Artykuł metodologiczny

Oddzielenie subpopulacji komórek odpornościowych w próbkach krwi obwodowej od dzieci z mononukleozą zakaźną

DOI:

10.3791/64212

⸱

7 września 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Beijing Key Laboratory of Pediatric Respiratory Infectious Diseases, Key Laboratory of Major Diseases in Children, Ministry of Education, National Clinical Research Center for Respiratory Diseases, Laboratory of Infection and Virology, Beijing Pediatric Research Institute, Beijing Children's Hospital, Capital Medical University, National Center for Children's Health, 2Research Unit of Critical Infection in Children, 2019RU016, Chinese Academy of Medical Sciences

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisujemy metodę łączącą kulki immunomagnetyczne i sortowanie komórek aktywowane fluorescencją w celu izolowania i analizowania zdefiniowanych subpopulacji komórek odpornościowych komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (monocyty, limfocyty T CD4+, limfocyty T CD8+, limfocyty B i komórki NK). Za pomocą tej metody można oczyścić i przeanalizować komórki znakowane magnetycznie i fluorescencyjnie.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mononukleoza zakaźna (IM) to ostry zespół najczęściej związany z pierwotnym Epstein–zakażenie wirusem Barr (EBV). Główne objawy kliniczne to nieregularna gorączka, powiększenie węzłów chłonnych i znaczne zwiększenie liczby limfocytów we krwi obwodowej. Mechanizm patogenny IM jest nadal niejasny; Nie ma skutecznej metody leczenia tej choroby, dostępne są głównie terapie objawowe. Głównym pytaniem w immunobiologii EBV jest to, dlaczego tylko niewielka podgrupa zakażonych osób wykazuje poważne objawy kliniczne, a nawet rozwijają się nowotwory złośliwe związane z EBV, podczas gdy większość osób jest bezobjawowa przez całe życie z wirusem.

Komórki B są najpierw zaangażowane w IM, ponieważ receptory EBV są obecne na ich powierzchni. Komórki NK (Natural Killer) to cytotoksyczne limfocyty wrodzone, które są ważne w zabijaniu komórek zakażonych EBV. Odsetek limfocytów T CD4 + zmniejsza się, podczas gdy liczba limfocytów T CD8 + dramatycznie się zwiększa podczas ostrej infekcji EBV, a trwałość limfocytów T CD8 + jest ważna dla kontroli IM przez całe życie. Te komórki odpornościowe odgrywają ważną rolę w IM, a ich funkcje muszą być identyfikowane oddzielnie. W tym celu monocyty są najpierw oddzielane od komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC) osób z IM za pomocą mikrogranulek CD14, kolumny i separatora magnetycznego.

Pozostałe PBMC są barwione białkiem perydyny-chlorofilu (PerCP)/cyjaniną 5.5 anty-CD3, allofikocyjaniną (APC)/cyjaniną 7 anty-CD4, fikoerytryną (PE) anty-CD8, izotiocyjanianem fluoresceiny (FITC) anty-CD19, anty-CD56 APC i anty-CD16 APC w celu sortowania limfocytów T CD4+, limfocytów T CD8+, limfocytów B i komórek NK za pomocą cytometru przepływowego. Ponadto przeprowadzono sekwencjonowanie transkryptomu pięciu subpopulacji w celu zbadania ich funkcji i mechanizmów patogennych w IM.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wirus Epsteina-Barr (EBV), γ-herpeswirus znany również jako ludzki wirus opryszczki typu 4, jest wszechobecny w populacji ludzkiej i powoduje utajoną infekcję na całe życie u ponad 90% dorosłej populacji1. Większość pierwotnych zakażeń EBV występuje w dzieciństwie i okresie dojrzewania, przy czym u części pacjentów objawia się mononukleoza zakaźna (IM)2, wykazując charakterystyczną immunopatologię, w tym aktywowaną odpowiedź immunologiczną limfocytami T CD8+ we krwi i przejściową proliferację komórek B zakażonych EBV w jamie ustnej gardła3. Przebieg IM może trwać od 2 do 6 tygodni, a większość pacjentów wraca do zdrowia4. Jednak u niektórych osób rozwijają się uporczywe lub nawracające objawy podobne do IM z wysoką zachorowalnością i śmiertelnością, co jest klasyfikowane jako przewlekłe aktywne zakażenie EBV (CAEBV)5. Ponadto EBV jest ważnym wirusem onkogennym, który jest ściśle związany z różnymi nowotworami złośliwymi, w tym nowotworami nabłonkowymi i limfoidalnymi, takimi jak rak nosogardzieli, chłoniak Burkitta, chłoniak Hodgkina (HL) i chłoniak z komórek T/NK6. Chociaż EBV jest badany od ponad 50 lat, jego patogeneza i mechanizm, za pomocą którego indukuje proliferację limfocytów, nie zostały w pełni wyjaśnione.

Kilka badań badało molekularne sygnatury immunopatologii infekcji EBV za pomocą sekwencjonowania transkryptomu. Zhong i in. przeanalizowali profilowanie całego transkryptomu komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC) od chińskich dzieci z IM lub CAEBV, aby stwierdzić, że ekspansja limfocytów T CD8 + występowała głównie w grupie IM 7, co sugeruje, że limfocyty T CD8 + mogą odgrywać główną rolę w IM. Podobnie, inne badanie wykazało niższy odsetek cytotoksycznych limfocytów T i limfocytów B CD19 + specyficznych dla EBV oraz wyższy odsetek limfocytów T CD8 + u pacjentów z IM spowodowanym pierwotnym zakażeniem EBV niż u pacjentów z IM spowodowanym zarówno reaktywacją EBV, jak i innymi czynnikami8. Limfocyty B są najpierw zaangażowane w IM, ponieważ receptory EBV są prezentowane na ich powierzchni. Al Tabaa i wsp. odkryli, że limfocyty B były wieloklonalnie aktywowane i zróżnicowane intoplazmablasty (komórki CD19 +, CD27 + i CD20 − i CD138 −) oraz komórki plazmatyczne (CD19 +, CD27 + i CD20− i CD138 +) podczas IM9. Co więcej, Zhong i in. odkryli, że markery monocytów CD14 i CD64 były regulowane w górę w CAEBV, co sugeruje, że monocyty mogą odgrywać ważną rolę w komórkowej odpowiedzi immunologicznej CAEBV poprzez cytotoksyczność komórkową zależną od przeciwciał (ADCC) i nadpobudliwą fagocytozę7. Alka i wsp. scharakteryzowali transkryptom komórek NK CD16 + posortowanych przez MACSCD56 od czterech pacjentów z IM lub HL i stwierdzili, że komórki NK zarówno z IM, jak i HL miały obniżoną odporność wrodzoną i geny sygnalizujące chemokiny, które mogą być odpowiedzialne za hipoaktywność komórek NK10. Ponadto Greenough i in. przeanalizowali ekspresję genów posortowanych limfocytów T CD8 + z 10 PBMC osób z IM. Stwierdzili, że duża część limfocytów T CD8 + w IM była specyficzna dla wirusa, aktywowana, dzieląca się i przygotowana do wywierania aktywności efektorowej11. Zarówno odpowiedzi zależne od limfocytów T, specyficzne dla EBV, jak i odpowiedzi niespecyficzne za pośrednictwem komórek NK odgrywają istotną rolę podczas pierwotnego zakażenia EBV. Jednak w badaniach tych analizowano tylko wyniki transkryptomu zróżnicowanej mieszaniny komórek odpornościowych lub tylko pewnej subpopulacji limfocytów, co nie jest wystarczające do kompleksowego porównania cech molekularnych i funkcji różnych subpopulacji komórek odpornościowych u dzieci z IM w tym samym stanie chorobowym.

Ten artykuł opisuje metodę, która łączy kulki immunomagnetyczne i sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS) w celu izolowania i analizowania zdefiniowanych subpopulacji komórek odpornościowych PBMC (monocyty, limfocyty T CD4+, limfocyty T CD8+, limfocyty B i komórki NK). Za pomocą tej metody komórki znakowane magnetycznie i fluorescencyjnie można oczyścić za pomocą separatora magnetycznego i FACS lub przeanalizować za pomocą cytometrii przepływowej. RNA można wyekstrahować z oczyszczonych komórek w celu sekwencjonowania transkryptomu. Metoda ta umożliwi charakterystykę i ekspresję genów różnych komórek odpornościowych w tych samych stanach chorobowych osób z IM, co poszerzy naszą wiedzę na temat immunopatologii zakażenia EBV.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Próbki krwi pobrano od pacjentów z IM (n = 3), zdrowych nosicieli EBV (n = 3) i dzieci niezakażonych EBV (n = 3). Ochotnicy zostali zrekrutowani z Pekińskiego Szpitala Dziecięcego, Stołecznego Uniwersytetu Medycznego, a wszystkie badania zostały zatwierdzone etycznie. Aprobata etyczna została uzyskana przez Komisję Etyczną Szpitala Dziecięcego w Pekinie, Stołeczny Uniwersytet Medyczny (numer zgody: [2021]-E-056-Y). Zrezygnowano ze świadomej zgody pacjentów, ponieważ w badaniu wykorzystano tylko pozostałe próbki do badań klinicznych. Wszystkie dane zostały w pełni pozbawione elementów pozwalających na identyfikację i zanonimizowane w celu ochrony prywatności pacjentów.

1. Izolacja PBMC od krwi obwodowej

  1. Pobrać świeżą krew obwodową (2 ml) od pacjentów z IM do probówek K3EDTA za pomocą standardowego nakłucia dożylnego.
    UWAGA: Proces musi być szybki, aby utrzymać żywotność komórek.
  2. Rozcieńczyć krew obwodową do podwójnej objętości solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) i ułożyć ją na pożywce do separacji ludzkich limfocytów (gęstość: 1,077 ± 0,001 g/ml) w probówce wirówkowej o pojemności 15 ml.
    UWAGA: Stosunek objętości krwi, PBS i pożywki separacyjnej wynosił 1:1:1. Powoli dodawaj krew do pożywki separacyjnej i natychmiast odwiruj, aby uniknąć osadzania się krwi w pożywce separacyjnej.
  3. Wirować przy 800 × g przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Przenieść środkową warstwę (wzbogacone PBMC) do kolejnej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml.
    UWAGA: Po odwirowaniu na dnie probówki znajdują się erytrocyty, środkowa warstwa to pożywka separacyjna, górna warstwa to osocze, a pomiędzy warstwą osocza a warstwą cieczy separacyjnej znajdowały się PBMC (w tym limfocyty i monocyty).
  4. Przemyć PBMC 10 ml PBS i odwirować przy 800 × g przez 20 minut w temperaturze pokojowej; ostrożnie wyrzucić sklarowany osad.
  5. Powtórzyć mycie i odwirowanie (krok 1.4) 2 x. Ponownie zawiesić PBMC z 1 ml PBS w probówce do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml i policzyć komórki za pomocą automatycznego licznika na bazie błękitu trypanowego.

2. Izolacja monocytów CD14 + z PBMC za pomocą mikrogranulek CD14

  1. Przygotować roztwór buforowy zawierający 0,5% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 2 mM EDTA w PBS (pH 7,2). Utrzymuj bufor w niskiej temperaturze (2−8 °C).
    UWAGA: Odgazuj bufor przed użyciem, ponieważ pęcherzyki powietrza mogą zablokować kolumnę. Utrzymuj komórki w niskiej temperaturze, aby zapobiec zasklepianiu przeciwciał na powierzchni komórki i niespecyficznemu znakowaniu komórek.
  2. Odwirować PBMC przy stężeniu 300 × g przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Sklarowany osad należy ostrożnie wyrzucić. Zawiesić komórki za pomocą 80 μl buforu. Dodać 20 μl mikrogranulek CD14 do zawiesiny komórek.
    UWAGA: Jeśli istnieje ≤107 PBMC, użyj woluminu wskazanego powyżej. Jeśli jest >107 PBMCs, proporcjonalnie zwiększ wszystkie objętości odczynników i całkowitą objętość.
  3. Mikrogranulki CD14 i komórki dobrze wymieszać w probówce do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml i inkubować przez 15 minut w lodówce o temperaturze 4 °C. Przemyć PBMC 1 ml buforu i odwirować w stężeniu 300 × g przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Całkowicie odrzucić supernatant. Zawiesić komórki za pomocą 500 μl buforu.
    UWAGA: Jeśli istnieje ≤108 PBMC, użyj woluminu wskazanego powyżej. Jeśli jest >108 PBMC, proporcjonalnie zwiększ objętość bufora.
  4. Separacja magnetyczna z kolumnami:
    1. Umieść kolumnę na magnetycznym separatorze kulkowym i umyj kolumnę 3 ml buforu. Dodaj zawieszenie komórki (z kroku 2.3) do kolumny.
    2. Zebrać nieznakowane komórki, które przechodzą przez kolumnę, do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml i przemyć kolumnę 3 ml buforu. Przemyć kolumnę buforem o pojemności 3 x 3 ml. Zebrać wszystkie ścieki do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml.
    3. Umieścić kolumnę w nowej probówce wirówkowej o pojemności 15 ml. Dodać 5 ml buforu do kolumny. Mocno wciśnij tłok do kolumny, aby natychmiast wypłukać magnetycznie oznakowane komórki do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml.
    4. Odwirować znakowane magnetycznie komórki o masie 300 × g przez 5 minut i usunąć supernatant. Ponownie zawiesić komórki w 500 μl PBS w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml w celu wykorzystania w późniejszym sekwencjonowaniu transkryptomu.

3. Oddzielenie populacji limfocytów od PBMC poprzez fluorescencyjnie znakowane barwienie przeciwciałami i FACS

  1. Odwirować nieznakowane komórki (etap 2.4.2) w temperaturze 300 × g przez 5 minut i usunąć supernatant. Ponownie zawiesić komórki w 100 μl PBS w probówce do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml.
  2. Dodać 2 μl każdego znakowanego przeciwciała (CD3, CD4, CD8, CD16, CD19, CD56) do 100 μl zawiesiny komórkowej (objętości i informacje o sprzężonych fluoroforach przeciwciał przedstawiono w tabeli 1), inkubować na lodzie przez 30 minut i chronić przed światłem.
  3. Przemyć komórki 2 razy, dodając 1 ml PBS i odwirowując przy 300 × g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Ponownie zawiesić komórki w 500 μl PBS w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. Delikatnie wymieszaj zawiesinę komórek przed uzyskaniem danych na cytometrze sortera komórek przepływowych.

4. Ustawienie parametrów cytometrii przepływowej

  1. Pobrać 100 μl zawiesiny komórek (patrz sekcja 1) w probówkach do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml zgodnie z wymaganiami i ustawić ujemną próbkę kontrolną, pojedynczą próbkę barwiącą CD3, pojedynczą próbkę barwiącą CD4, próbkę jednobarwną CD8, próbkę jednobarwną CD19 i próbkę barwiącą CD56/CD16.
  2. Dodać 2 μl odpowiedniego przeciwciała znakowanego fluorescencyjnie na 100 μl zawiesiny komórkowej i wirować. Inkubować na lodzie przez 30 minut w ciemności. Wirować przez 5 minut przy stężeniu 300 × g i odessać supernatant. Zawiesić granulki z 500 μl PBS i odwirować.
  3. Uruchom strumień sortowania i opóźnij kropelki za pomocą kulek fluorescencyjnych w następujący sposób:
    1. Otwórz system sortowania komórek, uruchom program włączania, zainstaluj dyszę 85 μm i otwórz strumień sortowania. Ustaw napięcie sortowania na 4 500 V, a częstotliwość na 47.
    2. Dostosuj parametry głównie poprzez dostosowanie punktu przerwania kropli głównego przepływu i opóźnienia kropli zgodnie z instrukcjami producenta12. Ustaw pozycję punktu przerwania pierwszej kropli (Drop1) na 275, a Odstęp na 8 w oknie Breakoff (Przerwanie). Włącz tryb automatycznego sortowania Sweet Spot, aby cytometria mogła automatycznie określić wartość amplitudy kropli w celu ustabilizowania strumienia.
    3. Dostosuj opóźnienie kropli do 30,31 w oknie strumienia bocznego, ładując kulki fluorescencyjne, upewniając się, że koraliki osiągają ugięcie przepływu bocznego o >99% w trybie początkowym lub precyzyjnym.
  4. Zapoznaj się ze strategią bramkowania pokazaną w Rysunek 1, aby wykonać bramkowanie w następujący sposób:
    1. Korzystając z wykresu punktowego obszaru rozproszenia do przodu (FSC-A)/obszaru rozproszonego bocznego (SSC-A), narysuj bramkę wielokątną (P1), aby zidentyfikować nienaruszoną populację limfocytów.
    2. Korzystając z wykresu punktowego FSC-A/FSC-height (FSC-H), narysuj bramkę wielokątną (P2), aby zidentyfikować pojedyncze komórki i wykluczyć dublety (Rysunek 1A).
    3. Korzystając z wykresu punktowego CD19 FITC-A/CD3 PerCP-Cy5.5-A, narysuj prostokątną bramkę (P3), aby wybrać limfocyty T CD3 + i komórki B CD19 + (Rysunek 1A,B).
    4. Używając wykresu punktowego CD4 APC-Cy7-A / CD8 PE-A, narysuj prostokątną bramkę, aby wybrać limfocyty T CD4 + i limfocyty T CD8 + (komórki o wysokiej fluorescencji odpowiednio dla tych markerów).
    5. Korzystając z wykresu punktowego CD56/CD16 APC-A/SSC-A, narysuj prostokątną bramkę, aby wybrać komórki NK CD56+/CD16+ (Rysunek 1C).
  5. Dostosować parametry instrumentalne przy użyciu ujemnej próby kontrolnej:
    1. Zainstaluj rurkę kontroli ujemnej w porcie ładowania i kliknij przycisk Załaduj na pulpicie nawigacyjnym akwizycji. Wybierz ustawienia cytometru w oprogramowaniu.
    2. W oknie Inspector (Inspektor) kliknij zakładkę Parameters (Parametry) i dostosuj napięcia FSC, SSC i różnych barwników fluorescencyjnych; FSC: 231, SSC: 512, PE: 549, APC: 615, APC-cyjanina 7: 824, FITC: 555, PerCP-cyjanina 5,5: 663.
  6. Dostosuj kompensację za pomocą pojedynczo barwionych próbek13.
    1. Załaduj kolejno pojedynczo barwione probówki do cytometrii i wybierz Ustawienia cytometru w oprogramowaniu. Kliknij kartę Kompensacja, aby dostosować kompensację.
      UWAGA: Odniesienie do kompensacji cytometrii przepływowej przedstawiono w tabeli 2.

5. Sortowanie komórek i zbieranie danych za pomocą cytometrii przepływowej

  1. Krótko wymieszać zawiesinę komórek (oddzielone PBMC zgodnie z sekcjami 1–3) w celu ponownego zawieszenia komórek przed załadowaniem probówki do cytometru. Pozostałe probówki trzymaj na lodzie.
  2. Dodaj 200 μl FBS do czterech probówek przepływowych, aby uniknąć przywierania posortowanych komórek do ścianki probówki i umieść je w komorze zbiorczej cytometru.
  3. Zbierz limfocyty T CD3 + CD4 +, limfocyty T CD3 + CD8 +, limfocyty B CD3−CD19 + i komórki NK CD3− CD56 + / CD16 + oddzielnie od próbki pacjenta z IM w czterech rurkach przepływowych (Figura 2A).
  4. Odwirować oddzielone komórki w ilości 300 × g przez 5 minut i usunąć supernatant. Dodaj 200 μl odczynnika do izolacji RNA do komórek w celu sekwencjonowania transkryptomu.
  5. Oddziel subpopulacje komórek odpornościowych w próbkach od zdrowych nosicieli EBV i dzieci niezakażonych EBV zgodnie z powyższymi krokami (Rysunek 2B, C).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Odniesienie do strategii bramkowania
Strategia bramkowania zastosowana do sortowania czterech subpopulacji limfocytów jest pokazana na Rysunek 1. Krótko mówiąc, limfocyty są wybierane (P1) na wykresie kropkowym pokazującym ziarnistość (SSC-A) w stosunku do wielkości (FSC-A). Następnie wybierane są pojedyncze komórki (P2) na wykresie kropkowym pokazującym rozmiar (FSC-A) w funkcji rozproszenia do przodu (FSC-H), podczas gdy komórki dubletowe są wykluczane. Limfocyty T CD3...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten stanowi skuteczny sposób sortowania subpopulacji komórek odpornościowych krwi obwodowej. W tym badaniu jako cel badania wybrano próbki krwi żylnej od pacjentów z IM, zdrowych nosicieli EBV i dzieci niezakażonych EBV. Praca z wykorzystaniem krwi obwodowej pacjentów z IM koncentruje się głównie na analizie i określeniu proporcji różnych podzbiorów komórek za pomocą wielokolorowej cytometrii przepływowej. Sekwencjonowanie transkryptomu stosuje się głównie do wykrywania i analizy pewnej subpopulacji limfocytów, ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez Chińską Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych (82002130), Pekińską Fundację Nauk Przyrodniczych (7222059) oraz Fundusz Innowacji CAMS dla Nauk Medycznych (2019-I2M-5-026).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
APC anty-ludzki CD16Biolegend302012Przeciwciało fluorescencyjne 
APC anty-human CD56 (NCAM)Biolegend362504Przeciwciało fluorescencyjne 
APC/Cyjanina7 anty-ludzka CD4Biolegend344616Przeciwciało fluorescencyjne 
Automatyczny licznik komórekBIO RADTC20Liczba komórek
BD FACSAria aktywowana fluorescencją  przepływ  komórka  sorter-cytometr (BD FACSAria II)Becton, Dickinson and Company644832Sortowanie komórek
CD14 Mikrokulki, ludzkieMiltenyi Biotec130-050-201mikrogranulki
Szkiełka komórkowectng BIO RAD1450016Liczba komórek
Probówki wirówkoweFalcon3520971515 mL probówka wirówkowa
EDTA (≥ 99%, BioPremium)BeyotimeST1303EDTA
Probówki przeciwzakrzepowe z kwasem etylenodiaminotetraoctowym (EDTA)Becton, Dickinson and Company  367862 Probówki przeciwzakrzepowe EDTA
Przeciwciało fluorescencyjneFITC anty-ludzkie CD19Biolegend302206
Gibco Płodowa surowica bydlęcaThermo Fisher Scientific16000-044Płodowa surowica bydlęca
  Duża prędkość  wirówkaSigma  3K15Wirowanie komórek do probówki wirówkowej 15 ml
  Duża prędkość  WirówkaEppendorf5424RWirowanie komórek do probówki Eppendorf (EP) 1,5 ml
Pożywka do separacji ludzkich limfocytówDakeweDKW-KLSH-0100Ficoll-Paque
LS  Separacja  kolumnyMiltenyi Biotec130-042-401Separacja  kolumny Probówki
mikrowirówekAxygenMCT-150-C1,5 ml Probówka do mikrowirówek
MidiMACS SeparatorMiltenyi Biotec130-042-302Magnetyczny separator kulkowy
PE anty-ludzki CD8Biolegend344706Przeciwciało fluorescencyjne 
PerCP/Cyjanina5.5 anty-ludzka CD3Biolegend344808Przeciwciało fluorescencyjne 
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)BI02-024-1ACSPBS
Polistyrenowe probówki z okrągłym dnemFalcon3522355 ml probówka do cytometru przepływowego
FACS Odczynnik trizolowyAmbion15596024Komórki lizy do ekstrakcji RNA
Zestaw do oznaczania żywotności komórek barwienia błękitem trypanowymBeyotimeC0011Barwienie niebieskim trypanem
  do

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kwok, H., Chiang, A. K. From conventional to next generation sequencing of Epstein-Barr virus genomes. Viruses. 8 (3), 60(2016).
  2. Bu, W., et al. Immunization with components of the viral fusion apparatus elicits antibodies that neutralize Epstein-Barr virus in B cells and epithelial cells. Immunity. 50 (5), 1305-1316 (2019).
  3. Balfour, H. H., et al. Behavioral, virology, and immunologic factors associated with acquisition and severity of primary Epstein-Barr virus infection in university students. Journal of Infectious Diseases. 207 (1), 80-88 (2013).
  4. Luzuriaga, K., Sullivan, J. L. Infectious mononucleosis. New England Journal of Medicine. 362 (21), 1993-2000 (2010).
  5. Fujiwara, S., et al. Current research on chronic active Epstein-Barr virus infection in Japan. Pediatrics International. 56 (2), 159-166 (2014).
  6. Tsao, S. W., Tsang, C. M., Lo, K. W. Epstein-Barr virus infection and nasopharyngeal carcinoma. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B: Biological Sciences. 372 (1732), 20160270(2017).
  7. Zhong, H., et al. Whole transcriptome profiling reveals major cell types in the cellular immune response against acute and chronic active Epstein-Barr virus infection. Scientific Reports. 7 (1), 17775(2017).
  8. Fedyanina, O. S., et al. The nature and clinical significance of atypical mononuclear cells in infectious mononucleosis caused by the Epstein-Barr virus in children. Journal of Infectious Diseases. 223 (10), 1699-1706 (2021).
  9. Al Tabaa, Y., et al. B-cell polyclonal activation and Epstein-Barr viral abortive lytic cycle are two key features in acute infectious mononucleosis. Journal of Clinical Virology. 52 (1), 33-37 (2011).
  10. M, A., et al. Natural Killer cell transcriptome during primary EBV infection and EBV associated Hodgkin Lymphoma in children-A preliminary observation. Immunobiology. 225 (3), 151907(2020).
  11. Greenough, T. C., et al. A gene expression signature that correlates with CD8+ T cell expansion in acute EBV infection. Journal of Immunology. 195 (9), 4185-4197 (2015).
  12. Xia, Y., Gao, Y., Wang, B., Zhang, H., Zhang, Q. Optimizing the method of cell separation from bile of patients with cholangiocarcinoma for flow cytometry. Gastroenterology Research and Practice. , 5436961(2019).
  13. Maecker, H. T., Trotter, J. Flow cytometry controls, instrument setup, and the determination of positivity. Cytometry Part A. 69 (9), 1037-1042 (2006).
  14. Byford, E., Carr, M., Pinon, L., Ahearne, M. J., Wagner, S. D. Isolation of CD4+ T-cells and analysis of circulating T-follicular helper (cTfh) cell subsets from peripheral blood using 6-color flow cytometry. Journal of Visualized Experiments. (143), e58431(2019).
  15. Djaoud, Z., et al. Two alternate strategies for innate immunity to Epstein-Barr virus: One using NK cells and the other NK cells and gammadelta T cells. Journal of Experimental Medicine. 214 (6), 1827-1841 (2017).
  16. Nakid-Cordero, C., Baron, M., Guihot, A., Vieillard, V. Natural killer cells in post-transplant lymphoproliferative disorders. Cancers. 13 (8), 1836(2021).
  17. Forrest, C., Hislop, A. D., Rickinson, A. B., Zuo, J. Proteome-wide analysis of CD8+ T cell responses to EBV reveals differences between primary and persistent infection. PLoS Pathogens. 14 (9), 1007110(2018).
  18. Zamai, L., et al. Understanding the Synergy of NKp46 and co-activating signals in various NK cell subpopulations: paving the way for more successful NK-cell-based immunotherapy. Cells. 9 (3), 753(2020).
  19. Lam, J. K. P., et al. Emergence of CD4+ and CD8+ polyfunctional T cell responses against immunodominant lytic and latent EBV antigens in children with primary EBV infection. Frontiers In Microbiology. 9, 416(2018).
  20. Choi, I. K., et al. Signaling by the Epstein-Barr virus LMP1 protein induces potent cytotoxic CD4(+) and CD8(+) T cell responses. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (4), 686-695 (2018).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Separacja kom rek odporno ciowychwirus Epsteina Barrcytometria przep ywowasortowanie aktywowane fluorescencjkoraliki immunomagnetycznelimfocyty T CD4limfocyty T CD8kom rki natural killer

Powiązane artykuły