Artykuł metodologiczny

Optymalizacja ATAC-Seq do badań epigenetycznych nowotworów

DOI:

10.3791/64242

⸱

30 czerwca 2022

 ,  ,  ,  , 
1University of North Dakota School of Medicine and Health Sciences, 2Dana-Farber Cancer Institute

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ATAC-seq to metoda sekwencjonowania DNA, która wykorzystuje nadpobudliwą zmutowaną transpozazę, Tn5, do mapowania zmian w dostępności chromatyny, w których pośredniczą czynniki transkrypcyjne. ATAC-seq umożliwia odkrycie mechanizmów molekularnych leżących u podstaw zmian fenotypowych w komórkach nowotworowych. Protokół ten określa procedury optymalizacyjne dla sekwencji ATAC w typach komórek nabłonkowych, w tym komórkach nowotworowych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Test chromatyny dostępnej dla transpozazy z sekwencjonowaniem wysokoprzepustowym (ATAC-seq) bada dostępność kwasu dezoksyrybonukleinowego (DNA) za pomocą nadpobudliwej transpozazy Tn5. Tn5 tnie i liguje adaptery do sekwencjonowania o wysokiej przepustowości w dostępnych regionach chromatyny. W komórkach eukariotycznych genomowe DNA jest upakowane w chromatynę, kompleks DNA, histonów i innych białek, który działa jako fizyczna bariera dla maszynerii transkrypcyjnej. W odpowiedzi na sygnały zewnętrzne czynniki transkrypcyjne rekrutują kompleksy przebudowujące chromatynę, aby umożliwić dostęp do maszynerii transkrypcyjnej do aktywacji genów. Dlatego identyfikacja otwartych regionów chromatyny jest przydatna podczas monitorowania aktywności wzmacniacza i promotora genów podczas zdarzeń biologicznych, takich jak progresja raka. Ponieważ protokół ten jest łatwy w użyciu i ma niskie wymagania dotyczące wkładu komórkowego, ATAC-seq został szeroko przyjęty do definiowania otwartych regionów chromatyny w różnych typach komórek, w tym w komórkach rakowych. Aby pomyślnie pozyskać dane, podczas przygotowywania bibliotek ATAC-seq należy wziąć pod uwagę kilka parametrów. Wśród nich wybór buforu do lizy komórek, miareczkowanie enzymu Tn5 i początkowa objętość komórek mają kluczowe znaczenie dla przygotowania biblioteki ATAC-seq w komórkach nowotworowych. Optymalizacja jest niezbędna do generowania wysokiej jakości danych. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy opis metod optymalizacji sekwencji ATAC dla typów komórek nabłonkowych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dostępność chromatyny jest kluczowym wymogiem dla regulacji ekspresji genów w skali całego genomu1. Zmiany w dostępności chromatyny są często związane z kilkoma stanami chorobowymi, w tym z rakiem2,3,4. Na przestrzeni lat opracowano liczne techniki, które umożliwiają naukowcom badanie krajobrazu chromatyny poprzez mapowanie regionów dostępności chromatyny. Niektóre z nich obejmują DNase-seq (sekwencjonowanie miejsc nadwrażliwych DNase I)5, FAIRE-seq (izolacja elementów regulatorowych wspomagana formaldehydem)6, MAPit (protokół dostępności metylotransferazy dla indywidualnych szablonów)7, oraz główny temat tego artykułu, ATAC-seq (test chromatyny dostępnej dla transpozazy)8. DNase-seq mapuje dostępne regiony, wykorzystując kluczową cechę DNazy, a mianowicie preferencyjne trawienie nagiego DNA wolnego od histonów i innych białek, takich jak czynniki transkrypcyjne5. FAIRE-seq, podobnie jak ChIP-seq, wykorzystuje sieciowanie formaldehydu i sonikację, z wyjątkiem tego, że nie jest zaangażowane immunoprecypitacja, a regiony wolne od nukleosomów są izolowane przez ekstrakcję fenolowo-chloroformową6. Metoda MAPit wykorzystuje metylotransferazę GC do badania struktury chromatyny w rozdzielczości pojedynczej cząsteczki7. ATAC-seq opiera się na transpozazie nadpobudliwej, Tn58. Transpozaza Tn5 preferencyjnie wiąże się z otwartymi regionami chromatyny i wstawia adaptery sekwencjonowania do dostępnych regionów. Tn5 działa poprzez mechanizm "wytnij i wklej" za pośrednictwem DNA, w którym transpozaza wstępnie załadowana adapterami wiąże się z otwartymi miejscami chromatyny, tnie DNA i liguje adaptery8. Regiony związane z Tn5 są odzyskiwane przez amplifikację PCR przy użyciu starterów, które wyżarzają się do tych adapterów. FAIRE-seq i DNase-seq wymagają dużej ilości materiału wyjściowego (~100 000 komórek do 225 000 komórek) i oddzielnego etapu przygotowania biblioteki przed sekwencjonowaniem9. Z drugiej strony, protokół ATAC-seq jest stosunkowo prosty i wymaga niewielkiej liczby komórek (<50 000 komórek)10. W przeciwieństwie do technik FAIRE-seq i DNase-seq, przygotowanie biblioteki sekwencjonowania ATAC-seq jest stosunkowo łatwe, ponieważ wyizolowana próbka DNA jest już znakowana za pomocą adapterów sekwencjonowania przez Tn5. W związku z tym, do zakończenia przygotowania biblioteki potrzebny jest tylko etap amplifikacji PCR z odpowiednimi starterami, a wcześniejsze etapy przetwarzania, takie jak naprawa końcowa i ligacja adaptera, nie muszą być wykonywane, co oszczędza czas11. Po drugie, ATAC-seq pozwala uniknąć konieczności konwersji wodorosiarczynu, klonowania i amplifikacji za pomocą starterów specyficznych dla regionu, wymaganych dla MAPit7. Ze względu na te zalety, sekwencja ATAC stała się niezwykle popularną metodą definiowania otwartych regionów chromatyny. Chociaż metoda ATAC-seq jest prosta, wiele kroków wymaga optymalizacji w celu uzyskania wysokiej jakości i powtarzalnych danych. W artykule omówiono procedury optymalizacyjne dla standardowego przygotowania biblioteki ATAC-seq, zwracając szczególną uwagę na trzy parametry: (1) skład buforu do lizy, (2) stężenie transpozazy Tn5 i (3) liczbę komórek. Ponadto w artykule przedstawiono przykładowe dane z warunków optymalizacyjnych z wykorzystaniem zarówno rakowych, jak i nienowotworowych adherentnych komórek nabłonkowych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowania przed rozpoczęciem eksperymentu

  1. Przygotować zapas buforowy do lizy.
    UWAGA: Optymalny bufor izolacji jądrowej może być różny dla każdego typu ogniwa. Zalecamy przetestowanie zarówno buforu hipotonicznego użytego w oryginalnym paper8, jak i bufora CSK12,13 dla każdego typu komórki przy użyciu barwienia błękitem trypanowym.
    1. Aby przygotować bufor hipotoniczny (bufor Greenleaf), wymieszaj 10 mM Tris-HCl pH 7,4, 10 mM NaCl, 3 mM MgCl2 i 0,1% NP-40.
    2. Aby przygotować bufor CSK, wymieszaj 10 mM PIPES pH 6,8, 100 mM NaCl, 300 mM sacharozy, 3 mM MgCl2 i 0,1% Triton X-100.
  2. Upewnij się, że warunki hodowli komórkowej są optymalne; zbadaj komórki pod mikroskopem świetlnym, aby upewnić się, że nie ma podwyższonego poziomu apoptozy.
  3. Włączyć wirówkę, aby osiągnęła temperaturę 4 °C.

2. Zbieranie komórek

  1. Odessać pożywkę z hodowli komórek przy <80% zbieżności. Komórki są zwykle hodowane w naczyniu o średnicy 35 mm lub 60 mm, w zależności od liczby potrzebnych komórek, zabiegów itp.
  2. Umyj komórki 1 ml lub 3 ml PBS.
  3. Dodaj 0,5 ml lub 1 ml trypsyny i inkubuj przez 2-3 minuty (w zależności od typu komórek). Ostrożnie użyj pipety o pojemności 1 ml, aby dobrze wymieszać.
  4. Dodaj 1 ml lub 2 ml podłoża do płytki i dobrze wymieszaj. Przenieść do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Odwirować komórki w probówce o pojemności 15 ml przez 3 minuty przy 300 x g.
    UWAGA: Zalecany jest wahliwy wirnik łyżki, aby zminimalizować utratę komórek.
  5. Odessać pożywkę i ponownie zawiesić komórki w 1 ml lub 2 ml pożywki.
    UWAGA: Bardzo ważne jest przygotowanie jednorodnego roztworu jednokomórkowego. W przypadku tkanek homogenizator Dounce może być używany do homogenizacji tkanek i minimalizacji dużych grudek lub agregatów komórkowych. Niektóre tkanki wymagają filtracji (np. sitka komórkowe) i/lub sortowania komórek FACS w celu wyizolowania żywych komórek i uzyskania roztworu pojedynczej komórki.
  6. Policz komórki za pomocą licznika komórek.
    UWAGA: W tym badaniu użyto automatycznego licznika komórek (Tabela materiałów).
  7. Odwirować wymaganą objętość komórek (np. objętość zawierającą 1 x 106 komórek w zależności od liczby komórek) przy 300 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej (RT).
  8. Zawiesić osad komórkowy zawierający 1 x 106 komórek w 1 ml zimnego PBS.
    UWAGA: Jeśli liczba komórek jest mniejsza niż 1 x 106 komórek, zmniejsz objętość zimnego PBS, aby przygotować roztwór komórek o tym samym stężeniu (1 x 106 komórek/ml).

3. Liza komórek

  1. Przenieść 25 μl (= 2,5 x 104 komórek) do nowej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,7 ml. Wirować przez 5 minut przy 500 x g w temperaturze 4 °C i ostrożnie wyrzucić supernatant
    UWAGA: Zalecany jest wahliwy wirnik łyżki, aby zminimalizować utratę komórek. Pozostawić około 3 μl supernatantu, aby upewnić się, że komórki nie zostaną wyrzucone.
  2. Dodać 25 μl buforu do lizy i ponownie zawiesić komórki, delikatnie pipetując w górę i w dół. Inkubuj na lodzie przez 5 minut
  3. Wirować przez 5 minut w temperaturze 500 x g w temperaturze 4 °C i ostrożnie wyrzucić supernatant.
    UWAGA: Zalecany jest wahliwy wirnik łyżki, aby zminimalizować utratę komórek. Pozostawić około 3 μl supernatantu, aby upewnić się, że komórki nie zostaną wyrzucone.

4. Tagowanie Tn5

  1. Natychmiast zawiesić osad w 25 μl mieszaniny reakcyjnej Tn5. Mieszanina reakcyjna Tn5 jest następująca: 12,5 μl 2x bufor DNA do znakowania (bufor TD), 1,25-5 μl transpozazy Tn5 i 11,25-7,5 μl wody wolnej od nukleaz.
    UWAGA: Standardowe stężenie Tn5 wynosi 2,5 μl dla komórek 2,5 x 104.
  2. Inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C.
    UWAGA: Roztwór mieszać co 10 minut.

5. Oczyszczanie DNA

UWAGA: Przed amplifikacją wymagane jest oczyszczenie. Oczyszczanie DNA odbywa się za pomocą zestawu do oczyszczania MinElute PCR (tabela materiałów).

  1. Dodać 5 μl 3 M octanu sodu (pH 5,2).
  2. Natychmiast dodać 125 μl Buffer PB i dobrze wymieszać.
  3. Postępuj zgodnie z protokołem zestawu do oczyszczania PCR, zaczynając od kroku 2.
    1. Umieść kolumnę wirową w probówce zbiorczej o pojemności 2 ml.
    2. Pobrać próbkę do kolumny wirowej i wirować przez 1 minutę przy 17 900 x g przy temperaturze pokojowej.
    3. Wyrzuć przepływowy przepływ i umieść kolumnę wirową z powrotem w tej samej probówce zbiorczej.
    4. Dodać 750 μl buforu PE do kolumny wirowej i wirować przez 1 minutę przy 17 900 x g w temperaturze pokojowej.
    5. Wyrzuć przepływowy przepływ i umieść kolumnę wirową z powrotem w tej samej probówce zbiorczej.
    6. Wirować kolumnę wirową przez 5 minut, aby całkowicie wysuszyć membranę.
    7. Wyrzuć przepływowy płyn i umieść kolumnę wirową w nowej probówce do mikrowirówek o pojemności 1,7 ml.
    8. Eluować fragmenty DNA za pomocą 10 μl buforu EB.
    9. Pozostaw kolumnę na 1 minutę w pozycji RT.
    10. Wirować przez 1 minutę przy 17 900 x g w temperaturze pokojowej w celu elucji DNA.

6. Amplifikacja PCR

UWAGA: Amplifikacja PCR transponowanych (oznakowanych) DNA jest niezbędna do sekwencjonowania. W tym przykładzie użyto adapterów z zestawu Nextera (Tabela materiałów). Startery użyte w tym badaniu wymieniono w Tabeli 1.

  1. Ustaw następującą reakcję PCR w probówkach PCR o pojemności 200 μl (50 μl na każdą próbkę). Mieszanina reakcyjna PCR jest następująca: 10 μl eluowanego DNA (etap 5.), 2,5 μl 25 mM adaptera 1, 2,5 μl 25 mM adaptera 2, 25 μL 2x PCR master mix i 10 μl wody wolnej od nukleaz
  2. Wykonaj program amplifikacji PCR, część 1 (Tabela 2).
    UWAGA: W przypadku początkowego amplifikacji te same warunki są stosowane dla wszystkich próbek przy użyciu standardowego termocyklera.
  3. qPCR w czasie rzeczywistym (łącznie 14,5 μl na próbkę)
    1. Używając 5 μl produktu z amplifikacji PCR część 1 (krok 6.2.), przygotuj następującą reakcję, tym razem obejmującą złoto SYBR i wykrywanie w maszynie do PCR w czasie rzeczywistym.
    2. Przygotować mieszaninę reakcyjną PCR w następujący sposób: 5 μl produktu PCR z kroku 6.2., 0,75 μl złota SYBR (1000x rozcieńczone), 5 μl 2x PCR master mix i 3,75 μl wody wolnej od nukleaz.
      UWAGA: Dokładne numery cykli dla wzmocnienia biblioteki przed osiągnięciem nasycenia dla każdej próbki są określane przez qPCR (Tabela 3) w celu zmniejszenia odchylenia GC i rozmiaru w PCR10. SYBR Gold rozcieńczono wodą wolną od nukleaz. Aby przygotować rozcieńczony roztwór, 1 μl SYBR Gold (stężenie podstawowe 10 000x) dodano do 999 μl wody wolnej od nukleaz. Czas trwania RT-qPCR, o którym mowa w tabeli 3, wynosi około 60 min.
  4. Określ wymaganą liczbę dodatkowych cykli PCR, korzystając z parametrów przebiegu z kroku 6.3.
    1. Liczba cykli = 1/4 maksymalnej intensywności fluorescencji (nasyconej) (zazwyczaj 3 lub 4 cykle PCR)
  5. Program amplifikacji PCR część 2 (objętość = 45 μL; Tabela 4): Po ustaleniu numeru cyklu należy skonfigurować PCR z dodatkowymi cyklami obliczonymi w kroku 6.4.1. Na przykład, jeśli obliczony numer cyklu wynosi 3, ustaw 3 cykle w poniższym programie. Łączna liczba cykli wyniesie 8 (5 w kroku 6.2 plus 3 dodatkowe cykle w kroku 6.5).

7. Oczyszczanie koralików

UWAGA: Tutaj użyto koralików AMPure XP (Tabela materiałów).

  1. Do produktów PCR amplifikowanych w poprzednim kroku dodać 150 μl kulek w RT.
    UWAGA: W tym procesie można użyć domowych koralików AMPure14.
  2. Inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
  3. Umieść probówki na stojaku magnetycznym na 5 minut.
  4. Ostrożnie usunąć supernatant.
  5. Umyj kulki 200 μl 80% etanolu.
    UWAGA: 80% etanolu należy przygotować na świeżo.
  6. Powtórz krok 7.4.
  7. Całkowicie usuń etanol.
  8. Suszyć próbki na powietrzu przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
  9. Zawiesić za pomocą 50 μl buforu elucyjnego (10 mM Tris-HCL pH 8,0).
  10. Powtórz oczyszczanie kulek (kroki 7.1-7.9.), aby jeszcze bardziej zminimalizować zanieczyszczenie podkładu.

8. Kontrola stężenia DNA i jakości

  1. Zmierz stężenie DNA za pomocą zestawu do kwantyfikacji kwasów nukleinowych (tabela materiałów).
  2. Zbadaj amplifikowane fragmenty DNA za pomocą elektroforezy żelowej przy użyciu SYBR Gold (0,5x TBE, 1,5% żelu agarozowego) lub automatycznego systemu elektroforezy (np. TapeStation, bioanalizator).

9. Sekwencjonowanie

  1. Wykonaj sekwencjonowanie o wysokiej przepustowości przy użyciu amplifikowanych próbek DNA12,13.
    UWAGA: Amplifikowane próbki DNA są gotowe do sekwencjonowania o wysokiej przepustowości. Aby zachować informacje o fragmentach DNA nukleosomów, zaleca się sekwencjonowanie sparowanych końców zamiast sekwencjonowania pojedynczego końca. Oba końce fragmentów DNA wskazują, gdzie wiąże się transpozaza. Do mapowania otwartych regionów chromatyny zwykle wystarcza 30 milionów odczytów na próbkę.

10. Analiza danych

  1. Filtrowanie danych na podstawie podstawowej jakości połączeń: ustaw minimalny średni podstawowy wynik jakości na 20 (99% dokładności).
  2. Przycinanie adaptera: Usuń sekwencje adaptera za pomocą odpowiedniego narzędzia.
    UWAGA: Narzędzie do owijania Trim Galore (http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/trim_galore/) zostało użyte do usunięcia sekwencji adapterów. W przypadku bibliotek ATAC-seq przygotowanych przez Illumina Tn5 jako sekwencja adaptera używana jest następująca sekwencja: CTGTCTCTTATACACATCT. Minimalna długość sekwencji do rozpoznania zanieczyszczenia adaptera jest ustawiona na 5.
  3. Mapowanie genomu: Mapuj odczyty do odpowiedniego genomu za pomocą Bowtie przy użyciu następujących parametrów "-I 0 -X 2000 -m 1"15. Przykład jakości mapowania z komórek podstawnego raka piersi MDA-MB-231 znajduje się poniżej:
    Odczytuje z co najmniej jednym zgłoszonym wyrównaniem: 52.79%
    Odczyty, które nie zostały wyrównane: 13,10%
    Odczyty z wyrównaniami pominiętymi przez -m: 34,11%
  4. Deduplikacja: Oznacz duplikaty PCR za pomocą Picard tools16.
  5. Generowanie pliku pokrycia genomu w celu wizualizacji danych: Przekonwertuj deduplikowane odczyty sparowanych końców na fragmenty odczytu pojedynczego końca. Ścieżki pokrycia genomu są uzyskiwane za pomocą genomeCoverageBed z bedtools17.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby uzyskać udane i wysokiej jakości dane ATAC-seq, ważne jest zoptymalizowanie warunków eksperymentalnych. Przygotowanie biblioteki ATAC-seq można podzielić na pięć głównych etapów (Rysunek 1), a mianowicie lizę komórek, tagmentację (fragmentacja i wstawienie adaptera przez Tn5), oczyszczanie genomowego DNA, amplifikację PCR i analizę danych. W procesie początkowym bufor lizy komórek (izolacji jądrowej) musi być najpierw zoptymalizowany dla każdego typu komórki. Do lizy komórek raka piersi użyto bufo...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ATAC-seq jest szeroko stosowany do mapowania otwartych i aktywnych regionów chromatyny. Progresja komórek rakowych jest często napędzana przez zmiany genetyczne i przeprogramowanie epigenetyczne, co skutkuje zmienioną dostępnością chromatyny i ekspresją genów. Przykładem tego przeprogramowania jest przejście z nabłonka do mezenchymalnego (EMT) i jego odwrotnego procesu, przejścia mezenchymalnego do nabłonkowego (MET), o których wiadomo, że są kluczowymi procesami przeprogramowania komórkowego podczas przerzutów nowotworo...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie istnieją żadne istotne lub istotne interesy finansowe, które odnoszą się do badań opisanych w niniejszym artykule.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy obiektowi UND Genomics Core za wyjątkową pomoc techniczną.

Ta praca została sfinansowana przez National Institutes of Health [P20GM104360 do M.T., P20 GM104360 do A.D.] oraz fundusze na start zapewnione przez University of North Dakota School of Medicine and Health Sciences, Department of Biomedical Sciences [do M.T.].

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1,5 ml probówki do mikrowirówekUSA Scientific1615-5500Natural
10 µ L XL Końcówki TipOneUSA Scientific1120-3810Filtrowane i o niskiej retencji
100 µ L XL Końcówki TipOne RPTUSA Scientific1182-1830Filtrowane i o niskiej retencji
100 µ L XL Końcówki TipOneUSA Scientific1120-1840Filtrowane i o niskiej retencji.
Stożkowe probówki wirówkoweCorning352096
20 i mikro; L TipOne RPT końcówkiUSA Scientific1183-1810Filtrowane i o niskiej retencji
200 µ L TipOne Końcówki RPTUSA Scientific1180-8810Filtrowane i o niskiej retencji
probówki wirówkowe 50 mlFisherbrand06-443-19
AgarozaThermoFisher ScientificYBP136010Analiza genetyczna Klasa
Wszystkie linie komórkowe użyte w tym badaniu pochodzą zATCC ATCC
Allegra X-30RBeckman Coulter364658SX2415
Koraliki AMPure XPBeckman CoulterA63881Zestaw do oczyszczania koralików
Licznik komórek CellDropDeNovixCellDrop FLLicznik komórek
EDTAMilliporeSigmaEDSBioUltra, bezwodny, ≥ 99% (miareczkowanie)
EGTAMilliporeSigmaE3889
Etanol 100%ThermoFisher ScientificAC615100020bezwodny; Fisher Scientific - Produkty do sterylizacji Decon Labs
Płodowa surowica bydlęca - testowana przez TETR& D SystemsS10350Potrójny 0,1 i mikro; m filtrowany
Gibco DMEM 1xThermoFisher Scientific11965092[+] 4,5 g/L D-glukozy; [+] L-glutamina; [-] Pirogronian sodu
Gibco PBS 1xThermoFisher Scientific10010023pH 7,4
Gibco Trypsin-EDTA 1xThermoFisher Scientific25200056(0,25%), czerwień fenolowa
GlicerolIBI Scientific56-81-5
GlicynaMiliporeSigmaG8898
HClMiliporeSigmaH1758
HEPESMilliporeSigmaH3375
Invitrogen Qubit FluorometrThermoFisher ScientificQ32857
MgCl2MilliporeSigmaM3634
MinElute PCR Zestaw do oczyszczaniaQiagen28004Zestaw do oczyszczania DNA
NaClIBI Scientific7647-14-5
NaOHMilliporeSigmaS8045BioXtra, ≥ 98% (acyzymetryczne), granulki (bezwodne)
NEBNext High-Fidelity 2x PCR Master MixNew England BiolabsM0541
Nextera Zestaw do przygotowania próbek DNAIlluminaFC-121-10302x transpozaza TD i Tn5
NP - 40 (IGEPAL CA-630)MilliporeSigmaI8896do biologii molekularnej
System wykrywania PCRBioRad1855484System czasu rzeczywistego CFX384. C1000 Touch Thermal Cycler
PIPESMilliporeSigmaP1851BioPerformance Certified, nadaje się do hodowli komórkowych
Zestaw testowy Qubit dsDNA HSThermoFisher ScientificQ32854Invitrogen; Zestaw do oznaczania ilościowego kwasów nukleinowych
Probówki testowe QuibitThermoFisher ScientificQ32856Invitrogen
SDSMilliporeSigmaL3771
Octan sodudomowejroboty-pH5,2
SacharozaIBI Scientific57-50-1
SYBR GoldThermoFisher ScientificS11494
SYBR Zielony Supermix, 1,25 mlBioRad1708882
T100 Thermal CyclerBioRad1861096
TempAssure 0,2 ml PCR 8-tubkowe paskiUSA Scientific1402-4700Flex-free, naturalny, polipropylenowy
TempPlate 384-WELL PCR PLATEUSA Scientific1438-4700Pojedyncze wcięcie. Naturalny polipropylen
Tris BaseMilliporeSigma648311ULTROL Grade
Triton x-100IBI Scientific9002-93-1
TrueSeq Zestaw podkładów do sekwencjonowania z podwójnymindeksem IlluminaPE-121-1003Trypan
Blue StainThermoFisher ScientificQ32851
Tween-20MilliporeSigmaP7949BioXtra, lepka ciecz
WodaMilliporeSigmaW3500sterylnie filtrowana, BioReagent, odpowiedni do hodowli komórkowych
ze skośnym 15 ml wirówki

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Klemm, S. L., Shipony, Z., Greenleaf, W. J. Chromatin accessibility and the regulatory epigenome. Nature Reviews Genetics. 20 (4), 207-220 (2019).
  2. Liu, Y. Clinical implications of chromatin accessibility in human cancers. Oncotarget. 11 (18), 1666-1678 (2020).
  3. Sanghi, A., et al. Chromatin accessibility associates with protein-RNA correlation in human cancer. Nature Communications. 12 (1), 5732(2021).
  4. Corces, M. R., et al. The chromatin accessibility landscape of primary human cancers. Science. 362 (6413), (2018).
  5. Boyle, A. P., et al. High-resolution mapping and characterization of open chromatin across the genome. Cell. 132 (2), 311-322 (2008).
  6. Giresi, P. G., Kim, J., McDaniell, R. M., Iyer, V. R., Lieb, J. D. FAIRE (Formaldehyde-Assisted Isolation of Regulatory Elements) isolates active regulatory elements from human chromatin. Genome Research. 17 (6), 877-885 (2007).
  7. Pardo, C. E., Nabilsi, N. H., Darst, R. P., Kladde, M. P. Integrated DNA methylation and chromatin structural analysis at single-molecule resolution. Methods in Molecular Biology. 1288, 123-141 (2015).
  8. Buenrostro, J. D., Giresi, P. G., Zaba, L. C., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position. Nature Methods. 10 (12), 1213-1218 (2013).
  9. Song, L., et al. Open chromatin defined by DNaseI and FAIRE identifies regulatory elements that shape cell-type identity. Genome Research. 21 (10), 1757-1767 (2011).
  10. Buenrostro, J. D., Wu, B., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. ATAC-seq: A method for assaying chromatin accessibility genome-wide. Current Protocols in Molecular Biology. , 1(2015).
  11. Mehrmohamadi, M., Sepehri, M. H., Nazer, N., Norouzi, M. R. A comparative overview of epigenomic profiling methods. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 714687(2021).
  12. Fujiwara, S., Baek, S., Varticovski, L., Kim, S., Hager, G. L. High quality ATAC-Seq data recovered from cryopreserved breast cell lines and tissue. Scientific Reports. 9 (1), 516(2019).
  13. Takaku, M., et al. GATA3-dependent cellular reprogramming requires activation-domain dependent recruitment of a chromatin remodeler. Genome Biology. 17, 36(2016).
  14. Rohland, N., Reich, D. C. ost-effective high-throughput DNA sequencing libraries for multiplexed target capture. Genome Research. 22 (5), 939-946 (2012).
  15. Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biology. 10 (3), 25(2009).
  16. Picard Toolkit Broad Institute, GitHub Repository. , Available from: https://broadinstitute.github.io/picard/ (2022).
  17. Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: A flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).
  18. Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Current Protocols in Immunology. 111, 1-3 (2015).
  19. Zhou, B., et al. INO80 governs superenhancer-mediated oncogenic transcription and tumor growth in melanoma. Genes & Development. 30 (12), 1440-1453 (2016).
  20. Takaku, M., et al. GATA3 zinc finger 2 mutations reprogram the breast cancer transcriptional network. Nature Communications. 9 (1), 1059(2018).
  21. Oldfield, A. J., et al. NF-Y controls fidelity of transcription initiation at gene promoters through maintenance of the nucleosome-depleted region. Nature Communications. 10 (1), 3072(2019).
  22. Langer, L. F., Ward, J. M., Archer, T. K. Tumor suppressor SMARCB1 suppresses super-enhancers to govern hESC lineage determination. Elife. 8, 45672(2019).
  23. Elrod, N. D., et al. The integrator complex attenuates promoter-proximal transcription at protein-coding genes. Molecular Cell. 76 (5), 738-752 (2019).
  24. Corces, M. R., et al. An improved ATAC-seq protocol reduces background and enables interrogation of frozen tissues. Nature Methods. 14 (10), 959-962 (2017).
  25. Porter, J. R., et al. Global inhibition with specific activation: How p53 and MYC redistribute the transcriptome in the DNA double-strand break response. Molecular Cell. 67 (6), 1013-1025 (2017).
  26. Dhasarathy, A., Kajita, M., Wade, P. A. The transcription factor snail mediates epithelial to mesenchymal transitions by repression of estrogen receptor-alpha. Molecular Endocrinology. 21 (12), 2907-2918 (2007).
  27. McCarthy, M. T., O'Callaghan, C. A. PeaKDEck: A kernel density estimator-based peak calling program for DNaseI-seq data. Bioinformatics. 30 (9), 1302-1304 (2014).
  28. Grandi, F. C., Modi, H., Kampman, L., Corces, M. R. Chromatin accessibility profiling by ATAC-seq. Nature Protocols. 7 (6), 1518-1552 (2022).
  29. Heinz, S., et al. Simple combinations of lineage-determining transcription factors prime cis-regulatory elements required for macrophage and B cell identities. Molecular Cell. 38 (4), 576-589 (2010).
  30. Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: The next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
  31. Garcia-Martinez, L., Zhang, Y., Nakata, Y., Chan, H. L., Morey, L. Epigenetic mechanisms in breast cancer therapy and resistance. Nature Communications. 12 (1), 1786(2021).
  32. Bhattacharya, A., et al. The calcium channel proteins ORAI3 and STIM1 mediate TGF-β induced Snai1 expression. Oncotarget. 9 (50), 29468-29483 (2018).
  33. Schep, A. N., et al. Structured nucleosome fingerprints enable high-resolution mapping of chromatin architecture within regulatory regions. Genome Research. 25 (11), 1757-1770 (2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Chromatin AccessibilityTn5 TransposaseLibrary PreparationOpen Chromatin RegionsCell Lysis BufferPCR AmplificationNucleosome Free FragmentsPeak Annotation

Powiązane artykuły