Badanie mutacji kaspazy i modyfikacji potranslacyjnych za pomocą podejść do modelowania molekularnego

Summary

Niniejszy protokół wykorzystuje pakiet symulacji biomolekularnej i opisuje podejście dynamiki molekularnej (MD) do modelowania kaspazy typu dzikiego i jej zmutowanych form. Metoda MD pozwala na ocenę dynamicznej ewolucji struktury kaspazy oraz potencjalnego wpływu mutacji lub modyfikacji potranslacyjnych.

Abstract

Apoptoza to rodzaj zaprogramowanej śmierci komórki, która eliminuje uszkodzone komórki i kontroluje rozwój i homeostazę tkanek organizmów wielokomórkowych. Kaspazy, rodzina proteaz cysteinowych, odgrywają kluczową rolę w inicjacji i wykonywaniu apoptozy. Dojrzewanie kaspaz i ich aktywność są dostrajane przez modyfikacje potranslacyjne w bardzo dynamiczny sposób. Aby ocenić wpływ zmian potranslacyjnych, potencjalne miejsca są rutynowo mutowane z pozostałościami trwałymi na wszelkie modyfikacje. Na przykład resztę seryny zastępuje się alaniną lub kwasem asparaginowym. Jednak takie substytucje mogą zmienić konformację miejsca aktywnego kaspazy, prowadząc do zaburzeń aktywności katalitycznej i funkcji komórkowych. Co więcej, mutacje innych reszt aminokwasowych znajdujących się w krytycznych pozycjach mogą również załamać strukturę i funkcje kaspaz oraz prowadzić do zaburzeń apoptozy. Aby uniknąć trudności związanych ze stosowaniem zmutowanych reszt, można łatwo zastosować podejścia modelowania molekularnego w celu oszacowania potencjalnego wpływu podstawień aminokwasów na strukturę kaspazy. Obecny protokół pozwala na modelowanie zarówno kaspazy typu dzikiego, jak i jej zmutowanych form za pomocą pakietu symulacji biomolekularnej (Amber) i urządzeń superkomputerowych w celu przetestowania wpływu mutacji na strukturę i funkcję białka.

Introduction

Apoptoza jest jednym z najszerzej przebadanych procesów komórkowych, które regulują morfogenezę i homeostazę tkanek organizmów wielokomórkowych. Apoptoza może być zainicjowana przez szeroki zakres bodźców zewnętrznych lub wewnętrznych, takich jak aktywacja receptorów śmierci, zakłócenie sygnałów cyklu komórkowego, uszkodzenie DNA, stres retikulum endoplazmatycznego (ER) oraz różne infekcje bakteryjne i wirusowe¹. Kaspazy - kluczowi gracze apoptozy - są konwencjonalnie klasyfikowane do dwóch grup: inicjatorów (kaspaza-2, kaspaza-8, kaspaza-9 i kaspaza-10) i efektorów (kaspaza-3, kaspaza-6 i kaspaza-7), w zależności od ich struktury domenowej i miejsca w kaskadzie kaspazy ^2,3. Po sygnale śmierci komórki kaspazy inicjujące oddziałują z cząsteczkami adaptorowymi, które ułatwiają dimeryzację indukowaną bliskością i autoprzetwarzanie w celu wytworzenia aktywnego enzymu. Kaspazy efektorowe są aktywowane poprzez rozszczepienie przez kaspazy inicjujące i wykonują dalsze etapy wykonawcze poprzez rozszczepienie wielu substratów komórkowych⁴.

Dojrzewanie i funkcja kaspaz inicjatora i efektora są regulowane przez dużą liczbę różnych mechanizmów wewnątrzkomórkowych, wśród których modyfikacja potranslacyjna odgrywa nieodzowną rolę w modulacji śmierci komórki⁵. Dodanie grup modyfikujących (fosforylacja, nitrozylacja, metylacja lub acetylacja) lub białek (ubikwitynacja lub SUMOylacja) zmienia aktywność enzymatyczną kaspaz lub konformację i stabilność białek, które regulują apoptozę. Mutageneza ukierunkowana na miejsce jest szeroko stosowana do badania potencjalnych miejsc modyfikacji potranslacyjnej i rozpoznawania ich roli. Przypuszczalne miejsce modyfikacji jest zwykle zastępowane innym aminokwasem, którego nie można dalej modyfikować. W ten sposób potencjalnie ufosforylowana seryna i treonina są zmutowane do alaniny, a miejsca ubikwitynacji lizyny są zastępowane argininą. Inna strategia obejmuje zastąpienie aminokwasu, który szczególnie naśladuje modyfikację potranslacyjną (np. glutaminian i asparaginian zostały użyte do naśladowania fosforylowanej seryny lub treoniny)⁶. Jednak niektóre z tych substytucji zlokalizowanych w dużym sąsiedztwie miejsca aktywnego lub w krytycznych pozycjach mogą zmieniać strukturę kaspazy, zakłócać aktywność katalityczną i hamować apoptozę śmierci komórki⁷. Podobne efekty można zaobserwować w przypadkach związanych z nowotworem mutacji typu missense w genach kaspazy. Na przykład związana z nowotworem mutacja kaspazy-6 - R259H - spowodowała zmiany konformacyjne pętli w kieszeni wiążącej substrat, zmniejszając efektywny obrót katalityczny substratów⁸. Substytucja aminokwasów G325A w kaspazie-8 zidentyfikowana w raku płaskonabłonkowym głowy i szyi może hamować aktywność kaspazy-8, co prowadziło do modulacji sygnalizacji czynnika jądrowego-kB (NF-kB) i sprzyjało powstawaniu nowotworzenia⁹.

Aby ocenić potencjalny wpływ podstawień aminokwasów na strukturę i funkcję kaspazy, można zastosować modelowanie molekularne. W niniejszej pracy opisano podejście oparte na dynamice molekularnej (MD) do modelowania kaspazy typu dzikiego i jej zmutowanych form przy użyciu pakietu symulacji biomolekularnej (Amber). Metoda MD daje wgląd w dynamiczną ewolucję struktury białka po wprowadzeniu mutacji. Pierwotnie opracowany przez grupę Petera Kollmana, pakiet Amber stał się jednym z najpopularniejszych narzędzi programowych do symulacji biomolekularnych 10,11,12,13. To oprogramowanie jest podzielone na dwie części: (1) AmberTools, zbiór programów rutynowo używanych do przygotowania systemu (przypisywanie typów atomów, dodawanie wodorów i cząsteczek wody itp.) oraz analizy trajektorii; oraz (2) Bursztynowy, który jest wyśrodkowany wokół programu symulacyjnego pmemd. AmberTools jest darmowym pakietem (i warunkiem wstępnym do zainstalowania samego Ambera), podczas gdy Amber jest dystrybuowany z oddzielną licencją i strukturą opłat. Równoległe symulacje na superkomputerze i/lub przy użyciu procesorów graficznych (GPU) mogą znacznie poprawić wydajność badań naukowych nad dynamiką struktury białek¹⁴. Najnowsze dostępne wersje oprogramowania to AmberTools21 i Amber20, ale opisane protokoły mogą być również używane z poprzednimi wersjami.

Protocol

1. Przygotowanie systemu

UWAGA: Modele molekularne natywnych i zmutowanych form białkowych zbudowane są w oparciu o odpowiednią strukturę krystaliczną uzyskaną z Banku Danych o Białkach^15,16.

1. Aby pobrać wybraną strukturę PDB, skorzystaj z listy rozwijanej Pobierz pliki i kliknij Format PDB. Usuń uwagi i dane dotyczące połączeń, a następnie włóż kartę TER między oddzielnymi łańcuchami białkowymi w pliku PDB. Opcjonalnie ustaw stan protonacji reszt histydyny, zastępując nazwę reszty HIS nazwą HIE, HID lub HIP (plik uzupełniający 1).
   UWAGA: Rozsądne jest, aby nie usuwać krystalograficznie rozdzielonych cząsteczek wody (jeśli są obecne w pliku PDB).
2. Aby przygotować model startowy, należy uruchomić program tleap (pakiet AmberTools), a następnie wprowadzić polecenia, które manipulują obiektami tleap.
   1. Uruchom program: tleap. Załaduj pole siłowe ff14SB, aby opisać białko za pomocą mechaniki molekularnej: > źródło leaprc.protein.ff14SB.
   2. Pola siły obciążenia dla cząsteczek wody i jonów atomowych (Na⁺, Cl^-): > źródło leaprc.water.tip3p.
   3. Załaduj plik PDB i zbuduj współrzędne wodorów, tworząc obiekt o nazwie mol: > mol = loadpdb protein.pdb.
   4. Sprawdź, czy nie ma wewnętrznych niespójności, które mogą powodować problemy: > sprawdź mol.
      UWAGA: Mostki dwusiarczkowe, jeśli występują, należy określić ręcznie. Zastąp nazwy kowalencyjnie związanych cystein CYS na CYX i wpisz następujące polecenie w tleap , aby utworzyć wiązanie między atomami SG: wiązanie mol.X.SG mol.Y.SG (X i Y to liczby reszt cysteiny).
   5. Utworzyć pudełko rozpuszczalnika wokół białka (woda TIP3P, odległość 12 A): > solwatbox mol TIP3PBOX 12,0.
   6. Sprawdź całkowity ładunek: > naładuj mol i dodaj przeciwjony (Na⁺ lub Cl^-), aby zneutralizować system:
      > dodatków mol Na⁺ 0.
   7. Utwórz plik prmtop topologii i plik inpcrd współrzędnych (dane wejściowe do uruchomienia symulacji): > saveamberparm mol protein.prmtop protein.inpcrd. Wyjdź z programu tleap : > wyjdź.
      UWAGA: Pliki współrzędnych w formacie bursztynowym można łatwo przekonwertować do formatu PDB za pomocą narzędzia ambpdb (patrz Podręcznik użytkownika, patrz Spis materiałów).

2. Minimalizacja energii

UWAGA: Minimalizacja energii jest konieczna, aby usunąć wszelkie złe styki i nakładanie się atomów w systemie rozruchowym, które prowadzą do niestabilności podczas pracy MD.

1. Przeprowadź pierwszy etap minimalizacji energii (2,500 kroków algorytmu najbardziej stromego spadku + 2,500 kroków algorytmu gradientu sprzężonego), aby zoptymalizować pozycje dodanych atomów wodoru i cząsteczek wody, utrzymując współrzędne białka ustalone przez ograniczenia pozycyjne na ciężkich atomach.
   1. Uruchom program pmemd w następujący sposób:
      pmemd -O -i min1.in -p białko.prmtop -c białko.inpcrd -o protein_min1.out
      -r protein_min1.rst -ref białko.inpcrd.
   2. Postępuj zgodnie z wymaganymi argumentami: -i PLIK dane kontrolne; -p PLIK topologia molekularna, parametry pola siłowego, nazwy atomów; -c PLIK współrzędne początkowe; -o PLIK wyjście dziennika czytelne dla użytkownika; -r PLIK współrzędne końcowe; -ref PLIK współrzędne odniesienia dla utwierdzeń pozycji.
   3. Określ opcje w pliku wejściowym min1.in:
      &cntrl powiedział:
      imin=1, maxcyc=5000, ncyc=2500,
      cięcie = 10,0, NTB = 1,
      ntc=1, ntf=1,
      NTPR=10,
      NTR=1,
      restraintmask=':1-517 & !@H=',
      restraint_wt=2,0
      /
      UWAGA: Opcje wprowadzania: imin=1 wykonują minimalizację; maxcyc=5000 maksymalna liczba cykli minimalizacji; Metoda minimalizacji ncyc=2500 jest przełączana z najbardziej stromego spadku na gradient sprzężony po cyklach ncyc ; cut=10.0 niezwiązane odcięcie (A); NTB=1 narzucone są granice okresowe, stała objętość; NTC=1 nie stosuje się żadnych ograniczeń dotyczących długości wiązań (dla lepszej konwergencji energii); NTF=1 obliczane są wszystkie interakcje; NTPR=10 informacje o energii są wypisywane do pliku wyjściowego co krok NTPR ; ntr=1 flaga do ograniczania określonych atomów za pomocą potencjału harmonicznego; restraintmask=':1-517 & !@H=' określa ograniczone atomy; restraint_wt=2,0 masy (kcal/mol∙Ų) dla ograniczeń pozycyjnych.
2. Przeprowadź drugi etap minimalizacji energii (5 000 najbardziej stromych stopni zjazdu + 5 000 sprzężonych stopni gradientu) bez ograniczeń, aby zoptymalizować cały system.
   1. Użyj min2.in i protein_min1.rst jako danych wejściowych: pmemd -O -i min2.in -p białko.prmtop
      -c protein_min1.rst -o protein_min2.out -r protein_min2.rst.
   2. Określ opcje w pliku wejściowym min2.in:
      &cntrl powiedział:
      imin=1, maxcyc=10000, ncyc=5000,
      cięcie = 10,0, NTB = 1,
      ntc=1, ntf=1,
      NTPR=10
      /

3. Ogrzewanie

UWAGA: Ten etap ma na celu podgrzanie układu od 0 K do 300 K. Prędkości początkowe są przypisywane atomom, ponieważ model wyjściowy oparty na pliku PDB nie zawiera informacji o prędkości.

1. Przeprowadzić proces ogrzewania z ograniczeniami położenia na atomach białka (50 ps, stała objętość).
   1. Użyj heat.in i protein_min2.rst jako danych wejściowych: pmemd -O -i heat.in -p białko.prmtop
      -c protein_min2.rst -o protein_heat.out
      -r protein_heat.rst -x protein_heat.mdcrd -ref protein_min2.rst
   2. Postępuj zgodnie z wymaganymi argumentami: -x PLIK zestawy współrzędnych zapisane na trajektorii MD.
   3. Określ opcje w pliku wejściowym heat.in:
      &cntrl powiedział:
      imin=0, irest=0, ntx=1,
      nstlim=25000, dt=0,002,
      ntc=2, ntf=2,
      cięcie = 10,0, NTB = 1,
      ntpr=500, ntwx=500,
      ntt=3, gamma_ln=2,0,
      tempi=0,0, temp0=300,0,
      ntr=1, maska krępująca=':1-517',
      restraint_wt=1,0,
      nmropt=1
      /
      &wt TYPE='TEMP0',
      istep1=0, istep2=25000,
      wartość1=0,1, wartość2=300,0 /
      &wt TYPE='KONIEC' /
      UWAGA: Opcje wprowadzania: imin=0 uruchom MD; irest=0 uruchamia nową symulację; ntx=1 z pierwszego pliku nie są odczytywane żadne prędkości początkowe; nstlim=25000 liczba kroków MD; dt=0,002 kroku czasowego (ps); ntc=2 wiązania zawierające wodór są ograniczone za pomocą algorytmu SHAKE; NTF=2 Siły dla wiązań ograniczonych nie są obliczane; ntwx=500 współrzędnych jest zapisywanych do pliku mdcrd co krok ntwx ; ntt=3 Regulacja temperatury Langevin; gamma_ln=2,0 częstotliwość kolizji dla dynamiki Langevina (ps⁻¹); tempi=0,0 temperatura początkowa; temp0=300.0 temperatura odniesienia; Odczytywane są parametry nmropt=1 określone na liście nazw &wt ; TYPE='TEMP0' zmienia temperaturę docelową.

4. Równowaga

UWAGA: Ten etap jest niezbędny do dostosowania gęstości wody i uzyskania stanu równowagi białka.

1. Wykonać równoważenie w temperaturze 300 K bez żadnych ograniczeń (500 ps, stałe ciśnienie).
   1. Użyj equil.in i protein_heat.rst jako danych wejściowych: pmemd -O -i equil.in -p białko.prmtop
      -c protein_heat.rst -o protein_equil.out -r protein_equil.rst -x protein_equil.mdcrd.
   2. Określ opcje w pliku wejściowym equil.in:
      &cntrl powiedział:
      imin=0, irest=1, ntx=5,
      nstlim=250000,
      dt=0,002,
      ntc=2, ntf=2,
      cięcie = 10,0, NTB = 2, NTP = 1, taup = 2,0,
      NTPR=1000, NTWX=1000, NTWR=50000,
      ntt=3, gamma_ln=2,0,
      temp0=300.0
      /
      UWAGA: Opcje wprowadzania: irest=1 uruchom ponownie symulację; ntx=5 współrzędnych i prędkości są odczytywane z wcześniej wygenerowanego pliku rst ; NTB=2 narzucone są granice okresowe, stałe ciśnienie; NTP=1 Izotropowe skalowanie ciśnienia; taup=2,0 czas relaksacji ciśnienia (ps); ntwr=50000 Na każdym kroku NTWR zapisywany jest pierwszy plik, co zapewnia odzyskanie danych po awarii.

5. Dynamika produkcji

1. Po pomyślnym osiągnięciu równowagi należy przeprowadzić symulację produkcji MD (10 ns lub więcej) przy stałym ciśnieniu i wygenerować plik trajektorii do późniejszej analizy struktury białka.
   1. Użyj prod.in i protein_equil.rst jako danych wejściowych: pmemd -O -i prod.in -p białko.prmtop
      -c protein_equil.rst -o protein_prod.out -r protein_prod.rst -x protein_prod.mdcrd.
   2. Określ opcje w pliku wejściowym prod.in:
      &cntrl powiedział:
      imin=0, irest=1, ntx=5,
      nstlim=5000000,
      dt=0,002,
      ntc=2, ntf=2,
      cięcie = 10,0, NTB = 2, NTP = 1, taup = 2,0,
      NTPR=1000, NTWX=1000, NTWR=50000,
      ntt=3, gamma_ln=2,0,
      temp0=300.0, ig=-1
      /
      UWAGA: Równoległa wersja pmemd (pmemd. MPI) lub wersja akcelerowana przez GPU (pmemd.cuda) może być używana w klastrach komputerowych i superkomputerach. Długa symulacja MD może być podzielona na kilka segmentów i wykonywana sekwencyjnie. Zdecydowanie zaleca się ustawienie ig=-1 (opcja losowego seeda) dla każdego ponownego uruchomienia symulacji. Programy ptraj lub cppptraj mogą być używane do analizy i przetwarzania trajektorii współrzędnych. Więcej informacji można znaleźć w Podręczniku użytkownika oprogramowania.

Results

Niniejszy protokół może być z łatwością zastosowany w badaniach nad potranslacyjną modyfikacją kaspaz lub mutacji patogennych. W tej sekcji zilustrowano przebieg modelowania MD (ryc. 1), który został z powodzeniem wykorzystany w badaniu kaspazy-2⁷. Stosując mutagenezę in vitro ukierunkowaną na miejsce potencjalnych miejsc fosforylacji (Ser/Thr do Ala) i podejścia biochemiczne, wykazano, że mutacja Ser384Ala zapobiegała przetwarzaniu kaspazy-2 i blokowała aktywność enzymatyczną oraz indukcję apoptotycznej śmierci komórki (rysunek uzupełniający 1). Jednak ani analiza spektrometrii mas, ani technologia Phos-Tag nie potwierdziły, że Ser384 ulega fosforylacji⁷. Aby zrozumieć, w jaki sposób Ser384 reguluje aktywność kaspazy-2, przeprowadzono modelowanie MD trójwymiarowej struktury białka (ryc. 1).

Modele molekularne dzikich i zmutowanych form kaspazy-2 zostały skonstruowane przy użyciu struktury krystalicznej 1pyo (dostępne struktury kaspazy-2 są wymienione w tabeli uzupełniającej 1). Mutant Ser384Ala powstał w wyniku usunięcia atomu O^γ z reszty Ser384 (w PDB reszty Ser i Ala wyróżniają się posiadaniem atomu O^γ ). Współrzędne wodoru są zwykle nieobecne w strukturach krystalicznych. W związku z tym do struktury białka dodano atomy wodoru, a następnie poddano go solwatacji w warstwie wody TIP3P o grubości 12 A, aby umożliwić dalsze symulacje rozpuszczalnika. Jony sodu zostały dodane w celu zneutralizowania układu. Uzyskane modele wyjściowe kaspazy-2 poddano minimalizacji energii, zrównoważeniu, a następnie symulacji MD 10 ns zgodnie z protokołem modelowania MD, z wykorzystaniem plików danych kontrolnych min1.in, min2.in, heat.in, equil.in i prod.in .

W strukturze krystalicznej kaspazy-2 Ser384 wraz z Arg219 i Arg378 biorą udział w tworzeniu powierzchni ubytku w miejscu aktywnym. Arg219 i Arg378 tworzą wiązania wodorowe z grupą karboksylową substratu, podczas gdy Ser384 nie interweniuje w bezpośrednich oddziaływaniach z substratem. Symulacje MD potwierdziły, że substytucja Ser384Ala nie wpłynęła na reszty katalityczne Cys320 (nukleofil) i His277 (zasada ogólna), ale wywołała poważną zmianę konformacyjną w Arg378. Jego grupa guanidynowa zwróciła się w kierunku rozpuszczalnika objętościowego, tak że atom N^ε nie mógł utworzyć niezbędnego wiązania wodorowego z grupą karboksylową substratu (ryc. 1). W enzymie natywnym zachodzi oddziaływanie elektrostatyczne między atomem O^γ Ser384 (częściowy ładunek ujemny) a grupą guanidynową Arg378 (ładunek dodatni). Jednak substytucja seryny najwyraźniej zakłóca tę interakcję. W ten sposób wykazano, że substytucja Ser384Ala wpłynęła na rozpoznawanie substratu przez reszty argininy w miejscu aktywnym kaspazy-2, upośledzając aktywność enzymatyczną i zdolność do wywoływania apoptotycznej śmierci komórki. Odkryty mechanizm wydaje się ewolucyjnie konserwatywny i wspólny dla innych członków rodziny kaspaz. Tym samym realizacja symulacji MD pozwoliła na potwierdzenie wyników biochemicznych i uzyskanie nowych informacji na temat struktury molekularnej aktywnego centrum kaspaz.

Rysunek 1: Proces modelowania MD wykorzystany do badania struktury kaspazy. Kaspaza-2 typu dzikiego i jej mutant Ser384Ala zostały zbadane zgodnie z instrukcjami w sekcji protokołu. Wykazano, że substytucja Ser384Ala indukuje ważną zmianę konformacyjną w reszcie miejsca aktywnego Arg378. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek uzupełniający 1: Funkcja kaspazy-2 w śmierci komórki. W odpowiedzi na bodźce zewnętrzne i wewnętrzne, kaspaza-2 typu dzikiego może być aktywowana przez mechanizm autoproteolityczny. Aktywna kaspaza-2 rozszczepia Bid, co z kolei sprzyja przenikaniu błony zewnętrznej mitochondriów i apoptotycznej śmierci komórki. Mutacja Ser384Ala zapobiega aktywacji kaspazy-2 i indukcji śmierci komórki. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Tabela uzupełniająca 1: Struktury kaspazy-2 dostępne w Banku Danych o Białkach. Struktury są sortowane według daty wydania. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Plik uzupełniający 1: Różne kroki edytowania pliku PDB. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Discussion

Opisane podejście MD pozwala na modelowanie zarówno dzikich, jak i zmutowanych form kaspazy przy użyciu pakietów symulacji biomolekularnych. Omówiono tu kilka istotnych zagadnień związanych z metodologią. Po pierwsze, reprezentatywna struktura krystaliczna kaspazy musi zostać wybrana z Banku Danych o Białkach. Co ważne, dopuszczalne są zarówno monomeryczne, jak i dimeryczne formy kaspazy. Dobrym pomysłem jest wybór struktur o wysokiej rozdzielczości z minimalną liczbą brakujących pozostałości. Stan protonacji niektórych reszt można ustawić ręcznie w wejściowym pliku PDB. Na przykład na rysunku 1 atom wodoru został przyłączony do atomu N^ε2 (forma HIE) reszty katalitycznej His277. Po drugie, wokół białka należy utworzyć pudełko z rozpuszczalnikiem w celu przeprowadzenia dalszych symulacji rozpuszczalnika jawnego. Minimalizacja energii jest wymagana do optymalizacji współrzędnych dodawanych atomów wodoru i cząsteczek wody. Po trzecie, ogrzewanie i równoważenie muszą być przeprowadzone przed symulacją dynamiki produkcji. Na etapie ogrzewania należy upewnić się, że ubytki i kieszenie wiążące na powierzchni białka wypełnią się cząsteczkami wody (w razie potrzeby można zwiększyć liczbę kroków MD). Na etapie równowagi nabycie konformacji równowagowej białka musi zostać potwierdzone poprzez analizę odchylenia średniej kwadratowej jego atomów szkieletu od pozycji początkowych¹². Po czwarte, konieczne jest monitorowanie zmian konformacyjnych struktury białka podczas symulacji dynamiki produkcji. W tym celu należy nałożyć ramy trajektorii na strukturę wyjściową poprzez dopasowanie atomów szkieletu, a następnie przeanalizować zmiany konformacyjne za pomocą narzędzia do wizualizacji molekularnej (VMD, PyMOL itp.).¹⁷. W razie potrzeby można zwiększyć liczbę kroków MD i/lub podzielić symulację na kilka segmentów wykonywanych sekwencyjnie. Po piąte, zaleca się korzystanie z akcelerowanej przez GPU wersji programu symulacyjnego MD (pmemd.cuda), której wydajność znacznie przewyższa osiągalną przez tradycyjną implementację procesora^14,18.

Możliwym ograniczeniem opisanej metody jest dostępność określonych struktur kaspazy w Banku Danych o Białkach. Jednak ponad 900 wpisów PDB znajduje się w żądaniu "kaspazy", co wskazuje, że struktury kaspazy zostały szczegółowo zbadane. Pewne trudności mogą pojawić się, gdy struktura krystaliczna jest uzyskiwana w niskiej rozdzielczości (tj. na zgrubnym poziomie szczegółowości) lub brakuje w niej niektórych fragmentów ważnych dla funkcji kaspazy.

Podsumowując, podejścia do modelowania MD okazały się skuteczne w przewidywaniu zmian strukturalnych białek po mutacjach ich genów, modyfikacjach lub interakcjach międzycząsteczkowych. Zastosowanie symulacji MD w dziedzinie śmierci komórki otwiera ogromne możliwości badania molekularnych mechanizmów regulacji kaspazy poprzez modyfikacje potranslacyjne. W związku z tym długoterminowa symulacja MD może ocenić dynamiczne zachowanie regionów funkcjonalnych i potencjalny wpływ podstawiania aminokwasów w celu wyjaśnienia przyczyn molekularnych związanych ze zmutowaną lub zmodyfikowaną kaspazą-2, a także innymi kaspazami. Na przykład mutacje typu missense genów kaspazy inicjującej (kaspaza-2 / kaspaza-8 / kaspaza-9 / kaspaza-10) wykryto w nowotworach przewodu pokarmowego oraz w nowotworach ośrodkowego i obwodowego układu nerwowego¹⁹. Modelowanie kaspaz metodą MD jest skutecznym podejściem in silico do zrozumienia mechanizmów regulujących zaprogramowaną śmierć komórki i związane z nią zaburzenia oraz do opracowania nowych skutecznych terapii.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bursztyn20	Uniwersytet Kalifornijski w San Francisco		Oprogramowanie do symulacji dynamiki molekularnej http://ambermd.org
Bursztynowe Narzędzia21	Uniwersytet Kalifornijski w San Francisco		Oprogramowanie do modelowania i analizy molekularnej http://ambermd.org