Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Ocena transcytozy jelitowej izolatów bakteriemii Escherichia coli u noworodków

2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/64241

⸱

17 lutego 2023

 ,  , 
1University of Missouri-Kansas City School of Medicine, 2Pediatric Infectious Diseases, Children’s Mercy Kansas City

W tym artykule

Podsumowanie

Escherichia coli powoduje sepsę u noworodków, które połykają bakterie w czasie porodu. Proces związany ze zdolnością E. coli do przemieszczania się z przewodu pokarmowego do krwiobiegu jest słabo poznany. Ten model in vitro ocenia zdolność szczepów E. coli do przemieszczania się przez komórki nabłonka jelitowego.

Streszczenie

Noworodki spożywają matczyne szczepy E. coli, które kolonizują ich przewód pokarmowy w czasie porodu. Szczepy E. coli ze zdolnością przemieszczania się przez jelita atakują krwiobieg noworodka, powodując zagrażającą życiu bakteriemię. Przedstawiona metodologia wykorzystuje spolaryzowane komórki nabłonka jelitowego hodowane na półprzepuszczalnych wkładkach do oceny transcytozy noworodków izolatów bakteriemii E. coli in vitro. Ta metoda wykorzystuje ustaloną linię komórek jelitowych T84, która ma zdolność wzrostu do zbiegu i tworzenia ścisłych połączeń i desmosomów. Po osiągnięciu konfluencji dojrzałe monowarstwy T84 rozwijają odporność przeznabłonkową (TEER), którą można określić ilościowo za pomocą woltomierza. Wartości TEER są odwrotnie skorelowane z przepuszczalnością parakomórkową składników zewnątrzkomórkowych, w tym bakterii, w poprzek monowarstwy jelitowej. Z drugiej strony przejście międzykomórkowe bakterii (transcytoza) niekoniecznie zmienia pomiary TEER. W tym modelu określa się ilościowo przejście bakterii przez monowarstwę jelitową przez okres do 6 godzin po zakażeniu, a następnie wykonuje się wielokrotne pomiary TEER w celu monitorowania przepuszczalności parakomórkowej. Ponadto metoda ta ułatwia stosowanie technik, takich jak barwienie immunologiczne, do badania zmian strukturalnych w połączeniach ścisłych i innych białkach adhezyjnych między komórkami podczas transcytozy bakteryjnej w spolaryzowanym nabłonku. Zastosowanie tego modelu przyczynia się do scharakteryzowania mechanizmów, za pomocą których noworodki E. coli transcytozują przez nabłonek jelitowy w celu wytworzenia bakteriemii.

Wprowadzenie

Escherichia coli jest najczęstszą przyczyną wczesnej sepsy u noworodków1,2,3. Śmiertelność noworodków z powodu bakteriemii E. coli może sięgać 40%, a zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych jest możliwym powikłaniem, które jest związane z poważnymi zaburzeniami neurorozwojowymi2. Spożycie matczynych szczepów E. coli przez noworodka może wywołać bakteriemię noworodków; Proces ten został powtórzony w modelach zwierzęcych2,4. Po spożyciu bakterie chorobotwórcze przemieszczają się ze światła jelita noworodka przez barierę jelitową i dostają się do krwiobiegu, powodując posocznicę. Inwazyjne szczepy E. coli u noworodków, które wywołują bakteriemię, różnią się zdolnością do atakowania komórek nabłonka jelitowego1,5. Jednak ich zdolność do transcytozy nabłonka jelitowego po inwazji nie została w pełni scharakteryzowana.

Ten model transcytozy jelitowej jest użyteczną metodą in vitro do naśladowania przejścia bakterii przez nabłonek jelitowy. Ogólnym celem metod przedstawionych w tym artykule jest porównanie zdolności noworodków izolatów E. coli do transcytozy nabłonka jelitowego. Opisany tutaj model wykorzystuje komórki T84, które są unieśmiertelnionymi komórkami ludzkiego gruczolakoraka jelita6,7. Komórki T84 są hodowane do zbiegu na półprzepuszczalnej membranie z dwoma oddzielnymi przedziałami. Uzasadnieniem dla stosowania tej techniki jest to, że podobnie jak w przypadku in vivo, te komórki jelitowe polaryzują się i rozwijają dojrzałe połączenia ścisłe6,8. Strona stykająca się z membraną staje się stroną podstawną. Przeciwna strona komórek staje się stroną wierzchołkową, przypominającą światło jelita, do którego przylegają i atakują połknięte patogeny. Błona transwell jest przepuszczalna dla bakterii, ale spolaryzowane komórki jelitowe tworzą ścisłe połączenia, które upośledzają ruch parakomórkowy bakterii9. W związku z tym metoda ta zapewnia przewagę w postaci kontrolowanego środowiska in vitro wykorzystującego ludzką linię komórkową do badania procesu transcytozy bakteryjnej, w tym drogi transkomórkowej. Chociaż istnieją inne metody badania transcytozy bakterii w nabłonku jelitowym, przedstawiona tutaj metoda transwell zapewnia większą łatwość i dostępność. Dostępne są techniki alternatywne, takie jak te wykorzystujące próbki ex vivo umieszczane w systemach komór using. Wykorzystują jednak próbki tkanek, które mogą nie być łatwo dostępne, szczególnie jeśli badania mają na celu zbadanie fizjologii człowieka10. Organoidy jelitowe stanowią kolejny przykład alternatywy in vitro do badania interakcji gospodarz-bakteria11. Podczas gdy monowarstwy organoidów mogą być również używane w systemie transwell do badania transcytozy bakteryjnej, wymagają one izolacji i wzrostu komórek macierzystych oraz użycia określonych czynników wzrostu w celu wywołania różnicowania12. Tym samym ich stosowanie jest bardziej czasochłonne i wiąże się z większymi kosztami w porównaniu z metodą transwell opisaną w tym manuskrypcie.

Ocena przejścia bakterii przez nabłonek jelitowy za pomocą tego systemu transwell in vitro została pomyślnie przeprowadzona dla różnych patogenów. Badania te wykazały użyteczność systemu transwell wykorzystującego komórki T84 do scharakteryzowania transcytozy bakterii w spolaryzowanym nabłonku jelitowym13,14,15. Jednak zastosowanie tej metody transwell do porównania zdolności transcytozy noworodków E. coli wytwarzających bakteriemię nie zostało szczegółowo opisane. Ten manuskrypt dostarcza innym badaczom standardowy protokół transwell, który jest niezawodny i łatwy w użyciu oraz nie wymaga zbyt drogich zasobów.

Aby porównać zdolność inwazyjnych szczepów E. coli noworodków do transcytozy nabłonka jelitowego, wierzchołkowa strona monowarstwy nabłonka jelitowego może być zainfekowana znaną liczbą komórek bakteryjnych. Po inkubacji można pobrać pożywkę po podstawowej stronie nabłonka i określić ilościowo bakterie w celu określenia ilości transcytozy bakteryjnej w czasie. W niniejszym manuskrypcie przedstawione metody są wykorzystywane do badania zdolności transcytozy noworodków szczepów klinicznych E. coli odzyskanych od noworodków hospitalizowanych z powodu bakteriemii. Kryteria włączenia do wyboru tych izolatów klinicznych noworodków do badań transcytozy zostały opublikowane wcześniej1,2,16. Gdy ta metoda jest wykonywana przy użyciu różnych szczepów E. coli, można porównać ich zdolności transcytozy. Dzięki temu procesowi model transcytozy jelitowej dostarcza cennych danych do scharakteryzowania czynników wirulencji E. coli, które przyczyniają się do wieloetapowego procesu, którego kulminacją jest rozwój bakteriemii noworodków.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

UWAGA: Wykonuj wszystkie manipulacje komórkami, bakteriami, płytkami i odczynnikami T84 w komorze bezpieczeństwa biologicznego poziomu 2 (BSL-2), aby uniknąć kontaminacji. Używaj oddzielnych obszarów i inkubatorów do wszystkich prac związanych ze sterylnymi komórkami T84, zakażonymi komórkami T84 i E. coli. Kliniczne izolaty E. coli przetestowane opisanymi tutaj metodami zostały uzyskane zgodnie z wytycznymi Institutional Review Board w naszej instytucji1,16.

1. Przygotowanie wstawek transcytozy z komórkami T84 (około 1-2 tygodnie przed eksperymentem)

  1. Hoduj komórki T84 American Type Culture Collection (ATCC) w pożywce do hodowli tkankowej (TCM + antybiotyki) składającej się z Dulbecco's Modified Eagle Medium: mieszanki składników odżywczych F-12 firmy Ham's (1:1, końcowe stężenie: 50% każda), 5% płodowej surowicy bydlęcej i 1% (100 U/ml) mieszaniny podwójnego antybiotyku penicylina/streptomycyna. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C z 5% CO2,
    UWAGA: Wariant tej pożywki bez penicyliny/streptomycyny (TCM bez antybiotyków) jest stosowany na późniejszych etapach (sekcja 2 i następne) procedury. Upewnij się, że na każdym etapie użyto właściwej formuły.
  2. Pracując w komorze bezpieczeństwa biologicznego (BSC), wysiewaj komórki T84 w wkładkach transwell do hodowli komórek z politereftalanu etylenu z otworami 3 μm wykonanymi dla płytek 24-dołkowych. Uwzględnij powtórzone wkładki transwellowej dla każdego pożądanego warunku eksperymentalnego oraz niezakażone kontrole w celu monitorowania możliwego zanieczyszczenia.
    1. W 24-dołkowej płytce przeznaczonej do przechowywania wkładek transwell, napełnij żądaną liczbę studzienek zbiorczych 1 ml TCM + antybiotyków.
    2. W każdym dołku umieść jedną wkładkę transwell.
    3. Wysiewaj te wkładki 1 x 105 komórek T84 zawieszonych w 500 μL TCM + antybiotyki. Określ ilościowo liczbę komórek za pomocą hemocytometru z barwieniem trypanem lub automatycznego licznika komórek17.
    4. Inkubować płytki transwell zawierające wkładki z nasionami w tych samych warunkach, w których komórki były hodowane.
    5. Sprawdź za pomocą mikroskopu świetlnego, czy monowarstwy zaczęły zlewać się po wysianiu wkładki, około 48 godzin po wysianiu.
  3. Co 2 dni po wysiewie mierz i zapisuj przeznabłonkową rezystancję elektryczną (TEER) za pomocą nabłonkowego woltomierza/omomierza (EVOM), aby ocenić dojrzałość monowarstwy. Gdy wkładki osiągną TEER co najmniej 1 000 Ω·cm2, uznaje się, że są gotowe do testu18.
    UWAGA: Wkładki zwykle potrzebują 7-10 dni, aby osiągnąć ten TEER po wysianiu. Komórki T84 wykażą 100% konfluencję pod mikroskopią świetlną po osiągnięciu tej odporności.
    1. Przechowuj sondę EVOM z elektrodami zanurzonymi w 0.15 M KCl, gdy nie jest używana.
    2. Przed pomiarem TEER należy odkazić sondę elektrody, zanurzając ją w 5 ml 70% etanolu w stożkowej probówce o pojemności 50 ml na 10-15 minut. Wyjmij sondę, strząśnij nadmiar etanolu i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu wewnątrz BSC przez 10 minut. Zachowaj probówkę z etanolem.
    3. Przetestuj EVOM i sondę, umieszczając suchą odkażoną sondę w sterylnym dołku zawierającym 1 ml antybiotyków TCM + ze sterylną wkładką wewnątrz zawierającą 500 μl antybiotyków TCM +. Upewnij się, że odczyt EVOM wynosi <200 Ω. Zapisz tę ślepą wartość, aby użyć jej w późniejszych obliczeniach rezystancji opisanych w kroku 1.3.6.
    4. Wyjmij sondę z probówki antybiotyków TCM +. Zachowaj tę rurkę do przechowywania sondy przez cały czas trwania eksperymentu.
    5. Delikatnie opuść sondę do pierwszej wkładki z długą elektrodą w studzience zbiorczej i krótką elektrodą wewnątrz wkładu. Pozwól, aby długa elektroda dobrze dotykała dna zbieracza, ale nie naciskaj, ponieważ może to zakłócić monowarstwę nabłonka.
    6. Powtórz ten proces, aby zmierzyć i zapisać rezystancję w omach (Ω) dla każdej wkładki. Po zakończeniu odkaż sondę w etanolu, zanurzając ją na kolejne 10-15 minut. Następnie przenieś odkażoną sondę z powrotem do roztworu KCl w celu przechowywania. Odjąć rezystancję ślepej próby uzyskaną w kroku 1.3.3 od każdej wartości uzyskanej z każdej wkładki zawierającej ogniwa T84. Pomnóż wynikową rezystancję (Ω) dla każdej wkładki przez powierzchnię dna każdej wkładki (cm2), aby uzyskać końcowy pomiar TEER (Ω · cm2).
    7. Gdy TEER osiągnie co najmniej 1000 Ω·cm2, monowarstwa nabłonka jest dojrzała i gotowa do testów infekcji.
  4. W miarę dojrzewania TEER należy co 1-2 dni dostarczać komórkom świeżą pożywkę.
    1. Na nowej 24-dołkowej płytce dodaj 1 ml TCM + antybiotyków do jednego dołka na każdą przygotowywaną wkładkę z nasionami.
    2. Za pomocą sterylnych kleszczy ostrożnie przenieś wkładki do nowo napełnionych studzienek.
    3. Wymień nośnik we wkładkach.
      1. Usuń stare media z wkładek, przechylając płytkę i używając wewnętrznego aspiratora próżniowego, aby delikatnie usunąć nośnik za pomocą końcówki pipety wzdłuż boku wkładki. Aspirator umożliwia regulację ssania na niskim poziomie, aby zapobiec rozerwaniu komórek. Nie pozwól, aby końcówka pipety dotykała dna wkładki, ponieważ spowoduje to przerwanie rozwijającej się monowarstwy nabłonka.
      2. Do wkładek dodać 500 μL TCM + antybiotyki. Wizualizuj monowarstwę za pomocą mikroskopii świetlnej, aby sprawdzić, czy pozostaje nienaruszona.
    4. Co 1-2 dni mierz TEER na każdej wkładce, jak opisano powyżej w krokach 1.3.2-1.3.6.

2. Przygotowanie komórek T84 na 1 dzień przed eksperymentem przy użyciu TCM bez antybiotyków

  1. Zmierz i zapisz TEER dzień przed eksperymentem.
  2. Wymień TCM w taki sam sposób, jak podczas poprzedniego przygotowania i konserwacji ogniw. Jednak zamiast tego stosuje się TCM bez antybiotyków w ramach przygotowań do zakażenia (1 ml w studzience na płytkę i 500 μl w wkładce).

3. Kultury E. coli (rozpoczęte 1 dzień przed eksperymentem)

UWAGA: Stosuj środki ostrożności na poziomie bezpieczeństwa biologicznego 2 (BSL-2) podczas pracy z patogennymi klinicznymi szczepami E. coli.

  1. Weź oznakowaną stożkową probówkę o pojemności 15 ml z 5 ml sterylnego bulionu lizogenicznego (LB) i użyj sterylnej pętli, aby zaszczepić bulion jedną kolonią z jednego szczepu bakteryjnego (E. coli). Powtórz ten proces, tworząc jedną probówkę do hodowli na noc dla każdego testowanego szczepu.
  2. Inkubować kulturę przez noc, z poluzowanymi nakrętkami probówek, w wytrząsarce inkubatora (250 obr./min, 37 °C).

4. Przygotowanie inokulum E. coli, komórek nabłonkowych i materiałów (rano w dniu eksperymentu)

UWAGA: Od tego momentu używaj TCM bez antybiotyków podgrzanych do 37 °C.

  1. Dodaj 250 μl z każdej nocnej hodowli LB do 25 ml TCM bez antybiotyków w stożkowej probówce o pojemności 50 ml (po jednej na pojedynczy szczep). Trzymaj zaślepki rurek poluzowane. Umieść te nowe probówki hodowlane w wytrząsarce z tymi samymi ustawieniami (250 obr./min, 37 °C) dokładnie na 2 godziny. Wykonaj pozostałe kroki podrzędne podczas oczekiwania.
  2. Zmierz TEER w poprzek każdej wkładki, jak opisano w krokach 1.3.2-1.3.6. Zapisuje się je jako TEER w czasie (t) = 0 h.
  3. Przenieś wkładki do dołków w nowej płytce i zmień pożywkę, stosując technikę opisaną w kroku 1.4.3. Tym razem jednak należy napełnić nowe studzienki zbiorcze 500 μl TCM bez antybiotyków, a wkłady napełnić 400 μl TCM bez antybiotyków. Wkładki należy przechowywać w inkubatorze do hodowli tkankowych do czasu zakażenia.
  4. Ustawić wystarczającą liczbę kwadratowych płytek agarowych LB do ogrzania do temperatury pokojowej (RT) w celu późniejszego posiewu i ilościowego określenia bakterii.

5. Inokulacja komórek (początek eksperymentu)

  1. Dokładnie po 2 godzinach wyjmij poranne kultury bakterii z wytrząsarki i odwiruj je przez 10 minut (1 900 x g, 4 °C).
    UWAGA: W przypadku wszystkich kolejnych kroków utrzymuj wszystkie zawiesiny bakteryjne na lodzie, aby zminimalizować wzrost.
  2. Ponownie zawiesić osad bakteryjny w TCM bez antybiotyków. Za pomocą spektrofotometru dostosuj gęstość optyczną (OD) do 0,7-0,9, a następnie rozcieńcz antybiotykami TCM bez antybiotyków do stężenia 1 x 106 jednostek tworzących kolonie (CFU)/ml (rozcieńczenie około 1:100). Użyj tej zawiesiny bakteryjnej, aby zainfekować każdą wkładkę 1 x 105 CFU na 100 μl objętości.
  3. Oznaczyć płytkę transwell i zainfekować każdą wkładkę 100 μl inokulum dostosowanego do OD (łącznie 1 x 105 CFU na wkładkę). Test właśnie się rozpoczął. Zanotuj czas i zapisz go jako t = 0 h.
  4. Umieść zawiesinę bakteryjną inokulum w celu ilościowego oznaczenia CFU/ml przy użyciu metody rozcieńczania toru, posiewając 10 μl podwielokrotności na kwadratowych płytkach agarowych LB19.

6. Kwantyfikacja transcytozy

  1. Co 30 minut po inokulacji napełniaj nowe studzienki 500 μl TCM bez antybiotyków. Przenieś wkładki do tych nowych studzienek za pomocą innego zestawu sterylnych kleszczy dla każdego innego szczepu bakterii.
  2. Zebrać pożywkę z używanej studzienki zbiorczej dla każdej wkładki do oddzielnych oznaczonych probówek. Umieść te rurki na lodzie. Włożyć płytki transwell do inkubatora pomiędzy punktami czasowymi.
  3. Dla każdej wkładki połącz zebrane media z t = 0,5 h, t = 1 h, t = 1,5 h i t = 2 h i krótko wiruj. Umieścić zebrane podłoża na płytkach agarowych LB przy użyciu metody rozcieńczania toru w celu ilościowego określenia ilości bakterii transcytozowanych w ciągu pierwszych 2 godzin doświadczenia.
    UWAGA: Pobieranie bakterii co 30 minut i trzymanie ich na lodzie zapewnia zminimalizowanie wzrostu bakterii w studzienkach zbiorczych, a pomiary są wykonywane na bakteriach z przewagą transcytozowanych.
  4. Umieścić oznakowane płytki agarowe LB do rozcieńczania torów w inkubatorze bakteryjnym w temperaturze 37 °C bez dodatkowego CO2 i umieścić płytkę transwell T84 z powrotem w inkubatorze do hodowli tkankowych.
  5. Przy t = 4 h powtórz krok 6.3, łącząc zebrane media z t = 2,5 h, t = 3 h, t = 3,5 h i t = 4 h.
  6. Przy t = 6 h powtórzyć krok 6.3, łącząc zebrane media z t= 4,5 h, t = 5 h, t = 5,5 h i t = 6 h. Dodatkowo, przy t = 6 h, pokryj media z dołków kontrolnych.

7. Koniec eksperymentu

  1. Zmierzyć i zapisać TEER na końcu eksperymentu, t = 6 h. Zastosować procedurę opisaną w krokach 1.3.2-1.3.6.
  2. Odkaż sondę, zanurzając ją w 70% etanolu na 10-15 minut. W razie potrzeby wyrzuć wkładki lub zachowaj/przetwórz je do dodatkowych zastosowań. Pozostawić płytki agarowe LB do inkubacji przez noc i zdezynfekować i/lub bezpiecznie usunąć wszystkie inne użyte materiały.
  3. Po całonocnej inkubacji należy ręcznie policzyć kolonie bakteryjne na płytkach LB do rozcieńczania torów, aby określić ilość inokulum i ilość transcytozy E. coli. Upewnij się, że na płytkach kontrolnych nie widać żadnych bakterii.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Wykres rozwoju TEER; dane czasu względem oporności, ocena wzrostu komórek w ciągu 10 dni, słupki błędów.
Rycina 1: TEER komórek T84 w czasie. Wraz z dojrzewaniem warstwy komórek T84 na wkładce, oporność elektryczna monowarstwy wzrasta. Przy TEER wynoszącym co najmniej 1,000 Ω·cm2, warstwa komó...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Metoda ta wywodzi się z technik stosowanych w gastroenterologii i chorobach zakaźnych20. Modele in vitro bariery nabłonkowej jelit wykorzystano w celu wyjaśnienia mechanizmów, za pomocą których zawartość światła oddziałuje z tym istotnym składnikiem odporności wrodzonej 6,8. Interakcje gospodarz-patogen inwazyjnych noworodków E. coli zostały również oddzielnie scharakteryzowane za pomocą analizy genetycznej, badań opornoś...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez grant studencki Sarah Morrison wydany przez University of Missouri-Kansas City School of Medicine dla A.I.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
10 000 U/ml Mieszanina penicyliny/streptomycynyFisher Scientific15-140-122
15 ml sterylne probówki stożkoweMidSciC15B
2 ml mikrowirówkiAvantAVSS2000
50 ml sterylne polipropylenowe probówki stożkoweFalcon352070
AspiratorCorning4930
Szafy bezpieczeństwa biologicznegoLabconco30441010028343Trzy z nich są używane w metodzie: jeden do pracy z tkankami sterylnymi, jeden do pracy z zakażonymi tkankami i jeden do pracy z bakteriami.
WirówkaSorvallLegend RT
Jednorazowe pętle inokulacyjneFisherbrand22363605
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)Gibco11965-084
Nabłonkowy miernik napięcia / omówŚwiatowe instrumenty precyzyjneEVOM2
Surowica bydlęcapłodu Fisher Scientific10437028
Mieszanka składników odżywczych Ham's F-12Gibco11765-047
HemacytometrSigma Aldrich, Bright LineZ359629
Wytrząsarka do inkubatoraNowy BrunszwikInnova 4080
InkubatoryThermo Scientific51030284Trzy z nich są stosowane w metodzie: jeden do sterylnej hodowli tkanek, jeden do hodowli zakażonych tkanek i jeden do inkubacji bakterii.
Rosół lizogenicznyDifco244610
Rosół lizogeniczny agarIBI ScientificIB49101
Mikroskop Nikon Eclipse TS2RSpektrofotometr Nikon
Unico1100RS
T84 Komórki jelitoweAmerykańska kolekcja kultur tkankowychCCL248
Wkładki do hodowli tkankowych, z membraną z politylenu treftalanu, 3 i mikro; m pory,  24-dołkowy formatFalcon353096
Płytka do hodowli tkankowej, 24 dołkiFalcon353504
Trypan niebieska plamaFisher ScientificT10282

Bibliografia

  1. Shakir, S. M., Goldbeck, J. M., Robison, D., Eckerd, A. M., Chavez-Bueno, S. Genotypic and phenotypic characterization of invasive neonatal Escherichia coli clinical isolates. American Journal of Perinatology. 31 (11), 975-982 (2014).
  2. Cole, B. K., et al. Route of infection alters virulence of neonatal septicemia Escherichia coli clinical isolates. PloS One. 12 (12), 0189032(2017).
  3. Stoll, B. J., et al. Early-onset neonatal sepsis 2015 to 2017, the rise of Escherichia coli, and the need for novel prevention strategies. Journal of the American Medical Association Pediatrics. 174 (7), 200593(2020).
  4. Dalgakiran, F., Witcomb, L. A., McCarthy, A. J., Birchenough, G. M., Taylor, P. W. Non-invasive model of neuropathogenic Escherichia coli infection in the neonatal rat. Journal of Visualized Experiments. (92), e52018(2014).
  5. Williams, M., et al. Whole-genome sequencing-based phylogeny, antibiotic resistance, and invasive phenotype of Escherichia coli strains colonizing the cervix of women in preterm labor. BMC Microbiology. 21 (1), 330(2021).
  6. Schoultz, I., Keita, Å The intestinal barrier and current techniques for the assessment of gut permeability. Cells. 9 (8), 1909(2020).
  7. Devriese, S., et al. T84 monolayers are superior to Caco-2 as a model system of colonocytes. Histochemistry and Cell Biology. 148 (1), 85-93 (2017).
  8. Buckley, A., Turner, J. R. Cell biology of tight junction barrier regulation and mucosal disease. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 10 (1), 029314(2018).
  9. Awad, W. A., Hess, C., Hess, M. Enteric pathogens and their toxin-induced disruption of the intestinal barrier through alteration of tight junctions in chickens. Toxins. 9 (2), 60(2017).
  10. Vancamelbeke, M., Vermeire, S. The intestinal barrier: A fundamental role in health and disease. Expert Review of Gastroenterology & Hepatology. 11 (9), 821-834 (2017).
  11. Aguilar, C., et al. Organoids as host models for infection biology - A review of methods. Experimental and Molecular Medicine. 53 (10), 1471-1482 (2021).
  12. Nickerson, K. P., et al. A versatile human intestinal organoid-derived epithelial monolayer model for the study of enteric pathogens. Microbiology Spectrum. 9 (1), 0000321(2021).
  13. Gavin, H. E., Beubier, N. T., Satchell, K. J. The effector domain region of the Vibrio vulnificus MARTX toxin confers biphasic epithelial barrier disruption and is essential for systemic spread from the intestine. PLoS Pathogens. 13 (1), 1006119(2017).
  14. Kobayashi, H., et al. Aeromonas sobria serine protease decreases epithelial barrier function in T84 cells and accelerates bacterial translocation across the T84 monolayer in vitro. PloS One. 14 (8), 0221344(2019).
  15. Kalischuk, L. D., Inglis, G. D., Buret, A. G. Campylobacter jejuni induces transcellular translocation of commensal bacteria via lipid rafts. Gut Pathogens. 1 (1), 2(2009).
  16. Cole, B. K., Ilikj, M., McCloskey, C. B., Chavez-Bueno, S. Antibiotic resistance and molecular characterization of bacteremia Escherichia coli isolates from newborns in the United States. PloS One. 14 (7), 0219352(2019).
  17. Cadena-Herrera, D., et al. Validation of three viable-cell counting methods: Manual, semi-automated, and automated. Biotechnology Reports. 7, 9-16 (2015).
  18. den Hartog, G., et al. Apurinic/apyrimidinic endonuclease 1 restricts the internalization of bacteria into human intestinal epithelial cells through the inhibition of Rac1. Frontiers in Immunology. 11, 553994(2020).
  19. Jett, B. D., Hatter, K. L., Huycke, M. M., Gilmore, M. S. Simplified agar plate method for quantifying viable bacteria. Biotechniques. 23 (4), 648-650 (1997).
  20. Lievin-Le Moal, V., Servin, A. L. Pathogenesis of human enterovirulent bacteria: Lessons from cultured, fully differentiated human colon cancer cell lines. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 77 (3), 380-439 (2013).
  21. Kaczmarek, A., Budzynska, A., Gospodarek, E. Detection of K1 antigen of Escherichia coli rods isolated from pregnant women and neonates. Folia Microbiologica. 59 (5), 419-422 (2014).
  22. Kalita, A., Hu, J., Torres, A. G. Recent advances in adherence and invasion of pathogenic Escherichia coli. Current Opinion in Infectious Diseases. 27 (5), 459-464 (2014).
  23. McCool, D. J., Marcon, M. A., Forstner, J. F., Forstner, G. G. The T84 human colonic adenocarcinoma cell line produces mucin in culture and releases it in response to various secretagogues. Biochemical Journal. 267 (2), 491-500 (1990).
  24. Resta-Lenert, S., Barrett, K. E. Enteroinvasive bacteria alter barrier and transport properties of human intestinal epithelium: Role of iNOS and COX-2. Gastroenterology. 122 (4), 1070-1087 (2002).
  25. Elatrech, I., et al. Escherichia coli LF82 differentially regulates ROS production and mucin expression in intestinal epithelial T84 cells: Implication of NOX1. Inflammatory Bowel Diseases. 21 (5), 1018-1026 (2015).
  26. El-Aouar Filho, R. A., et al. Heterogeneous family of cyclomodulins: Smart weapons that allow bacteria to hijack the eukaryotic cell cycle and promote infections. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 208(2017).
  27. Hopkins, A. M., Walsh, S. V., Verkade, P., Boquet, P., Nusrat, A. Constitutive activation of Rho proteins by CNF-1 influences tight junction structure and epithelial barrier function. Journal of Cell Science. 116, 725-742 (2003).
  28. Shiou, S. R., et al. Erythropoietin protects intestinal epithelial barrier function and lowers the incidence of experimental neonatal necrotizing enterocolitis. Journal of Biological Chemistry. 286 (14), 12123-12132 (2011).
  29. Newburg, D. S., Ko, J. S., Leone, S., Nanthakumar, N. N. Human milk oligosaccharides and synthetic galactosyloligosaccharides contain 3’-, 4-, and 6'-galactosyllactose and attenuate inflammation in human T84, NCM-460, and H4 cells and intestinal tissue ex vivo. Journal of Nutrition. 146 (2), 358-367 (2016).
  30. Burns, J. L., Griffith, A., Barry, J. J., Jonas, M., Chi, E. Y. Transcytosis of gastrointestinal epithelial cells by Escherichia coli K1. Pediatric Research. 49 (1), 30-37 (2001).
  31. Raut, B., Chen, L. J., Hori, T., Kaji, H. An open-source add-on EVOM((R)) device for real-time transepithelial/endothelial electrical resistance measurements in multiple transwell samples. Micromachines. 12 (3), 282(2021).
  32. McCarthy, A. J., Stabler, R. A., Taylor, P. W. Genome-wide identification by transposon insertion sequencing of Escherichia coli K1 genes essential for in vitro growth, gastrointestinal colonizing capacity, and survival in serum. Journal of Bacteriology. 200 (7), 00698(2018).
  33. Sayoc-Becerra, A., et al. The JAK-inhibitor tofacitinib rescues human intestinal epithelial cells and colonoids from cytokine-induced barrier dysfunction. Inflammatory Bowel Diseases. 26 (3), 407-422 (2020).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Noworodkowe E. Colispolaryzowane komórki nabłonkowelinia komórkowa T84oporność transepithelialnapomiar TEERinserty Transwelltranslokacja bakteryjnapołączenia ścisłeprzepuszczalność parakomórkowa
Ocena transcytozy jelitowej izolatów bakteriemii Escherichia coli u noworodków
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.