Selektywna depolaryzacja mitochondriów aksonalnych wspomagana mikrofluidyką

Podsumowanie

Obecny protokół opisuje zasiewanie i barwienie mitochondriów neuronalnych w komorach mikroprzepływowych. Gradient ciśnienia płynu w tych komorach pozwala na selektywne traktowanie mitochondriów w aksonach w celu analizy ich właściwości w odpowiedzi na wyzwania farmakologiczne bez wpływu na przedział ciała komórki.

Streszczenie

Mitochondria są głównymi dostawcami ATP (adenozynotrójfosforanu) w neuronach. Dysfunkcja mitochondriów jest powszechnym fenotypem w wielu chorobach neurodegeneracyjnych. Biorąc pod uwagę skomplikowaną architekturę i ekstremalną długość niektórych aksonów, nie jest zaskakujące, że mitochondria w aksonach mogą doświadczać różnych środowisk w porównaniu z ich odpowiednikami w ciałach komórkowych. Co ciekawe, dysfunkcja mitochondriów aksonalnych często poprzedza wpływ na organizm komórki. Aby modelować dysfunkcję mitochondriów aksonalnych in vitro, urządzenia mikroprzepływowe umożliwiają leczenie mitochondriów aksonalnych bez wpływu na mitochondria somalne. Gradient ciśnienia płynu w tych komorach zapobiega dyfuzji cząsteczek w kierunku przeciwnym do gradientu, umożliwiając w ten sposób analizę właściwości mitochondriów w odpowiedzi na lokalne wyzwania farmakologiczne w obrębie aksonów. Obecny protokół opisuje wysiewanie zdysocjowanych neuronów hipokampa w urządzeniach mikroprzepływowych, barwienie barwnikiem wrażliwym na potencjał błonowy, leczenie toksyną mitochondrialną, a następnie analizę mikroskopową. Ta wszechstronna metoda badania biologii aksonalnej może być stosowana do wielu zaburzeń farmakologicznych i odczytów obrazowych i jest odpowiednia dla kilku podtypów neuronów.

Wprowadzenie

Mitochondria są głównymi dostawcami ATP (adenozynotrójfosforanu) w neuronach. Ponieważ zdrowie neuronów jest ściśle związane z funkcją mitochondriów, nie jest zaskakujące, że dysfunkcyjna regulacja tych organelli jest związana z wystąpieniem różnych chorób neurodegeneracyjnych, w tym choroby Parkinsona¹. Co więcej, zatrucie mitochondriami zostało z powodzeniem wykorzystane do modelowania objawów choroby Parkinsona u zwierząt². Zarówno w modelach zwierzęcych, jak i w chorobach ludzkich, obumieranie neuronów zaczyna się w częściach dystalnych^3,4, co sugeruje, że mitochondria aksonalne mogą być bardziej podatne na zniewagi. Jednak biologia mitochondriów w aksonach nie jest dobrze poznana ze względu na trudności związane z celowanym leczeniem i analizą mitochondriów aksonalnych bez jednoczesnego zaburzenia procesów zachodzących w organizmie komórki.

Ostatnie postępy w technikach hodowli zdysocjowanych neuronów in vitro pozwalają teraz na płynne rozdzielanie aksonów i ciał komórkowych za pomocą urządzeń mikroprzepływowych⁵. Jak pokazano w Rysunek 1A, urządzenia te posiadają cztery studnie dostępowe (a/h i c/i), z dwoma kanałami łączącymi każdą parę (d i f). Duże kanały są połączone ze sobą szeregiem mikrokanałów o długości 450 μm (e). Celowe różnice w poziomach napełnienia między dwiema komorami tworzą gradient ciśnienia płynu ( Rysunek 1B), który zapobiega dyfuzji małych cząsteczek z kanału o niższym poziomie płynu na drugą stronę (Rysunek 1C, zilustrowany niebieskim barwnikiem trypanowym).

Ostatnio używaliśmy urządzeń mikroprzepływowych do badania lokalnych wymagań translacji w mitofagii aksonalnej, selektywnym usuwaniu uszkodzonych mitochondriów⁶. W niniejszym protokole przedstawiono różne etapy indukcji miejscowego uszkodzenia mitochondriów poprzez selektywne traktowanie aksonów przy użyciu inhibitora kompleksu mitochondrialnego III Antimycin A^6,7.

Protokół

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z odpowiednimi wytycznymi i przepisami rządu Górnej Bawarii. Pierwotne neurony przygotowano z zarodków myszy typu dzikiego E16.5 C57BL/6 obu płci zgodnie ze standardowymi metodami, jak opisano wcześniej⁶.

1. Montaż urządzenia mikroprzepływowego

1. Pokryć jedną sześciodołkową płytkę do hodowli tkankowej ze szklanym dnem o końcowym stężeniu 20 μg/ml poli-D-lizyny i 3,4 μg/ml lamininy w PBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanami) (patrz tabela materiałów).
2. Inkubować powlekaną płytkę przez noc w ciemności w temperaturze pokojowej.
   UWAGA: Powlekanie można również wykonywać w temperaturze 37 °C przez 1-2 godziny. Wybór powłoki zależy od zastosowanego typu ogniwa.
3. Po powlekaniu przynieś sześciodołkowe płytki do sterylnego kaptura i umyj je dwukrotnie sterylnym ddH₂O.
   UWAGA: Nie myć zawierającymi sól, takimi jak PBS, ponieważ kryształki soli będą przeszkadzać w tworzeniu uszczelnienia.
4. Pozostaw płytkę do wyschnięcia w pozycji pochylonej na 3-5 minut. Usuń nadmiar wody przez odsysanie próżniowe lub pipetowanie.
5. Namocz komorę mikroprzepływową w 80% etanolu.
   UWAGA: Komora mikroprzepływowa została pozyskana ze źródeł komercyjnych (patrz Tabela Materiałów).
6. Pozostaw komorę mikroprzepływową do wyschnięcia na 3-5 minut w pozycji przechylonej. Usuń nadmiar etanolu za pomocą próżni, odsysania lub pipetowania.
7. Po całkowitym wyschnięciu umieść komorę mikroprzepływową na środku studzienki.
   UWAGA: Powstawanie uszczelki można zaobserwować jako zmianę właściwości odblaskowych po wykluczeniu powietrza z powierzchni styku między płytą a urządzeniem silikonowym. Zarówno płyta, jak i komora mikroprzepływowa muszą być całkowicie suche przed montażem, aby zapewnić dobre uszczelnienie. Jednak czas schnięcia musi być zminimalizowany tak bardzo, jak to możliwe, aby zapewnić prawidłowe przyleganie do komórek. Dlatego studnie i komory muszą być wizualnie sprawdzone pod kątem pozostałych kropelek cieczy. Jeśli nie widać żadnych kropel, natychmiast zmontuj komory.
8. Delikatnie postukaj w komorę mikroprzepływową na jej krawędziach i w sekcję mikrorowków pośrodku, aby prawidłowo przymocować do szklanej płytki.

2. Zasiewanie i utrzymywanie neuronów

1. Zbierz żądaną liczbę zdysocjowanych neuronów hipokampa na komorę w probówce reakcyjnej o pojemności 1,5 ml.
   UWAGA: W niniejszym badaniu 1,5 x 10⁵ neuronów na urządzenie zostało wysianych do zastosowań opartych na obrazowaniu.
2. Odwirować neurony przy 1000 x g przez 4 minuty w temperaturze pokojowej.
3. Odrzucić supernatant za pomocą pipety i ponownie zawiesić osad w 8 μl pożywki B27-Neurobasel (patrz Tabela Materiałów).
4. Odpipetować roztwór komórkowy do wejścia do kanału komory mikroprzepływowej (b w Rysunek 1A).
5. Stuknij w tylną część płyty, aby wspomóc przepływ przez kanał.
   UWAGA: Stukanie można wykonać dość mocno, bez obawy, że uszczelka pęknie.
6. Odessać pipetą pozostałą zawiesinę komórek na wyjściu z kanału (g w Rysunek 1A), aby zmniejszyć liczbę komórek na zewnątrz kanału.
7. Inkubować komorę mikroprzepływową z komórkami przez 15-20 minut w temperaturze 37 °C i 5% CO_{2 .}
8. Napełnij górną studzienkę aksonalną 50 μl pożywki B27-neurobazalnej w (c w Rysunek 1A).
9. Stuknij w tylną część płyty, aby wspomóc przepływ przez kanał.
10. Napełnij studzienki po stronie somy (a i h w Rysunek 1A) 150 μl pożywki B27-Neurobasel każda, tworząc na wierzchu pęcherzyk napięcia. Objętość pęcherzyka wynosi około 20 μL.
    UWAGA: Tworzenie pęcherzyka napięcia nie jest konieczne do uzyskania izolacji płynowej, ale zapewnia wyraźny obraz większej objętości po stronie somy.
11. Napełnij obie studzienki po stronie aksonalnej (c i i w Rysunek 1A) 100 μl pożywki B27-Neurobasel każda.
    UWAGA: Aby promować wzrost aksonów przez mikrorowki, zaleca się, aby studzienki po stronie somy zawierały więcej pożywki niż studzienki po stronie aksonów. Jednak aksony przez przypadek wyrosną przez mikrorowki nawet bez różnic objętości.
12. Inkubować komorę mikroprzepływową w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ przez 7-8 dni.
    UWAGA: Wzrost aksonów do komory aksonalnej można zwykle zaobserwować począwszy od dnia in vitro (DIV) 5. Dłuższe czasy hodowli są możliwe, jeśli pożądane są bardziej dojrzałe kultury.
13. Karmić neurony co 2-3 dni, usuwając pożywkę z dwóch górnych dołków (a i c) i zastępując ją świeżą pożywką B27-Neurobasel, aż utworzy się pęcherzyk napięcia.

3. Barwienie barwnikiem wrażliwym na potencjał błony mitochondrialnej

1. W DIV 7-8 oceń, czy aksony wyrosły przez mikrorowki i rozciągają się do komory aksonalnej pod mikroskopem świetlnym.
   UWAGA: Możliwe są również różne stopnie DIV w zależności od pożądanego wieku.
2. Wykonać dwa płukania wstępnie podgrzanym podłożem do obrazowania (37 °C), usuwając pożywkę B27-Neurobasel ze wszystkich studzienek i dodając około 100 μl pożywki do obrazowania do górnych studzienek zarówno kanału aksonalnego, jak i somowego (a i c). Pozwól, aby medium przepłynęło do dolnych studzienek (h i i).
   1. Usuń pożywkę z dolnych studzienek i wszelkie resztki pożywki w górnych studzienkach i powtórz ze świeżą pożywką, pozostawiając studzienki puste pod koniec płukania.
      UWAGA: Ze względu na dużą siłę kapilarną w kanałach (d i f), w kanałach pozostanie pożywka płucząca, której nie należy usuwać, aby zapobiec wysuszeniu neuronów. Można tu użyć dowolnego podłoża do obrazowania wolnego od czerwieni fenolowej, na przykład Hibernate E (patrz Tabela materiałów). Jeśli mikroskop nie jest wyposażony w źródło CO₂ , upewnij się, że podłoże obrazujące wykorzystuje alternatywny system buforowania do węglanu/CO₂ (np. HEPES)⁸.
3. Rozcieńczyć 1 mM ester etylowy tetrametylorodaminy (TMRE, czerwony, patrz tabela materiałów) do 5 nM w podłożu do obrazowania.
   UWAGA: Nie przekraczać 1% DMSO w końcowym rozcieńczeniu, aby uniknąć toksyczności.
4. Dodać 100 μl rozcieńczenia TMRE 5 nM zarówno do studzienki somatycznej, jak i aksonalnej (a i c) i pozwolić pożywce przepływać zarówno przez przedziały somatyczne, jak i aksonalne, aż we wszystkich studzienkach będzie taka sama objętość. Napełnić pożywką zawierającą TMRE.
5. Umieść neurony z powrotem w komorze o kontrolowanym środowisku (37 °C i 5% CO_{2 )} na 25 minut.
6. Wykonać dwa płukania wstępnie podgrzanym podłożem obrazowym (37 °C), jak opisano wcześniej (krok 3.2). Podczas ostatniego płukania napełnij 100 μl w każdym dołku i utwórz pęcherzyk naprężający pożywki na studzienkach somatycznych (a i c).

4. Obrazowanie żywych komórek

UWAGA: Pokazane zdjęcia zostały wykonane za pomocą mikroskopu konfokalnego z wirującym dyskiem, przy użyciu obiektywu o kącie zanurzenia 40x NA 1,25 (patrz Tabela materiałów). Wybrano czas naświetlania 200 ms i 10% mocy lasera dla kanału czerwonego oraz czas ekspozycji 500 ms dla jasnego pola. Jednak zwykłe mikroskopy konfokalne lub odwrócone o szerokim polu widzenia mogą być również używane do badania intensywności TMRE.

1. Zobrazuj komórki za pomocą odwróconego mikroskopu.
2. Upewnij się, że mikroskop jest wyposażony w inkubator stopniowy w celu utrzymania kultury neuronalnej w temperaturze 37 °C przez cały czas trwania eksperymentu.
3. Wybierz interesujący Cię obszar w przedziale somatycznym i podążaj za nim przez mikrorowki do przedziału aksonalnego. Upewnij się, że obrazowane mikrorowki pasują do tych w przedziałach somatycznych i aksonalnych (dla łatwiejszego porównania wartości wyjściowej i po leczeniu).
4. Rejestruj obrazy fluorescencyjne za pomocą wzbudzenia przy 561 nm i emisji przy 625 nm dla sygnału czerwonej fluorescencji.
5. Zdobądź obrazy.
6. Aby wywołać depolaryzację mitochondriów, dodaj 20 μM antymycyny A (patrz tabela materiałów) w pożywce do obrazowania do przedziału aksonalnego. Aby zapewnić różnicę objętości między komorą soma a komorą aksonalną, sprawdź, czy po stronie somatycznej znajduje się pęcherzyk naprężający (równy objętości >110 μl).
   1. Usunąć całą pożywkę obrazową z dolnej studzienki po stronie aksonalnej (i), z wyjątkiem pożywki wewnątrz kanału (f). Dodać 160 μl 20 μM antymycyny A do górnej studzienki aksonalnej (c) i pozwolić jej przepłynąć przez kanał, aż w obu studzienkach aksonalnych będzie równa objętość. Objętości w studzienkach aksonalnych wynoszą około 80 μl na studzienkę.
      UWAGA: Upewnij się, że objętość w studzienkach aksonalnych jest mniejsza niż w studzienkach somatycznych, aby zapewnić odpowiednie ciśnienie płynu. Zalecana jest różnica co najmniej 10 μl (10% objętości studzienki), ale możliwe są również większe różnice.
7. Inkubować neurony w komorze kontrolowanego środowiska (37 °C) przez 20-30 minut.
8. Powtórzyć obrazowanie zgodnie z powyższym opisem (kroki 4.3-4.5). Upewnij się, że te same pozycje są obrazowane (łatwe do zidentyfikowania przez mikrorowki), co podczas akwizycji linii bazowej.

Wyniki

Pierwotne neurony hipokampa hodowano w urządzeniach mikroprzepływowych przez 7-8 dni, po czym mitochondria barwiono barwnikiem wrażliwym na błonę (TMRE) przez 25 min w obu kanałach. Jak pokazano na Rysunku 2A, pozwoliło to na jednorodne barwienie mitochondriów po obu stronach mikrowgłębień, jednak nie było to wystarczające do wyrównania barwienia w środkowej części mikrowgłębień. Po dodaniu antymycyny A po stronie aksonalnej, mitochondria somatyczne zachowały sygnał TMRE (

Dyskusja

Niniejszy protokół opisuje metodę wysiewu i hodowli zdysocjowanych neuronów hipokampa w urządzeniu mikroprzepływowym do oddzielnego leczenia mitochondriów aksonalnych. Użyteczność tego podejścia z wrażliwym na błonę barwnikiem TMRE i inhibitorem kompleksu III antymycyną A (jak wykazano wcześniej⁷) została wykazana tutaj, ale metodę tę można łatwo dostosować do innych barwników mitochondrialnych lub genetycznie kodowanych czujników funkcji mitochondriów, które umożliwiają lokalne odczyty oparte na ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
6-dołkowa szklana płyta dolna	Cellvis	P06.1.5H-N	Urządzenie silikonowe
Antymycyna A	Sigma	A8674
B27	Gibco	17504044
EVOS M5000	Thermofischer Scientific	EVOS M5000	w pełni zintegrowany cyfrowy mikroskop szerokokątny
Hibernate E	BrainBits	HE500
Odwrócony dysk wirujący konfokalny	Nikon	TI2-E + CSU-W1	Z komorą inkubatora
Laminin	Invitrogen	L2020
Urządzenia mikroprzepływowe	XONA mikrofluidyka	RD450
Podłoże neuropodstawowe	Gibco	21103049
Poli-D-Lizyna	Sigma	P2636
TMRE	Sigma	87917

Mikroskop szerokokątny