenia ręcznego należy zachować większą ostrożność między poszczególnymi odstępami głębokości wiercenia, aby upewnić się, że wiertło nie przekracza opony twardej. Sprawdź wywiercony otwór za pomocą kilofa twardego między przedziałami głębokości, aby potwierdzić, czy opona twarda została osiągnięta. Po zakończeniu ręcznego siewu należy normalnie kontynuować procedurę cięcia krawędzi, jak opisano powyżej.
    11. Metoda impulsowa
      1. Aby przeprowadzić ręczne wiercenie impulsowe, wyłącz funkcję automatycznego zatrzymywania, odznaczając pole wyboru obok opcji Auto-Stop w menu Wiertło. Musi to być wyłączone, aby umożliwić kontrolę, kiedy wiertło jest wyłączone dla pulsowania.
        UWAGA: Wiercenie impulsowe przebiega według schematu 2 s wiercenia, po którym następują 2 s bez wiercenia, aby umożliwić ochłodzenie czaszki.
      2. W menu Wiertło wybierz 100 μm jako stopień zaawansowania wiercenia, co będzie równać się ~2 s wiercenia w dół.
      3. Gdy wszystko będzie gotowe, kliknij przycisk Advance, aby rozpocząć wiercenie.
        UWAGA: Bądź gotowy do szybkiego zatrzymania wiertła po przesunięciu się o 100 μm, ponieważ wiertło kontynuuje obracanie się na głębokości, aż zostanie naciśnięty ucieczka (wytwarzając niepotrzebne ciepło).
      4. Gdy wiertło przesunie się o 100 μm, naciśnij dwukrotnie Escape, aby zatrzymać wiertło. Po 2 s powtórz ten cykl dla głębokości czaszki.
        UWAGA: Tylko metoda punkt po punkcie może być wykonywana przy użyciu metody impulsowej ze względu na ograniczenia programowe i mechaniczne. W ten sposób nie można wykonać ciągłego wiercenia poziomego.
      5. Wywierć wszystkie punkty wysiewu i krawędzi, korzystając z metody opisanej powyżej. Pamiętaj, aby ustawić oponę twardą za pomocą przycisku w menu Wiertło po osiągnięciu opony twardej.

7. Perfuzja i ekstrakcja mózgu

  1. Po zakończeniu wysiewu nasion i krawędzi należy utrzymać zwierzę w znieczuleniu izofluranem przez dodatkowy 1 godzinę, aby umożliwić krążenie barwnika EB i wynaczynienie przez uszkodzoną barierę krew-mózg. Wykonaj perfuzję serca, aby usunąć krew lub płyny z naczyń, a następnie usuń mózg w celu obrazowania i analizy, jak opisano poniżej.
    1. Po 1 godzinnym okresie krążenia EB po utworzeniu okna czaszkowego, należy wstrzyknąć zwierzęciu koktajl ketaminy (160 mg/kg) i ksylazyny (20 mg/kg) dootrzewnowo. Gdy przestanie reagować, wykonaj perfuzję serca.
    2. Rozetnij brzuch myszy za pomocą nożyczek i odsłoń serce, przecinając pionowo klatkę piersiową i poziomo w poprzek przepony. Cofnij klatkę piersiową, aby wyraźnie zobaczyć serce. Włóż igłę motylkową do lewej komory serca i zacznij podawać 1x sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) w całym ciele. Odetnij niewielką część prawego przedsionka serca, aby uwolnić narastające ciśnienie.
    3. Po tym, jak 25 ml 1x PBS przeniknie do całego ciała, zatrzymaj perfuzję i odetnij głowę myszy jako drugorzędny sposób eutanazji.
      UWAGA: Należy upewnić się, że wykonałeś instytucjonalnie zatwierdzoną metodę eutanazji i/lub perfuzji końcowej dla zwierzęcia w celu odizolowania mózgu.
    4. Stąd wyekstrahuj mózg z czaszki, usuwając kość i tkankę za pomocą rongeurs.
    5. Wyobraź sobie wyekstrahowany mózg za pomocą systemu obrazowania fluorescencyjnego, aby obserwować ilość EB zlokalizowanej w mózgu wokół miejsc wiercenia.
      UWAGA: EB wiąże się z krążącą albuminą. Jeśli dojdzie do uszkodzenia naczyń krwionośnych w mózgu, EB wycieknie i zwiąże się z tkanką mózgową, co prowadzi do wyraźnego wizualnego wskaźnika uszkodzenia.

8. Obrazowanie i analiza Błękitu Evansa

  1. Inicjalizacja sprzętowa
    1. Włącz komputer podłączony do systemu obrazowania fluorescencyjnego EB i uruchom oprogramowanie do obrazowania (patrz Tabela materiałów), podczas gdy inne elementy są przygotowywane. Włącz źródło światła, platformę i kamerę w tej kolejności.
    2. Przejdź do oprogramowania do obrazowania i kliknij przycisk Zainicjuj w Panelu sterowania pobierania. System i komora zasygnalizują kolor z czerwonego na zielony, gdy tylko inicjalizacja zostanie zakończona.
      UWAGA: Zainicjuj system obrazowania fluorescencyjnego EB 30 minut przed jakimkolwiek obrazowaniem, aby temperatura źródła światła osiągnęła optymalny poziom.
  2. Obrazowanie mózgu
    1. Umieść wysadzany mózg w przezroczystym naczyniu na środku sceny w celu obrazowania.
    2. W Panelu sterowania pobierania dostosuj ustawienia obrazu. Wybierz czas ekspozycji: 1 s; Binning: Średni; Przyspieszenie: F1; Wzbudzenie: od 535 do 675 nm; emisja: Cy 5.5; Poziom lampy: Wysoki; i pole widzenia: 5 cm. Pozostaw filtr zablokowany, a nakładka fotografii i fluorescencji sprawdzona. Te ustawienia są oparte na wcześniejszych doświadczeniach laboratoryjnych i innych opublikowanych metodach obrazowania EB36.
  3. Załaduj obrazy systemu obrazowania fluorescencyjnego EB do otwartego oprogramowania do przetwarzania obrazów (patrz tabela materiałów) i wygeneruj trzy odręczne obszary zainteresowania (ROI), aby znaleźć intensywność fluorescencji EB, mierząc średnie promieniowanie na tle, całym mózgu i oknie czaszkowym.
    1. Znormalizuj pomiary okna czaszkowego i całego mózgu na odpowiednim tle ROI.
    2. Wyobraź sobie każdy mózg pod różnymi filtrami wzbudzenia (535-675 nm), aby znaleźć długość fali o najwyższym stosunku sygnału do szumu (wybrano 605 nm) między grupami eksperymentalnymi a kontrolą soli fizjologicznej.
      1. Wyizoluj średnie promieniowanie pod odpowiednią długością fali i uśrednij, aby uzyskać średnie promieniowanie lub natężenie fluorescencji dla całego mózgu i ROI okna czaszkowego.
  4. Znajdź i znormalizuj średnie promieniowanie w obszarze okna czaszki dla każdej grupy w porównaniu z kontrolą soli fizjologicznej.

9. Ocena termopary

  1. Zmierz zmiany temperatury czaszki i mózgu za pomocą termopary (patrz Tabela materiałów) w połączeniu z trzema różnymi schematami wiercenia. Termopara jest podłączona do systemu akwizycji danych (DAQ), który pozwala na odczyt pomiaru do MATLAB.
  2. Zamontuj mysz do zwłok na ramie stereotaktycznej i zrobotyzowanej wiertarce. Ręcznie wywierć mały otwór (tego samego rozmiaru co punkt wysiewu) ~2 mm od miejsca, w którym okno czaszki zostanie wykonane z boku czaszki25. Otwór ten pozwoli na wsunięcie termopary w miejsce, w którym następuje wiercenie okna czaszki (Rysunek 2D).
    UWAGA: Myszy ze zwłokami są używane, ponieważ do przesunięcia termopary nad obszarem wiercenia okna czaszki wymagane jest rozwiercenie boku czaszki. Ta mysz ze zwłok jest innym zwierzęciem niż to, które wcześniej było używane do analizy Evans Blue.
  3. Rozpocznij proces wiercenia dla każdego z trzech schematów, jak wykonano wcześniej (krok 6). Gdy wiertło przechodzi przez czaszkę, nastąpią skoki zmian temperatury, co wskazuje na ogrzewanie występujące w pobliżu mózgu.
  4. Zapisz i wykreśl wyniki w MATLAB, aby obliczyć maksymalną różnicę temperatur. Należy to zrobić oddzielnie dla siewu i siewu krawędziowego, aby ocenić siew poziomy i siew punkt po punkcie wraz z metodą ręcznego wiercenia impulsowego.

10. Statystyki

  1. Przeprowadź analizę statystyczną dla obrazowania fluorescencyjnego termoparą i EB w R przy użyciu testu sumy rang Kruskala-Wallisa z korekcją Benjaminiego-Hochberga, a następnie porównań parami za pomocą dokładnego testu sumy rang Wilcoxona25.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Ocena termiczna
Potencjał do uszkodzeń termicznych oceniono poprzez pomiar zmiany temperatury względem wartości bazowej podczas wiercenia przy użyciu metod poziomej (Rysunek 2A), punkt po punkcie (Rysunek 2B) oraz impulsowej punkt po punkcie (Rysunek 2C). Na Rysunku 2D przedstawiono układ eksperymentalny służący do pozyskiwania danych termicznych. Do oceny termicznej wykorzystano pr...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Zastosowanie barwnika EB i obrazowania jest proste, szybkie i przydatne do oceny uszkodzeń naczyń krwionośnych w mózgu dla nowych metod i technik. Niezależnie od tego, czy używasz robota chirurgicznego, czy potwierdzasz metody wykonywane obecnie w laboratorium, ważne jest, aby zweryfikować metody chirurgiczne w celu wyizolowania efektów eksperymentalnych zabiegów w porównaniu z wpływem chirurgicznym i poprawy dobrostanu zwierząt. Konfiguracja termopary jest również przydatna do oceny metod wiercenia, aby upewnić się, że ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do zgłaszania żadnych konfliktów interesów. Treść nie reprezentuje poglądów Departamentu ds. Weteranów Stanów Zjednoczonych, Narodowych Instytutów Zdrowia ani rządu Stanów Zjednoczonych.

Podziękowania

To badanie było częściowo wspierane przez Merit Review Awards GRANT12418820 (Capadona) i GRANTI01RX003420 (Shoffstall/Capadona) oraz Research Career Scientist Award # GRANT12635707 (Capadona) od United States (US) Department of Veterans Affairs Rehabilitation Research and Development Service. Ponadto prace te były również częściowo wspierane przez Narodowy Instytut Zdrowia, Narodowy Instytut Zaburzeń Neurologicznych i GRANT12635723 Udarów Mózgu (Capadona) oraz Narodowy Instytut Obrazowania Biomedycznego i Bioinżynierii, T32EB004314, (Capadona/Kirsch). Materiał ten oparty jest na pracach wspieranych przez National Science Foundation Graduate Research Fellowship w ramach grantu nr. GRANT12635723. Wszelkie opinie, ustalenia, wnioski lub zalecenia wyrażone w tym materiale są opiniami autora (autorów) i niekoniecznie odzwierciedlają poglądy National Science Foundation.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1x sól fizjologiczna buforowana fosforanami
Rodzaj: Odczynnik		VWRMRGF-6235Do rozcieńczenia Evans Blue
Oprogramowanie Aura
Rodzaj: Narzędzie		do obrazowania instrumentów spektralnych Oprogramowanie do przetwarzaniaobrazów Otwarte oprogramowanie do przetwarzania obrazów dla systemów obrazowania Lumina
Buprenorfina
Rodzaj: Lek		pozyskiwany z
, 0,6 mm (wiertarka robota)
Rodzaj:		Narzędzie Stoelting58640-1
Carprofen
Rodzaj: Lek		pozyskiwany z zakładu
Cefazolin
Rodzaj: Lek		pozyskiwany z zakładu
Evans Blue Dye
Rodzaj: Odczynnik		Millipore Sigma E2129Rozpuszczony w 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanem
Izofluran
Rodzaj: Lek		Pozyskiwany z Animal Facility
IVIS Lumina II
Typ: Narzędzie		Perkin ElmerCLS136334IVIS Lumina III obecnie zamiast Lumina II na rynku
Termometr linearyzacyjny Jenco
Typ: Narzędzie		Jenco765JFdo konfiguracji termopary
Ketamina
Rodzaj: Lek		pozyskiwany z Animal Facility
LivingImage
Typ: Narzędzie		Perkin ElmerOprogramowanie dla IVIS Lumina III
Marcaine
Typ: Lek		pochodzący z Animal Facility
Neurostar Software
Typ:		Tool StoeltingW zestawie z zakupem robota chirurgicznego
Physiosuite z MouseSTAT® Pulsoksymetr i pulsoksymetr Monitor pracy serca
Typ: Narzędzie		Kent ScientificPS-03Służy do monitorowania parametrów życiowych
Myszy PrismPlus
Typ: Zwierzę		Jackson Labortory031478, RRID: IMSR_JAX:031478, Samiec, ~8 miesięcyZwierzęta wykorzystane do badania
Wiertarka stoelting i robot iniekcyjny do zmotoryzowanych instrumentów stereotaktycznych
Rodzaj: Narzędzie		Stoelting58640Główna wiertarka robotyczna z ramą stereotaktyczną
Termopara
Typ: Narzędzie		TC Direct206-557Do konfiguracji termopary
USB-6008 Wielofunkcyjne I/O DAQ
Typ: Narzędzie		National InstrumentsUSB-6008do konfiguracji termopary
Ksylazyna
Rodzaj: Lek		pozyskiwany z zakładu
wiertła z węglika spiekanego w zakładzie dla zwierzątdla zwierzątdla zwierząt dla zwierząt

Bibliografia

  1. Kilic, K., et al. Chronic cranial windows for long term multimodal neurovascular imaging in mice. Frontiers in Physiology. 11, 612678(2020).
  2. Goldey, G. J., et al. Removable cranial windows for long-term imaging in awake mice. Nature Protocols. 9 (11), 2515-2538 (2014).
  3. Augustinaite, S., Kuhn, B. Intrinsic optical signal imaging and targeted injections through a chronic cranial window of a head-fixed mouse. STAR Protocols. 2 (3), 100779(2021).
  4. Wang, X., et al. A skull-removed chronic cranial window for ultrasound and photoacoustic imaging of the rodent brain. Frontiers in Neuroscience. 15, 673740(2021).
  5. Wang, Y., Xi, L. Chronic cranial window for photoacoustic imaging: a mini review. Visual Computing for Industry, Biomedicine, and Art. 4 (1), 15(2021).
  6. Augustinaite, S., Kuhn, B. Chronic cranial window for imaging cortical activity in head-fixed mice. STAR Protocols. 1 (3), 100194(2020).
  7. Kunori, N., Takashima, I. An implantable cranial window using a collagen membrane for chronic voltage-sensitive dye imaging. Micromachines. 10 (11), 789(2019).
  8. Beckmann, L., et al. Longitudinal deep-brain imaging in mouse using visible-light optical coherence tomography through chronic microprism cranial window. Biomedical Optics Express. 10 (10), 5235-5250 (2019).
  9. Heo, C., et al. A soft, transparent, freely accessible cranial window for chronic imaging and electrophysiology. Scientific Reports. 6, 27818(2016).
  10. Holtmaat, A., et al. Imaging neocortical neurons through a chronic cranial window. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (6), 694-701 (2012).
  11. Holtmaat, A., et al. high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nature Protocols. 4 (8), 1128-1144 (2009).
  12. Sundaram, G. S., et al. Characterization of a brain permeant fluorescent molecule and visualization of Abeta parenchymal plaques, using real-time multiphoton imaging in transgenic mice. Organic Letters. 16 (14), 3640-3643 (2014).
  13. Spires, T. L., et al. Dendritic spine abnormalities in amyloid precursor protein transgenic mice demonstrated by gene transfer and intravital multiphoton microscopy. Journal of Neuroscience. 25 (31), 7278-7287 (2005).
  14. Price, D. L., et al. High-resolution large-scale mosaic imaging using multiphoton microscopy to characterize transgenic mouse models of human neurological disorders. Neuroinformatics. 4 (1), 65-80 (2006).
  15. Kimchi, E. Y., Kajdasz, S., Bacskai, B. J., Hyman, B. T. Analysis of cerebral amyloid angiopathy in a transgenic mouse model of Alzheimer disease using in vivo multiphoton microscopy. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 60 (3), 274-279 (2001).
  16. Hyman, B. T. The natural history of Alzheimer disease dissected through multiphoton imaging of transgenic mice. Alzheimer Disease and Associated Disorders. 20 (4), 206-209 (2006).
  17. Korzhova, V., et al. Long-term dynamics of aberrant neuronal activity in awake Alzheimer's disease transgenic mice. Communications Biology. 4 (1), 1368(2021).
  18. Chawda, C., McMorrow, R., Gaspar, N., Zambito, G., Mezzanotte, L. Monitoring immune cell function through optical imaging: a review highlighting transgenic mouse models. Molecular Imaging and Biology. 24 (2), 250-263 (2022).
  19. Courtin, J., et al. A neuronal mechanism for motivational control of behavior. Science. 375 (6576), (2022).
  20. Mostany, R., Portera-Cailliau, C. A craniotomy surgery procedure for chronic brain imaging. Journal of Visualized Experiments. (12), e680(2008).
  21. Cramer, S. W., et al. Through the looking glass: A review of cranial window technology for optical access to the brain. Journal of Neuroscience Methods. 354, 109100(2021).
  22. Eles, J. R., Vazquez, A. L., Kozai, T. D. Y., Cui, X. T. Meningeal inflammatory response and fibrous tissue remodeling around intracortical implants: An in vivo two-photon imaging study. Biomaterials. 195, 111-123 (2019).
  23. Jorfi, M., Skousen, J. L., Weder, C., Capadona, J. R. Progress towards biocompatible intracortical microelectrodes for neural interfacing applications. Journal of Neural Engineering. 12 (1), 011001(2015).
  24. Cole, J. T., et al. Craniotomy: true sham for traumatic brain injury, or a sham of a sham. Journal of Neurotrauma. 28 (3), 359-369 (2011).
  25. Shoffstall, A. J., et al. Potential for thermal damage to the blood-brain barrier during craniotomy: implications for intracortical recording microelectrodes. Journal of Neural Engineering. 15 (3), 034001(2018).
  26. Saunders, N. R., Dziegielewska, K. M., Mollgard, K., Habgood, M. D. Markers for blood-brain barrier integrity: how appropriate is Evans blue in the twenty-first century and what are the alternatives. Frontiers in Neuroscience. 9, 385(2015).
  27. Wang, H. L., Lai, T. W. Optimization of Evans blue quantitation in limited rat tissue samples. Scientific Reports. 4, 6588(2014).
  28. Goss-Varley, M., et al. Microelectrode implantation in motor cortex causes fine motor deficit: Implications on potential considerations to Brain Computer Interfacing and Human Augmentation. Scientific Reports. 7 (1), 15254(2017).
  29. Oomoto, I., et al. Protocol for cortical-wide field-of-view two-photon imaging with quick neonatal adeno-associated virus injection. STAR Protocols. 2 (4), 101007(2021).
  30. Dougherty, J. D., Zhang, J., Feng, H., Gong, S., Heintz, N. Mouse transgenesis in a single locus with independent regulation for multiple fluorophores. PLoS One. 7 (7), 40511(2012).
  31. Jung, S., et al. Analysis of fractalkine receptor CX(3)CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion. Molecular and Cellular Biology. 20 (3), 4106-4114 (2000).
  32. Kiyatkin, E. A., Sharma, H. S. Permeability of the blood-brain barrier depends on brain temperature. Neuroscience. 161 (3), 926-939 (2009).
  33. Eriksson, A. R., Albrektsson, T. Temperature threshold levels for heat-induced bone tissue injury: a vital-microscopic study in the rabbit. The Journal of Prosthetic Dentistry. 50 (1), 101-107 (1983).
  34. Bonfield, W., Li, C. H. The temperature dependence of the deformation of bone. Journal of Biomechanics. 1 (4), 323-329 (1968).
  35. Hrapkiewicz, K., Medina, L. Clinical Laboratory Animal Medicine, second ed. , Blackwell Publishing. Ames Iowa. (2007).
  36. McLean, R., Moritz, A. R., Roos, A. Studies of thermal Injury. VI. Hyperpotassemia caused by cutaneous exposure to excessive heat. Journal of Clinical Investigations. 26 (3), 497-504 (1947).
  37. Kyweriga, M., Sun, J., Wang, S., Kline, R., Mohajerani, M. H. A large lateral craniotomy procedure for mesoscale wide-field optical imaging of brain activity. Journal of Visualized Experiments. (123), e52642(2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Ocena uszkodze termicznychimpulsowe wiercenie punktowewiercenie poziomewiercenie punkt po punkcieobrazowanie wielofotonoweobrazowanie b kitem Evansapomiar termoparoperacja m zgu myszy
Ocena uszkodzeń termicznych spowodowanych kraniotomią z nawierceniem przez robota w chirurgii okienka czaszkowego u myszy
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.