Artykuł metodologiczny

Opracowanie prostego i skutecznego modelu szczura do śródoperacyjnego obrazowania przytarczyc

DOI:

10.3791/64222

⸱

17 sierpnia 2022

 ,  ,  , 
1Key Laboratory of Head & Neck Cancer Translational Research of Zhejiang Province, Zhejiang Cancer Hospital, 2The Cancer Hospital of the University of Chinese Academy of Sciences (Zhejiang Cancer Hospital), 3Institute of Basic Medicine and Cancer (IBMC), Chinese Academy of Sciences

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Do tej pory rozwój metod identyfikacji przytarczyc (PG) jest ograniczony przez brak modeli zwierzęcych w badaniach przedklinicznych. W tym miejscu tworzymy prosty i skuteczny model szczura do śródoperacyjnego obrazowania PG i oceniamy jego skuteczność, wykorzystując nanocząstki tlenku żelaza jako nowy środek kontrastowy PG.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Identyfikacja przytarczyc (PG) jest krytyczną, niezaspokojoną potrzebą w tyreoidektomii. Identyfikacja PG jest trudna w chirurgii tarczycy, ponieważ ma ona kolor podobny do tarczycy. Brak skutecznych modeli zwierzęcych w badaniach przedklinicznych jest poważnym ograniczeniem dla rozwoju technik identyfikacji PG. Protokół ten pozwala na stworzenie prostego i skutecznego modelu szczura do identyfikacji PG. W tym modelu czarne nanocząstki tlenku żelaza (IONP) są wstrzykiwane lokalnie do tarczycy i szybko dyfundują w tarczycy, ale nie w PG. Ujemnie zabarwiony PG i dodatnio zabarwiony tarczyca mogą być łatwo zidentyfikowane gołym okiem bez konieczności stosowania zewnętrznych mikroskopów. Położenie PG można zidentyfikować, zwiększając kontrast kolorów między tarczycą a PG, w oparciu o kolor czarnych IONPs. Ten model szczura jest tani i wygodny do identyfikacji PG, a IONPs są nowym środkiem kontrastowym PG.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przytarczyce (PG) to małe, owalne gruczoły dokrewne znajdujące się na szyi ludzi i innych kręgowców, które produkują i wydzielają parathormony do regulacji i równoważenia poziomu wapnia i fosforu we krwi i kościach1. Ludzie zwykle mają dwie pary PG zlokalizowane za płatami tarczycy w różnych lokalizacjach; rozmiar ludzkiego PG zwykle mierzy 6 mm x 4 mm x 2 mm, przy wadze około 35-40 mg2. Usunięcie lub uszkodzenie PG powoduje niedoczynność przytarczyc (HP), zaburzenie endokrynologiczne charakteryzujące się hipokalcemią i niskim lub niewykrywalnym poziomem parathormonów, które powodują szeroki zakres objawów, od skurczów przypominających skurcze, przez zniekształcone zęby, po przewlekłe choroby nerek. Niektóre z tych powikłań są śmiertelne (np. niewydolność serca i drgawki)3,4,5; dlatego PG jest niezbędny w regulacji metabolizmu organizmu i podtrzymywaniu życia.

HP jest jednym z najczęstszych powikłań po operacji przedniej części szyi, szczególnie w tyreoidektomii, uznanej metodzie leczenia raka tarczycy, który jest najczęstszym nowotworem endokrynnym na świecie6,7. HP po tyreoidektomii jest głównie spowodowane bezpośrednim urazem, niedokrwieniem lub usunięciem PG podczas operacji z powodu poważnego braku zdolności do niezawodnego odróżnienia PG od płatów tarczycy i innych otaczających tkanek (np. węzłów chłonnych i obwodowych cząstek tłuszczu) w czasie rzeczywistym na sali operacyjnej. W 2021 roku Barrios i in. zgłosili średni wskaźnik błędnych sekcji PG wynoszący 22,4% w 1,114 przypadkach tyreoidektomii, a nawet doświadczeni chirurdzy, którzy mieli minimalny wskaźnik błędu 7,7%8. Tak wysokie wskaźniki błędnych sekcji PG są zgodne z innymi podobnymi raportami9,10,11. Tak więc nieprawidłowa paratyreoidektomia jest niezależnym czynnikiem ryzyka przemijającego i trwałego pooperacyjnego HP.

Opracowanie skutecznych metod śródoperacyjnej identyfikacji PG jest kluczem do rozwiązania tej krytycznej, niezaspokojonej potrzeby medycznej; jednak zostało to poważnie ograniczone przez brak modeli zwierzęcych w badaniach przedklinicznych. Do tej pory większość śródoperacyjnych badań identyfikacyjnych PG przeprowadzono na ludziach i dużych zwierzętach (np. psach)12, które są drogie i trudne do uzyskania aprobaty etycznej, rozszerzają liczbę pacjentów i powtarzają testy. Tymczasem mysz, najczęściej używany model kręgowca w badaniach biologicznych, ma niezwykle małe PG, o rozmiarze mniejszym niż 1 mm13. Ze względu na to ograniczenie, mysie modele PG rzadko były używane w śródoperacyjnych badaniach nad identyfikacją PG.

Ten artykuł informuje o stworzeniu prostego, nieskomplikowanego i skutecznego modelu szczura do śródoperacyjnych badań nad identyfikacją PG. Zbadaliśmy wykorzystanie rodzimych szczurów Sprague-Dawley (SD) bez żadnych modyfikacji chirurgicznych lub inżynierii genetycznej jako wiarygodnego modelu zwierzęcego do testowania środka kontrastowego do obrazowania PG, IONPs, podczas operacji tyreoidektomii. Ten model szczurzy wykazuje bardzo podobną strukturę fizjologiczną PG i otaczającego mikrośrodowiska do ludzkiej, a rozmiar PG szczura jest wystarczająco duży, aby można go było wykryć wizualnie w porównaniu z modelami u myszy. Większość szczurów ma po jednym PG po każdej stronie tarczycy. Prostota i skuteczność tego modelu szczurzego została wykazana poprzez wykonanie śródoperacyjnego obrazowania PG wzmocnionego IONP podczas operacji tyreoidektomii.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie badania na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania (IACUC) Instytutu Medycyny Podstawowej i Raka Chińskiej Akademii Nauk. Jest to operacja niezapewniająca przeżycia.

1. Zwierzę

  1. Użyj 6-8-tygodniowej samicy szczura SD o wadze 250 g do śródoperacyjnego obrazowania PG.

2. Znieczulenie

  1. Włącz aparat do znieczulenia.
  2. Przed rozpoczęciem upewnij się, że poziom izofluranu w waporyzatorze anestezjologicznym jest pełny. Następnie włącz tlen i ustaw natężenie przepływu na 0,4-0,8 l/min. Wywołać znieczulenie 3-5% izofluranem i utrzymać na poziomie 2% izofluranu (szybkość przepływu: 0,4-0,8 l/min).
  3. Umieść szczura SD w pudełku aparatu do znieczulania i wybierz model kanału, aby rozpocząć znieczulenie zwierząt.
  4. Obserwuj aktywność szczurów w pudełku. Kiedy szczur zapada w śpiączkę, przesuń go do stożka nosowego, aby utrzymać znieczulenie (nieprzytomna pozycja leżąca na plecach bez odruchu bólu i odruchu rogówkowego).
  5. Użyj maski anestezjologicznej, aby zakryć nos szczura i przełącz maszynę anestezjologiczną w tryb maski, aby utrzymać zwierzę pod narkozą podczas operacji.

3. Postawa i fiksacja

  1. Przenieś znieczulonego szczura na serwetę chirurgiczną na stole operacyjnym. Umieść wstępnie ogrzaną poduszkę grzewczą pod zwierzęciem, aby utrzymać temperaturę ciała zwierzęcia podczas operacji.
  2. Użyj gumek, aby przymocować kończyny szczura do stołu operacyjnego. Umieść cylindryczną poduszkę wykonaną z zasłony pod ramieniem szczura, aby odchylić jego głowę do tyłu, całkowicie odsłaniając obszar szyi.
  3. Nałóż maść na sztuczne łzy na oba oczy szczura, aby zapobiec wysuszeniu podczas znieczulenia.

4. Depilacja

  1. Nałóż krem do depilacji na okolicę szyi: do przestrzeni podżuchwowej, w dół do wyrostka mieczykowatego i po obu stronach na zewnątrz mięśnia mostkowo-obojczykowo-sutkowego.
  2. Po 3 minutach delikatnie przetrzyj chusteczką włosy i krem do depilacji.

5. Sterylizacja

  1. Użyj wacika Iodophor, aby zdezynfekować obszar operacji 3 razy od środka szyi do otoczenia. Dezynfekuj tylko obszar, z którego usunięto włosy.

6. Układanie serwetek chirurgicznych

  1. Użyj serwety chirurgicznej, aby zakryć obszar operacyjny szyi szczura. Otwór w serwety chirurgicznej powinien być wyrównany z obszarem dezynfekcji zwierzęcia.

7. Nacięcie

  1. Potwierdź chirurgiczną płaszczyznę znieczulenia poprzez brak odruchu szczypania palca u nogi przed wykonaniem nacięcia. Następnie wpasuj ostrze w skalpel i użyj skalpela, aby wykonać podłużne nacięcie w przedniej linii środkowej szyi szczura. Upewnij się, że długość nacięcia wynosi około 5 cm i tylko w skórze właściwej.

8. Wypreparowanie tkanki podskórnej z mięśnia szyjnego przedniego

  1. Podnieś skórę po obu stronach nacięcia.
  2. Użyj nożyczek, aby przeciąć wzdłużnie wzdłuż linea alba cervicalis.
  3. Użyj kleszczy, aby oddzielić mięsień mostkowo-gnykowy i mięsień mostkowo-tarczowy.

9. Przymocuj mięśnie przedniej części szyi po obu stronach

  1. Użyj kleszczyków naczyniowych, aby zacisnąć oddzielony mięsień mostkowo-gnykowy i mięsień mostkowo-tarczowy przed szyją i wyciągnij zaciśniętą tkankę na zewnątrz.
  2. Użyj retraktora lub igły, aby przeciągnąć szew (3-0 #) przez zaciśniętą tkankę, zawiązać węzeł i przymocować szew do serwety chirurgicznej stołu operacyjnego.

10. Lokalizacja tarczycy

  1. Zlokalizuj chrząstkę tarczycy i chrząstkę grzastą jako górną granicę w obszarze operacyjnym. Zidentyfikuj chrząstkę tarczycy na podstawie kształtu tarczy i chrząstki cricoid na podstawie kształtu pierścienia.
  2. Zlokalizuj tchawicę jako dolną granicę w obszarze operacyjnym. Poszukaj tchawicy z przodu i pośrodku szyi, w oparciu o kształt pierścienia chrząstki rurkowej.
  3. Zlokalizuj tarczycę między górną i dolną granicą - czerwony gruczoł w kształcie motyla po przeciwnej stronie tchawicy.

11. Identyfikacja wizualna PG

  1. Zlokalizuj PG na górnej i zewnętrznej stronie tarczycy. Poszukaj dwóch PG w wrzecionowatym kształcie o długości około 1,2-2 mm i szerokości 1,0-1,5 mm, które są czerwonawe, ale jaśniejsze niż otaczająca tarczyca z pewną granicą.
  2. Wykonaj przednie zdjęcie PG z tchawicą, tarczycą i krtanią, aby ilościowo porównać działanie IONP przed i po wstrzyknięciu.
  3. Rozetnij tylną część przełyku, a następnie użyj retraktora, aby odsłonić prawą stronę PG. Zrób zdjęcie PG po prawej stronie z tarczycą i tchawicą.
  4. Zamień retraktor, aby naświetlić przeciwną stronę PG i zrób zdjęcie po lewej stronie z tarczycą i tchawicą.

12. Wstrzyknięcie IONPs do tarczycy

  1. Za pomocą strzykawki insulinowej wstrzyknąć miejscowo 10 μl zawiesiny IONPs (20 mg/ml w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami) do środka tarczycy. Delikatnie uciskać miejsce wstrzyknięcia gazą przez 5 sekund.

13. Identyfikacja PG po wstrzyknięciu IONPs

  1. Po wstrzyknięciu obserwuj szybką dyfuzję IONP w tarczycy, ale nie w PG, ponieważ negatywnie zabarwia PG i odróżnia je od otaczającej tarczycy.
  2. Zrób zdjęcie z przodu negatywowo wybarwionego PG wraz z tchawicą, tarczycą i krtanią.
  3. Zrób zdjęcia po lewej i prawej stronie negatywowo wybarwionego PG, stosując te same procedury, jak opisano powyżej.

14. Resekcja gardła i tchawicy z tarczycą i PG

  1. Gdy szczury wdychają nadmiar izofluranu (5% izofluranu przez ponad 5 minut) i są pod głęboką narkozą, należy je poddać eutanazji przez dosercowe wstrzyknięcie 0,5 ml nasyconego roztworu chlorku potasu.
  2. Pośmiertnie usuń gardło, tchawicę, tarczycę i PG.
  3. Pod wyciągiem umieść usunięte gardło, tchawicę, tarczycę i próbki PG w 4% roztworze paraformaldehydu na 24 godziny.

15. Badania histopatologiczne

  1. Odwodnić tkanki i zanurzyć je w parafinie. Pokrój na kawałki o grubości 5 μm. Piecz kawałki w temperaturze 37 °C w piekarniku przez noc i w temperaturze 65 °C przez 1 godzinę.
  2. Wybarwieć skrawki hematoksyliną i eozyną (H&E) po umyciu 3 x 5 min alkoholem gradientowym 75%, 95%, 100% i praniem wodą w temperaturze pokojowej.
  3. Poproś patologów o zbadanie skrawków wybarwionych H&E pod mikroskopem świetlnym.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym modelu zwierzęcym chirurgicznie nacięliśmy szyję szczura SD, aby odsłonić tchawicę, krtań i otaczające tkanki. Następnie tarczyca była wizualnie zlokalizowana po obu stronach tchawicy; Ma kształt motyla i ma wymiary około 3 mm x 5 mm. Para PG znajduje się zwykle w górnej części tarczycy, a ich kolor jest bardzo podobny do koloru płatów tarczycy, co sprawia, że niezwykle trudno jest je odróżnić gołym okiem (Ryc. 1).

Po wstrzyknięciu, środek kontrastowy (

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Demonstrujemy technikę obrazowania negatywnego PG szczura pod kontrolą IONPs przy użyciu czarnych IONPs, które zostały wstrzyknięte lokalnie w środek tarczycy i rozproszone w obrębie tarczycy, ale nie PG. Umożliwia wyraźną identyfikację PG gołym okiem bez pomocy mikroskopu. Chociaż zgłoszono transgeniczne myszy z białkiem zielonej fluorescencji selektywnie eksprymowanym w PG13, model opisany w tym artykule jest prostszy do wykonania. Zajmuje to tylko ~1 minutę na szczura po wstrzyknięciu, a wyraźn...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

P.G. i W.Z. są współtwórcami wniosku patentowego złożonego przez Szpital Onkologiczny Uniwersytetu Chińskiej Akademii Nauk (Zhejiang Cancer Hospital) w oparciu o projekt. Pozostali autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie było wspierane przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (NSFC) (82172598), Fundację Nauk Przyrodniczych Prowincji Zhejiang w Chinach (LZ22H310001), 551 Health Talent Training Project Komisji Zdrowia Prowincji Zhejiang w Chinach oraz Projekt Nauk i Technologii Medycznych i Zdrowotnych w Prowincji Zhejiang w Chinach (2021KY110).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
alkoholLi feng9400820067
aparat anestezjologicznyRWD FirmaR520IENumer maszyny
ostrzeDaopianTB-JZ-10#
cylindryczna poduszkawykonana przez nas
krem do depilacjiNairTMG-001
waga elektronicznaHong xingdaCN-HXD2
eosinThermo Fisher (Waltham, Stany Zjednoczone).C0105S-2
erytromycynaShuang ji (Pekin, Chiny)200409
gazaFulannsYY0331-2006
poduszka grzewczaJohon (ShenZhen, Chiny)JH-36-2006
hematoksylinaThermo Fisher (Waltham, USA).C0105S-1
igła do wstrzykiwań insulinyJiangyin NanquanMakrocząsteczka20170702
wacik jodoforowyHOYON19-6007
roztwór nanocząsteczek tlenku żelazaZhongke Leiming Technology (Pekin, Chiny)Mag9110-05
izofluranSigma Aldrich (St Louis, USA).
uchwyt na igłęStół operacyjny MeijunMH0587
Roztwór paraformaldehyduBioJane
G-CLONEbr/> XT41050
Kleszcze
SupingSPHC-0676
rękojeść noża chirurgicznegoAladdinS3052-06-1EA
retraktor chirurgicznyTOCYTO18-4010
chirurgicznySupingSPHC-0795
Wzdłuż technologiiYCKJ-RJ-036205
szewEthiconSA84G
szew z igłaJinhuan (Szanghaj, Chiny)F301
Wzdłuż technologiiYCKJ-RJ-016218
Suszarka do kąpieli wodnejHua su (Jinhua, Chiny)HS-1145
21112801 BJ-P-M Maszyna skanująca z gumy 21269333 < chirurgiczne Olympus Slideview VS200 Nożyczki chirurgiczne Ręcznik Kleszcze naczyniowe

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cope, O., Donaldson, G. A. Relation of thyroid and parathyroid glands to calcium and phosphorus metabolism. Study of a case with coexistent hypoparathyroidism and hyperthyroidism. The Journal of Clinical Investigation. 16 (3), 329-341 (1937).
  2. Mansberger, A. R., Wei, J. P. Surgical embryology and anatomy of the thyroid and parathyroid glands. Surgical Clinics of North America. 73 (4), 727-746 (1993).
  3. Koch, A., Hofbeck, M., Dorr, H. G., Singer, H. Hypocalcemia-induced heart failure as the initial symptom of hypoparathyroidism. Zeitschrift für Kardiologie. 88 (1), 10-13 (1999).
  4. Shoback, D. M., et al. Presentation of hypoparathyroidism: etiologies and clinical features. The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 101 (6), 2300-2312 (2016).
  5. Arneiro, A. J., et al. Self-report of psychological symptoms in hypoparathyroidism patients on conventional therapy. Archives of Endocrinology Metabolism. 62 (3), 319-324 (2018).
  6. Olson, E., Wintheiser, G., Wolfe, K. M., Droessler, J., Silberstein, P. T. Epidemiology of thyroid cancer: a review of the national cancer database, 2000-2013. Cureus. 11 (2), 4127(2019).
  7. Du, L., et al. Epidemiology of thyroid cancer: incidence and mortality in China, 2015. Frontiers in Oncology. 10, 1702(2020).
  8. Barrios, L., et al. Incidental parathyroidectomy in thyroidectomy and central neck dissection. Surgery. 169 (5), 1145-1151 (2021).
  9. Sitges-Serra, A., et al. Inadvertent parathyroidectomy during total thyroidectomy and central neck dissection for papillary thyroid carcinoma. Surgery. 161 (3), 712-719 (2017).
  10. Sakorafas, G. H., et al. Incidental parathyroidectomy during thyroid surgery: an underappreciated complication of thyroidectomy. World Journal of Surgery. 29 (12), 1539-1543 (2005).
  11. Sahyouni, G., et al. Rate of incidental parathyroidectomy in a pediatric population. OTO Open. 5 (4), (2021).
  12. Erickson, A. K., et al. Incidence, survival time, and surgical treatment of parathyroid carcinomas in dogs: 100 cases (2010-2019). Journal of the American Veterinary Medical Association. 259 (11), 1309-1317 (2021).
  13. Bi, R., Fan, Y., Luo, E., Yuan, Q., Mannstadt, M. Two techniques to create hypoparathyroid mice: parathyroidectomy using GFP glands and diphtheria-toxin-mediated parathyroid ablation. Journal of Visualized Experiments. (121), e55010(2017).
  14. Soulsby, S. N., Holland, M., Hudson, J. A., Behrend, E. N. Ultrasonographic evaluation of adrenal gland size compared to body weight in normal dogs. Veterinary Radiology & Ultrasound. 56 (3), 317-326 (2015).
  15. Zheng, W. H., et al. Biodegradable iron oxide nanoparticles for intraoperative parathyroid gland imaging in thyroidectomy. PNAS Nexus. 1 (3), 087(2022).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Thyroid SurgeryPG IdentificationIron Oxide NanoparticlesContrast AgentThyroid GlandNegative StainingAutofluorescence ImagingPreclinical Research

Powiązane artykuły