C. elegans (C. elegans) Rozwarstwienie gonad i pęknięcie zamrażające do barwienia immunofluorescencyjnego i DAPI

Podsumowanie

To jest powszechnie stosowana metoda do sekcji gonad C. elegans, po której następuje pęknięcie zamrażające, która wytwarza próbki linii zarodkowej do immunofluorescencji poprzez barwienie przeciwciał, lub do prostego barwienia DAPI w celu wizualizacji DNA. Protokół ten okazał się skuteczny w przypadku studentów studiów licencjackich w laboratorium badawczym i w ramach badań licencjackich opartych na kursach.

Streszczenie

Linia zarodkowa C. elegans stanowi doskonały model do badania mejozy, częściowo ze względu na łatwość przeprowadzania analiz cytologicznych na wypreparowanych zwierzętach. Preparaty całych wierzchowców zachowują strukturę jąder mejotycznych, a co ważne, każde ramię gonady zawiera wszystkie etapy mejozy, zorganizowane w progresję czasowo-przestrzenną, która ułatwia identyfikację jąder na różnych etapach. Dorosłe hermafrodyty mają dwa ramiona gonad, z których każde jest zorganizowane jako zamknięta rurka z proliferującymi komórkami macierzystymi linii rozrodczej na dystalnym zamkniętym końcu i komórkowymi oocytami na bliższym otwartym końcu, które łączą się w środku macicy. Rozwarstwienie uwalnia jedno lub oba ramiona gonady z jamy ciała, umożliwiając wizualizację całej mejozy. W tym miejscu przedstawiono powszechny protokół immunofluorescencji przeciwko białku będącemu przedmiotem zainteresowania, a następnie barwienie DAPI w celu oznaczenia wszystkich chromosomów. Młodzi dorośli są unieruchamiani w lewamizolu i szybko wycinani za pomocą dwóch igieł strzykawkowych. Po wytłoczeniu linii zarodkowej próbka jest utrwalana przed poddaniem jej pękaniu zamrażającemu w ciekłym azocie, co pomaga w przepuszczalności naskórka i innych tkanek. Próbkę można następnie odwodnić w etanolu, ponownie uwodnić i inkubować z przeciwciałami pierwszorzędowymi i drugorzędowymi. DAPI jest dodawany do próbki w podłożu montażowym, co umożliwia wiarygodną wizualizację DNA i ułatwia znalezienie zwierząt do zobrazowania pod mikroskopem fluorescencyjnym. Technika ta jest chętnie stosowana przez osoby zaznajomione z obchodzeniem się z C. elegans po kilku godzinach spędzonych na ćwiczeniu samej metody sekcji. Protokół ten został nauczony uczniom szkół średnich i studentom pracującym w laboratorium badawczym i włączony do opartego na kursie doświadczenia badawczego na studiach licencjackich w college'u sztuk wyzwolonych.

Wprowadzenie

Mejoza to wyspecjalizowany podział komórek używany do tworzenia gamet (jaj i plemników/pyłku) we wszystkich organizmach rozmnażających się płciowo^1,2. Rekombinacja krzyżowa to wzajemna wymiana DNA między chromosomami homologicznymi; Jest niezbędna dla mejozy, zarówno stanowiąc ważne źródło różnorodności genetycznej, jak i promując stabilność genomu przez pokolenia. Chromosomy, które nie utworzą co najmniej jednego skrzyżowania podczas mejozy, będą segregować losowo, co może skutkować brakiem dysjunkcji chromosomów, tworząc gamety o nieprawidłowej liczbie chromosomów – stan, który zwykle jest śmiertelny dla powstałego potomstwa³. Podczas mejozy krzyżowanie się jest indukowane przez zaprogramowane dwuniciowe pęknięcia DNA⁴. Podzbiór tych pęknięć zostanie naprawiony jako skrzyżowania, które zapewniają fizyczne połączenia DNA, zwane chiasmata, które pomagają orientować chromosomy homologiczne w przygotowaniu do podziału komórki⁵. Stadia mejotyczne są wysoce konserwatywne u wszystkich eukariontów, a ich konformacja chromosomalna pozwala na ich łatwą identyfikację.

Jako podstawowe pojęcie w biologii, mejoza jest tematem, z którym studenci spotykają się wiele razy na różnych kursach biologii. Często są wprowadzani w mechanikę segregacji chromosomów mejotycznych w szkole średniej, podczas gdy kursy na poziomie college'u koncentrują się na biologii komórki segregacji i genetycznym wpływie rekombinacji krzyżowej. Jednak mejoza jest bardzo trudnym pojęciem dla wielu studentów¹. Niezrozumienie związku między genami, DNA, chromosomami i mejozą może generować błędne przekonania uczniów i luki w zrozumieniu, które utrudniają pełne zrozumienie dziedziczenia genetycznego^6,7. Jednym ze sposobów na poprawę zrozumienia przez uczniów abstrakcyjnych tematów jest zapewnienie konkretnych, praktycznych zajęć. Na przykład, ucząc mejozy, instruktorzy mogą wybierać spośród ćwiczeń, które emulują analizę molekularną⁸, modeli 3D, które pozwalają uczniom manipulować cząsteczkami⁹, lub odgrywania ról, w których uczniowie sami odgrywają choreografię molekularną¹. Włączenie badań o nieznanych wynikach jest szczególnie skutecznym sposobem na poprawę zrozumienia przez uczniów. Praktyka ta jest znana jako doświadczenie badawcze na studiach licencjackich (CURE) i ma dodatkową zaletę w postaci wzmocnienia postaw i sprawczości studentów, szczególnie w przypadku osób należących do grup, które pozostają niedostatecznie reprezentowane w klasie STEM10^,11. Nicienie Caenorhabditis elegans są szczególnie podatne na badania nad zachowaniem, płodnością i krzyżówkami genetycznymi w klasie, a także są skutecznym modelem wprowadzającym uczniów do badań biologicznych¹².

C. elegans tworzy potężny organizm modelowy dla biologii komórki, łącząc genetykę molekularną z prostą analizą cytologiczną. Szczególnie dobrze nadaje się również do użytku w klasie biologicznej ^13,14,15. Są łatwe i ekonomiczne w utrzymaniu w laboratorium, produkując setki potomstwa co 3 dni, zarówno w standardowej temperaturze pokojowej, jak i w 20 °C, najczęstszej temperaturze inkubacji. Co ważne, można je zamrozić w postaci zapasu glicerolu i przechowywać w zamrażarce o temperaturze -80 °C, co oznacza, że wszelkie błędy hodowlane popełnione przez początkujących badaczy można łatwo poprawić¹⁶. Co więcej, jego dobrze opisany genom pozwala na stosowanie technik genetycznych do przodu i do tyłu^17,18, co pozwala na wykorzystanie C. elegans do rozwiązywania problemów biologicznych, od molekularnych po ewolucyjne. Wreszcie, badacze C. elegans stworzyli wspierającą społeczność, która często jest chętna do udzielania pomocy i porad początkującym naukowcom¹⁹. Te zalety doprowadziły do tego, że C. elegans został włączony do wielu CUREs w różnych typach instytucji^{12,19,20,21,22,23}.

Oprócz korzyści dla badań i nauczania, C. elegans stał się popularnym modelem do badań nad mejozą i rozwojem linii zarodkowej^24,25,26. Przejrzystość optyczna tych zwierząt upraszcza podejścia cytologiczne²⁷, a u dorosłych gonady stanowią prawie połowę zwierzęcia, dostarczając setki komórek mejotycznych do badania. W gonadach jądra mejotycznej linii zarodkowej są ułożone jak linia montażowa (Ryc. 1); Replikacja mitotyczna zachodzi na dystalnym końcu gonady, a jądra przechodzą przez etapy mejotyczne, migrując w kierunku bliższego końca gonady, gdzie zapłodnione zarodki wyłaniają się ze sromu. Ponieważ stereotypowa organizacja przestrzenna reprezentuje również postęp czasowy poprzez mejozę, różne etapy można łatwo zidentyfikować na podstawie ich organizacji chromosomalnej i lokalizacji w gonadzie. Wreszcie, procesy, które zaburzają mejozę i powodują aneuploidię, tworzą fenotypy, które są łatwe do scharakteryzowania, nawet dla nowicjuszy: bezpłodność, śmiertelność embrionalna lub wysoka częstość występowania samców (fenotyp Him)²⁸.

To jest prosty protokół do wizualizacji chromosomów mejotycznych u C. elegans. Montaż, rozwarstwienie, utrwalanie i barwienie przeciwciał są wykonywane na tym samym szkiełku mikroskopowym, co upraszcza protokół i umożliwia niemal idealne odzyskanie próbki. Ta metoda działa w przypadku prostego barwienia DAPI w celu wizualizacji chromosomów i może być stosowana do immunofluorescencji w celu wizualizacji lokalizacji białek w gonadzie. Studenci analizują gonady za pomocą podstawowych mikroskopów preparacyjnych, generują preparaty do wizualizacji DNA lub immunofluorescencji w całości i obrazują je na złożonym mikroskopie fluorescencyjnym. Protokół ten został nauczony uczniom szkół średnich i studentom pracującym w laboratorium badawczym C. elegans i włączony do CURE w college'u sztuk wyzwolonych¹². Chociaż CURE miał stosunkowo małą liczebność klas, protokół ten byłby dostępny dla zajęć w wielu instytucjach ze względu na stosunkowo niski koszt szczepów robaków i odczynników. Instruktorzy byliby ograniczeni jedynie liczbą dostępnych do użytku mikroskopów preparacyjnych. Poprzednie wdrożenie polegało na tym, że studenci pracowali w trzyosobowych grupach, aby dzielić się jednym mikroskopem i odbyło się w ciągu trzech 90-minutowych sesji: pierwsza polegała na ćwiczeniu sekcji, druga na implementacji sekcji i barwienia DAPI, a trzecia polegała na obrazowaniu preparatów pod szerokokątnym mikroskopem fluorescencyjnym. Udział w badaniach licencjackich przynosi studentom wiele korzyści^11,29, zarówno akademickich, jak i osobistych. Osadzenie badań w kursach za pośrednictwem CURE pozwala studentom uczestniczyć w badaniach w normalnych godzinach zajęć^11,30,31, co sprawia, że dostęp do tych korzyści jest bardziej dostępny i sprawiedliwy.

Protokół

1. Hodowla C. elegans

UWAGA: Zobacz protokół konserwacji C. elegans¹⁶ i Elgin et al.³², aby uzyskać więcej szczegółów. Szczepy C. elegans można łatwo nabyć w Caenorhabditis Genetics Center (https://cgc.umn.edu) i są wysyłane zwykłą pocztą do dowolnego miejsca w USA. Każdy szczep kosztuje 10 USD, a każde laboratorium / użytkownik płaci roczną opłatę w wysokości 30 USD.

1. Stosując sterylną technikę, przygotuj 6 cm płytki agarowe z podłożem do wzrostu nicieni (płytki agarowe NGM).
   UWAGA: Wylane talerze można przechowywać do góry nogami w oryginalnych plastikowych rękawach lub hermetycznych pojemnikach w temperaturze 4 °C przez kilka miesięcy.
   1. Aby zrobić płytki agarowe NGM, dodaj 3 g NaCl, 2,5 g peptonu Bacto, 20 g agaru NGM i ddH₂O do 1 l (~975 ml). Autoklawować pożywkę w cyklu cieczy, który utrzymuje się w temperaturze 121 °C przez 20 minut. Ostudzić do temperatury 55 °C i stosując sterylną technikę, dodać 1 ml cholesterolu, 0,5 ml 1 M CaCl₂, 1 ml 1 M_MgSO4 i 25 ml 1 M buforu fosforanu potasu (pH 6).
      UWAGA: Aby przygotować 1 M bufor fosforanu potasu, wymieszaj 108,3 g KH₂PO₄ (monozasadowy) i 35,6 g_K2HPO₄ (dwuzasadowy); w razie potrzeby dostosuj pH do 6 za pomocą KOH. Dodać ddH₂O do 1 L (zwykle ~900 mL) i sterylizować w autoklawie przez 40 minut w temperaturze 121 °C. 1 L NGM tworzy około 100 płytek zawierających 10 ml każda.
2. Za pomocą pipety serologicznej lub transferowej naniec na płytki trzy krople kultur bakterii E.coli OP50 (~150 μL). Staraj się umieszczać miejsca na środku płyty i unikaj umieszczania miejsc zbyt blisko krawędzi płytki; Zniechęci to zwierzęta do czołgania się po bokach talerzy i wysuszania.
3. Po wyschnięciu trawnika bakteryjnego przechowuj nakrapiane płytki do góry nogami w temperaturze pokojowej (RT) przez okres do 2 tygodni. Punktowe płytki co najmniej 1-2 dni przed użyciem pozwolą trawnikom bakteryjnym rosnąć grubsze i wspierać większe zagęszczenie zwierząt.
   UWAGA: Aby przygotować kultury bakterii OP50, OP50 można zamówić w Centrum Genetyki Caenorhabditis. Bakterie OP50 są przenoszone z wywaru glicerolu na płytkę LB w celu uzyskania pojedynczych kolonii i utrzymywane w temperaturze 4 °C przez 4-6 tygodni. Kultury bakterii OP50 są hodowane w LB przez noc w temperaturze 37 °C z jednej kolonii – nie jest potrzebne wytrząsanie. Aby przygotować pożywkę LB, dodać 10 g tryptonu, 10 g NaCl, 5 g ekstraktu drożdżowego, 950 ml ddH₂O, dostosować pH do 7 za pomocą 10 N NaOH i dostosować końcową objętość do 1 l za pomocą ddH₂O. Podwielokrotność podzielić na 100 ml ilości i sterylizować w autoklawie przez 20 minut w temperaturze 121 °C.
4. Aby stworzyć zapas roboczy dla każdego szczepu, wybierz trzy hermafrodyty w stadium L4 na nakrapianej płytce NGM. Przechowywać płytki w temperaturze 15-25 °C. Standardowe warunki hodowli to 20 °C. Jeśli dostęp do inkubatorów z kontrolowaną temperaturą nie jest możliwy, należy przechowywać kultury na stole w temperaturze RT.
   UWAGA: Hermafrodyty w stadium L4 mogą być łatwo zainscenizowane zarówno przez rozmiar (mniejszy niż dorosłe osobniki), jak i obecność wyraźnego półkola w połowie ich ciała (rozwijający się srom). W temperaturze 20 °C zwierzęta osiągają stadium L4 po 34–46 godzinach od wyklucia (czyli około 40–52 godzin po złożeniu zarodków). Zobacz Corsi et al.¹⁴, aby uzyskać więcej informacji na temat czasu etapów rozwojowych.
   1. Przenieś kultury do różnych temperatur, aby kontrolować tempo rozwoju. Zwierzęta będą rosły szybciej w wyższych temperaturach i wolniej w niższych temperaturach. Zaczną stawać się sterylne w temperaturach wyższych niż 25 °C.
      UWAGA: Niektóre zmutowane genotypy są wrażliwe na temperaturę i wykazują różne fenotypy w zależności od temperatury hodowli.
5. Utrzymuj zapasy robocze, zbierając trzy hermafrodyty w stadium L4 na nową nakrapianą płytkę NGM co 4 dni. W ten sposób zapewniona zostanie stała, dobrze odżywiona populacja o szerokim zakresie etapów rozwoju.

2. Rozwarstwienie gonad

1. Zbieranie dorosłych w tym samym wieku: 12-24 godziny przed sekcją należy pobrać hermafrodyty w stadium L4 na nową nakrapianą płytkę NGM – następnego dnia wyrastają one na młode osobniki dorosłe, które są idealne do sekcji. Liczba hermafrodytów w stadium L4 będzie zależeć od przeprowadzanej analizy cytologicznej; Zwykle na szkiełku przeprowadza się preparację 10-20 hermafrodytów, przy czym na każdy warunek generowane są od dwóch do czterech szkiełek.
   UWAGA: Gonady są najefektywniej wytłaczane u dobrze odżywionych zwierząt. Pamiętaj, aby wybrać hermafrodyty L4 z zapasów roboczych, które nie są głodzone (tj. Nadal mają widoczny trawnik bakteryjny obecny na talerzu). Wygłodzone zwierzęta mają tendencję do przechodzenia niepełnej ekstruzji gonad, co utrudnia ich wizualizację.
   1. Oceniając późniejsze etapy mejozy, takie jak diakineza, należy przeprowadzić sekcję osób starszych (48 godzin po L4), ponieważ gromadzą one więcej jąder w stadium dikinezy, upraszczając analizę. Naukowcy powinni jednak zwrócić uwagę na możliwość, że niektóre efekty mogą być spowodowane zaawansowanym wiekiem matki.
2. Przygotuj się do sekcji.
   1. Przygotowanie M9: Dodać 3 g KH₂PO₄ (monozasadowy), 6 g Na₂HPO₄ (dwuzasadowy), 5 g NaCl i dodać ddH₂O do 100 ml. Roztwór należy sterylizować w autoklawie przez 20 minut w temperaturze 121 °C, pozostawić do ostygnięcia, a następnie dodać 1 ml 1 M_MgSO4 przy użyciu sterylnej techniki.
   2. Przygotuj bufor preparacyjny: Wymieszaj 1 μl 10% Tween 20, 12 μl 100 mM lewamizolu, 10 μL 10x M9 i 77 μL ddH₂O.
      UWAGA: Tween 20 jest zawarty w buforze preparacyjnym w celu zmniejszenia napięcia powierzchniowego i dalszej przepuszczalności błon tkankowych.
   3. Przygotuj roztwór utrwalający (2% PFA [100 μL]): Wymieszaj 12,5 μl 16% paraformaldehydu (PFA), 10 μl 10x M9 i 77,5 μl ddH₂O; pamiętaj, aby użyć świeżej ampułki PFA (otwartej nie dłużej niż 2 tygodnie).
      UWAGA: PFA jest niebezpieczną substancją chemiczną, a roztwór utrwalający należy przygotować w dygestorium.
   4. Ustaw metodę zamrażania - ciekły azot jest łatwiejszy w zarządzaniu, ale w razie potrzeby na suchym lodzie można użyć aluminiowego bloku.
      1. Metoda ciekłego azotu: Umieść plastikową zlewkę lub plastikowy słoik Coplin w styropianowym pudełku. Napełnij zlewkę ciekłym azotem (przelew do pojemnika z polistyrenu jest w porządku). Ustaw pęsetę w pobliżu. Idealnie byłoby, gdyby zlewka była wystarczająco wąska, aby zapobiec całkowitemu opadaniu szkiełek mikroskopowych - szkiełka powinny leżeć pod kątem i być łatwe do uchwycenia pęsetą.
         UWAGA: Podczas pracy z ciekłym azotem ważne jest, aby używać plastikowych pojemników, a nie szkła, aby uniknąć stłuczenia z powodu szybkiego chłodzenia.
      2. Metoda suchego lodu:
         1. Umieść płaski aluminiowy blok na suchym lodzie w styropianowym pojemniku lub prostokątnym wiaderku na lód. Łatwiej jest zamrozić szkiełka, jeśli górna część bloku znajduje się nad górną częścią pojemnika.
         2. Zakładając rękawice, delikatnie dociśnij aluminiowy blok, aby zapewnić dobry kontakt z suchym lodem i przyspieszyć proces chłodzenia (może wydać pisk, gdy metal szybko się ochładza). Ustaw żyletkę w pobliżu.
         3. Pozostaw aluminiowy blok na suchym lodzie na co najmniej 30 minut przed zatrzymaniem pękania mrozowego, aby umożliwić pełne ostygnięcie, co jest niezbędne do szybkiego zamrożenia.
            UWAGA: Idealnie byłoby, gdyby używano solidnych bloków suchego lodu, co pomaga utrzymać powierzchnię równą. W razie potrzeby blok aluminiowy można umieścić na granulkach suchego lodu, ale należy zadbać o to, aby powierzchnia pozostała równa.
         4. Powierzchnia bloku aluminiowego będzie zbierać szron, co może zapobiec ścisłemu kontaktowi prowadnic z blokiem. Użyj żyletki, aby zeskrobać szron z powierzchni, oczyszczając obszar dla każdego slajdu. Przykrycie styropianowego pojemnika pokrywką pomoże zapobiec nadmiernemu gromadzeniu się szronu.
   5. Napełnij słoik Coplin ~40 ml 95% etanolu.
   6. Napełnij trzy słoiki Coplin ~40 ml PBS-T.
      UWAGA: Aby zrobić PBS-T, wymieszaj 100 ml 10x PBS, 5 ml Triton X-100 i 2 ml 0,5 M EDTA (pH 8). Dodać 873 ml ddH2O. Wstrząśnij energicznie, aby rozpuścić Triton X-100. Aby uzyskać 10x PBS, wymieszaj 25,6 g Na₂HPO₄·7H₂O, 80 g NaCl, 2 g KCl i 2 g KH₂PO₄. Dodać ddH₂O, aby zwiększyć objętość do 1 l. Autoklaw przez 40 minut w temperaturze 121°C. Detergent Triton X-100 jest zawarty w buforze do mycia PBS-T w celu zmniejszenia napięcia powierzchniowego i zwiększenia retencji całych zwierząt na szkiełku.
3. Rozwiń zwierzęta na szkiełku nakrywkowym o wymiarach 18 mm x 18 mm. Ten etap jest wrażliwy na czas ze względu na odparowanie bufora preparacyjnego. Zakończenie sekcji powinno zająć mniej niż 5 minut.
   UWAGA: Lewamizol służy do unieruchamiania zwierząt, aby ułatwić ich sekcję, ale pozostawienie ich w lewamizolu zbyt długo spowoduje słabą ekstruzję gonad. Najłatwiej jest zmniejszyć liczbę zwierząt poddanych sekcji na szkiełku, aby zmieścić się w 5-minutowym przedziale czasowym.
   1. Umieść szkiełko przytrzymujące na stoliku mikroskopu preparacyjnego - szkiełko przytrzymujące służy do łatwiejszego przesuwania szkiełka nakrywkowego i może być ponownie używane w nieskończoność (Rysunek 2A, zdjęcie po lewej).
   2. Umieścić szkiełko nakrywkowe na szkiełku przytrzymującym i odpipetować 4 μl roztworu preparacyjnego na środek szkiełka nakrywkowego. Przesuń suwak przytrzymujący na jedną stronę stołu montażowego, aby zwolnić widok.
   3. Wybierz 10-20 hermafrodytów do kropli roztworu preparacyjnego. Wybierz wystarczającą liczbę zwierząt do sfotografowania ~10 na slajd, ale nie na tyle, aby nie można było ich przeciąć w ciągu 5 minut.
   4. Rozkrój zwierzęta za pomocą dwóch igieł strzykawkowych, po jednej na każdą rękę (Rysunek 2A).
      1. Skrzyżuj punkty igieł, aby utworzyć kształt litery X i użyj dolnej części litery X, aby przygwoździć osobę dorosłą do powierzchni szkiełka nakrywkowego.
         UWAGA: Odkrycie najlepszego sposobu trzymania każdej igły pod względem kąta i obrotu może wymagać praktyki. Zacznij od trzymania igieł skosami (skośną krawędzią) skierowanymi w dół. Zobacz dyskusję, aby uzyskać sugestie dotyczące pierwszej nauki analizowania w większej objętości (Rysunek 2D).
      2. Umieść kształt litery X bezpośrednio za gardłem, około 1/5 długości ciała młodego dorosłego lub tuż poniżej przezroczystej części głowy (Rysunek 2A, prawy diagram).
      3. Odetnij zwierzę jednym ruchem nożyc (jak krojenie jedzenia nożem i widelcem). Dobra ekstruzja spowoduje, że jedno ramię gonady (lub czasami oba ramiona) całkowicie uwolni się z jamy ciała, wraz z jedną lub obiema połówkami jelita (Rysunek 2B, zdjęcie po lewej). Jelito będzie wydawało się ciemniejsze i o jednolitej szerokości, podczas gdy gonada będzie wydawać się przezroczysta z dystalnym, zwężającym się końcem.
         1. Każde zwierzę powinno być cięte tylko raz; jeśli gonada nie wystaje po wykonaniu cięcia, po prostu przejdź do następnego zwierzęcia. Pierwsze cięcie znacznie zmniejsza ciśnienie hydrostatyczne w korpusie, co sprawia, że dalsze cięcia prawdopodobnie nie zakończą się lepszym wytłaczaniem. Niekompletne lub słabe wytłoczenia są łatwo widoczne podczas obrazowania i mogą być ignorowane (Rysunek 2B, obraz po prawej).
            UWAGA: Nie próbuj oddzielać gonady od tuszy - zwykle spowoduje to rozdarcie tkanki i ograniczenie liczby etapów mejotycznych, które można przeanalizować.
      4. Powtórzyć sekcję dla pozostałych zwierząt na szkiełku nakrywkowym.
4. Utrwal próbkę formaldehydem.
   1. Pracując delikatnie, odpipetować 4 μl roztworu utrwalającego na szkiełko nakrywkowe bardzo blisko kropli ze zwierzętami. Idealnie, krople są wystarczająco blisko, aby się połączyć; Należy unikać pipetowania bezpośrednio do kropli rozbiorowej i przemieszczania rozczłonkowanych tusz
   .
   2. Przypnij szkiełko nakrywkowe do szkiełka przytrzymującego jednym palcem. Drugą ręką delikatnie strzepnij kilka razy szkiełko nakrywkowe, aby wymieszać krople. Końcowe stężenie utrwalające wynosi 0,8% PFA.
   3. Trzymając dodatnio naładowany szkiełko przodem do dołu, użyj go, aby podnieść szkiełko nakrywkowe na środku szkiełka. Delikatnie dotknij kropli próbki, a napięcie powierzchniowe kropli podniesie szkiełko nakrywkowe.
      UWAGA: Dodatnio naładowane szkiełka mają powłokę elektrostatyczną, która pomaga tkankom przylegać do powierzchni, aby zapobiec utracie próbki.
      1. W razie potrzeby ustaw szkiełko nakrywkowe po przekątnej, tak aby jeden róg zwisał z górnej lub dolnej krawędzi szkiełka na 1 mm. Pozostawienie zwisu ułatwi złamanie szkiełka nakrywkowego po zamrożeniu (Rysunek 2C).
   4. Ustaw zjeżdżalnię na ławce i zamocuj dokładnie na 5 minut w RT. W tym czasie oznacz slajd ołówkiem.
      UWAGA: Często dochodzi do nadmiernego utrwalenia próbek, co można wykryć poprzez wykluczenie przeciwciał z jąder lub nawet ze wszystkich tkanek. Dodatkowo niektóre przeciwciała są szczególnie wrażliwe na formaldehyd. W takich przypadkach należy skrócić czas utrwalania lub zmniejszyć końcowe stężenie użytego formaldehydu.
5. Pęknięcie zamrażające
   1. Natychmiast po naprawieniu zamroź slajdy.
      1. W przypadku używania ciekłego azotu: Przytrzymaj oznaczoną krawędź szkiełka pęsetą i delikatnie opuść ją do ciekłego azotu. Zwolnić szkiełko w taki sposób, aby opierało się o bok zlewki, szkiełkiem nakrywkowym do góry. Szkiełka zamraża się w ciągu 10 sekund (gdy płyn przestanie wrzeć).
      2. Jeśli używasz suchego lodu: zeskrob szron z powierzchni aluminiowego bloku za pomocą brzytwy. Mocno przytrzymaj oznaczoną krawędź szkiełka i połóż ją na oczyszczonej powierzchni, wywierając lekki nacisk w dół, aby zapewnić pełny kontakt z blokiem. Szkiełko nakrywkowe powinno znajdować się całkowicie na powierzchni bloku. Zamarzanie następuje w ciągu 10 s i można je wizualnie potwierdzić, gdy próbka pod szkiełkiem nakrywkowym zamienia się w lód.
      3. W przypadku obu metod pozostaw szkiełka na co najmniej 5 minut do całkowitego zamrożenia.
         UWAGA: Po zamrożeniu szkiełka można pozostawić w ciekłym azocie lub na bloku na 15-20 minut, o ile pozostają zamrożone. Pozwala to na zebranie wielu szkiełek na tym etapie przed przejściem do etapu pękania.
   2. Pracując szybko, oderwij szkiełko nakrywkowe od próbki. Ten krok jest wrażliwy na czas. Usunąć szkiełko nakrywkowe i zanurzyć szkiełko w etanolu, zanim próbka zacznie się rozmrażać.
      1. Wyjmij zamrożone szkiełko (za pomocą pęsety do ciekłego azotu).
      2. Mocno chwyć krótszą krawędź prowadnicy oznaczoną i przymocuj jedną długą krawędź do ławki.
      3. Drugą ręką mocno chwyć maszynkę do golenia i przesuń krawędź brzytwy w dół szkiełka, aby strzepnąć szkiełko nakrywkowe i odsunąć je od próbki. Ten krok jest nieco łatwiejszy, jeśli szkiełko nakrywkowe jest ustawione z wysięgiem narożnym (Rysunek 2C).
6. Natychmiast umieść szkiełko w słoiku Coplin zawierającym 95% etanolu w temperaturze pokojowej. Pozostaw szkiełka w etanolu na co najmniej 5 minut.
   UWAGA: Szkiełka można pozostawić na chwilę w etanolu - pozwala to na zebranie wielu szkiełek na tym etapie przed przystąpieniem do prania. Na tym etapie slajdy mogą być również przechowywane przez kilka dni. W przypadku przechowywania należy przesunąć słoik Coplin ze szkiełkami w etanolu do -20 °C.
7. Umyj szkiełka w PBS-T trzy razy po 5 minut w temperaturze RT. Do każdego prania używaj świeżego PBS-T.
8. W przypadku barwienia przeciwciałami przejdź do kroku 3 (barwienie przeciwciałami). Jeśli tylko barwienie za pomocą DAPI w celu wizualizacji chromosomów, przejdź do kroku 4 (montaż i obrazowanie).

3. Barwienie przeciwciał

1. Inkubacja przeciwciał pierwotnych
   UWAGA: Przy opracowywaniu odpowiednich warunków dla nowych przeciwciał ważne jest uwzględnienie następujących kontroli ujemnych w celu sprawdzenia swoistości sygnału fluorescencyjnego: 1) Szkiełko, które nie ma przeciwciała pierwszorzędowego i ma tylko przeciwciało drugorzędowe; 2) szkiełko z samym przeciwciałem pierwszorzędowym, które nie ma przeciwciała drugorzędowego. Każda z tych kontroli ujemnych powinna powodować całkowity brak sygnału. Jeśli fluorescencja zostanie zidentyfikowana na szkiełku zawierającym tylko przeciwciała drugorzędowe, należy zwiększyć rozcieńczenie przeciwciał drugorzędowych lub zastosować inne rozcieńczenie przeciwciał drugorzędowych. Jeśli fluorescencja zostanie zidentyfikowana na szkiełku zawierającym tylko przeciwciała pierwotne, prawdopodobnie jest to spowodowane autofluorescencją lub innymi potencjalnymi zanieczyszczeniami.
   1. Rozcieńczyć przeciwciało pierwszorzędowe w buforze do rozcieńczania przeciwciał (50 mg BSA + 50 μL 10% azydku sodu + 10 ml PBS-T) - przygotować wystarczającą ilość rozcieńczenia przeciwciała, aby użyć 20-30 μL na szkiełko.
   2. Przygotuj wilgotną komorę: Wyłóż dno plastikowego pojemnika hermetyczną pokrywką wilgotnymi ręcznikami papierowymi. Połóż pojedynczą warstwę szklanych pipet Pasteura na ręcznikach papierowych. Pipety te tworzą powierzchnię, która pozwala szkiełkom pozostać poziomo i utrzymuje je uniesione nad ręcznikami papierowymi.
      UWAGA: W przypadku wilgotnych komór najlepiej używać plastikowych pojemników do przechowywania żywności z pokrywkami zatrzaskowymi, co ułatwia otwieranie i zamykanie pojemnika bez naruszania znajdujących się w nim prowadnic. Poszukaj takiej, która jest wystarczająco długa dla pipet Pasteura, ale ma również stosunkowo płaskie dno bez wgłębień, aby szkiełka mogły spoczywać całkowicie poziomo.
   3. Wyjmij szkiełko z końcowego prania PBS-T. Od tego kroku należy pracować szybko, aby próbka była zawsze mokra i nie powodowała parowania. Jeśli próbka wyschnie, będzie to miało negatywny wpływ na barwienie przeciwciałami.
   4. Osusz całą powierzchnię szkiełka za pomocą chusteczki do wycierania złożonej w zwarty prostokąt. Wytrzyj przód i tył szkiełka, ale pozostaw dużo miejsca wokół próbki. Zachowaj szczególną ostrożność podczas suszenia powierzchni w pobliżu próbki - unikaj zbliżania się do próbki, ponieważ pozostawia obszar o wielkości szkiełka nakrywkowego nienaruszony. Należy jednak upewnić się, że obwód próbki jest suchy do następnego etapu.
   5. Narysuj okrąg wokół próbki za pomocą hydrofobowego pisaka PAP. Należy zachować ostrożność, aby zamknąć cały obszar próbki, ale nie należy uszkadzać zwłok zwierzęcych widocznych na powierzchni szkiełka. Odczekaj ~5 s, aby bariera całkowicie wyschła.
      UWAGA: Bariera hydrofobowa jest niezbędna do przechowywania pierwotnego roztworu przeciwciała, ponieważ powierzchnia szkiełka została pokryta PBS-T, który zawiera detergent. Pisak PAP najlepiej sprawdza się na suchej powierzchni szkiełka, dlatego ważne jest, aby stworzyć suchy obwód wokół próbki. Pozostawienie niewysuszonego obszaru znajdującego się najbliżej próbki chroni ją na tym etapie
   6. Pracując szybko, użyj rogu lub krawędzi złożonej chusteczki do wycierania, aby odprowadzić płyn z próbki w obrębie bariery hydrofobowej. Uważaj, aby nie uszkodzić zwłok zwierzęcych.
   7. Natychmiast odpipetować 20 μl roztworu przeciwciała pierwszorzędowego do pierścienia utworzonego przez barierę hydrofobową. Należy pamiętać, aby pipetować delikatnie i pod kątem, aby nie dopuścić do uszkodzenia tusz. Unikać pipetowania bezpośrednio na tuszę.
   8. Delikatnie przechyl szkiełko, aby upewnić się, że cała powierzchnia w obrębie bariery hydrofobowej jest pokryta roztworem.
      UWAGA: Najlepiej, jeśli bariery hydrofobowe mają wewnętrzny obwód 1-1,5 cm, który jest w całości pokryty 20 μL roztworu przeciwciała. Szerokość obwodu będzie zależała od tego, w jaki sposób tusze są rozłożone na etapie pękania zamrażającego. Szersze bariery mogą wymagać większej objętości roztworu przeciwciał. W razie potrzeby na wierzchu próbki można delikatnie umieścić małe kwadraty parafilmu (przycięte do rozmiaru szkiełka nakrywkowego 18 mm x 18 mm). Kwadraty parafilmu zapewnią, że roztwór przeciwciała pokryje całą próbkę, a także pomogą zapobiec parowaniu.
   9. Powtórz kroki 3.1.3-3.1.8 dla pozostałych slajdów.
   10. Ostrożnie przenieś szkiełka do wilgotnej komory, upewniając się, że roztwór pozostaje zawarty w barierze hydrofobowej i że szkiełka spoczywają całkowicie poziomo.
   11. Preparaty należy inkubować przez noc w temperaturze pokojowej. W zależności od przeciwciała, etap ten można skrócić do 6 godzin lub wykonać przez noc w temperaturze 4 °C, utrzymując wilgotną komorę w chłodni lub lodówce.
       UWAGA: Użycie wilgotnej komory i barier hydrofobowych jest zwykle wystarczające, aby zapobiec parowaniu roztworu przeciwciała, nawet w przypadku długich nocnych inkubacji. Jeśli jednak parowanie okaże się problemem, małe kwadraty parafilmu można delikatnie umieścić na każdej próbce, co pomoże zapobiec parowaniu. Można je usunąć na pierwszym etapie mycia: zanurzyć każde szkiełko w słoiku z kopliny wypełnionym PBS-T (niezawierającym innych szkiełek) i pozwolić, aby parafilm odpłynął od próbki. Usuń parafilm ze słoika Coplin przed użyciem tego samego słoika do usunięcia parafilmu z następnego szkiełka.
2. Umyj szkiełka w słoikach Coplin zawierających ~40 ml PBS-T trzy razy po 5 minut każdy w temperaturze RT. Do każdego prania używaj świeżego PBS-T.
   1. Podczas tych płukań rozcieńczyć przeciwciało drugorzędowe w buforze do rozcieńczania przeciwciał. Przygotować wystarczającą ilość rozcieńczenia przeciwciał, aby użyć 20-30 μl na szkiełko. Często stosuje się sprzężone przeciwciała drugorzędowe Alexa Fluor rozcieńczone w stosunku 1:200.
3. Inkubacja przeciwciał wtórnych
   1. Wyjmij szkiełko z końcowego prania PBS-T. Od tego kroku należy pracować szybko, aby próbka była zawsze mokra i nie powodowała parowania.
   2. Osusz szkiełko za pomocą złożonej chusteczki do wycierania. Unikaj osuszania obszaru objętego barierą hydrofobową.
   3. Pracując szybko, użyj rogu lub krawędzi złożonej chusteczki do wycierania, aby odprowadzić płyn z próbki w obrębie bariery hydrofobowej. Uważaj, aby nie uszkodzić tusz zwierzęcych.
   4. Natychmiast odpipetować 20 μl roztworu przeciwciała wtórnego do pierścienia utworzonego przez barierę hydrofobową. Należy pamiętać, aby pipetować delikatnie i pod kątem, aby zapobiec uszkodzeniu tusz.
   5. Unikać pipetowania bezpośrednio na tuszę. Upewnij się, że cała powierzchnia w obrębie bariery hydrofobowej jest pokryta roztworem. Szersze obwody bariery mogą wymagać większej objętości roztworu przeciwciał. W razie potrzeby przykryć próbkę małym kwadracikiem parafilmu (patrz uwaga poniżej kroku 3.1.8).
   6. Ostrożnie przenieś szkiełko do wilgotnej komory, upewniając się, że roztwór pozostaje zawarty w barierze hydrofobowej i że szkiełko spoczywa całkowicie poziomo. Załóż pokrywę na wilgotną komorę, aby szkiełko było w ciemności.
   7. Powtórz kroki 3.3.1-3.3.6 dla pozostałych slajdów.
   8. Inkubować w ciemności przez 4 godziny w temperaturze RT.
      UWAGA: W zależności od przeciwciała krok ten można skrócić do 2 godzin lub wydłużyć do 6 godzin. Jeśli wilgotna komora nie jest ciemna, umieść ją w szufladzie lub przykryj kartonem. Alternatywnie wilgotną komorę można owinąć folią aluminiową, aby utrzymać szkiełka w ciemności.
4. Umyj szkiełka w słoikach Coplin zawierających ~40 ml PBS-T trzy razy po 5 minut każdy w temperaturze RT. Do każdego prania używaj świeżego PBS-T.

4. Montaż i obrazowanie

1. Przygotuj się do montażu próbki, mając w zasięgu ręki podłoże montażowe + DAPI (2 μg/ml), szkiełka nakrywkowe 18 mm x 18 mm i lakier do paznokci.
2. Wyjmij szkiełko z końcowego prania i wysusz za pomocą złożonej chusteczki do wycierania. Unikaj osuszania obszaru objętego barierą hydrofobową.
3. Używając rogu złożonej chusteczki do wycierania, ostrożnie odsuń płyn z próbki wewnątrz bariery. Na tym etapie usuń większość płynu, ale nie pozwól, aby tusze całkowicie wyschły.
4. Pracując szybko, dodać 8 μl podłoża montażowego do próbki. Pipetować delikatnie i pod kątem, aby zapobiec uszkodzeniu tusz. Należy unikać pipetowania bezpośrednio na tusze.
5. Nadal pracując szybko, ostrożnie opuść szklane szkiełko nakrywkowe na próbkę.
   1. Pęcherzyki powietrza mogą zakłócać obrazowanie i prowadzić do degradacji próbki. Aby zminimalizować pęcherzyki powietrza, oprzyj jedną krawędź szkiełka nakrywkowego na szkiełku obok próbki, tak aby była trzymana po przekątnej nad próbką. Pomocne może być oparcie górnej krawędzi szkiełka nakrywkowego na ołówku lub pęsetie. Następnie powoli opuść górną krawędź szkiełka nakrywkowego w dół - ten ruch pozwala medium montażowemu na utworzenie płynnego uszczelnienia postępującego od jednej krawędzi do przeciwnej.
6. Powtórz kroki 4.2-4.5 dla pozostałych slajdów.
7. Uszczelnij szkiełka nakrywkowe lakierem do paznokci. Należy uważać, aby nie naciskać na szkiełko nakrywkowe (co spowoduje zgniecenie próbki) lub przesuwać szkiełko nakrywkowe w poziomie (co spowoduje rozmazanie próbki).
   1. Dodaj małą kropkę lakieru do paznokci w każdym rogu szkiełka nakrywkowego (o szerokości ~1 mm). Pomogą one utrzymać szkiełko nakrywkowe na miejscu. Pozwól kropkom całkowicie wyschnąć.
   2. Gdy rogi całkowicie wyschną, uszczelnij krawędzie lakierem do paznokci. Upewnij się, że pasta całkowicie wypełnia szczelinę między szkiełkiem nakrywkowym a szkiełkiem, ale unikaj zbyt dużego zakrywania szkiełka nakrywkowego próbki. Najlepiej jest zachować zakładkę 1 mm na szkiełku nakrywkowym. Używaj tylko tyle lakieru do paznokci, ile jest potrzebne. Unikaj używania zbyt dużej ilości lub nadmiaru pasty, ponieważ wyschnięcie może zająć dużo czasu i grozi uszkodzeniem obiektywu mikroskopu.
      UWAGA: Zaleca się używanie kolorowego lakieru do paznokci zamiast przezroczystego, co ułatwia dostrzeżenie granicy pieczęci i pomaga zapobiegać obrazowaniu zwierząt, które leżą pod granicą lakieru do paznokci.
   3. Poczekaj, aż lakier do paznokci całkowicie wyschnie przed obrazowaniem. Ten krok jest ważny, ponieważ mokry lakier do paznokci może poważnie uszkodzić obiektywy mikroskopu.
      UWAGA: Od tego momentu slajdy powinny być trzymane w ciemności tak bardzo, jak to możliwe. Użyj płaskiego kartonu, aby je przykryć, gdy schną na ławce.
8. Szkiełka należy przechowywać w ciemności w temperaturze 4 °C przez 1-2 tygodnie przed obrazowaniem. W razie potrzeby przechowywać szkiełka w temperaturze -20 °C przez dłuższy czas.
9. Obraz wykonany przy użyciu standardowej fluorescencji złożonej mikroskopii świetlnej.
   1. Dla każdego szkiełka, najpierw zbadaj całą próbkę przy 10x w kanale DAPI, aby zidentyfikować dobrze wytłoczone gonady i zanotować ich rozmieszczenie. W przypadku większości zastosowań należy unikać obrazowania gonad, które są odcięte, niekompletne lub częściowo pokryte przez inną część zwierzęcia. W przypadku większości zwierząt tylko jedno ramię gonady będzie w pełni wytłoczone i widoczne.
      UWAGA: Pomocne może być wykonanie zdjęcia w mniejszym powiększeniu przy 10-krotnym powiększeniu całej gonady w kanale DAPI w celu późniejszej orientacji lub zidentyfikowania lokalizacji określonych jąder.
   2. W zależności od zastosowania zdjęcia mogą być wykonywane z powiększeniem 40x, 63x lub 100x. Jeśli ma zostać uchwycona cała gonada, utwórz montaż z nakładającymi się granicami. Podczas obrazowania pamiętaj, że gonada jest pustą rurką, z jądrami najbardziej gęstymi na górze i na dole.

Wyniki

DAPI silnie wiąże się z DNA, a jego barwienie jest odporne nawet w najróżniejszych warunkach (Rysunek 3A,B). Powinien być obecny we wszystkich jądrach i dlatego zapewnia skuteczną kontrolę pozytywną obecności jakiejkolwiek tkanki robaka na szkiełku i zdolność do wykrywania fluorescencji pod mikroskopem. Barwienie jest skuteczne, gdy przeciwciało jest obecne w jądrach mejotycznych (Rysunek 3A, B). Na przykład, Rysunek 3A,B pokazuje jądra środkowego pachytenu wybarwione DAPI i przeciwciałem skierowanym przeciwko RAD-51, markerowi pęknięć dwuniciowych. KLE-2 jest składnikiem kondensyny, wysoce konserwatywnego kompleksu białkowego, który strukturyzuje chromosomy w ramach przygotowań do mitozy i mejozy. Mutanty kle-2/+ mają niewielkie defekty w strukturze chromosomów, o czym świadczy lekko nieuporządkowane barwienie DAPI i wzrost liczby pęknięć dwuniciowych odzwierciedlony w wyższej liczbie ognisk RAD-51 (Figura 3B). Częstym błędem w immunofluorescencji jest zbyt długie pozostawianie próbki w roztworze utrwalającym. Nadmierne utrwalenie może prowadzić do nieudanego barwienia, ponieważ zwykle zapobiega dyfuzji przeciwciał do jąder. Błąd ten można zidentyfikować, gdy przeciwciało jest rozproszone w regionach cytoplazmatycznych gonady, ale wydaje się, że jest wykluczone z jąder.

W linii zarodkowej (Rysunek 1), jądra mitotycznie namnażają się na dystalnym końcu, wchodzą w mejozę podczas strefy przejściowej i przechodzą przez pachyten (który często jest podzielony na trzy równe etapy przez kilka rzędów jąder) przed wejściem w diploten i ostatecznie diakinezę. Oocyty w diakinezie są ponumerowane na podstawie ich bliskości do spermateki, przy czym oocyt -1 jest najbardziej proksymalny do spermateki, oocyt -2 jest następnym dystalnym i tak dalej. C. elegans ma sześć chromosomów, które objawiają się jako zwarte owale w jądrach diakinezy. Każda z nich reprezentuje homologiczną parę dwóch siostrzanych chromatyd utrzymywanych razem przez chiazmat, zwany również biwalentnym (Rysunek 3C). Mutanty, takie jak spo-11, które zakłócają powstawanie krzyżówek, nie będą w stanie utworzyć chiasmata; w związku z tym jądra diakinezy będą miały 12 oddzielnych ciał DAPI (zwanych również jednowartościowymi), po jednym dla każdej chromatydy siostrzanej (Rysunek 3D).

Rysunek 1: Jądra linii zarodkowej są ułożone w sposób przestrzenno-czasowy, który reprezentuje ich postęp poprzez mejozę. (A) Pełnomocny hermafrodyta młodego dorosłego wybarwiony DAPI. Przedstawiono etapy gonadowe i mejotyczne, od dystalnego wierzchołka (gwiazdka) do obszaru proksymalnego (oocyt -1, oznaczony strzałką), w którym znajduje się spermateka (trójkąt). Podziałka skali reprezentuje 100 μm. (B) Rzutowany obraz fluorescencyjny wypreparowanej gonady hermafrodyty wybarwionej DAPI. Etapy mejotyczne są oznaczone, z reprezentatywnymi jądrami pokazanymi we wstawkach (wszystkie wstawki są pokazane jako skalujące się ze sobą). Jądra można łatwo klasyfikować na podstawie ich lokalizacji w linii zarodkowej i charakterystycznej morfologii chromosomów, postępując od strefy mitotycznej na dystalnym końcu (gwiazdka) do strefy przejściowej, poprzez pachyten, diploten i diakinezę. Spermateka jest oznaczona trójkątem. Ten rysunek został zaadaptowany z Hillers et al. na licencji CC BY 3.0²⁸. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Demonstracja konfiguracji sekcji. (A) Etap mikroskopu podczas sekcji. Zwierzęta są preparowane w 4 μl roztworu rozwarstwiającego na szkiełku nakrywkowym umieszczonym na szkiełku przytrzymującym, które służy do przesuwania szkiełka nakrywkowego w pole widzenia. Schemat przedstawia idealne ułożenie igły. Igły są trzymane ze ściętą krawędzią skierowaną w dół, skrzyżowaną w okolicy gardła. Różowe strzałki pokazują ruch przypominający nożyce dla igieł. Różowa przerywana linia wskazuje idealne miejsce cięcia. (B) Obrazy zwierząt poddanych sekcji, z przykładem pełnego wytłoczenia i niepełnego wytłoczenia. Odcinki wytłaczanych gonad i wnętrzności są oznaczone. (C) Obraz przedstawiający etap zamrażania-krakingu. Szkiełko powinno być mocno trzymane w jednej ręce, stroną z szkiełka nakrywkowego skierowaną w stronę przeciwną do korpusu. Przeciwległa krawędź opiera się o ławkę. Maszynkę do golenia należy trzymać w drugiej ręce. Różowa strzałka wskazuje kierunek ruchu, w którym maszynka do golenia zrzuca szkiełko nakrywkowe ze szkiełka, lekko obracając tak, aby szkiełko nakrywkowe odsunęło się od ciała. Zwróć uwagę, że szkiełko nakrywkowe zostało umieszczone w taki sposób, że jeden róg zwisa z dłuższej krawędzi szkiełka. (D) Obraz zestawu do ćwiczeń preparacyjnych w szklanym naczyniu do barwienia zarodków. Zwierzęta umieszcza się w 50-200 μl roztworu preparacyjnego, co niweluje problem parowania i wydłuża czas preparacji. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Reprezentatywne wyniki fluorescencji jąder linii zarodkowej. (A,B) Projekcje stosu Z późnych jąder pachytenów wybarwionych przeciwciałem RAD-51 (zielony) i DAPI (czerwony) w (A) heterozygotach typu dzikiego i (B) kle-2/+. (C,D) Projekcje stosu Z pojedynczego jądra diakinezy wybarwionego DAPI w (C) mutantach typu dzikiego (z sześcioma ciałami barwiącymi DAPI) i (D) spo-11 (z 12 ciałami barwiącymi DAPI). Podziałka skali reprezentuje 5 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

Rozmnażanie płciowe wymaga stworzenia haploidalnych gamet, które są wytwarzane w wyniku wyspecjalizowanego podziału komórkowego mejozy. C. elegans stał się popularnym modelem do cytologicznego badania mejozy ze względu na jego przezroczystość optyczną, wygodną anatomię linii zarodkowej i potężną genetykę²⁸. Proste eksperymenty organizmowe oceniające płodność i śmiertelność zarodków można połączyć z genetyką molekularną, aby odpowiedzieć na wiele pytań w laboratorium lub w klasie. Na przykład, ponieważ krzyżowanie jest niezbędne do prawidłowej segregacji chromosomów, procesy, które zakłócają ich powstawanie lub rozdzielczość, generują gamety aneuploidalne. Z kolei aneuploidia prowadzi do niezdolnego do życia potomstwa, które można łatwo ocenić poprzez liczenie potomstwa lub za pomocą nieco bardziej skomplikowanej metody określania śmiertelności zarodka. Cytologicznie brak krzyżówek wpłynie na liczbę ciał barwiących DAPI obserwowanych podczas diakinezy. Solidność barwienia DAPI i łatwość punktacji sprawiają, że jest to idealny eksperyment do nauki technik cytologicznych. Czasowo-przestrzenny układ jąder w hermafrodytycznej linii zarodkowej zapewnia migawkę każdego etapu mejozy w jednym momencie. Jądra potrzebują około 54 godzin, aby przejść od dystalnego mitotycznego końca linii zarodkowej do bliższego końca (dla przykładów, patrz Jaramillo-Lambert i ^wsp.33, Stamper i wsp.34 oraz Libuda i wsp.35). Ten dobrze ugruntowany czas postępu mejotycznego pozwala na znakowanie impulsowe lub eksperymenty uszkadzające DNA.

Ponieważ barwienie DAPI prawie zawsze działa, służy jako użyteczna kontrola techniczna dla mikroskopii fluorescencyjnej (i może zapewnić satysfakcję dla szkolących się mikroskopistów). Barwienie przeciwciał może być bardziej zmienne i jest dobrą miarą odtwarzalności między kontrpróbami. Gonady C.elegans mogą być trudne do konsekwentnego naprawiania, ponieważ ten krok wymaga równowagi między zachowaniem struktury chromosomów, a jednocześnie umożliwieniem wystarczającej dyfuzji przeciwciał. Utrwalanie formaldehydem najlepiej zachowuje morfologię chromosomów, a przygotowanie formaldehydu świeżo z ampułek paraformaldehydu zapewniło najbardziej powtarzalne wyniki. Możliwe jest również stosowanie formaldehydu przygotowanego z formaliny (37% wodnego roztworu formaldehydu i metanolu). Dla każdego przeciwciała może być konieczne empiryczne określenie siły i czasu wiązania. Alternatywne metody polegają na pominięciu wiązania formaldehydu w kroku 2.4 i, po krakingu zamrażalnym, zanurzeniu w 100% etanolu w temperaturze -20 °C lub zanurzeniu w 100% metanolu na 10 minut, a następnie zanurzeniu w 100% acetonie na 10 minut w temperaturze -20 °C. Te warunki utrwalenia pozwalają na lepszą penetrację przeciwciał, ale negatywnie wpływają na morfologię tkanek (chromosomy będą wyglądać na wydmuchane i bardziej opuchnięte).

Czas jest bardzo ważny dla sekcji i kroków naprawy opisanych w kroku 2. Ponieważ objętość roztworu preparacyjnego jest tak mała, parowanie może wpływać na końcowe stężenie utrwalenia, co spowoduje zmienne barwienie przeciwciał. Doświadczony treser C. elegans może przygotować szkiełko w mniej niż 2 minuty od rozpoczęcia (krok 2.3) do naprawy (krok 2.4). Główną przeszkodą techniczną jest możliwość wybierania zwierząt do kropli roztworu preparacyjnego i szybkiego ich preparowania. Może być łatwiej nauczyć się analizować w większych ilościach. Nowi stażyści najpierw zaczynają od pobrania zwierząt do 50-200 μl roztworu preparacyjnego w szklanym naczyniu do barwienia zarodków (ryc. 2D); Szersza powierzchnia zapewnia większe pole manewru podczas określania idealnej pozycji igły dla dobrych wytłaczania gonad, a większa objętość cieczy sprawia, że parowanie jest mniejszym problemem. Gdy już oswoiają się z ruchami preparacyjnymi, stażyści rozpoczynają preparację, używając tylko 50 μl w naczyniu, a następnie przechodzą do sekcji w 20 μl na szkiełku. Po przeprowadzeniu analizy na szkiełkach kursanci mogą szybko zacząć zmniejszać ilość roztworu, aż do momentu, gdy będą wystarczająco szybcy w pracy w 4 μl, aby parowanie było znikome.

Jeśli czas przeprowadzenia sekcji pozostaje problemem, uczestnicy szkolenia mogą przeprowadzić sekcję w 8 μl roztworu preparacyjnego podczas kroku 2.3. Następnie, w kroku 2.4, mogą dodać 8 μl roztworu utrwalającego, delikatnie pipetując w celu dokładnego wymieszania (uważnie obserwując, aby tusze nie zostały zakłócone lub odpipetowane) i usuwając 8 μl z wymieszanego roztworu. To alternatywne podejście doprowadzi do uzyskania tej samej końcowej objętości 8 μl i tego samego końcowego stężenia wiązanego; Objętość ta jest istotna dla zapewnienia, że tusze stykają się zarówno ze szkiełkiem nakrywkowym, jak i z powierzchnią ślizgu podczas pękania zamrażającego w kroku 2.5. Jeśli czas przygotowania każdego preparatu pozostaje problemem nawet w przypadku większych objętości sekcji, metoda zawiesiny w protokole immunofluorescencji linii zarodkowej została opisana przez Gervaise'a i Arura²⁶.

Głównym ograniczeniem stosowania immunofluorescencji do wizualizacji białek in situ jest dostępność pierwszorzędowych przeciwciał ukierunkowanych na określone białko będące przedmiotem zainteresowania. Jeśli jednak zmodyfikowano znakowaną wersję białka, protokół ten można dostosować do wizualizacji znacznika białkowego. Powszechnie dostępne są przeciwciała skierowane przeciwko popularnym znacznikom, takim jak FLAG, HA lub GFP. Znaczniki fluorescencyjne, takie jak GFP, mogą być często wygaszane przez etapy fiksacji, dlatego zaleca się stosowanie pierwszorzędowego przeciwciała ukierunkowanego na GFP, zamiast polegania na samym natywnym sygnale fluorescencyjnym. Innym ograniczeniem tego protokołu jest to, że przechwytuje on linię zarodkową w ciągu jednego czasu (chociaż wszystkie etapy oogenezy będą reprezentowane w linii zarodkowej). Dlatego ta technika może pominąć dynamiczne zmiany, które mogą wystąpić w miarę postępu oocytu w procesie oogenezy. Jednak czas gametogenezy został dobrze zbadany u C. elegans; U młodego dorosłego osobnika typu dzikiego oocyt potrzebuje około 60 godzin, aby przejść od dystalnego końca linii zarodkowej (strefy mitotycznej) do diakinezy³³. Dlatego pogoń za pulsem lub specyficzna interwencja, taka jak napromienianie, po którym następuje przebieg w czasie, pozwoliłaby na obserwację efektów na różnych etapach mejozy.

Podsumowując, protokół ten opisuje rozwarstwienie gonad C. elegans , a następnie barwienie DAPI i przeciwciał do mikroskopii fluorescencyjnej. Wypreparowanie i utrwalenie (krok 2) trwa 60-90 minut, w zależności od liczby wygenerowanych preparatów. Barwienie przeciwciał (krok 3) odbywa się głównie bez użycia rąk i może trwać od 7 godzin do 1,5 dnia, w zależności od czasu inkubacji przeciwciał. Montaż (kroki 4.1-4.7) trwa około 15 minut. To ogólne podejście do wizualizacji chromosomów linii zarodkowej i gonady może być wykorzystane do badań cytologicznych dowolnego białka, jeśli istnieje przeciwciało lub odczynnik znacznika fluorescencyjnego. W najprostszej formie barwienie DAPI jąder diakinezy może być stosowane do badań przesiewowych pod kątem czynników wpływających na rekombinację mejotyczną. W połączeniu z analizami organizmów dotyczącymi liczby potomstwa, częstości występowania samców (fenotyp Him) i śmiertelności zarodka, to podejście cytologiczne stanowi jednokomórkowy kontrapunkt dla analiz populacyjnych.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Rabbit IgG Wtórne sondy	molekularne	711-545-152
Aluminiowy blok grzewczo-chłodzący	Millipore Sigma	Z743497
Bacto Peptone	Gibco	DF0118 17 0
Pipety Pasteura ze szkła borokrzemianowego, jednorazowe, 5,75 cala	Fisherbrand	13 678 20B	Służy do produkcji kilofów do robaków
BSA, Surowica bydlęca Albumina	VWR	97061 420
C. elegans typ dziki (przodek)	Caenorhabditis Centrum Genetyki	N2 (przodkowie)
C. elegans kle-2 (ok1151) mutanty	Caenorhabditis Centrum Genetyki	VC768	Pełny genotyp tego szczepu to: kle-2(ok1151) III/hT2 [bli-4(e937) let-?( q782) qIs48] (I;III). Ma kle-2 zrównoważony z chromosomem równoważącym oznaczonym falowym GFP. Wybierz zwierzęta inne niż zielone, aby zidentyfikować homozygotyczne mutanty kle-2.
C. elegans spo-11 (ME44) mutanty	Caenorhabditis Centrum Genetyki	TY4342	Pełny genotyp tego szczepu to: spo-11(me44)  IV / nT1[qIs51] (IV:V). Ma spo-11 zrównoważony chromosomem równoważącym oznaczonym pharangeal GFP. Wybierz zwierzęta inne niż zielone, aby zidentyfikować homozygotyczne mutanty spo-11.
Chlorek wapnia bezwodny	VWR	97062 590
Cholesterol	Sigma Aldrich	501848300
DAPI	Life Technologies	D1306
EDTA, Sól disodowa dwuwodna	Apex Bioresearch Products	20 147
Naczynie na zarodki, szkło, wnęka 30 mm	Usługi mikroskopii elektronowej	100492-980	Używany do ćwiczenia sekcji; Szkło jest preferowane, ponieważ wypreparowane zwierzęta mogą przyklejać się do plastiku
Escherichia coli	Caenorhabditis Centrum Genetyki	OP50
przechowywania żywności, plastikowy	różne	nie dotyczy	Plastikowe pojemniki z (1) stosunkowo płaskim dnem, aby umożliwić zjeżdżalnie spoczynek na poziomie; (2) preferowane są pokrywki, które są szczelne, ale nadal można je łatwo zdjąć bez naruszania zawartości pojemnika, oraz (3) mają około 9 cali długości i 6 cali szerokości
Szklany słoik Coplin	DWK Nauki przyrodnicze  Wheaton	08-813E
Bariera hydrofobowa PAP Pen	ImmEdge	NC9545623
Kimwipes	Kimtech Science	06 666A
Chlorowodorek lewamizolu	Sigma Aldrich	L0380000
Siarczan magnezu bezwodny	Fisher Chemical	M65 500
Igły, jednorazowe, 25 G	BD PrecisionGlide	14 821 13D	niebieski, 1-calowy
agar NGM, granulowany	Apex Bioresearch Products	20 249NGM
Parafilm	Bemis	16 101
Paraformaldehyd (16% w/v) Wodny roztwór	Mikroskopia elektronowa Sciences	50 980 487
PBS, sól fizjologiczna buforowana fosforanami (10x roztwór)	Fisher BioReagents	BP399500
szalki Petriego, 60 mm	Tritech Research	NC9321999	wentylacji, z ostrą krawędzią
(90% platyna, 10% iryd)	Tritech Research	PT 9010	Służy do produkcji kilofów do robaków
Chlorek potasu	Fisher	BP366-500
Fosforan potasu dwuzasadowy	VWR BDH Chemicals	BDH9266 500G
Fosforan potasu jednozasadowy	VWR BDH Chemicals	BDH9268 500G
Okulary korekcyjne premium 18 mm x 18 mm	Fisherbrand	12-548-AP	0,13– Żyletki o grubości 0,17 mm
, jednokrawędziowe	Sondy	55411 055
SlowFade Gold Antifade Mountant		S36937	Alternatywy: VectaShield Antifade Mounting Medium (Vector Laboratories, H-1000-10) lub ProLong Diamond Antifade (Thermo Fisher Scientific, P36970). W przypadku stosowania ProLong Diamond do uszczelnienia nie jest wymagany lakier do paznokci, ale szkiełka muszą utwardzać się przez 24 godziny przed obrazowaniem.
Odczynniki biologiczne azydku sodu	Fisher	BP922I 500
Chlorek sodu	Fisher Chemical	S271 500
Fosforan sodu dwuzasadowy	bezwodny Sigma Aldrich	7558 79 4
Fosforan sodu dwuzasadowy siedmiowodny	Sigma Aldrich	S9390
Pudełko styropianowe	różne	n/a	Przybliżone wymiary wnętrza: 12 cali długości, 9 cali szerokości, 8 cali głębokości
Szkiełka mikroskopowe Superfrost Plus	Fisherbrand	22 037 246
Triton X-100	Fisher BioReagents	BP151 500
Tryptone	Apex Bioresearch Products	20 251
Tween 20	Fisher Chemical	BP337 500
Ekstrakt drożdżowy	Apex Produkty badań biologicznych	20 254