Przygotowanie cytoplazmatycznych i jądrowych długich RNA z komórek pierwotnych i hodowanych

Podsumowanie

Obecny protokół oferuje efektywną i elastyczną metodę izolacji RNA z frakcji jądrowych i cytoplazmatycznych za pomocą hodowanych komórek, a następnie walidacji za pomocą qPCR. Skutecznie służy jako zamiennik dla innych zestawów do przygotowania RNA.

Streszczenie

Rozdzielanie składników wewnątrzkomórkowych jest kluczowym narzędziem w biologii komórkowej od wielu lat i jest w stanie dostarczyć użytecznych informacji na temat tego, jak ich lokalizacja może wpływać na ich funkcję. W szczególności oddzielenie jądrowego i cytoplazmatycznego RNA stało się ważne w kontekście komórek nowotworowych i poszukiwania nowych celów dla leków. Zakup zestawów do ekstrakcji jądrowo-cytoplazmatycznego RNA może być kosztowny, gdy wiele wymaganych materiałów można znaleźć w typowych warunkach laboratoryjnych. Korzystając z obecnej metody, która może zastąpić droższe zestawy lub inne czasochłonne procesy, do wyizolowania jądrowego i cytoplazmatycznego RNA potrzebny jest tylko domowy bufor do lizy, wirówka stołowa i kolumny oczyszczające do izolacji RNA. Bufor do lizy służy do delikatnej lizy zewnętrznej błony komórki bez wpływu na integralność otoczki jądrowej, co pozwala na uwolnienie jej składników wewnątrzkomórkowych. Następnie jądra można wyizolować za pomocą prostego etapu wirowania, ponieważ mają one większą gęstość niż roztwór do lizy. Wirowanie stosuje się do oddzielenia tych obszarów na podstawie ich różnic gęstości w celu wyizolowania elementów subkomórkowych w jądrze od tych w cytoplazmie. Po odwirowaniu wyizolowania różnych składników, zestaw do czyszczenia RNA jest używany do oczyszczania zawartości RNA, a qPCR jest wykonywany w celu walidacji jakości separacji, określonej ilościowo na podstawie ilości jądrowego i cytoplazmatycznego RNA w różnych frakcjach. Osiągnięto statystycznie istotne poziomy separacji, co ilustruje skuteczność protokołu. Ponadto system ten można dostosować do izolacji różnych typów RNA (całkowitego, małego RNA itp.), co pozwala na ukierunkowane badanie interakcji cytoplazma-jądro i pomaga w zrozumieniu różnic w funkcji RNA, które znajdują się w jądrze i cytoplazmie.

Wprowadzenie

Frakcjonowanie komórek na składniki subkomórkowe pozwala na izolację i badanie zdefiniowanych domen biochemicznych oraz pomaga w określeniu lokalizacji określonych procesów komórkowych i jak może to wpłynąć na ich funkcję¹. Izolacja RNA z różnych lokalizacji wewnątrzkomórkowych może pozwolić na poprawę dokładności analizy genetycznej i biochemicznej zdarzeń na poziomie transkrypcji i innych interakcji między jądrem a cytoplazmą, co służy jako główny cel obecnego protokołu². Protokół ten został opracowany w celu zapewnienia izolacji cytoplazmatycznych i jądrowych RNA w celu określenia ich odpowiednich ról w eksporcie jądrowym oraz zrozumienia, w jaki sposób subkomórkowa lokalizacja RNA w jądrze i cytoplazmie może wpływać na ich funkcję w procesach komórkowych. Korzystając z materiałów pochodzących z typowych warunków laboratoryjnych, możliwe było osiągnięcie frakcjonowania jądrowego i cytoplazmatycznego w sposób bardziej efektywny i tańszy niż wcześniej ustalone protokoły bez narażania na szwank jakości wyników³.

Dodatkowo, wymiana cząsteczek między cytoplazmą a jądrem może być badana bezpośrednio poprzez rozdzielenie tych regionów. Mówiąc dokładniej, zrozumienie transkryptomu jest niezbędne do zrozumienia rozwoju i choroby. Jednak RNA mogą znajdować się na różnych poziomach dojrzewania w danym momencie i mogą komplikować dalszą analizę. Protokół ten pozwala na izolację RNA z jądrowych i cytoplazmatycznych frakcji subkomórkowych, co może pomóc w badaniach RNA i pozwolić na lepsze zrozumienie konkretnego RNA będącego przedmiotem zainteresowania, takiego jak lokalizacja niekodujących RNA lub analiza połączeń splicingowych w jądrze.

Ten protokół został zoptymalizowany do izolowania cytoplazmatycznych i jądrowych długich RNA, w tym mRNA, rRNA i długich niekodujących RNA (lncRNA), ze względu na selektywność wielkości zastosowanej kolumny oczyszczającej RNA, która może być modyfikowana w celu wyizolowania innych interesujących RNA. Wcześniej funkcja długich RNA, takich jak mRNA i lncRNA, w dużym stopniu zależała od ich odpowiedniej lokalizacji w komórce^4,5. W związku z tym badanie eksportu z jądra do domen subkomórkowych stało się bardziej ukierunkowane na zrozumienie roli, jaką eksport RNA lub innych składników komórkowych może odgrywać w komórce. lncRNA są tego doskonałym przykładem, ponieważ ich translacja i późniejsze efekty zależą w dużej mierze od bliskości i interakcji z innymi formami RNA⁶. Co więcej, wymiana elementów komórkowych między regionami jądrowymi i cytoplazmatycznymi jest powiązana z mechanizmami oporności na różne metody leczenia raka⁷. Izolacja przedziałów wewnątrzkomórkowych pozwoliła na opracowanie inhibitorów eksportu jądrowego, co zmniejszyło wpływ mechanizmów oporności na różne terapie⁸.

Po oddzieleniu jądrowego i cytoplazmatycznego RNA, wykonywane są kroki mające na celu oczyszczenie interesującego RNA. Ponieważ zestawy do oczyszczania RNA są powszechnie spotykane w laboratoriach i służą do oczyszczania i izolowania długich RNA, dobrze spełniają cel tego protokołu. W przypadku oczyszczania RNA generowanie proporcji 260:280 większych niż 1,8 ma kluczowe znaczenie dla zapewnienia jakości próbek do sekwencjonowania RNA lub innych podobnych procedur wymagających wysokiego poziomu czystości i izolacji. Nieregularne wartości 260:280 wskazują na zanieczyszczenie fenolem, wykazując słabą izolację i dając niedokładne wyniki⁹.

Gdy oczyszczanie RNA zostanie zakończone i potwierdzono, że wartości 260:280 przekraczają dopuszczalny zakres, qPCR został wykorzystany do walidacji wyników izolacji frakcji jądrowych i cytoplazmatycznych. W tym celu użyto starterów specyficznych dla obszaru zainteresowania, aby zademonstrować poziomy frakcjonowania jądrowego i cytoplazmatycznego. W tym protokole MALAT1 i TUG1 zostały użyte jako markery jądrowe i cytoplazmatyczne odpowiednio¹⁰. Razem pozwalają one na wykazanie wysokiego poziomu frakcjonowania jądrowego za pomocą MALAT1, podczas gdy oczekuje się, że frakcjonowanie cytoplazmatyczne będzie niskie. I odwrotnie, gdy stosuje się TUG1, oczekuje się, że poziomy frakcjonowania cytoplazmatycznego będą wyższe niż poziomy frakcjonowania jądrowego.

Korzystając z tego protokołu, możliwe było wyizolowanie RNA na podstawie ich pozycji działania w komórce. Ze względu na powszechny dostęp do wielu materiałów i wykorzystanie podczas tego eksperymentu wyłącznie buforu do lizy i technik wirowania opartych na gęstości, zastosowanie do innych typów RNA i innych składników komórkowych jest powszechne. Może to dostarczyć ważnych informacji, rzucając światło na zdarzenia wyrażeń specyficzne dla lokalizacji, które w przeciwnym razie byłyby nie do odróżnienia bez separacji.

Protokół

Komórki K562 są używane w niniejszym badaniu. Ten protokół został zoptymalizowany do pracy dla 1 x 10^6-5 x 10⁶ milionów komórek. Procedurę tę można jednak zwiększyć w przypadku większych ilości komórek, odpowiednio zwiększając ich objętość.

1. Przygotowanie 0,25x buforu do lizy

1. Przygotować 0,25-krotny bufor do lizy, mieszając następujące składniki podane w tabeli 1A.
   UWAGA: Próbki wymagają około 300 μl 0,25x buforu do lizy. Zalecana objętość = liczba próbek x 300 μL.

2. Separacja frakcji jądrowej i cytoplazmatycznej

1. Granulować komórki za pomocą probówek o pojemności 1,5 ml przez wirowanie przez 5 minut w temperaturze 2000 x g (temperatura pokojowa). Usunąć supernatant za pomocą pipety zasysającej.
   UWAGA: Komórki K562 zostały wykorzystane podczas tego protokołu. Protokół można jednak dostosować do różnych linii komórkowych.
2. Zawiesić osad w 300 μl lodowatego buforu 0,25x bufor do lizy.
   UWAGA: Trzymaj na lodzie przez 2 minuty i obracaj rurkę co 45 sekund, aby zapewnić prawidłową lizę komórek.
3. Wirować probówki z najwyższą prędkością (12 000 x g) w temperaturze 4 °C przez 2 minuty.
4. Po odwirowaniu ostrożnie usunąć supernatant i umieścić go w nowej probówce o pojemności 1,5 ml. Będzie to frakcja cytoplazmatyczna. Zostanie osiągnięte około 300 μL frakcji cytoplazmatycznej.
5. Pozostała pastylka będzie frakcją jądrową. Dodać 500 μl lodowatego PBS do osadu i odwirować przy 2 000 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
   UWAGA: Na tym etapie usuwany jest nadmiar DNA.

3. Oczyszczanie RNA za pomocą zestawu do oczyszczania RNA

UWAGA: Ten protokół został osiągnięty przy użyciu komercyjnie dostępnego zestawu do oczyszczania RNA (zobacz Tabelę materiałów).

1. Oddziel próbki cytoplazmatycznego RNA i próbki cytoplazmy jądrowej (ponieważ etapy frakcjonowania różnią się między nimi).
   1. Aby oddzielić frakcję cytoplazmatyczną, dodaj 1,050 μl 3,5x buforu do lizy RLT (patrz tabela materiałów) i krótko odwiruj. Następnie dodaj 750 μl 90% etanolu i załaduj go do kolumny z zestawu do czyszczenia RNA.
      UWAGA: Roztwór musi być dobrze wymieszany przed załadowaniem na kolumnę.
   2. Aby oddzielić frakcję jądrową, dodaj 600 μl 3,5x buforu do lizy i wiru. Następnie dodaj 600 μl 70% etanolu.
2. Załaduj zarówno frakcję cytoplazmatyczną, jak i jądrową na kolumny RNA (patrz Tabela materiałów).
   UWAGA: W pozostałej części kroku 3 zarówno próbki cytoplazmatyczne, jak i jądrowe podlegają tej samej procedurze. Należy jednak upewnić się, że próbki te pozostają od siebie niezależne.
   1. Załaduj zarówno frakcje cytoplazmatyczne, jak i jądrowe na kolumny RNA i wiruj przez 30 s w temperaturze 8 000 x g w temperaturze pokojowej. Wyrzuć nadmiar przepływu.
   2. Dodać 350 μl buforu płuczącego z dostępnego w handlu zestawu do oczyszczania (bufor RW1, patrz tabela materiałów), ponownie odwirować i odrzucić przepływ.
   3. Dodać roztwór DNAzy (1U/uL) przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Następnie dodaj 350 μl buforu do mycia, ponownie odwiruj i wylej przepływ.
   4. Dodać 500 μl łagodnego buforu myjącego (RPE, patrz tabela materiałów), ponownie odwirować i wylać przepływ. Dodać 500 μl łagodnego buforu myjącego, ponownie odwirować, ale tylko przez 2 min.
   5. Przenieś kolumnę do nowej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml i dodaj 30 μl wody do kolumny wirowej. Pozostaw kolumnę na 1 minutę przed odwirowaniem.

4. Walidacja separacji jądrowej od cytoplazmy

1. Przeprowadzanie syntezy cDNA
   1. Po wyekstrahowaniu i oczyszczeniu subkomórkowych przedziałów RNA potwierdź rozdzielenie przedziałów za pomocą qPCR. Aby to zrobić, najpierw przekształć RNA w cDNA za pomocą dostępnego na rynku zestawu, postępując zgodnie z instrukcjami producenta (patrz Tabela materiałów).
   2. Przygotuj mastermix odwrotnej transkryptazy. Dodaj szablon RNA. Inkubacja reakcji w termocyklerze.
      UWAGA: W przypadku heksamerów losowych stosowane parametry cykliczne podano w tabeli 2A. Reakcję odwrotnej transkryptazy należy natychmiast zastosować lub przechowywać w temperaturze -20 °C (Tabela 1B).
2. Przeprowadzić ilościową reakcję łańcuchową polimerazy (qPCR) i analizę.
   1. Rozcieńczyć syntezę cDNA wodą DEPC (patrz tabela materiałów), aby uzyskać końcowe stężenie 20 ng / ml.
   2. Używając głównej mieszanki PCR, przygotuj reakcję dla każdej próbki, korzystając z ręcznych instrukcji wymienionych poniżej.
   3. Zdobądź komercyjne sondy niezbędne do wykrywania frakcjonowania cytoplazmatycznego i jądrowego. Użyj MALAT1 jako markera jądrowego i TUG1 jako markera cytoplazmatycznego (patrz Tabela materiałów).
      UWAGA: Sekwencje dla MALAT1 i TUG1 przedstawiono w Tabeli 3.
   4. Obliczyć objętość każdego składnika, mnożąc każdy składnik przez 3 dla każdej z kontrprób technicznych dla danej próbki.
   5. Dla każdej próbki jądrowej i cytoplazmatycznej należy uzyskać następujące mieszaniny dla każdej: a) frakcji jądrowej z MALAT1, b) frakcji cytoplazmatycznej z MALAT1, c) frakcji jądrowej z TUG1 i (d) frakcji cytoplazmatycznej z TUG1 (tabela 1C).
   6. Krótko przetrząsnąć, aby wymieszać roztwory i przenieść 20 μl mieszaniny do każdego dołka płytki reakcji optycznej (patrz tabela materiałów).
   7. Przykryj płytkę przezroczystą folią samoprzylepną używaną do qPCR (patrz tabela materiałów) i krótko odwiruj płytkę w celu usunięcia pęcherzyków powietrza, a następnie odwiruj próbkę przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
   8. Korzystając z oprogramowania do projektowania i analizy (patrz tabela materiałów), wybierz krzywą standardową dla parametrów cyklicznych (tabela 2B).
   9. Korzystając z oprogramowania qPCR, wybierz opcję Uruchom instalator (rysunek uzupełniający 1).
   10. Na stronie Data File Properties (Właściwości pliku danych) wybierz opcję Method and input cycle parameters (Metoda i parametry cyklu wejściowego) z tabeli 2B (Rysunek uzupełniający 2).
   11. Po wprowadzeniu parametrów cyklu wybierz zakładkę Płyta i wprowadź próbki do uruchomienia (Rysunek uzupełniający 3). Wybierz pozycję Start Run.
       UWAGA: Opisane kroki zostały wykonane w maszynie qPCR przy użyciu dostępnej na rynku mieszanki wzorcowej (patrz Tabela materiałów).
3. Przeprowadzanie analizy danych
   1. Po zakończeniu przebiegu utwórz arkusz kalkulacyjny danych z nazwą próbki, nazwą docelową i cyklem kwantyfikacji (Cq) (tabela uzupełniająca 1).
   2. Zacznij od próbek MALAT1, aby obliczyć frakcję jądrową. Odejmij frakcję cytoplazmatyczną MALAT1 od frakcji jądrowej MALAT1 (Tabela 4).
   3. Następnie oblicz ΔCq (2^(-wartość)) (Tabela 5).
   4. Kontynuuj z próbkami MALAT1 w celu obliczenia frakcji cytoplazmatycznej, odejmij frakcję jądrową MALAT1 od frakcji cytoplazmatycznej MALAT1, a następnie oblicz ΔCq (2^(-wartość)) (Tabela 6).
      UWAGA: Patrząc na ΔCq, obserwuje się, że frakcja jądrowa MALAT1 (zielone podświetlenie) ma większy marker MALAT1 niż cytoplazma (czerwone podświetlenie), ale teraz wymagane jest potwierdzenie, aby upewnić się, że frakcja cytoplazmatyczna jest głównie cytoplazmą i że frakcja jądrowa nie zawiera zanieczyszczenia cytoplazmatycznego.
   5. W przypadku próbek TUG1 wykonaj te same obliczenia, co powyżej (kroki 4.3.2-4.3.4) (Tabela 7).
      UWAGA: Patrząc na ΔCq, obserwuje się, że cytoplazmatyczna frakcja TUG1 (zielone podświetlenie) ma większy marker TUG1 niż frakcja jądrowa (czerwone podświetlenie), potwierdzając w ten sposób dobrą separację frakcji cytoplazmatycznej i jądrowej (Tabela 8, Rysunek 1).

Wyniki

Aby upewnić się, że uzyskano separację frakcji jądrowej i cytoplazmatycznej, przeprowadzono analizę qPCR w celu walidacji wyników. W tym celu wykorzystano primery specyficzne dla interesującego regionu, aby wykazać poziom frakcjonowania jądrowego i cytoplazmatycznego. W niniejszym badaniu jako primery dla frakcji jądrowej i cytoplazmatycznej zastosowano odpowiednio MALAT1 i TUG1. Pozwalają one na wykazanie wysokiego poziomu frakcjonowania jądrowego, gdzie MALAT1 służy jako kontrola pozytywna dla elementów jądrowych, podc...

Dyskusja

W trakcie trwania protokołu podjęto pewne kroki w celu optymalizacji elementów, aby były jak najbardziej skuteczne dla linii komórkowej będącej przedmiotem zainteresowania. Chociaż kroki w ramach protokołu są stosunkowo proste, może być konieczna analiza i drobne korekty w krytycznych aspektach protokołu. Najważniejszym krokiem w protokole jest modyfikacja stężenia buforu do lizy do odpowiedniego stężenia w oparciu o linię komórkową będącą przedmiotem zainteresowania i cel komórkowy. Ponieważ wykorzystanie buforu do lizy...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Agilent Tapestation	Agilent	G2991BA	System Agilent TapeStation to zautomatyzowane rozwiązanie do elektroforezy do kontroli jakości próbek DNA i RNA.
0,5% Nonidet P-40	Thermo-Fischer	28324	Stosowany do wytwarzania buforu do lizy
50 mM Tris-Cl pH 8,0	Thermo-Fischer	15568025	Stosowany do wytwarzania buforu do lizy
MALAT1 GE Test	Thermo-Fischer	Hs00273907_s1	Używany do potwierdzania frakcji jądrowej.
Optyczna 96-dołkowa płytka reakcyjna MicroAmp z kodem kreskowym	Thermo-Fischer	4326659	Optyczna 96-dołkowa płytka reakcyjna MicroAmp firmy Applied Biosystems z kodem kreskowym została zoptymalizowana, aby zapewnić niezrównaną dokładność i jednorodność temperatury w celu szybkiej i wydajnej amplifikacji PCR. Ta płytka, wykonana z pojedynczego sztywnego kawałka polipropylenu w formacie 96-dołkowym, jest kompatybilna z 96-dołkowymi systemami PCR w czasie rzeczywistym i termocyklerami firmy Applied Biosystems.
Optyczna folia samoprzylepna MicroAmp	Thermo-Fischer	4311971	Stosowana przezroczysta folia samoprzylepna MicroAmp zmniejsza ryzyko zanieczyszczenia od studni do studni i parowania próbki po nałożeniu na mikropłytkę podczas qPCR
PBS	Gibco	20012-023	Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) to zrównoważony roztwór soli, który jest używany do różnych zastosowań w hodowlach komórkowych, takich jak mycie komórek przed dysocjacją, transport komórek lub próbek tkanek, rozcieńczanie komórek do liczenia i przygotowywanie odczynników.
Qiagen RNA Clean Up Kit-Rneasy Mini Kit	Qiagen	74106	umożliwiają skuteczne oczyszczanie RNA z reakcji enzymatycznych i oczyszczanie RNA oczyszczonego różnymi metodami. Zawiera RW1, RLT, RW1 wymienione w całym protokole.
Oprogramowanie QuantStudio 6	Thermo-Fischer	A43180	qPCR wykorzystywane podczas protokołu. Zawiera oprogramowanie do projektowania i analizy do analizy próbek frakcjonowanych
Bufor RLT	Qiagen	79216	Bufor do lizy z zestawu do czyszczenia RNA
Bufor RPE	1018013		Wash Bufor z zestawu do czyszczenia
RNA Bufor RW1 Bufor	Qiagen	1053394	Wash z zestawu do czyszczenia RNA
Testy ekspresji genów Taqman	Thermo-Fischer	4331182	Testy ekspresji genów TaqMan firmy Applied Biosystems stanowią największy zbiór wstępnie zaprojektowanych testów w branży, z ponad 2,8 milionami testów dla 32 gatunków eukariotycznych i licznych drobnoustrojów. Testy ekspresji genów TaqMan umożliwiają szybkie uzyskanie wyników bez marnowania czasu na optymalizację starterów SYBR Green i bez dodatkowego czasu spędzonego na uruchamianiu i analizowaniu krzywych topnienia.
TaqMan Universal PCR Master Mix	Thermo-Fischer	4305719	TaqMan Universal PCR Master Mix to idealne rozwiązanie odczynnika, gdy potrzebujesz mieszanki wzorcowej do wielu zastosowań nukleazy DNA 5'. Odczynniki Applied Biosystems zostały zwalidowane za pomocą testów TaqMan i systemów czasu rzeczywistego Applied Biosystems, aby zapewnić czułe, dokładne i niezawodne działanie za każdym razem.
Test TUG1 GE	Thermo-Fischer	Hs00215501_m1	Służy do potwierdzania frakcji cytoplazmatycznej.
Woda uzdatniona UltraPure DEPC	Thermo-Fischer	750024	Woda uzdatniona UltraPure DEPC nadaje się do stosowania z RNA. Przygotowuje się go przez inkubację z 0,1% dietylowęglanem (DEPC), a następnie jest sterylizowany w autoklawie w celu usunięcia DEPC. Sterylne z filtrem.

Zestawy do oczyszczania RNA