Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Badanie współpracy mikrobiologicznej poprzez obrazową analizę spektrometrii mas kolonii bakteryjnych hodowanych na agarze i w tkance podczas infekcji

2.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/64200

⸱

18 listopada 2022

 ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry, University of Florida, 2Division of Protective Immunity, Children’s Hospital of Philadelphia, 3Department of Pathology and Laboratory Medicine, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania

W tym artykule

Podsumowanie

Nowatorska metoda przygotowania próbek została zademonstrowana do analizy makrokolonii bakteryjnych na bazie agaru za pomocą matrycowej desorpcji/jonizacji laserowej spektrometrii mas.

Streszczenie

Zrozumienie metabolicznych konsekwencji interakcji mikrobiologicznych, które zachodzą podczas infekcji, stanowi wyjątkowe wyzwanie dla dziedziny obrazowania biomedycznego. Spektrometria mas z desorpcją/jonizacją laserową wspomaganą matrycą (MALDI) reprezentuje bezznacznikową metodę obrazowania in situ, zdolną do generowania map przestrzennych dla szerokiej gamy metabolitów. Podczas gdy cienko pocięte próbki tkanek są obecnie rutynowo analizowane za pomocą tej technologii, obrazowe analizy spektrometrii mas nietradycyjnych substratów, takich jak kolonie bakterii powszechnie hodowane na agarze w badaniach mikrobiologicznych, pozostają wyzwaniem ze względu na wysoką zawartość wody i nierówną topografię tych próbek. W artykule przedstawiono proces przygotowania próbki, który umożliwia obrazowanie analiz spektrometrii mas tych typów próbek. Przykładem tego procesu jest kokultura bakteryjna makrokolonii dwóch patogenów przewodu pokarmowego: Clostridioides difficile i Enterococcus faecalis. Wykazano również, że badanie interakcji mikrobiologicznych w tym dobrze zdefiniowanym środowisku agarowym uzupełnia badania tkankowe mające na celu zrozumienie mikrobiologicznej współpracy metabolicznej między tymi dwoma organizmami chorobotwórczymi w mysich modelach infekcji. Obrazowe analizy metabolitów aminokwasów argininy i ornityny za pomocą spektrometrii mas przedstawiono jako dane reprezentatywne. Metoda ta ma szerokie zastosowanie w przypadku innych analitów, patogenów lub chorób mikrobiologicznych oraz typów tkanek, w przypadku których pożądany jest przestrzenny pomiar biochemii komórkowej lub tkankowej.

Wprowadzenie

Ludzki mikrobiom to wysoce dynamiczny ekosystem obejmujący molekularne interakcje bakterii, wirusów, archeonów i innych mikrobiologicznych eukariontów. Chociaż w ostatnich latach intensywnie badano związki mikrobiologiczne, wiele pozostaje do zrozumienia na temat procesów mikrobiologicznych na poziomie chemicznym1,2. Wynika to częściowo z niedostępności narzędzi zdolnych do dokładnego pomiaru złożonych środowisk mikrobiologicznych. Postępy w dziedzinie obrazowania spektrometrii mas (IMS) w ciągu ostatniej dekady umożliwiły przestrzenne mapowanie in situ i bez znaczników wielu metabolitów, lipidów i białek w podłożach biologicznych3,4. Desorpcja/jonizacja laserowa wspomagana matrycą (MALDI) stała się najpowszechniejszą techniką jonizacji stosowaną w obrazowaniu spektrometrii mas, polegającą na użyciu lasera UV do ablacji materiału z powierzchni cienkiego wycinka tkanki w celu pomiaru za pomocą spektrometrii mas4. Proces ten jest ułatwiony dzięki zastosowaniu matrycy chemicznej nanoszonej jednorodnie na powierzchnię próbki, co pozwala na wykonywanie pomiarów sekwencyjnych w rastrze na całej powierzchni próbki. Po zebraniu danych generowane są mapy cieplne intensywności jonów analitu. Ostatnie postępy w zakresie źródeł jonizacji i technik pobierania próbek umożliwiły analizę nietradycyjnych substratów, takich jak bacterial5 i mammalian6,7,8 próbek komórkowych wyhodowanych na agarze odżywczym. Molekularne informacje przestrzenne dostarczane przez IMS mogą dostarczyć unikalnego wglądu w biochemiczną komunikację interakcji mikroorganizm-mikrob i gospodarz-mikrob podczas infekcji9,10,11,12,13,14.

Po zakażeniu Clostridioides difficile (CDI), C. difficile jest narażony na szybko zmieniające się środowisko mikrobiologiczne w przewodzie pokarmowym, gdzie interakcje wielomikrobiologiczne mogą mieć wpływ na wyniki infekcji15,16. Co zaskakujące, niewiele wiadomo na temat molekularnych mechanizmów interakcji między C. difficile a mikrobiotą rezydentną podczas infekcji. Na przykład enterokoki są klasą oportunistycznych patogenów komensalnych w mikrobiomie jelitowym i są związane ze zwiększoną podatnością i nasileniem CDI17,18,19,20. Niewiele jednak wiadomo na temat molekularnych mechanizmów interakcji między tymi patogenami. Aby zobrazować komunikację małych cząsteczek między tymi członkami mikrobiomu jelitowego, na agarze wyhodowano makrokolonie bakteryjne, aby symulować interakcje drobnoustroje-drobnoustroje i tworzenie biofilmu bakteryjnego w kontrolowanym środowisku. Jednak uzyskanie reprezentatywnych rozkładów metabolicznych na podstawie analizy spektrometrii mas za pomocą obrazowania MALDI próbek kultur bakteryjnych jest trudne ze względu na wysoką zawartość wody i nierówną topografię powierzchni tych próbek. Jest to w dużej mierze spowodowane wysoce hydrofilowym charakterem agaru i niejednorodną reakcją powierzchni agaru podczas usuwania wilgoci.

Wysoka zawartość wody w agarze może również utrudnić uzyskanie jednorodnej powłoki matrycy MALDI i może zakłócać późniejszą analizę MALDI wykonywaną w próżni<sup class="xref">21. Na przykład wiele źródeł MALDI działa pod ciśnieniem 0,1-10 Torr, co jest wystarczającą próżnią do usunięcia wilgoci z agaru i może powodować deformację próbki. Te zmiany morfologiczne w agarze wywołane przez środowisko próżniowe powodują bulgotanie i pękanie w wysuszonym materiale agarowym. Artefakty te zmniejszają przyleganie agaru do szkiełka i mogą powodować demontaż lub łuszczenie się próbki do systemu próżniowego instrumentu. Grubość próbek agaru może wynosić do 5 mm od szkiełka, co może powodować niewystarczający odstęp od optyki jonowej wewnątrz instrumentu, powodując zanieczyszczenie i/lub uszkodzenie optyki jonowej przyrządu. Te skumulowane efekty mogą powodować zmniejszenie sygnału jonowego odzwierciedlającego topografię powierzchni, a nie leżące u podstaw mikrobiologiczne interakcje biochemiczne. Próbki agaru muszą być jednorodnie wysuszone i mocno przyklejone do szkiełka mikroskopowego przed analizą w próżni.

Ten artykuł demonstruje proces przygotowania próbki do kontrolowanego suszenia makrokolonii kultur bakteryjnych hodowanych na podłożach agarowych. Ten wieloetapowy, wolniejszy proces suszenia (w stosunku do wcześniej opisanych) zapewnia, że agar będzie się równomiernie odwadniał, jednocześnie minimalizując skutki bulgotania lub pękania próbek agaru zamontowanych na szkiełkach mikroskopowych. Dzięki zastosowaniu tej metody stopniowego suszenia, próbki są silnie przylegane do szkiełka mikroskopowego i nadają się do późniejszego nałożenia matrycy i analizy MALDI. Przykładem tego są modelowe kolonie bakteryjne C. difficile hodowane na modelach tkanek agarowych i mysich zawierających CDI z obecnością komensalnego i oportunistycznego patogenu Enterococcus faecalis i bez niej. Analizy spektrometrii mas za pomocą spektrometrii mas MALDI zarówno modeli bakteryjnych, jak i tkankowych pozwalają na przestrzenne mapowanie profili metabolitów aminokwasów, dostarczając nowego wglądu w bioenergetyczny metabolizm mikrobiologiczny i komunikację

.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

UWAGA: Eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Komitety ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Zwierząt Szpitala Dziecięcego w Filadelfii oraz University of Pennsylvania Perelman School of Medicine (protokoły IAC 18-001316 i 806279).

UWAGA: Clostridium difficile (C. difficile) i Enterococcus faecalis (E. faecalis) są patogenami BSLII i powinny być traktowane z najwyższą ostrożnością. W razie potrzeby stosuj odpowiednie protokoły dekontaminacji.

1. Wzrost makrokolonii kultur bakteryjnych i przygotowanie do wysyłki z dnia na dzień

  1. Przygotować nocne kultury C. difficile i E. faecalis i hodować je pojedynczo w temperaturze 37 °C w komorze beztlenowej (85% azotu, 10% wodoru, 5% dwutlenku węgla) w bulionie do infuzji mózgowo-sercowej uzupełnionym 0,5% ekstraktem drożdżowym i 0,1% l-cysteiną (BHIS). Użyj 1,5% agaru do wszystkich platerowanych próbek.
  2. Znormalizować pożywkę do hodowli bakteryjnej do gęstości optycznej przy 600 nm (OD600). Umieścić 5 μl każdej makrokolonii na płytkach agarowych BHIS + l-cysteina i hodować beztlenowo przez 7 dni w temperaturze 37 °C. W przypadku makrokolonii mieszanych gatunków, przed posiewem należy wymieszać pożywkę bakteryjną w stosunku 1:1.
  3. Przygotować szkiełka mikroskopowe pokryte tlenkiem indu i cyny (ITO) za pomocą omomierza w celu zidentyfikowania strony szkiełka z powłoką przewodzącą. Użyj rysika z diamentową końcówką, aby wytrawić i oznaczyć stronę szkiełka mikroskopowego pokrytą ITO.
  4. Wyciąć całą kulturę z płytki do wzrostu agaru, a następnie zamontować na szkiełku mikroskopowym pokrytym ITO, upewniając się, że pęcherzyki powietrza nie są uwięzione między agarem a szkiełkiem.
    UWAGA: Zawartość wody w podłożu agarowym powinna umożliwiać naturalne przyleganie kultury do powierzchni szkiełka mikroskopowego. Film ilustrujący ten proces znajduje się w dodatkowej dokumentacji Yang et al.22.
  5. Umieść kolonie w pudełkach na szkiełka mikroskopowe w celu ochrony. Przechowuj pudełka na suwaki w workach do transportu próbek o wymiarach 8 cali x 8 w workach do transportu próbek zagrożeń biologicznych z garścią granulek środka osuszającego i zamknij do wysyłki w nocy w celu dalszego przetwarzania i analizy.
    UWAGA: Ważne jest, aby utrzymać suche środowisko dla kultur bakteryjnych podczas transportu w warunkach otoczenia, aby spowolnić wzrost i metabolizm bakterii oraz utrzymać utrwalenie próbek bakteryjnych do czasu analizy. Ta metoda transportu została zoptymalizowana w wyniku szeroko zakrojonych eksperymentów i jest preferowana w stosunku do wysyłki kolonii zamrożonych w suchym lodzie. Duże zmiany temperatury przed suszeniem mają tendencję do powodowania demontażu i bulgotania pod zamontowaną próbką agaru.

2. Suszenie makrokolonii bakterii C. difficile + E. faecalis w otoczeniu

  1. Usuń kolonie bakterii agarozowych zamontowane na szkiełkach mikroskopowych pokrytych ITO z materiału opakowaniowego. Umieścić próbki w suchym pudełku ze środkiem osuszającym na 48-72 godziny w temperaturze pokojowej.
    UWAGA: Jest to łagodny i powolny proces schnięcia, który minimalizuje bulgotanie, pękanie lub odklejanie się podłoża agarowego od powierzchni szkiełka mikroskopowego.
  2. Prawidłowo zutylizuj wszystkie zanieczyszczone materiały opakowaniowe i odkaż miejsce pracy odpowiednim bakteriobójczym/sporobójczym środkiem dezynfekującym.
  3. Sprawdzić wzrokowo kolonie pod kątem deformacji powierzchni agaru (np. bulgotanie, pękanie, demontaż).
    UWAGA: Wysokość powierzchni agarozy powinna widocznie się zmniejszać i leżeć płasko w poprzek szkiełka.

3. Suszenie próżniowe i cieplne makrokolonii bakterii C. difficile + E. faecalis

UWAGA: Specjalnie skonstruowane urządzenie do suszenia próżniowego (Rysunek 1) zostało zbudowane w celu ułatwienia usuwania nadmiaru wilgoci z próbek agaru. Urządzenie to wykorzystuje rotacyjną łopatkową pompę próżniową podłączoną liniowo do biofiltra HEPA, wymrażarki i komory ze stali nierdzewnej, w której umieszczane są próbki bakterii. Transformator o zmiennym napięciu jest podłączony do izolowanego włókna drucianego, co pozwala użytkownikowi na podgrzanie komory w celu przyspieszenia procesu suszenia.

  1. Zamknij przewód podciśnieniowy do komory na próbkę i włącz wyłącznik zasilania pompy łopatkowej, aby umożliwić pompie próżniowej rozgrzanie się i osiągnięcie odpowiedniego ciśnienia podciśnienia.
  2. Włącz transformator o zmiennym napięciu, aby podgrzać żarnik drutu owinięty wokół komory. Wyreguluj zmienne zasilanie, aż temperatura wewnętrzna komory próżniowej osiągnie ~50 °C. Podczas nagrzewania się pompy umieść zawiesinę suchego lodu i 100% etanolu w skraplaczu zimnej wymrażarki.
    UWAGA: Wymrażarka skrapla wszelkie opary lub zarodniki z próbki i zapobiega zanieczyszczeniu układu pompy łopatkowej i oleju pompy próżniowej.
  3. Otwórz komorę próżniową za pomocą klucza, aby poluzować kołnierz z podwójnym pazurem 16 mm clamps. Włóż próbki agarozy do komory i szczelnie zamknij komorę za pomocą 16 mm dwukłowych zacisków kołnierzowych.
  4. Otwórz zawór pompy, aby opróżnić komorę. Pozostawić próbki do wyschnięcia na 60-120 minut (np. w temperaturze ~150 mTorr).
    UWAGA: Ten czas schnięcia jest wystarczający do usunięcia większości wilgoci z małych kawałków agaru. Empiryczne określenie optymalnego czasu suszenia w celu usunięcia wilgoci i zmniejszenia wysokości agaru może być konieczne w zależności od indywidualnej konfiguracji i próbek. Znacznie dłuższy czas schnięcia może spowodować, że wysuszony agar stanie się kruchy i podatny na pękanie.
  5. Po zakończeniu powoli odpowietrz komorę próżniową do ciśnienia otoczenia, zamykając zawór na pompie łopatkowej i otwierając zawór zewnętrzny na powietrze z otoczenia. Otworzyć komorę zgodnie z wcześniej wymienionym protokołem i wyjąć z niej wysuszoną próbkę agarozy.
  6. Przechowywać próbkę w suchym pudełku ze środkiem osuszającym do czasu aplikacji matrycy.
    UWAGA: Rysunek 2 pokazuje obrazy powierzchni agaru przed i po wysuszeniu.

4. Aplikacja matrycy MALDI za pomocą zrobotyzowanego natryskiwania

UWAGA: Po dokładnym wysuszeniu próbek agarozy i zauważalnym zmniejszeniu wysokości sekcji hodowli, użyj automatycznego rozpylacza matrycy, aby równomiernie nałożyć cienką warstwę chemicznego związku matrycy MALDI. Procedura ta powinna być wykonywana w dygestorium chemicznym i przy użyciu odpowiedniego sprzętu ochrony osobistej, w tym rękawiczek, okularów laboratoryjnych i fartucha laboratoryjnego.

  1. Wybierz odpowiednią macierz MALDI. Aby postępować zgodnie z tym protokołem, należy użyć matrycy MALDI 1,5-diaminonaftalenu (DAN) w celu korzystnej desorpcji i jonizacji aminokwasów w trybie jonów ujemnych.
  2. Przygotować 10 ml roztworu matrycowego o stężeniu 10 mg/ml DAN MALDI w roztworze 90/10 (v/v) acetonitryl/woda. Użyj rozpuszczalników klasy HPLC, sonikuj przez 30 minut i przefiltruj roztwór przez nylonowe filtry strzykawkowe 0,2 μm przed wprowadzeniem do pompy strzykawkowej z opryskiwaczem automatycznym. Dodatkowo przygotuj roztwory myjące, aby upewnić się, że przewód opryskiwacza jest czysty między każdym użyciem.
    UWAGA: Roztwory myjące dobierane są w celu zwiększenia rozpuszczalności matrycy i innych zanieczyszczeń w przewodzie opryskiwacza oraz ułatwienia ich usuwania z układu. Roztwory myjące stosowane w niniejszym dokumencie to 90/10 (v/v) acetonitryl/woda, 50/50 (v/v) woda/metanol, 99/1 (v/v) acetonitryl/kwas octowy i 95/5 (v/v) woda/wodorotlenek amonu.
  3. Przymocuj próbkę do tacki opryskiwacza i załaduj przygotowane roztwory do linii opryskiwacza ( Rysunek 3). Za pomocą oprogramowania komputerowego określ niezbędne parametry, które pozwolą na równomierne pokrycie masy matrycowej: 30 °C temperatura dyszy, osiem ciągów, natężenie przepływu 0,1 ml/min, wzór CC, czas schnięcia 0 s, 10 psi.
    UWAGA: Ogólnie przyjmuje się, że większość patogenów zostanie inaktywowana przez zastosowanie matrycy MALDI, która jest zazwyczaj małym kwasem organicznym lub zasadą.
  4. Po zakończeniu sekwencji rozpylania wyjmij próbkę z tacki opryskiwacza i przechowuj w komorze osuszającej do czasu analizy.

5. Przygotowanie makrokolonii bakteryjnych do akwizycji danych ze spektrometrii mas obrazowania MALDI

UWAGA: Wszystkie analizy spektrometrii mas obrazowania zostały wykonane przy użyciu spektrometru masowego rezonansu jonów jonowych z transformacją Fouriera (FTICR). Przyrząd ten wyposażony jest w system laserowy Nd:YAG MALDI (2 kHz, 355 nm).

  1. Włóż próbkę pokrytą matrycą do adaptera szkiełka mikroskopowego MALDI z płytką docelową i narysuj co najmniej trzy znaczniki referencyjne, które obejmują obszar próbki, za pomocą markerów permanentnych (Rysunek 4). Użyj skanera płaskiego, aby uzyskać optyczny obraz szkiełka mikroskopowego wraz ze znacznikami odniesienia.
    UWAGA: Znaczniki odniesienia pozwolą na rejestrację obrazu optycznego w kamerze MALDI view obserwowany w instrumencie.
  2. Zdefiniuj metodę przyrządu MS zoptymalizowaną pod kątem pożądanego zakresu masy, czułości i rozdzielczości, która obejmuje kalibrację masy, ustawienia lasera MALDI, parametry optyki jonowej i warunki ogniwa ICR. Dla tej metody należy wybrać okno masowe 100 Da od m/z 100 do 200 dla wzbogacania sygnału fazy gazowej w trybie jonów ujemnych przy użyciu podejścia ciągłej akumulacji wybranych jonów (CASI), 23, które obejmuje wartości m/z metabolitów będących przedmiotem zainteresowania.
  3. Otwórz oprogramowanie do akwizycji obrazu instrumentu i użyj kreatora konfiguracji, aby zdefiniować nazwę i lokalizację pliku, metodę akwizycji MS, obszary zainteresowania do próbkowania oraz rozdzielczość przestrzenną obrazu.
    UWAGA: Rozdzielczości przestrzenne 100-300 μm są zwykle stosowane do obrazowania makrokolonii bakteryjnych.
  4. Po zdefiniowaniu wszystkich parametrów rozpocznij sekwencję akwizycji, aby szeregowo uzyskać widmo masowe dla każdego piksela w zdefiniowanych obszarach zainteresowania.
    UWAGA: Czas akwizycji obrazu zależy od ustawień instrumentu, ale zwykle wynosi od 2 do 6 godzin w przypadku obrazów zawierających 5 000-10 000 pikseli.

6. Obrazowanie, spektrometria mas, analiza danych i identyfikacja związków

  1. Po pobraniu obrazu zapisz dane z rozszerzeniem pliku ".mis", które jest formatem pliku specyficznym dla dostawcy dla platform obrazowania spektrometrii mas. Otwórz plik danych w pakietach oprogramowania flexImaging lub SCiLS lub wyeksportuj go do niezastrzeżonego formatu danych, takiego jak .mzml i wizualizuj za pomocą oprogramowania niezależnego od dostawcy (np. Cardinal24 lub MSIreader25,26).
    UWAGA: Po otwarciu danych obrazowania w programie flexImaging wyświetlane jest średnie widmo masowe, które reprezentuje średnie intensywności wszystkich jonów wykrytych w próbkowanych regionach. Interesujące piki można wstępnie zidentyfikować na podstawie dokładnych pomiarów masy. Zazwyczaj dokładność masy lepsza niż 5 części na milion (ppm) jest wystarczająca do identyfikacji metabolitów za pomocą spektrometrów masowych FTICR.
  2. Korzystając z przywołanego oprogramowania, zdefiniuj okna masy dla pików zainteresowania, aby wygenerować mapy cieplne rozkładów jonów w sztucznych kolorach w próbkowanych regionach.
    1. Na ekranie widma średniej masy powiększ obraz do interesującego go piku i wybierz odpowiednie okno masy, które obejmuje obszar profilu piku.
    2. Kliknij prawym przyciskiem myszy podświetlone okno masowe i wybierz Dodaj filtr masowy.... Oznaczyć wybraną wartość m/z, korzystając ze wstępnej identyfikacji podejrzewanego metabolitu, zgodnie z dokładnym pomiarem masy o wysokiej rozdzielczości.
    3. Wybierz próg intensywności, aby dostosować zakres dynamiczny obrazu analitu wyświetlanego przez mapę cieplną w sztucznych kolorach. Następnie dostosuj parametry filtrowania masowego tak, aby okno bryły obejmowało obszar profilu piku, a następnie dodaj filtr masowy.
      UWAGA: Normalizację intensywności można przeprowadzić w razie potrzeby, aby poprawić względną kwantyfikację w mierzonych regionach. W eksperymentach wykorzystano akwizycję danych CASI (vide infra), co może spowodować, że metody normalizacji całkowitej liczby jonów (TIC) i średniej kwadratowej (RMS) będą niedokładne. W związku z tym wszystkie obrazy jonów pokazane w niniejszym dokumencie są wyświetlane bez normalizacji.

7. Przygotowanie i wysyłka niezakażonych tkanek kontrolnych i zakażonych C. difficile mysich tkanek jelita ślepego

  1. Inokulować 4-8-tygodniowe samce myszy C57BL/6 antybiotykami (0,5 mg/ml cefoperazonu lub 0,5 mg/ml cefoperazonu + 1 mg/ml wankomycyny) w wodzie pitnej ad libitum przez 5 dni, po czym następuje 2-dniowy okres rekonwalescencji i następująca infekcja.
  2. Poddaj zwierzęta eutanazji przez asfikację CO2 i natychmiast zbierz narząd jelita ślepego myszy. Zanurzyć w 20% mieszaninie związku o optymalnej temperaturze cięcia (OCT) w wodzie destylowanej.
  3. Umieścić próbki na suchym lodzie, a następnie zapakować i wysłać do analizy; przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu analizy.

8. Kriosekcja niezakażonych tkanek jelita ślepego myszy verus C. difficile

  1. Wyczyść cały sprzęt do kriosekcji, spłukując go 100% etanolem i pozostaw do wyschnięcia przed umieszczeniem próbek w komorze kriostatu. Przygotuj szkiełka mikroskopowe z powłoką ITO, używając omomierza, aby zidentyfikować stronę szkiełka z powłoką przewodzącą. Użyj rysika z diamentową końcówką, aby wytrawić i oznaczyć stronę szkiełka mikroskopowego pokrytą ITO.
    UWAGA: Należy nosić odpowiednie środki ochrony osobistej, w tym rękawice, okulary laboratoryjne, fartuch laboratoryjny i rękawy kriostatu.
  2. Wykonaj kriosekcję na kriomikrotomie badawczym. Przenieść tkanki jelita ślepego myszy osadzone w OCT z zamrażarki o temperaturze -80 °C do komory kriomikrotomu (temperatura komory 30 °C, temperatura obiektu -28 °C) na suchym lodzie. Zamontuj próbki tkanek, które mają być porównane za pomocą obrazowej spektrometrii mas (np. niezakażona kontrola vs. zakażona C. difficile) na tym samym szkiełku mikroskopowym, aby zapewnić identyczne przygotowanie próbki obu typów tkanek i umożliwić dokładne porównania metabolitów.
  3. Wewnątrz komory kriomikrotomu zamontuj tkankę osadzoną w OCT na uchwycie na próbkę za pomocą dodatkowego roztworu OCT. Po zestaleniu się roztworu OCT przymocuj uchwyt do głowicy próbki. Rozpocznij kriosekcję w krokach co 10-50 μm, aby osiągnąć pożądaną głębokość/płaszczyznę tkanki narządu.
  4. Po osiągnięciu optymalnego przekroju poprzecznego tkanki należy rozpocząć pobieranie skrawków o grubości 12 μm. Delikatnie manipuluj plasterkiem za pomocą pędzli artystycznych i umieść go na pokrytym teflonem szkiełku mikroskopowym.
  5. Przetocz szkiełko mikroskopowe z powłoką ITO na część tkanki, aby pobrać tkankę ze szkiełka pokrytego teflonem. Rozmrozić Zamontuj wycinek tkanki na szkiełku mikroskopowym, dociskając dłoń do tylnej części szkiełka pokrytego ITO. Kontynuuj rozmrażanie, aż część tkanki zmieni się z półprzezroczystej w nieprzezroczystą/matową.
  6. Przenieść szkiełka mikroskopowe zamontowane na tkankach na suchym lodzie do suchego pudełka ze środkiem osuszającym w celu przechowywania do analizy tego samego dnia lub przechowywać w temperaturze -80 °C do dłuższego przechowywania.

9. Przygotowanie niezakażonych tkanek jelita ślepego myszy zakażonych C. difficile do aplikacji matrycowej i spektrometrii mas obrazowania MALDI

  1. Wykonaj aplikację matrycy MALDI przy użyciu tego samego protokołu, który opisano w kroku 4 (temperatura dyszy 30 ° C, osiem ciągów, natężenie przepływu 0,1 ml/min, wzór CC, czas schnięcia 0 s, 10 psi).
  2. Wykonaj obrazowanie MALDI spektrometrii mas przy użyciu tych samych protokołów, które opisano w krokach 5 i 6.
  3. Przeanalizuj obrazy jonów z wielu kontrprób biologicznych i porównaj wyniki pod kątem istotności za pomocą porównań na wykresie pudełkowym intensywności przy użyciu oprogramowania statystycznego SCiLS, o którym mowa powyżej.
    UWAGA: Odpowiednie testy i porównania statystyczne będą zależeć od zastosowania i mogą obejmować segmentację przestrzenną, modele klasyfikacyjne i analizę porównawczą w celu określenia dyskryminacyjnych i skorelowanych cech spektralnych. Analizy porównawcze mogą obejmować przypisywanie wartości p do istotnych cech, generowanie analiz głównych składowych do porównań tkanek oraz wizualizację wykresów pudełkowych w celu identyfikacji zmian. Przydatna jest również wizualizacja tkanki za pomocą mikroskopii jasnego pola wycinka tkanki wybarwionego hematoksyliną i eozyną (H&E) po obrazowaniu spektrometrii mas. Umożliwia to wyraźną identyfikację cech morfologicznych w tkance i może być analizowane w porozumieniu z przeszkolonym patologiem.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Przeprowadziliśmy obrazowanie spektrometrią mas MALDI metabolitów modelowych kolonii bakteryjnych oraz myszy współkolonizowanych przez E. faecalis i C. difficile, aby zbadać rolę aminokwasów w oddziaływaniach między drobnoustrojami. Bakteryjne makrokolonie hodowane na agarze służą jako dobrze zdefiniowany model do analizy odrębnych zmian biochemicznych w tworzeniu biofilmu bakteryjnego. Ważne jest zapewnienie kontrolowanego procesu suszenia makrokolonii kultur bakteryjnych hodowanych na podłożach agarow...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Podczas obrazowania spektrometrii mas MALDI ważne jest, aby mieć płaską powierzchnię próbki, aby zapewnić stałą średnicę ogniskowej padającego lasera MALDI na podłoże próbki. Odchylenia w wysokości próbki mogą powodować przesunięcie wiązki laserowej MALDI w celu przesunięcia ostrości, powodując zmiany średnicy i intensywności wiązki, co może wpłynąć na wydajność jonizacji MALDI. Te zmiany w wydajności jonizacji mogą powodować różnice w intensywności analitu na powierzchni tkanki, które nie odzwierciedlają biochemii tkank...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez National Institutes of Health (NIH) National Institute of General Medical Sciences (NIGMS) w ramach nagrody GM138660. J.T.S. był wspierany przez Charles and Monica Burkett Family Summer Fellowship z University of Florida. J.P.Z. był wspierany przez granty NIH K22AI7220 (NIAID) i R35GM138369 (NIGMS). A.B.S. był wspierany przez Cell and Molecular Biology Training Grant na University of Pennsylvania (T32GM07229).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,2 μ m Nylonowe filtry strzykawkowe Titan3Thermo Scientific42225-NN
1,5-diaminonaftalen matryca MALDISigmaAldrich 2243-62-1
20 mL Strzykawki Henke Ject luer lockHenke Sass Wolf4200.000V0 
Wakuometr konwekcyjny serii 275iFirma Kurt J. LeskerKJL275807LL
spektrometr masowy 7T solariX FTICR wyposażony w system laserowy Smartbeam II Nd:YAG MALDI (2 kHz, 355 nm) Bruker Daltonics
Roztwór kwasu octowego, odpowiedni do HPLCSigma Aldrich64-19-7
Acetonitryl, odpowiedni do HPLC, stopień gradientowy, ≥ 99,9%Sigma Aldrich75-05-8
Roztwór wodorotlenku amonu, 28% NH3 w H2O, ≥ 99,99% na bazie metali śladowychSigma Aldrich1336-21-6
Autoklawowalne worki na zagrożenia biologiczne: 55 galonówWorkiGrainger 45TV10
(8 x 8 cali)Fisher Scientific01-800-07
Rosół z naparem z serca do mózguBD Biosciences90003-040
C57BL/6 samców myszy Jackson Laboratories
CanoScan 9000F Mark II skaner fotograficzny i dokumentowyKriomikrotom
CM 3050SLeica Biosystems
Sigma AldrichZ268135
Rysik z diamentową końcówką, Nauki o mikroskopii elektronowej Fisher Scientific50-254-51
Granulki środka osuszającegoDrierite21005
Etanol, 200 ProofDecon Labs2701
flexImagingOprogramowanie Bruker Daltonics
Szklany pułapka próżniowaSigma AldrichZ549460
Zrobotyzowany opryskiwacz HTX M5 TMHTX Technologies
pokryte tlenkiem indu i cyny (ITO) DeltaTechnologiesCG-81IN-S115
Liniowy filtr HEPA do pompy próżniowejLABCONCO7386500
Metanol, klasa HPLCFisher Chemical  67-56-1
Adapter suwaka MTP IIBruker Daltonics235380
Związek o optymalnej temperaturze cięcia (OCT)Fischer Scientific23-730-571
Peridox RTU Środek sporobójczy, dezynfekujący i czyszczącyCONTECCR85335 
Preparaty drukowane z PTFE (teflonu), Nauki o mikroskopii elektronowejVWR100488-874
Obrotowa łopatkowa pompa próżniowa RV8EdwardsA65401903
Tissue-Tek Accu-Edge Jednorazowe wysokoprofilowe ostrza mikrotomuMikroskopia elektronowa Sciences63068-HP
Przezroczyste rurki próżnioweCole PalmerEW-06414-30
Ultragrade 19 olej do pompy próżniowejEdwardsH11025011
Transformator zmiennego napięciaPowerstat
Woda, odpowiedni do HPLCSigma Aldrich7732-18-5
Kolba Dewara z szerokim otworemSigmaAldrich Z120790
do transportu próbek Biohazard badawczy Canon Szafa eksykatorowa Oprogramowanie do obrazowania ftmsOprogramowanie sterujące Bruker Daltonics Szkiełka mikroskopowe

Bibliografia

  1. Biteen, J. S., et al. Tools for the microbiome: nano and beyond. ACS Nano. 10 (1), 6-37 (2016).
  2. Shreiner, A. B., Kao, J. Y., Young, V. B. The gut microbiome in health and in disease. Current Opinion in Gastroenterology. 31 (1), 69-75 (2015).
  3. Watrous, J. D., Alexandrov, T., Dorrestein, P. C. The evolving field of imaging mass spectrometry and its impact on future biological research. Journal of Mass Spectrometry. 46 (2), 209-222 (2011).
  4. Gessel, M. M., Norris, J. L., Caprioli, R. M. MALDI imaging mass spectrometry: spatial molecular analysis to enable a new age of discovery. Journal of Proteomics. 107, 71-82 (2014).
  5. Fang, J., Dorrestein, P. C. Emerging mass spectrometry techniques for the direct analysis of microbial colonies. Current Opinion in Microbiology. 19, 120-129 (2014).
  6. Wheatcraft, D. R. A., Liu, X., Hummon, A. B. Sample preparation strategies for mass spectrometry imaging of 3D cell culture models. Journal of Visualized Experiments. (94), e52313(2014).
  7. Zink, K. E., Dean, M., Burdette, J. E., Sanchez, L. M. Capturing small molecule communication between tissues and cells using imaging mass spectrometry. Journal of Visualized Experiments. (146), e59490(2019).
  8. Li, H., Hummon, A. B. Imaging mass spectrometry of three-dimensional cell culture systems. Analytical Chemistry. 83 (22), 8794-8801 (2011).
  9. Watrous, J. D., Dorrestein, P. C. Imaging mass spectrometry in microbiology. Nature Reviews Microbiology. 9 (9), 683-694 (2011).
  10. Dunham, S. J. B., Ellis, J. F., Li, B., Sweedler, J. V. Mass spectrometry imaging of complex microbial communities. Accounts of Chemical Research. 50 (1), 96-104 (2017).
  11. Frydenlund Michelsen, C., et al. Evolution of metabolic divergence in Pseudomonas aeruginosa during long-term infection facilitates a proto-cooperative interspecies interaction. Multidisciplinary Journal of Microbial Ecology. 10 (6), 1323-1336 (2016).
  12. Si, T., et al. Characterization of Bacillus subtilis colony biofilms via mass spectrometry and fluorescence imaging. Journal of Proteome Research. 15 (6), 1955-1962 (2016).
  13. Wakeman, C. A., et al. The innate immune protein calprotectin promotes Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus interaction. Nature Communications. 7, 11951(2016).
  14. Phelan, V. V., Fang, J., Dorrestein, P. C. Mass spectrometry analysis of Pseudomonas aeruginosa treated with azithromycin. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 26 (6), 873-877 (2015).
  15. Ferreyra, J. A., et al. Gut microbiota-produced succinate promotes C. difficile infection after antibiotic treatment or motility disturbance. Cell Host & Microbe. 16 (6), 770-777 (2014).
  16. Buffie, C. G., et al. Precision microbiome reconstitution restores bile acid mediated resistance to Clostridium difficile. Nature. 517 (7533), 205-208 (2015).
  17. Schubert, A. M., et al. Microbiome data distinguish patients with Clostridium difficile infection and non-C. difficile-associated diarrhea from healthy controls. mBio. 5 (3), 01021-01014 (2014).
  18. Auchtung, J. M., et al. Identification of simplified microbial communities that inhibit Clostridioides difficile infection through dilution/extinction. mSphere. 5 (4), 00387(2020).
  19. Zackular, J. P., et al. Dietary zinc alters the microbiota and decreases resistance to Clostridium difficile infection. Nature Medicine. 22 (11), 1330-1334 (2016).
  20. Tomkovich, S., Stough, J. M., Bishop, L., Schloss, P. D. The initial gut microbiota and response to antibiotic perturbation influence Clostridioides difficile clearance in mice. mSphere. 5 (5), 00869(2020).
  21. Hoffmann, T., Dorrestein, P. C. Homogeneous matrix deposition on dried agar for MALDI imaging mass spectrometry of microbial cultures. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 26 (11), 1959-1962 (2015).
  22. Yang, J. Y., et al. Primer on agar-based microbial imaging mass spectrometry. Journal of Bacteriology. 194 (22), 6023-6028 (2012).
  23. Prentice, B. M., et al. Dynamic range expansion by gas-phase ion fractionation and enrichment for imaging mass spectrometry. Analytical Chemistry. 92 (19), 13092-13100 (2020).
  24. Bemis, K. D., et al. Cardinal: an R package for statistical analysis of mass spectrometry-based imaging experiments. Bioinformatics. 31 (14), 2418-2420 (2015).
  25. Robichaud, G., Garrard, K. P., Barry, J. A., Muddiman, D. C. MSiReader: An open-source interface to view and analyze high resolving power MS imaging files on Matlab platform. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 24 (5), 718-721 (2013).
  26. Bokhart, M. T., Nazari, M., Garrard, K. P., Muddiman, D. C. MSiReader v1.0: Evolving open-source mass spectrometry imaging software for targeted and untargeted analyses. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 29 (1), 8-16 (2018).
  27. Smith, A. B., et al. Enterococci enhance Clostridioides difficile Pathogenesis. Nature. , (2022).
  28. Korte, A. R., Lee, Y. J. MALDI-MS analysis and imaging of small molecule metabolites with 1,5-diaminonaphthalene (DAN). Journal of Mass Spectrometry. 49 (8), 737-741 (2014).
  29. Hankin, J. A., Barkley, R. M., Murphy, R. C. Sublimation as a method of matrix application for mass spectrometric imaging. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 18 (9), 1646-1652 (2007).
  30. Thomas, A., Charbonneau, J. L., Fournaise, E., Chaurand, P. Sublimation of new matrix candidates for high spatial resolution imaging mass spectrometry of lipids: Enhanced information in both positive and negative polarities after 1,5-diaminonapthalene deposition. Analytical Chemistry. 84 (4), 2048-2054 (2012).
  31. Huizing, L. R., et al. Development and evaluation of matrix application techniques for high throughput mass spectrometry imaging of tissues in the clinic. Clinical Mass Spectrometry. 12, 7-15 (2019).
  32. Anderton, C. R., Chu, R. K., Tolić, N., Creissen, A., Paša-Tolić, L. Utilizing a robotic sprayer for high lateral and mass resolution MALDI FT-ICR MSI of microbial cultures. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 27 (3), 556-559 (2016).
  33. Gilmore, M. S., Clewell, D. B., Ike, Y., Shankar, N. Enterococci: From commensals to leading causes of drug resistant infection. Massachusetts Eye and Ear Infirmary. , Boston. (2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Analiza MALDIhodowle na agarzemodele infekcji tkanekmapowanie metabolit wmetabolity aminokwas wkriosekcjonowanie tkanekmetabolizm przestrzenny
Badanie współpracy mikrobiologicznej poprzez obrazową analizę spektrometrii mas kolonii bakteryjnych hodowanych na agarze i w tkance podczas infekcji
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.