Artykuł metodologiczny

Ocena nadwrażliwości mechanicznej wywołanej uszkodzeniem nerwów u szczurów za pomocą operacyjnego testu bólu ustno-twarzowego

4.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/64221

⸱

26 lipca 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Oral and Maxillofacial Surgery, University of Florida, Gainesville, 2Department of Orthodontics, University of Florida, Gainesville, 3Stoelting Co. Wood Dale

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje ocenę mechanicznej nadwrażliwości w modelu szczura neuropatycznego bólu ustno-twarzowego przy użyciu instrumentalnego urządzenia do oceny bólu ustno-twarzowego.

Streszczenie

Ból ma komponenty sensoryczne i afektywne. W przeciwieństwie do tradycyjnych, opartych na odruchach testów bólu, operacyjne testy bólu mogą dawać bardziej istotne klinicznie wyniki, odnosząc się do poznawczych i motywacyjnych aspektów bólu u gryzoni. W pracy przedstawiono protokół oceny nadwrażliwości mechanicznej po przewlekłym zwężeniu nerwów podoczodołowych (CCI-ION) u szczurów z wykorzystaniem instrumentalnego systemu bólu ustno-twarzowego. Przed operacją CCI-ION szczury zostały przeszkolone w użyciu urządzenia do oceny bólu ustno-twarzowego (OPAD), aby pić słodzone mleko skondensowane podczas kontaktu twarzą z metalowymi kolcami i rurką do lizania.

W tym teście szczury mogą wybierać między otrzymywaniem mleka jako pozytywnego wzmacniacza a ucieczką przed awersyjnym bodźcem mechanicznym, który jest wytwarzany przez pionowy rząd małych kolców w kształcie piramidy po każdej stronie otworu dostępu do nagrody. Po 2 tygodniach treningu w OPAD i przed operacją CCI-ION, podstawowe dane dotyczące wrażliwości mechanicznej były rejestrowane przez 5 dni dla każdego szczura podczas 10-minutowej sesji testowej. Podczas sesji system operacyjny automatycznie rejestruje między innymi liczbę aktywacji butelki z nagrodą (liźnięć) i kontaktów twarzy, czas trwania kontaktu i opóźnienie do pierwszego liźnięcia.

Zgodnie z pomiarami wyjściowymi, szczury przeszły operację CCI-ION lub pozorowaną operację. W tym protokole nadwrażliwość mechaniczna została określona ilościowo, mierząc liczbę liźnięć, opóźnienie do pierwszego liźnięcia, liczbę kontaktów i stosunek lizania do kontaktów twarzy (L / F). Dane wykazały, że CCI-ION skutkował istotnym spadkiem liczby lizań i stosunku L/F oraz wzrostem latencji do pierwszego lizania, co wskazuje na nadwrażliwość mechaniczną. Dane te wspierają stosowanie instrumentalnych testów bólu do oceny wrażliwości bólu mechanicznego w przedklinicznych badaniach nad bólem.

Wprowadzenie

Przewlekły ból dotyka miliony Amerykanów rocznie1. Niestety, przewlekły ból jest trudny do leczenia, ponieważ istniejące terapie są stosunkowo nieskuteczne w łagodzeniu przewlekłego bólu i często mają niepożądane skutki uboczne przy długotrwałym stosowaniu2,3,4. Tradycyjne przedkliniczne testy bólu, takie jak test von Freya, opierają się na wynikach odruchowych lub reakcjach stymulowanych bólem5. Chociaż test von Freya jest używany od dziesięcioleci do pomiaru allodynii mechanicznej, jest podatny na kilka czynników zakłócających, w szczególności stronniczość eksperymentatora6. Zastosowanie testów von Freya do oceny bólu ustno-twarzowego jest również problematyczne ze względu na stopień unieruchomienia potrzebny do zabezpieczenia głowy zwierzęcia w celu skutecznego zbadania obszaru twarzy, co może powodować niepożądane skutki stresowe, takie jak nasilenie bólu lub odwrotnie, analgezja wywołana stresem.

Zachowania stymulowane bólem są również podatne na fałszywie pozytywne wyniki7 i nie uwzględniają afektywnego komponentu bólu, który jest integralną częścią ludzkiego doświadczenia bólu8. W związku z tym rośnie zainteresowanie wykorzystaniem instrumentalnych modeli bólu, które oceniają zachowania związane z depresją bólu, które obejmują zarówno sensoryczne, jak i afektywne komponenty bólu, w celu poprawy treści i trafności predykcyjnej w badaniach przedklinicznych. Opisany tutaj test oceny bólu jamy ustnej i twarzy opiera się na paradygmacie nagrody-konfliktu9,10,11. W tym teście gryzoń może wybrać między otrzymaniem pozytywnego wzmacniacza i poddaniem się bodźcowi nocyceptywnemu lub rezygnacją z nagrody i unikaniem bodźca nocyceptywnego, kontrolując w ten sposób ilość odczuwanego bólu. W przeciwieństwie do tradycyjnych testów bólu, test instrumentalny jest niezależny od eksperymentatora i nie jest podatny na fałszywie dodatnie wyniki z powodu niepożądanych efektów uspokajających.

Szkodliwe odczucia z głowy i twarzy są przenoszone przez gałąź oczną, szczękową i żuchwową nerwu trójdzielnego. Uraz lub stan zapalny nerwu trójdzielnego zwiększa wrażliwość neuronów czuciowych na bodźce termiczne lub mechaniczne12,13,14,15. Testy bólu ustno-twarzowego oparte na instrumentach zapewniają automatyczny pomiar termicznego lub mechanicznego bólu ustno-twarzowego przenoszonego przez nerw trójdzielny u gryzoni11,12,16,17,18. Stymulacja bodźcami nieszkodliwymi i szkodliwymi jest ważnym rozróżnieniem między testowaniem termicznej i mechanicznej allodynii i hiperalgezji w okolicy ustno-twarzowej za pomocą OPAD, ponieważ mogą one reprezentować przejawy różnych mechanizmów leżących u podstaw.

W teście termicznym ustno-twarzowym, zwierzęta przyciskają twarz do gładkich termod, aby uzyskać dostęp do nagrody. Termody można ustawić na różne chłodne, ciepłe i gorące temperatury, umożliwiając w ten sposób ocenę zachowania w warunkach neutralnych lub nocyceptywnych. W teście mechanicznym ustno-twarzowym zwierzęta przyciskają twarz do kolczastych prętów podczas badania operacyjnego; Ponieważ te kolce powodują pewien poziom dyskomfortu, gryzonie mogą pić mniej, gdy ich twarze dotykają kolców, a nie gładkich powierzchni termod. W ten sposób instrumentalny test mechaniczny ustno-twarzowy może ocenić wpływ różnych stopni mechanicznej stymulacji nocyceptywnej. Wcześniej wykazaliśmy, że OPAD jest użyteczną i wiarygodną metodą oceny ostrej choroby termicznej9, a także ostrej mechanicznej19, nocycepcji i hiperalgezji.

Ten artykuł opisuje użycie nowo opracowanej wersji OPAD do oceny mechanicznej nocycepcji i nadwrażliwości. Dodatkowo, w ramach walidacji, wykazujemy zdolność CCI-ION do indukowania przewlekłej neuropatii, która skutkuje przewidywalną odpowiedzią w OPAD. Szczegółowo opisano również, jak używać OPAD i powiązanego z nim oprogramowania do szybkiego uzyskiwania i analizowania danych behawioralnych gryzoni.

Protokół

Wszystkie procedury eksperymentalne zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Florydy i były zgodne ze standardami określonymi w Przewodniku National Institutes of Health dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych. W tym miejscu opisano ocenę nadwrażliwości mechanicznej za pomocą OPAD przy użyciu szczurzego modelu neuropatycznego bólu ustno-twarzowego. Schemat osi czasu użytej w badaniu jest pokazany w Rysunek 1. Wszystkie oceny behawioralne zostały przeprowadzone przez eksperymentatorki.

1. Zwierzęta

  1. Samice szczurów rasy Sprague-Dawley (n = 8/grupę, 150-200 g) trzyma się w parach w pomieszczeniu o kontrolowanej temperaturze (22 °C ± 1 °C) w cyklu 12 h:12 h jasno-ciemnym. Zapewnij jedzenie i wodę ad libitum. Trzymaj szczury w obiekcie przez 5 dni w celu aklimatyzacji przed eksperymentami.
  2. Wykonaj operacyjne testy bólu w tym samym dniu tygodnia i o tej samej godzinie (9-11
    3. ).
  3. Pod koniec eksperymentów poddać szczury eutanazji przez dekapitację po znieczuleniu izofluranem.

2. Konfiguracja OPAD

  1. Umieść tacki na mleko, klatki z pleksiglasu i metalowe ruszty podłogowe na OPAD. Podłącz okablowanie do klatek. Wsuń uchwyt na butelkę na metalowy drążek z tyłu urządzenia.
  2. Przygotuj wodę w stosunku 2:1 do słodzonego mleka skondensowanego jako roztwór nagrody, otwierając puszkę słodzonego mleka skondensowanego i wlewając ją do zlewki o pojemności 1 l. Dodaj ~600 ml wody z kranu do 300 ml mleka. Najpierw wymieszaj roztwór za pomocą łyżki, a następnie użyj mieszadła i mieszadła z płytą grzejną. Następnie napełnij butelki z nagrodą roztworem mleka i utrzymuj podstawowy roztwór mleka w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Przykryj bulionowy roztwór mleka folią spożywczą. Podgrzej roztwór mleka przed każdym użyciem. Roztwór mleka w lodówce może krzepnąć po tygodniu. Kiedy krzepnie, może zatkać rurkę do lizania. Dlatego wyrzuć go i przygotuj nowy roztwór podstawowy.
  3. Umieść butelki z mlekiem na uchwycie na butelkę i wyreguluj je tak, aby zwierzę mogło sięgnąć do dziobka. Dokręć lewe pokrętło uchwytu, aby zamocować butelkę na miejscu.
  4. Włącz klatki za pomocą przełącznika na panelu przednim.

3. Konfiguracja protokołu i tworzenie pliku eksperymentu

UWAGA: Najpierw skonfiguruj protokół, aby przeprowadzić eksperyment. Protokół opisuje, w jaki sposób oprogramowanie ANY-maze przeprowadza eksperyment.

  1. Otwórz oprogramowanie. Wpisz hasło. Kliknij Zaloguj mnie lub naciśnij Enter.
  2. Kliknij Nowy pusty eksperyment | Menu protokołu.
    1. Wybierz tryb, który będzie używany przez ten protokół, i nazwij protokół. W obszarze Aparatura kliknij opcję Protokół nienazwany, kliknij sekcję wybierz tryb, którego będzie używał ten protokół, a następnie w obszarze Tryby specyficzne dla sprzętu wybierz opcję Tryb klatki mechanicznej OPAD i kliknij przycisk OK. Następnie nazwij protokół (np. OPAD mechaniczny).
    2. Dodaj klatki OPAD.
      1. W obszarze Aparatura kliknij pozycję Aparatura | Dodaj element znajdujący się w górnej części okienka Protokół | Nowa klatka OPAD | Dodaj wszystkie połączone klatki OPAD.
        UWAGA: Przed dodaniem klatek upewnij się, że wszystkie klatki są włączone.
    3. Dodawanie etapów testów eksperymentalnych.
      1. W obszarze Testowanie kliknij pozycję Etapy | Pierwszy etap i nazwa Etap (np. Dzień bazowy 1). Wpisz 10 minut na czas trwania testu. Aby dodać więcej etapów, kliknij przycisk Dodaj element znajdujący się w górnej części okienka Protokół | Nowy etap.
        UWAGA: Każdy etap odnosi się do sesji, w której wykonywany jest test. Na przykład na 10 dni szkolenia potrzeba 10 etapów. Czas trwania testu można wydłużyć lub skrócić w zależności od projektu eksperymentalnego.
    4. Przypisz grupy leczenia.
      1. W obszarze Dodatkowe informacje kliknij pozycję Grupy leczenia. Sprawdź Użyj grup leczenia | Użytkownik ręcznie przypisze zwierzęta do swoich grup.
        UWAGA: Oprogramowanie, do którego się odwołuje (patrz Tabela materiałów) umożliwia również losowe przypisywanie zwierząt lub w określonej kolejności. Eksperymenty mogą być prowadzone na ślepo. Aby wyświetlić przypisane grupy leczenia, odznacz opcję Przeprowadzaj eksperymenty na ślepo.
    5. Przypisywanie identyfikatorów zwierząt (ID).
      1. Kliknij menu Protokół, a w obszarze Dodatkowe informacje kliknij opcję Identyfikator zwierzęcia i zaznacz opcję Użyj moich identyfikatorów w odniesieniu do zwierząt.
  3. Kliknij menu Eksperyment.
    1. Wpisz tytuł eksperymentu.
    2. Nazwij zabiegi, klikając Wyświetl zabiegi, a następnie wpisz nazwy zabiegów (np. Zabieg 1: CCI-ION, Zabieg 2: pozorny).
    3. Dodawaj zwierzęta i przypisuj zabiegi oraz identyfikatory zwierząt, klikając Wyświetl zwierzęta | Dodaj zwierzęta, wprowadź liczbę zwierząt, które zostaną przebadane, a następnie kliknij przycisk OK. Poczekaj, aż pojawi się lista zwierząt i dodaj identyfikatory zwierząt oraz zabiegi dla każdego szczura.
      UWAGA: Lista statusów pojawiająca się obok identyfikatora zwierzęcia zostanie ustawiona na Normalny na początku badania. Zwierzęta można później usunąć z harmonogramu testów, zmieniając ich status na Wycofane lub Usunięte.
  4. Zapisz protokół, klikając menu Protokół | Zapisz protokół znajdujący się w górnej części okienka Protokół. Wpisz nazwę pliku i hasło oprogramowania (ANY-maze), a następnie kliknij Zapisz.
    UWAGA: Zapisane protokoły można ponownie wykorzystać w nowych eksperymentach.
  5. Zapisz plik eksperymentu, klikając pozycję Plik | Zapisz, wpisz hasło oprogramowania i kliknij przycisk Zapisz.

4. Sesje szkoleniowe i testowe

UWAGA: Przyprowadź szczury do pokoju co najmniej 15 minut przed testem, jeśli pokój testów behawioralnych znajduje się w tym samym pomieszczeniu dla zwierząt. Jeśli są transportowane do pomieszczenia testowego poza obiektem dla zwierząt, należy dać szczurom 1 godzinę na aklimatyzację w pomieszczeniu.

  1. Przed zapisami wyjściowymi trenuj szczury w OPAD przez 2 tygodnie (5 dni w tygodniu, 10 minut/dzień), aby przyciskały twarze do metalowych prętów z kolcami, aby otrzymać roztwór mleka.
    UWAGA: Reprezentatywny obraz kolczastych prętów i szczura wykonującego test jest pokazany na Rysunek 2.
  2. Skonfiguruj sprzęt OPAD.
  3. Włącz klatki za pomocą przełącznika na panelu przednim. Poszukaj zielonego światła na klatce, co oznacza, że klatka jest gotowa do testu.
  4. Kliknij dwukrotnie zapisany plik eksperymentu, aby go otworzyć. Wpisz hasło. Kliknij Zaloguj mnie lub naciśnij Enter.
  5. Poczekaj, aż pojawi się menu Testy. Po lewej stronie ekranu zanotuj liczbę zwierząt i odpowiadającą im klatkę (np. Zwierzę 1 zostanie przetestowane w klatce 1), etap, który zostanie uruchomiony w tym dniu, oraz status testu ("gotowy"). Po prawej stronie ekranu obserwuj tabelę każdego zwierzęcia, która pokazuje liczbę lizań i kontaktów.
  6. Obserwuj ekran klatek, na którym wyświetlany jest identyfikator zwierzęcia, które ma być badane. Umieść każdego szczura w odpowiedniej klatce i dwukrotnie naciśnij przycisk na klatce. Należy pamiętać, że zielone światło zmieni się w pomarańczowe światło po rozpoczęciu testowania, a po zakończeniu sesji testowej usłyszysz dźwięk ostrzegawczy.
  7. Przez pierwsze 2 dni treningu umieść butelki z mlekiem całkowicie w klatce, aby umożliwić szczurom picie mleka bez kontaktu z bodźcem.
  8. W dniach 3-8 treningu, gdy zwierzęta zaczną pić, stopniowo przesuwaj butelki do tyłu, aby zachęcić szczury do przyciśnięcia twarzy do kolczastych prętów.
  9. W dniach 9-10 treningu, gdy zwierzęta w pełni naciskają na kolczaste pręty, a liczba lizań jest spójna (minimum 500 lizań podczas 10-minutowych sesji testowych), zanotuj położenie butelki z mlekiem dla każdego zwierzęcia i użyj tej odległości do zapisów linii podstawowej.
  10. Po 2 tygodniach treningu zbierz dane z podanej odległości od butelki z mlekiem przez 5 dni jako punkt odniesienia (10 min/dzień).

5. Indukcja bólu neuropatycznego ustno-twarzowego i ocena nadwrażliwości mechanicznej

UWAGA: Zgodnie z pomiarami wyjściowymi, szczury przeszły operację CCI-ION, która obejmowała obustronne podwiązanie ION, jak wcześniej opisano20. Szczury kontrolne przeszły pozorowaną operację. W zabiegu nie zastosowano aneggezji przed- ani pooperacyjnej, ponieważ może ona zmienić przebieg neuropatii w czasie. UWAGA: Odpady izofluranu należy przeszukać przez kanistry na węgiel drzewny. Ostrza skalpela i igły należy wyrzucać wraz z odpadami stanowiącymi zagrożenie biologiczne.

  1. Znieczulić szczura w komorze indukcyjnej mieszaninąO2 (1 l/min) i 4% izofluranu i utrzymać stan znieczulenia za pomocą specjalistycznego stożka nosowego na czas trwania zabiegu.
  2. Umieść znieczulonego szczura na stole chirurgicznym i unieruchomij go. Utrzymuj temperaturę ciała na poziomie 37 °C za pomocą poduszki grzewczej. Nałóż maść okulistyczną na oczy, aby zapobiec ich wysuszeniu. Sprawdź głębokość znieczulenia, ściskając palec u nogi i rozpocznij procedurę, gdy odruch wycofania palca u nogi nie jest już obserwowany.
  3. Wykonaj zabieg chirurgiczny pod mikroskopem stereoskopowym. Otwórz usta za pomocą retraktorów i schowaj wargę za pomocą małego klipsa.
  4. Wykonaj małe nacięcie między dziąsłem grzbietowym a wargą za pomocą ostrza skalpela (#15). Delikatnie odetnij miękką tkankę za pomocą końcówki ostrza skalpela, aby odsłonić gałąź ION.
  5. Umieść dwie chromowe ligatury jelitowe (#5-0) wokół ION za pomocą, zgiętej igły strzykawki.
  6. Zamknij ranę za pomocą kleju tkankowego.
  7. W przypadku operacji pozorowanej należy odsłonić jon przy użyciu tej samej procedury, ale nie podwiązywać nerwu.
  8. Po zabiegu podawaj gryzoniom zmiękczoną mlekiem karmę przez 2 dni, aby zachęcić do jedzenia i zapobiec odwodnieniu.
  9. Testuj szczury w OPAD dzień po operacji przez 3 kolejne dni, a następnie 3 dni w tygodniu (np. w każdy wtorek, czwartek i piątek) przez kolejne tygodnie, aż liczby lizawek osiągną wartości wyjściowe.
    UWAGA: Czas trwania wrażliwości mechanicznej wywołanej przez CCI-ION może zależeć od płci, szczepu użytego gryzonia i wydajności eksperymentatora. W związku z tym wskazanie określonego czasu testowania zwierząt może nie być dokładne. W związku z tym testowanie, dopóki liczby lizawek nie osiągną wartości wyjściowych, jest dokładniejsze.

6. Czyszczenie urządzenia

  1. Po zakończeniu testowania zamknij oprogramowanie, klikając ikonę x w prawym górnym rogu i poczekaj, aż dane zostaną zapisane automatycznie.
  2. Wyłącz klatki za pomocą przełącznika na panelu przednim.
  3. Odłącz przewody od metalowych kratek podłogowych. Wyjmij i umyj tacki na mleko, klatki z pleksiglasu, metalowe kratki podłogowe i uchwyty na butelki płynem do naczyń. Połóż wszystko na suszarce.
  4. Przetrzyj metalowe pręty z kolcami, urządzenie testowe i stoły laboratoryjne za pomocą 70% alkoholu izopropylowego.
    UWAGA: Z instrumentami należy obchodzić się ostrożnie. Używaj miękkich szczotek do czyszczenia butelek z mlekiem i rurek do lizania. Brudny sprzęt może prowadzić do gromadzenia się bakterii.

7. Analiza danych

  1. Kliknij dwukrotnie plik eksperymentu, aby go otworzyć.
  2. Kliknij menu Wyniki. Wybierz środki (np. lizanie, kontakt) lub dni testowe, które chcesz zobaczyć.
  3. Kliknij opcję Tekst, Wykres lub Statystyczne znalezione w górnej części panelu Wyniki, aby wyświetlić tekst, wykres lub raport analizy statystycznej.
  4. Aby wyświetlić nieprzetworzone dane, kliknij menu Dane. Kliknij przycisk Zapisz w górnej części panelu Dane, aby zapisać dane jako arkusz kalkulacyjny, lub kliknij przycisk Wyślij, aby otrzymać je pocztą e-mail.
  5. Aby zmienić lub dodać więcej zmiennych do wyświetlenia, kliknij Wybierz dane, wybierz miary, a następnie kliknij Wyświetl arkusz kalkulacyjny.
  6. analiza statystyczna
    1. Automatycznie określ liczbę zagrywek i kontaktów oraz opóźnienie do pierwszego zagrywki z oprogramowania i wyeksportuj dane z oprogramowania do arkusza kalkulacyjnego.
    2. Oblicz stosunek L/F jako wskaźnik nadwrażliwości, dzieląc liczbę lizań przez liczbę kontaktów21,22,23.
      UWAGA: W tym badaniu jeden ze szczurów w grupie pozorowanej został wykluczony z badania z powodu niskiej liczby lizań (<500 lizań) przed operacją.
    3. Przeanalizuj istotność statystyczną różnic między L/F, liczbą liźnięć i kontaktami oraz opóźnieniem do pierwszego lizania za pomocą dwukierunkowych powtarzanych pomiarów ANOVA, a następnie wielokrotnych porównań Dunnetta lub testów wielokrotnych porównań Šídáka, w stosownych przypadkach.
      UWAGA: P < 0,05 uznano za statystycznie istotne. Dane przedstawiono jako średnią ± błąd standardowy średniej (SEM).

Wyniki

Przykład polizań butelki z nagrodą oraz kontaktów z metalowymi kolczastymi prętami u jednego szczura w punkcie wyjściowym oraz w 2., 4. i 6. tygodniu po operacji przedstawiono na Rysunku 3. W okresach bezbolesnych szczury zazwyczaj wykazują długie sesje picia (np. w punkcie wyjściowym i podczas regeneracji po CCI-ION: tydzień 6 na obrazie), a po CCI-ION liczba polizań spada, ponieważ zwierzęta nie są w stanie utrzymać kontaktu twarzy z kolczastymi prętami przez dłuższy czas (Rysunek 3A), przy braku istotnych zmian w okresach picia w grupie pozorowanej (Rysunek 3B).

U szczurów z CCI-ION odnotowano istotny spadek liczby polizań do 4 tygodni po operacji oraz wydłużenie czasu do pierwszego polizania w tygodniu operacyjnym (tydzień 0) i 1 tydzień po operacji w porównaniu z wartościami wyjściowymi. W grupie pozorowanej nie stwierdzono istotnych zmian (Rysunek 4A,B). CCI-ION spowodowało zmniejszenie liczby kontaktów, jednak różnica ta nie była istotna (Rysunek 4C). CCI-ION wywołało również istotny spadek wskaźnika L/F, a spadek ten w grupie CCI-ION był większy niż w grupie pozorowanej (Rysunek 4D).

Wyniki te wskazują, że po zastosowaniu CCI-ION szczury wykazują mniejszą tendencję do picia mleka jako nagrody, a wykonanie pierwszego liznięcia zajmuje im więcej czasu, co świadczy o zachowaniu nocyfensywnym. Niemniej jednak CCI-ION nie wpływa na ich chęć dotarcia do mleka. Ponadto spadek stosunku L/F u szczurów z CCI-ION wskazuje na nadwrażliwość mechaniczną, ponieważ L/F jest wyższy w warunkach bezbolesnych.

figure-results-1
Rycina 1Schematyczny przedstawienie projektu badania. Skróty: OPAD = urządzenie do oceny bólu twarzy i żuchwy (orofacial pain assessment device); CCI-ION = przewlekłe uszkodzenie uciskowe nerwów podocznych (chronic constriction injury of the infraorbital nerves). Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

figure-results-2
Rysunek 2Reprezentatywne zdjęcie prętów z kolcami oraz szczura wykonującego test. Pręty z kolcami są wykonane ze stali nierdzewnej. Długość całego pręta wynosi 7 cm. Wysokość kolców wynosi 0,3 cm. Odległość między kolcami wynosi 0,5 cm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3Reprezentatywne próby kontaktu i dane dotyczące lizania u pojedynczej szczura po zabiegu CCI-ION oraz u szczura z grupy sham w trakcie standardowej 10-minutowej sesji testowej w punkcie wyjściowym oraz 2, 4 i 6 tygodni po operacji. Skróty: CCI-ION = przewlekła kontuzja uciskowa nerwów podocznych; AS = po operacji. Aby wyświetlić większą wersję tej ryciny, kliknij tutaj.

figure-results-4
Rysunek 4Rozwój nadwrażliwości mechanicznej po CCI-ION u szczurów Sprague-Dawley. (A) Szczury z CCI-ION (n = 8) wykazywały istotny spadek liczby polizań do 4 tygodni po operacji i (B) an wydłużenie czasu do pierwszego polizania w tygodniu operacyjnym (tydzień 0) oraz 1 tydzień po operacji (**p < 0,01, *p < 0,05: tygodnie po operacji w porównaniu z poziomem wyjściowym. #p < 0,05: CCI-ION vs. grupa pozorowana). W grupie pozorowanej nie odnotowano istotnego statystycznie spadku (n = 7, p > 0.05). (C) Operacja CCI-ION lub operacja pozorowana (sham) nie spowodowała żadnych istotnych zmian w liczbie kontaktów. (D) Szczury z CCI-ION wykazały istotny spadek L/F w tygodniu operacyjnym oraz 3 tygodnie po zabiegu, a w 2. tygodniu po operacji zaobserwowano trend spadkowy. W porównaniu z grupą kontrolną (sham), spadek ten był istotnie większy u szczurów z CCI-ION; rozpoczął się on w 1. tygodniu po operacji i utrzymywał się do 3. tygodnia po zabiegu. W grupie kontrolnej nie stwierdzono istotnych różnic (**p < 0,01, *p < 0,05: tygodnie po operacji vs. stan wyjściowy. # p < 0,05: CCI-ION vs sham). Na wykresach czerwona linia reprezentuje grupę CCI-ION, a niebieska linia reprezentuje grupę sham. Dane przedstawiono jako średnią ± SEM. Istotne różnice analizowano za pomocą dwukierunkowej analizy wariancji (ANOVA) z powtarzanymi pomiarami, a następnie odpowiednio za pomocą testów wielokrotnych porównań Šídáka lub Dunnetta. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Dyskusja

Ból wywołany nieszkodliwą mechaniczną stymulacją błony śluzowej twarzy i błony śluzowej wewnątrzustnej jest istotną cechą stanów bólowych ustno-twarzowych, w tym neuralgii nerwu trójdzielnego i zaburzeń stawu skroniowo-żuchwowego24,25. Chociaż ból neuropatyczny nerwu trójdzielnego jest klinicznie dobrze opisany, ocena neuropatycznych zachowań nocyceptywnych u gryzoni jest trudna. Testy bólu mierzące zachowania odruchowe są najczęściej stosowanymi metodami w przedklinicznych badaniach nad bólem. Jednak stres związany z aparaturą testową, niemożność oceny stanu afektywnego i stronniczość eksperymentatora budzą obawy co do użyteczności i trafności testów odruchowych26.

Badanie to wprowadza ocenę wrażliwości mechanicznej w okolicy ustno-twarzowej szczurów, wykazując jej wrażliwość na CCI-ION za pomocą instrumentalnego testu bólu. Ten sam system operacyjny może być również używany do testowania wrażliwości mechanicznej myszy. Należy zauważyć, że szczepy myszy i szczurów mogą wykazywać różnice w odpowiedzi na CCI-ION, a zatem poziomy nadwrażliwości mechanicznej mogą się różnić. Opierając się na naszym doświadczeniu, szczury Sprague-Dawley zazwyczaj rozwijają stabilną nadwrażliwość mechaniczną 2 tygodnie po CCI-ION, zaczynają wracać do zdrowia 4 tygodnie po CCI-ION, a po 6 tygodniach CCI-ION obserwujemy powrót do zdrowia po operacji.

W tym protokole nadwrażliwość mechaniczna została określona ilościowo poprzez pomiar liczby lizań i kontaktów, L/F i opóźnienia do pierwszego lizania. Dane wykazały, że CCI-ION spowodował zmniejszenie L/F i liczby reakcji na lizanie oraz zwiększenie opóźnienia pierwszej odpowiedzi na lizanie, co wskazuje, że zwierzęta nie chciały przyciskać twarzy do kolczastych prętów z powodu zwiększonej wrażliwości na ból ustno-twarzowy.

OPAD to test nagrody-konfliktu, w którym zwierzęta muszą znosić bodźce nocyceptywne, aby uzyskać dostęp do smacznej nagrody. Na lizanie w teście może mieć wpływ zachowanie apetytywne. Ponadto w tym badaniu wykorzystaliśmy szczury, które miały zarost. Opierając się na wcześniejszych doświadczeniach z operacyjnymi testami bólu, wśród gryzoni szczepy bezwłose są lepsze do wykrywania kontaktów twarzowych16; Jednak w momencie publikacji bezwłose szczepy szczurów nie były już dostępne na rynku. Można to uznać za ograniczenie badania. Ponieważ również użyliśmy tylko samic szczurów Sprague-Dawley, należy spodziewać się związanych z płcią i szczepem różnic w reakcjach bólowych.

Istnieje również kilka krytycznych kroków w celu zapewnienia optymalnych wyników testu. Dokładne dane dotyczące lizania i kontaktu muszą być wyświetlane odpowiednio jako jednolite czerwone i białe bloki w oprogramowaniu odniesienia (patrz rysunek 3). Odległość między kolcami a butelką z mlekiem ma kluczowe znaczenie dla powodzenia eksperymentu. Jeśli końcówka butelki z mlekiem jest zbyt daleko wysunięta do przodu, zwierzę nie nawiąże kontaktu z kolcami, a oprogramowanie nie zarejestruje poprawnie kontaktów ani nie poliże numerów. I odwrotnie, jeśli butelka z mlekiem jest zbyt daleko z tyłu, kontakty zostaną zarejestrowane, ale zwierzę nie będzie w stanie dosięgnąć mleka. Podczas sesji treningowych dane dotyczące lizania mogą być wyświetlane jako ciągłe białe bloki, ponieważ końcówka butelki z mlekiem jest zbyt wysunięta do przodu. Zmienia się w czerwone, stałe bloki, gdy butelka z mlekiem zostanie popchnięta do tyłu. Z jakiegoś powodu, jeśli dane dotyczące lizania zaczną pojawiać się jako białe bloki z odległości, która została odnotowana, pomocne może być lekkie popchnięcie butelki i lekkie przesunięcie uchwytu na mleko w dół/w górę.

Kilka punktów można również uznać za ograniczenia opisanego tutaj systemu bólu instrumentalnego ustno-twarzowego. Szkolenie gryzoni jest konieczne i trwa tygodnie. Przed każdą sesją testową konieczne jest ograniczenie pokarmu u myszy, ale nie u szczurów. Wykazano, że myszy niena czczo mają niską i niespójną liczbę lizania w porównaniu z myszami na czczo27. Ponieważ system OPAD jest modelem nagrody-konfliktu, może mieć na niego wpływ zachowanie apetytywne zwierząt lub lek wpływający na apetyt. Posiadanie wielu aparatów jest również korzystne dla skrócenia całkowitego czasu testowania zwierząt, co może zwiększyć koszty. Jednak testy bólu instrumentalnego ustno-twarzowego są nadal korzystne w porównaniu z konwencjonalnymi testami opartymi na odruchach, ponieważ umożliwiają testowanie wielu zwierząt w tym samym czasie i ograniczają interakcję zwierzę-eksperymentator.

Warunkowanie instrumentalne w stanach bólowych modyfikuje zachowanie ludzi i zwierząt zgodnie z ich konsekwencjami28. Stosowanie modelu nagroda-konflikt jest zatem korzystne dla oceny stanów bólowych, ponieważ pozwala zwierzętom na wykonywanie reakcji instrumentalnych. Jest to bardziej istotne klinicznie, ponieważ cechy zachowań instrumentalnych obejmują intencję, motywację i, zazwyczaj, przetwarzanie korowe29. Ponieważ zwierzęta dobrowolnie zbliżają się do butelki z nagrodą i mogą swobodnie wycofać się z kolczastych prętów w dowolnym momencie, integruje to wyższe ośrodki mózgu i pozwala na ocenę stanów afektywno-motywacyjnych związanych z bólem10. W związku z tym instrumentalne testy bólu dostarczają lepszych danych podczas oceny bólu i leków przeciwbólowych in vivo. Pomagają również zrozumieć procesy nocyceptywne w układzie trójdzielnym, przyczyniając się w ten sposób do rozwoju pola bólu ustno-twarzowego.

Oświadczenia

John K. Neubert i Robert M. Caudle są wynalazcami OPAD. Stoelting Co. jest producentem OPAD, a Richard Mills jest pracownikiem Stoelting. Opłata za publikację została uiszczona przez Stoelting Co. Richard Mills, John K. Neubert i Robert M. Caudle są poprzednimi właścicielami Velocity Laboratories, firmy, która zapewnia płatne testy behawioralne przy użyciu instrumentalnych testów bólu.

Podziękowania

To badanie jest finansowane przez Fundację Badań nad Bólem Twarzy.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Oprogramowanie do śledzenia wideo ANY-mazeStoelting60000
Szczotki do czyszczenia butelekDOWOLNEDOWOLNE Szczotki o różnych rozmiarach do butelek i tubek
Chromowy szew jelitowy rozmiar 5-0Ethicon687-G
Mydło do naczyńDOWOLNEpłynie
DOWOLNADOWOLNA
wersja GraphPad Prism 9.3.1 Oprogramowanie GraphPad, San Diego, Kalifornia
Mieszadło magnetyczne z płytą grzejnąBenchmark ScientificH4000-HS
IsofluranPatterson Veterinary07-893-8440Pivetal
Alkohol izopropylowyFisher Scientific60-001-56
Maść okulistycznaDechraPuralube Vet Maść, wazelina maść okulistyczna
Instrumentalne urządzenie do oceny bólu (OPAD)System Stoelting67500
Zbiornik
Medyczny ręcznik papierowyDOWOLNA DOWOLNA
Plastikowa folia spożywczaDOWOLNADOWOLNA
Wielokątne mieszadłaFisher Scientific14-512-124
Szklane zlewki wielokrotnego użytku Berzelius (1 L)Fisher Scientific
Ostrze skalpela #15FST10015-00
System znieczulania małych zwierzątVetFloVetFlo-1205S
ŁyżkaDOWOLNA DOWOLNA
Szczury Sprague-Dawley, samiceCharles River Laboratories,  USA
Stereoskopowy mikroskop wysięgnikowyOmanoOM2300S-GX4
Słodzone mleko skondensowaneBorden 
Klej tkankowy3M Vetbond1469SB
Poduszka grzewcza i pompa z obiegiem wodyGaymarModel TP-500
GĄBKA do naczyń w tlenu FB1021000 marki Eagle

Bibliografia

  1. Dahlhamer, J., et al. Prevalence of chronic pain and high-impact chronic pain among adults - United States, 2016. Morbidity and Mortality Weekly Report. 67 (36), 1001-1006 (2018).
  2. Ab del Shaheed, C., Maher, C. G., Williams, K. A., Day, R., McLachlan, A. J. Efficacy, tolerability, and dose-dependent effects of opioid analgesics for low back pain: A systematic review and meta-analysis. JAMA Internal Medicine. 176 (7), 958-968 (2016).
  3. Chou, R., et al. The effectiveness and risks of long-term opioid therapy for chronic pain: A systematic review for a National Institutes of Health Pathways to Prevention Workshop. Annals of Internal Medicine. 162 (4), 276-286 (2015).
  4. Vowles, K. E., et al. Rates of opioid misuse, abuse, and addiction in chronic pain: A systematic review and data synthesis. Pain. 156 (4), 569-576 (2015).
  5. Barrot, M. Tests and models of nociception and pain in rodents. Neuroscience. 211, 39-50 (2012).
  6. Bove, G. Mechanical sensory threshold testing using nylon monofilaments: The pain field's "tin standard". Pain. 124 (1-2), 13-17 (2006).
  7. Negus, S. S. Core outcome measures in preclinical assessment of candidate analgesics. Pharmacological Reviews. 71 (2), 225-266 (2019).
  8. Vierck, C. J., Hansson, P. T., Yezierski, R. P. Clinical and pre-clinical pain assessment: Are we measuring the same thing. Pain. 135 (1-2), 7-10 (2008).
  9. Anderson, E. M., et al. Use of the Operant Orofacial Pain Assessment Device (OPAD) to measure changes in nociceptive behavior. Journal of Visualized Experiments. (76), e50336(2013).
  10. Murphy, N. P., Mills, R. H., Caudle, R. M., Neubert, J. K. Operant assays for assessing pain in preclinical rodent models: Highlights from an orofacial assay. Current Topics in Behavioral Neurosciences. 20, 121-145 (2014).
  11. Neubert, J. K., et al. Use of a novel thermal operant behavioral assay for characterization of orofacial pain sensitivity. Pain. 116 (3), 386-395 (2005).
  12. Neubert, J. K., Rossi, H. L., Malphurs, W., Vierck, C. J., Caudle, R. M. Differentiation between capsaicin-induced allodynia and hyperalgesia using a thermal operant assay. Behavioural Brain Research. 170 (2), 308-315 (2006).
  13. Kumada, A., et al. Intradermal injection of Botulinum toxin type A alleviates infraorbital nerve constriction-induced thermal hyperalgesia in an operant assay. Journal of Oral Rehabilitation. 39 (1), 63-72 (2012).
  14. Ma, F., Zhang, L., Lyons, D., Westlund, K. N. Orofacial neuropathic pain mouse model induced by Trigeminal Inflammatory Compression (TIC) of the infraorbital nerve. Molecular Brain. 5, 44(2012).
  15. Deseure, K., Hans, G. H. Chronic constriction injury of the rat's infraorbital nerve (IoN-CCI) to study trigeminal neuropathic pain. Journal of Visualized Experiments. (103), e53167(2015).
  16. Rohrs, E. L., et al. A novel operant-based behavioral assay of mechanical allodynia in the orofacial region of rats. Journal of Neuroscience Methods. 248, 1-6 (2015).
  17. Cha, M., Kohan, K. J., Zuo, X., Ling, J. X., Gu, J. G. Assessment of chronic trigeminal neuropathic pain by the orofacial operant test in rats. Behavioural Brain Research. 234 (1), 82-90 (2012).
  18. Zuo, X., Ling, J. X., Xu, G. Y., Gu, J. G. Operant behavioral responses to orofacial cold stimuli in rats with chronic constrictive trigeminal nerve injury: Effects of menthol and capsazepine. Molecular Pain. 9, 28(2013).
  19. Nolan, T. A., Hester, J., Bokrand-Donatelli, Y., Caudle, R. M., Neubert, J. K. Adaptation of a novel operant orofacial testing system to characterize both mechanical and thermal pain. Behavioural Brain Research. 217 (2), 477-480 (2011).
  20. Rossi, H. L., et al. Characterization of bilateral trigeminal constriction injury using an operant facial pain assay. Neuroscience. 224, 294-306 (2012).
  21. Ramirez, H. E., et al. Assessment of an orofacial operant pain assay as a preclinical tool for evaluating analgesic efficacy in rodents. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 54 (4), 426-432 (2015).
  22. Rossi, H. L., Vierck, C. J., Caudle, R. M., Neubert, J. K. Characterization of cold sensitivity and thermal preference using an operant orofacial assay. Molecular Pain. 2, 37(2006).
  23. Sapio, M. R., et al. Pain control through selective chemo-axotomy of centrally projecting TRPV1+ sensory neurons. Journal of Clinical Investigation. 128 (4), 1657-1670 (2018).
  24. Lambru, G., Zakrzewska, J., Matharu, M. Trigeminal neuralgia: A practical guide. Practical Neurology. 21 (5), 392-402 (2021).
  25. Doshi, T. L., Nixdorf, D. R., Campbell, C. M., Raja, S. N. Biomarkers in temporomandibular disorder and trigeminal neuralgia: A conceptual framework for understanding chronic pain. Canadian Journal of Pain. 4 (1), 1-18 (2020).
  26. Sadler, K. E., Mogil, J. S., Stucky, C. L. Innovations and advances in modelling and measuring pain in animals. Nature Reviews Neuroscience. 23 (2), 70-85 (2022).
  27. Neubert, J. K., et al. Characterization of mouse orofacial pain and the effects of lesioning TRPV1-expressing neurons on operant behavior. Molecular Pain. 4, 43(2008).
  28. Vlaeyen, J. W. S. Learning to predict and control harmful events: Chronic pain and conditioning. Pain. 156, Suppl 1 86-93 (2015).
  29. Vierck, C. J. Animal studies of pain: Lessons for drug development. Emerging Strategies for the Treatment of Neuropathic Pain. Campbell, J. C., et al. , IASP Press. Chapter 23 475-495 (2006).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Przewlek y uraz uciskowyuraz nerwu podocznegoprzedkliniczne badania nad b lemraty model b luocena wra liwo ci mechanicznejparadygmat konfliktu nagrodyanaliza zachowa b lowych
Ocena nadwrażliwości mechanicznej wywołanej uszkodzeniem nerwów u szczurów za pomocą operacyjnego testu bólu ustno-twarzowego
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.