Artykuł metodologiczny

Dyfuzja i montaż pojedynczych cząsteczek na błonach lipidowych stłoczonych w polimerach

2.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/64243

⸱

19 lipca 2022

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Chemical Engineering, Indian Institute of Science, 2Holonyak Micro & Nanotechnology Lab, University of Illinois, Urbana-Champaign, 3Center for BioSystems Science and Engineering, Indian Institute of Science

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj przedstawiono protokół do wykonywania i analizy wiązania, mobilności i składania pojedynczych cząsteczek na sztucznych zatłoczonych błonach lipidowych za pomocą mikroskopii smTIRF (smTIRF) z wykorzystaniem pojedynczej cząsteczki całkowitego wewnętrznego odbicia.

Streszczenie

Błony komórkowe są bardzo zatłoczonymi środowiskami dla reakcji biomolekularnych i sygnalizacji. Jednak większość eksperymentów in vitro badających interakcje białek z lipidami wykorzystuje nagie błony dwuwarstwowe. Takie systemy nie mają złożoności stłoczenia przez białka i glikany osadzone w błonie i wykluczają związane z tym efekty objętości występujące na powierzchniach błon komórkowych. Ponadto ujemnie naładowana szklana powierzchnia, na której tworzą się dwuwarstwy lipidowe, zapobiega swobodnej dyfuzji transbłonowych biomolekuł. W tym miejscu przedstawiamy dobrze scharakteryzowaną błonę polimerowo-lipidową jako naśladownictwo zatłoczonych błon lipidowych. Protokół ten wykorzystuje lipidy sprzężone z glikolem polietylenowym (PEG) jako uogólnione podejście do włączania tłumów do obsługiwanej dwuwarstwy lipidowej (SLB). W pierwszej kolejności przedstawiono procedurę czyszczenia szkiełek mikroskopowych i szkiełek nakrywkowych do przeprowadzania eksperymentów na pojedynczych cząsteczkach. Następnie omówiono metody charakteryzowania PEG-SLB i przeprowadzania jednocząsteczkowych eksperymentów wiązania, dyfuzji i składania biomolekuł za pomocą śledzenia pojedynczych cząsteczek i fotowybielania. Wreszcie, protokół ten pokazuje, jak monitorować gromadzenie się nanoporów bakteryjnej toksyny tworzącej pory cytolizyny A (ClyA) na zatłoczonych błonach lipidowych za pomocą analizy fotowybielania pojedynczej cząsteczki. Kody MATLAB z przykładowymi zestawami danych są również dołączane do wykonywania niektórych typowych analiz, takich jak śledzenie cząstek, wyodrębnianie zachowania dyfuzyjnego i zliczanie podjednostek.

Wprowadzenie

Błony komórkowe to bardzo zatłoczone i złożone systemy1. Stłoczenie molekularne może mieć znaczący wpływ na dyfuzję jednostek związanych z błoną, takich jak białka i lipidy2,3,4. Podobnie, na reakcje dwucząsteczkowe na błonach lipidowych, takie jak dimeryzacja receptorów lub oligomeryzacja kompleksów błonowych, wpływa stłoczenie5,6,7. Natura, konfiguracja i koncentracja tłumów może regulować wiązanie błony, dyfuzyjność i interakcję białko-białko na kilka sposobów8,9. Ponieważ kontrolowanie stłoczenia błon komórkowych i interpretacja ich wpływu na osadzone biomolekuły jest trudne, naukowcy podjęli próbę stworzenia alternatywnych systemów in vitro10.

Popularnym podejściem do sztucznych zatłoczonych membran jest domieszkowanie dwuwarstwowych membran lipidami szczepionymi polimerem (takim jak glikol polietylenowy, PEG)11,12. Podczas wizualizacji dynamiki białek i lipidów na podpartych dwuwarstwach lipidowych (SLB), polimery te dodatkowo osłaniają elementy osadzone w błonie przed leżącym pod spodem ujemnie naładowanym substratem (takim jak szkło), skutecznie odciągając dwuwarstwę od leżącego poniżej nośnika. Zmieniając rozmiar i stężenie polimeru, można kontrolować zakres stłoczenia molekularnego, a także jego oddzielenie od leżącego pod spodem stałego nośnika13,14. Jest to wyraźna przewaga nad dwuwarstwami lipidowymi opartymi na podłożach stałych bez poduszek polimerowych15,16, gdzie transbłonowe biomolekuły mogą stracić swoją aktywność17,18,19. Co ważniejsze, pozwala nam to na odtworzenie zatłoczonego środowiska błony komórkowej in vitro, które ma kluczowe znaczenie dla wielu procesów błonowych.

Polimery szczepione powierzchniowo na membranach również ulegają zmianom w swojej konfiguracji w zależności od gęstości szczepienia12. W niskich stężeniach pozostają w entropicznie zwijanej konfiguracji, znanej jako grzyb, nad powierzchnią błony. Wraz ze wzrostem koncentracji zaczynają one wchodzić w interakcje, mają tendencję do rozwijania się i rozszerzania, ostatecznie tworząc gęstą formację przypominającą szczotkę na membranie21. Ponieważ przejście od reżimu grzybowego do szczotkowego jest wysoce niejednorodne i objawia się słabo scharakteryzowanymi warunkami polimeru, ważne jest, aby stosować dobrze scharakteryzowane warunki do stłoczenia na membranach szczepionych polimerem. W porównaniu z niedawnym badaniem20, identyfikujemy i raportujemy zatłoczone kompozycje błonowe, które utrzymują transport dyfuzyjny i aktywność transbłonowych biomolekuł.

W tym protokole omawiamy, jak generować pegylowane błony lipidowe i podajemy zalecenia dotyczące gęstości PEG, które naśladują stłoczenie w dwóch różnych reżimach konfiguracji polimeru (mianowicie grzyba i szczotki). Protokół opisuje również wiązanie pojedynczych cząsteczek, śledzenie cząstek oraz pozyskiwanie i analizę danych fotowybielania dla cząsteczek osadzonych w tych zatłoczonych błonach. Najpierw opisujemy dokładne etapy czyszczenia, montaż komory obrazowania i generowanie PEG-SLB. Po drugie, podajemy szczegółowe informacje na temat eksperymentów związanych z wiązaniem pojedynczych cząsteczek, śledzeniem cząstek i fotowybielaniem. Po trzecie, omawiamy i) ekstrakcję względnego powinowactwa wiązania, ii) charakteryzowanie dyfuzji molekularnej oraz iii) liczenie podjednostek w zespole białkowym z filmów pojedynczych cząsteczek na błonie.

Chociaż scharakteryzowaliśmy ten system za pomocą obrazowania pojedynczych cząsteczek, protokół jest przydatny dla wszystkich biofizyków błon zainteresowanych zrozumieniem wpływu stłoczenia na reakcje biomolekularne na błonach lipidowych. Ogólnie rzecz biorąc, prezentujemy solidną linię produkcyjną do tworzenia zatłoczonych i podpartych dwuwarstw lipidowych, wraz z różnymi testami jednocząsteczkowymi przeprowadzanymi na nich i odpowiednimi procedurami analizy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Czyszczenie szkiełka przedmiotowego i nakrywki do eksperymentów z pojedynczymi cząsteczkami

  1. Przed montażem komory obrazującej należy oczyścić i przygotować zarówno szkiełka podstawowe, jak i nakrywki. W szkiełkach podstawowych należy wywiercić kilka par otworów za pomocą wiertarki z wiertłami diamentowymi (o średnicy 0,5-1 mm). W przypadku stosowania arkuszy akrylowych, należy użyć wycinarki laserowej do wykonania precyzyjnych otworów (0,5 mm), jak pokazano na Rysunku 1.
    UWAGA: Każda para otworów będzie pełnić funkcję wlotu i wylotu dla wymiany przepływu w poszczególnych komorach mikrofluidycznych. Reprezentatywny plik CAD dla otworów w szkiełku akrylowym dostępny jest w Supplementary Coding File 1. Otwory wywiercone w szkiełkach szklanych są zazwyczaj od 1,5 do 2 razy większe niż rozmiar wiertła.
  2. Szkiełka podstawowe i nakrywki należy umyć detergentem. Następnie należy je dokładnie wypłukać wodą dejonizowaną. Szkiełka i nakrywki należy umieścić w osobnym słoiku do barwienia szkiełek (Coplin) z wodą i poddać sonikacji w myjce ultradźwiękowej przez 30 min. We wszystkich etapach sonikacji należy ustawić moc 70 W.
  3. Należy usunąć wodę i wypełnić słoik Coplina zawierający szklane szkiełka i nakrywki acetonem po brzegi (50-100 mL w zależności od objętości słoika). W przypadku arkuszy akrylowych należy użyć tej samej objętości gotowego 50% (v/v) roztworu acetonu, w przeciwnym razie szkiełka mogą zmatowieć. Słoik Coplina należy potrząsnąć, aby upewnić się, że wszystkie szkiełka i nakrywki są całkowicie zanurzone w roztworze, a następnie sonikować w myjce ultradźwiękowej przez 30 min.
  4. Należy usunąć aceton i wylać go do pojemnika na odpady, wlać do słoików Coplina metanol (50% v/v dla szkiełek akrylowych) i sonikować przez 30 min. Zarówno aceton, jak i metanol są używane do usuwania cząsteczek organicznych ze szkiełek.
  5. Szkiełka podstawowe i nakrywki należy wypłukać obfitą ilością wody typu 1 i umieścić w szklanym słoiku Coplina. Do słoika należy wlać 1 M roztwór KOH i sonikować przez 1 h. W przypadku szkiełek akrylowych należy użyć 0,5 M KOH.
  6. Roztwór KOH należy wylać do pojemnika na odpady nieorganiczne. Słoik należy wypłukać dużą ilością wody i umieścić w dygestorium w celu przeprowadzenia obróbki roztworem piranha. W przypadku szkiełek akrylowych nie należy przeprowadzać obróbki roztworem piranha; należy przejść bezpośrednio do kroku 1.9.
    OSTROŻNIE: Obróbkę roztworem piranha należy przeprowadzać w dygestorium, używając odpowiednich rękawic, okularów ochronnych i fartucha do pracy z kwasami. Roztwór piranha jest silnym utleniaczem i usuwa wszelkie pozostałe cząsteczki organiczne ze szkiełek podstawowych i nakrywek.
  7. Aby przygotować roztwór piranha, należy ostrożnie wlać do szklanej zlewki 2/3 objętości kwasu siarkowego (98% v/v), a resztę uzupełnić nadtlenkiem wodoru (30% v/v). Roztwór należy ostrożnie wymieszać szklaną bagietką, wlać do słoika Coplina i pozostawić w dygestorium na co najmniej 1 h.
  8. Roztwór piranha należy odlać ze słoika Coplina do pojemnika na odpady kwasowe znajdującego się w dygestorium. Słoik Coplina należy wypłukać obfitą ilością wody typu 1.
  9. Szkiełka podstawowe i nakrywki należy osuszyć łagodnym strumieniem gazu azotowego i umieścić w czystym słoiku Coplina. Osuszone szkiełka i nakrywki są teraz gotowe do obróbki plazmowej. Należy wziąć parę szkiełek i nakrywek i umieścić je w urządzeniu do plazmowania.
  10. W komorze należy wytworzyć próżnię. Pokrętło należy ustawić na częstotliwość radiową 8-12 MHz w celu wygenerowania plazmy w komorze. Fioletowa poświata wewnątrz komory będzie sygnalizować powstanie plazmy.
  11. Obróbkę plazmową należy przeprowadzać przez 8-10 min. Po wyłączeniu plazmy należy powoli zwolnić próżnię i przejść do kroku 2 w celu zmontowania mikrofluidycznej komory obrazującej.

2. Montaż komory mikrofluidycznej

UWAGA: Komorę obrazowania tworzy się poprzez umieszczenie dwustronnej taśmy pomiędzy uprzednio oczyszczonym szkiełkiem podstawowym a lamellką z poprzedniego kroku, zgodnie z poniższym opisem.

  1. Złóż preparaty i szkiełka nakrywkowe po obróbce plazmą, zgodnie z Rysunkiem 1. Połóż szkiełko przedmiotowe na czystym papierze chłonnym. Potnij dwustronną taśmę na paski o szerokości ~2-3 mm i umieść je po obu stronach pary otworów na szkiełku przedmiotowym. Użyj końcówki pipety, aby dokładnie docisnąć taśmę, w przeciwnym razie może dojść do wycieku z jednego kanału do drugiego.
    UWAGA: Alternatywnie można wyciąć taśmę na całe szkiełko za pomocą lasera lub zautomatyzowanego plotera tnącego (Rysunek 1).
  2. Umieść poddaną obróbce plazmą nakrywkę na szkiełku z taśmą, aby zamknąć komorę. Użyj końcówki pipety, aby delikatnie docisnąć szkiełko nakrywkowe do obszarów z taśmą, zapewniając wodoszczelność kanału.
  3. W przypadku stosowania szkiełek szklanych, uszczelnij krawędzie za pomocą żywicy epoksydowej. Ostatecznie każda komora obrazowania wykonana ze szkiełka przedmiotowego i nakrywki ma wymiary 10 mm x 2 mm x 0.1 mm (długość x szerokość x głębokość). Przygotowane mikroprzepływowe komory obrazowania należy przechowywać przez 1-2 tygodnie w warunkach bezwodnych (najlepiej w temperaturze 10-25 °C).
    UWAGA: W przypadku taśm ciętych laserowo stosowanych ze szkiełkami akrylowymi stosowanie żywicy epoksydowej nie jest konieczne, ponieważ krawędzie taśmy tworzą szczelną blokadę zapobiegającą wyciekom.

3. Tworzenie wspieranych dwuwarstw na podłożu szklanym poprzez fuzję pęcherzyków

UWAGA: Zagęszczone wspomagane dwuwarstwy lipidowe są tworzone na ściankach komory obrazowania poprzez fuzję pęcherzyków lipidowych przygotowanych z domieszkowanych lipidów PEG.

  1. Należy wziąć czystą fiolkę szklaną, najlepiej uprzednio oczyszczoną roztworem pirania. Należy dodać chloroformowy roztwór 1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine (POPC) oraz 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[amino(polyethylene glycol)-2000] (DOPE-PEG2000) w pożądanym ułamku molowym lipidów PEG2000, tak aby końcowe stężenie po dodaniu buforu w kroku 3.4 wynosiło 3 mM lipidów. W podobny sposób należy przygotować inne składy lipidowe błon.
  2. Chloroform z fiolki należy odparować łagodnym strumieniem azotu, lekko obracając naczyniem, aby wysuszone lipidy równomiernie pokryły powierzchnię fiolki. Fiolkę należy umieścić w eksykatorem próżniowym na 1 h, co pozwoli usunąć resztki chloroformu ze szklanego naczynia. Następnie należy dodać 1 mL soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS) i inkubować przez noc w 37 °C.
  3. Małe pęcherzyki jednowarstwowe (SUVs) należy przygotować zgodnie z poniższym opisem.
    1. Po nocnej inkubacji delikatnie mieszać w vortexie przez 1-2 min, aż roztwór stanie się mętny i mleczny.
    2. 100 µL tego roztworu należy przenieść do małej probówki wirówkowej o pojemności 500 µL i poddać sonikacji przez około 1 h w kąpieli ultradźwiękowej (ustawionej na moc 70 W). Roztwór powinien stać się klarowny; jeśli tak się nie stanie, należy sonikować przez dodatkowe 30 min. Krok ten pozwoli na wytworzenie SUVs o średnicy 50-100 nm.
      UWAGA: Przy pierwszym przygotowaniu należy scharakteryzować SUVs za pomocą dynamicznego rozpraszania światła22,23 (DLS) lub równoważnej metody.
  4. Do sonikowanych pęcherzyków należy dodać chlorek wapnia (CaCl2, stok 3 M) w taki sposób, aby jego stężenie końcowe w roztworze lipidowym wynosiło 30 mM.
  5. Należy odciąć końcówkę mikropipety do aplikacji roztworu próbki tak, aby ściśle pasowała do otworu. Należy wymieszać roztwór lipidowy i wstrzyknąć go przez jeden z otworów w komorze obrazowania wykonanej w kroku 2. Nadmiar roztworu wypływający z komory należy wytrzeć czystą chusteczką, aby zapobiec zanieczyszczeniu sąsiednich kanałów.
  6. Zestaw należy pozostawić w komorze nawilżania na 90 min. Komorę nawilżania przygotowuje się, umieszczając mokrą chusteczkę na dnie probówki wirówkowej o pojemności 50 mL. Przeszkło należy umieścić wewnątrz probówki bokiem i zamknąć zakrętką. Pęcherzyki ulegną fuzji, tworząc jednorodną dwuwarstwę na powierzchni szkła.
  7. Komorę należy dokładnie wypłukać obfitą ilością buforu PBS (około 5-krotność objętości komory obrazowania). Podczas płukania należy zapobiegać dostawaniu się pęcherzyków powietrza do komory, ponieważ mogą one spowodować powstanie defektów w błonie.

4. Konfiguracja mikroskopu i pomiary obrazowania pojedynczych cząstek

UWAGA: Eksperymenty z pojedynczymi cząsteczkami są przeprowadzane przy użyciu układu mikroskopu do fluorescencji z całkowitym wewnętrznym odbiciem24,25,26 (TIRF) opartego na obiektywie (Rysunek 2). Obrazowanie TIRF zapewnia lepszy stosunek sygnału do szumu w obrazowaniu pojedynczych cząsteczek, choć w określonych warunkach (zwłaszcza gdy fluorescencyjne biomolekuły można usunąć z roztworu głównego poprzez przemywanie) można stosować również mikroskopy epi-fluorescencyjne. Można zastosować TIRF typu pryzmatycznego, jednak typ obiektywowy jest preferowany ze względu na łatwość konfiguracji mikroprzepływów27. W przypadku TIRF typu obiektywowego zaleca się stosowanie obiektywu o wysokiej aperturze numerycznej (powiększenie 100x, zazwyczaj dostępny w sprzedaży jako obiektyw TIRF).

  1. Przed przeprowadzeniem jakiegokolwiek eksperymentu dotyczącego mobilności i montażu, skalibruj mikroskop TIRF, aby zapewnić optymalny stosunek sygnału do szumu dzięki oświetleniu polem ewanescentnym. Podczas kalibracji utrzymuj niską moc lasera, w zakresie od 100 µW do 1 mW.
    OSTROŻNIE: Podczas ustawiania wiązki lasera należy używać okularów ochronnych do pracy z laserem.
    1. Aby skalibrować mikroskop, przygotuj próbkę kulek fluorescencyjnych, wprowadzając je do kanału mikroprzepływowego w niskich stężeniach (ok. 100 pM), tak aby plamki fluorescencyjne pojedynczych kulek nie nakładały się na obrazach.
    2. Najpierw zwizualizuj kulki w trybie epifluorescencji. Podczas oświetlania w trybie epifluorescencji, przesuwaj stolik translacyjny lustra M5 (lustra odbijającego laser do lustra dichroicznego) tak długo, aż wiązka wychodząca z obiektywu ugnie się i ostatecznie znajdzie się w konfiguracji całkowitego wewnętrznego odbicia.
    3. Zweryfikuj, czy osiągnięto oświetlenie TIR. Gdy pole ewanescentne TIR oświetla próbkę kulek, sprawdź, czy widoczne są tylko kulki znajdujące się na powierzchni, a kulki swobodnie pływające z dala od powierzchni nie są obserwowane.
  2. Na początku eksperymentu ustaw moc lasera w tylnej płaszczyźnie ogniskowej obiektywu na 5-10 mW, aby zapobiec fotodestrukcji (fotoblaknięciu) fluoroforów.
  3. Pozostaw szkiełko na stoliku mikroskopu i najpierw ustaw ostrość na czystą membranę (bez fluoroforów). Zazwyczaj niewielkie ilości zanieczyszczeń w membranach lipidowych są wystarczające do wykonania tej czynności. Opcjonalnie: w kroku 3.1 wprowadź niewielką liczbę kulek fluorescencyjnych lub kropek kwantowych (w zakresie sub-pikomolarnym), tak aby w polu widzenia znajdowało się tylko od dwóch do pięciu cząstek fluorescencyjnych, co ułatwi zidentyfikowanie prawidłowej ostrości.
  4. Wstrzyknij próbkę (białka błonowe itp.) za pomocą mikropipety do komory obrazowania powleczonej PEG-SLB, przygotowanej w kroku 3.7.
  5. Do pomiaru kinetyki wiązania pojedynczych cząsteczek użyj pompy strzykawkowej, aby przepływać znakowane biomolekuły przez otwory wlotowe do komory mikroprzepływowej (Rycina 3). Zastosuj szybkość przepływu 50-500 µL/min.
    1. Rozpocznij akwizycję filmu przed dodaniem roztworu do komory obrazowania. Pozyskaj >5 000 klatek przy szybkości 25-50 klatek/s w warunkach ciągłego przepływu, aż do momentu, gdy nie nastąpi dalszy wzrost liczby nowych plamek na powierzchni membrany (Wideo 1). W celu analizy kinetyki wiązania postępuj zgodnie z krokami z punktu 6.1.
  6. Do śledzenia pojedynczych cząstek dodaj znakowane biomolekuły w niskich stężeniach (w porównaniu do stałej wiązania) do kanału za pomocą mikropipety. Zoptymalizuj stężenie do gęstości <0,1 cząstek/µm2, tak aby poszczególne cząstki rzadko przecinały swoje ścieżki (Wideo 2). Zapewnia to wysoką wierność trajektorii odzyskanych ze zbiorów danych. W razie potrzeby inkubuj (w przypadku słabego wiązania biomolekuł z membraną, ok. 10 min) w środowisku nawilżonym i przemyj komorę buforem.
    UWAGA: Przemywanie jest konieczne w przypadku słabego wiązania z membraną, gdy większość cząsteczek fluorescencyjnych pozostaje w roztworze. W przeciwnym razie może to zakłócać obrazowanie i skutkować niskim stosunkiem sygnału do szumu.
  7. Do analizy trajektorii pojedynczych cząstek pozyskaj 200-500 klatek przy 10-100 klatkach/s. Utrzymuj obiektyw w ostrości na płaszczyźnie dwuwarstwy przy minimalnym dryfcie stolika podczas interwału akwizycji.

5. Pozyskiwanie obrazów w celu zliczenia podjednostek w kompleksie białkowym

UWAGA: Akwizycja obrazów w celu oszacowania stechiometrii wymaga ciągłego wygaszania fluoroforów i wykrywania liczby stopni, aż do momentu, gdy żadne fluorofory nie będą już emitować fluorescencji.

  1. W celu pomiaru podjednostek, do mikrofluidycznej komory obrazowania należy dodać odpowiednie stężenie znakowanych biomolekuł (przykład: patrz wyniki; ClyA dodano w stężeniu 25 nM) i inkubować (w razie potrzeby przemyć). Preparat należy inkubować w komorze nawilżającej w pożądanej temperaturze przez wymagany czas (przykład: 37 °C i 60 min dla montażu ClyA).
  2. Przeprowadzić akwizycję obrazów dla fotowyblakania pojedynczych cząsteczek zgodnie z poniższym opisem.
    1. Przed obrazowaniem przemyć komorę obrazowania buforem (jeśli to konieczne). Umieścić preparat na mikroskopie i ustawić ostrość, aby zwizualizować znakowane cząsteczki.
    2. Ustawić moc lasera na poziomie, przy którym wyblakanie fluoroforu następuje stopniowo (~1-5 min). Idealnie, dla każdej zmontowanej biomolekuły, należy utrzymać tempo stopni fotowyblakania z odstępem >10-20 klatek obrazowania. Pozyskiwać obrazy do czasu całkowitego fotowyblaknięcia wszystkich cząsteczek (Wideo 3).
      UWAGA: Aby określić całkowity wymagany czas trajektorii fotowyblakania, należy wykreślić średnią intensywność poszczególnych plamek w funkcji liczby klatek obrazowania i wyznaczyć stałą czasową poprzez dopasowanie funkcji wykładniczego zaniku. Całkowity czas akwizycji można ustawić na wartość od 5 do 10 razy większą od stałej czasowej.
  3. Przeprowadzić pomiar montażu zależny od czasu, rozpoczynając akwizycję filmu natychmiast po wprowadzeniu próbki do komory, a następnie rejestrując nowe filmy z fotowyblakania w stałych odstępach czasu po związaniu z błoną, pobierając dane z różnych segmentów PEG-SLB.

6. Analiza obrazów i danych

  1. Przeprowadź wiązanie i śledzenie pojedynczych cząsteczek zgodnie z poniższym opisem.
    1. Wyodrębnij trajektorie pojedynczych cząsteczek z nagrań uzyskanych powyżej, jak pokazano na Rysunku 4. Do wykrywania pojedynczych cząsteczek i ich śledzenia użyj pakietu MATLAB u-track28 lub Trackmate29, wtyczki do programu ImageJ, która również zapewnia skuteczny algorytm śledzenia pojedynczych cząsteczek. Postępuj zgodnie z krokami konfiguracji analizy u-track przedstawionymi w Pliku uzupełniającym 1.
      UWAGA: Krytycznymi parametrami śledzenia pojedynczych cząsteczek są odchylenie standardowe rozmiaru cząsteczki (w pikselach) oraz długość zamykania luk (gap closing length). Dla tych parametrów użyj odpowiednio wartości 1 i 0, aby zastosować najbardziej rygorystyczne kryteria śledzenia.
    2. Aby obliczyć stałe szybkości wiązania, najpierw oszacuj liczbę cząsteczek wiążących się z powierzchnią błony w czasie. Użyj pliku MATLAB binding_SPT (Uzupełniający plik z kodem 2) wraz z folderem wyjściowym u-track, aby zidentyfikować i wykreślić liczbę cząsteczek pojawiających się na błonie uzyskanych w kroku 6.1. Dopasuj obserwowaną kinetykę do odpowiednich modeli kinetycznych (przykład: dopasowanie pojedynczej wykładniczej w celu wyznaczenia stałej czasowej, której odwrotność może zostać przypisana do pozornej stałej szybkości)30, aby wyznaczyć stałe szybkości (patrz wyniki, Rysunek 5).
    3. Średnie kwadratowe przemieszczenie (MSD) dyfundujących cząsteczek (takich jak znacznik DNA w PEG-SLBs, Rysunek 6) wskazuje na charakter dyfuzji. Użyj pakietu MATLAB MSD_ISD (Uzupełniający plik z kodem 2) wraz z folderem wyjściowym u-track, aby uzyskać wykres MSD jako funkcję czasu opóźnienia (lag time) (Rysunek 6B).
    4. Aby zidentyfikować heterogeniczne gatunki dyfundujące, oblicz rozkłady chwilowego kwadratowego przemieszczenia (ISD), jak pokazano na Rysunku 6C. ISD2 zdefiniowano jako (Xt+τ - Xt)2 + (Yt+τ− Yt)2, gdzie preferowany jest czas opóźnienia τ = 2, ponieważ redukuje on szum. Odfiltruj krótkie trajektorie obejmujące mniej niż trzy klatki, aby zmniejszyć szum.
    5. Użyj narzędzia ISD_analyzer (Uzupełniający plik z kodem 2) w programie MATLAB wraz z danymi wyjściowymi z u-track, aby wykreślić ISD śledzonych cząsteczek (Rysunek 6C).
  2. Przeprowadź analizę fotowybielania pojedynczych cząsteczek zgodnie z poniższym opisem.
    1. Aby oszacować stechiometrię kompleksów błonowych, przeprowadź analizę fotowybielania zależnych od czasu intensywności fluorescencyjnych kompleksów (Wideo 3). W tym celu zastosuj algorytm korekcji dryftu (drift_correct_images, Uzupełniający plik z kodem 2) oparty na autokorelacji klatek filmu, aby wyodrębnić dryft translacyjny. Zakłada się tutaj, że zmontowane struktury są w dużej mierze nieruchome podczas akwizycji obrazów. Uruchom pakiet MATLAB Extract_traces_1C (Uzupełniający plik z kodem 2), aby wykryć przebiegi czasowe intensywności cząsteczek z nagrań.
    2. Użyj kodu MATLAB Stepcount_immobile (Uzupełniający plik z kodem 2), aby przeprowadzić detekcję stopni dla przebiegów czasowych intensywności. W przypadku, gdy cząsteczki nie są nieruchome, użyj pakietu u-track, aby wyodrębnić lokalizację ruchomych cząsteczek. Ten zestaw współrzędnych xy można zmapować na surowe nagrania, aby wyodrębnić wartości intensywności ruchomej cząsteczki podczas jej dyfuzji bocznej w błonie. W tej opcji użyj pakietu MATLAB utrack_Int (Uzupełniający plik z kodem 2) wraz z wynikami analizy u-track.
    3. Przeprowadź korekcję niepełnego znakowania biomolekuł znacznikami fluoroforowymi, aby oszacować prawidłową stechiometrię kompleksu białkowego. Wyznacz wydajność znakowania za pomocą spektrofotometru UV-VIS, mierząc absorbancję barwnika i białka w celu oszacowania stężenia. Oblicz wydajność znakowania jako stosunek molowy barwnika do białka.
      UWAGA: Niektóre barwniki absorbują również przy długościach fal bliskich 280 nm, w związku z czym wkład absorbancji barwnika powinien zostać uwzględniony podczas obliczania stężenia.
    4. Przeprowadź korekcję dwumianową, aby uwzględnić niepełną wydajność znakowania fluoroforu, w następujący sposób: użyj kodu MATLAB Step_correction (Uzupełniający plik z kodem 2) wraz z danymi uzyskanymi z zliczania stopni w kroku 6.2.2. Na przykład dla toksyny tworzącej pory, takiej jak Cytolizyna A, która tworzy dodekameryczną strukturę pierścieniową, zastosuj korekcję dwumianową przy użyciu następującego wzoru:
      nk Wzór równowagi statycznej Σ z prawdopodobieństwem i współczynnikami dwumianowymi, równanie matematyczne.
      gdzie Schemat równowagi statycznej ΣF=0; koncepcja fizyczna; analiza bilansu; rozkład sił wektorowych. = wydajność znakowania, n = liczba stopni fotowybielania i s = rzeczywiste zliczenia. Użyj procedury MATLAB Stepcount_immobile, aby odzyskać skorygowane gatunki oligomeryczne. Przelicz częstotliwość oligomerów (si) na ułamki masowe (Rysunek 7C; Uzupełniający plik z kodem 2).
      UWAGA: Zestaw plików analizowanych w u-track znajduje się w Uzupełniającym pliku z kodem 3. Kody MATLAB w Uzupełniającym pliku z kodem 2 mogą być uruchamiane z tymi zestawami danych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Monitorowanie wiązania białka ClyA z membranami pegylowanymi
Po kroku 4.5 kinetykę wiązania szacuje się poprzez wykreślenie liczby cząsteczek wiążących się z powierzchnią membrany w funkcji czasu (Wideo 1). W miarę jak białko ClyA wiąże się z membraną zawierającą 5 mol% lipidów PEG2000, gęstość cząsteczek wzrasta i osiąga nasycenie (Rysunek 5). Dopasowanie funkcją wykładniczego zaniku do związanych cząsteczek (cyjanowe kółka) pozwala wyznaczyć stałą czas...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W tym miejscu demonstrujemy eksperymenty z pojedynczymi cząsteczkami na podpartych dwuwarstwach lipidowych (SLB), które manifestują zatłoczone środowisko dla biomolekuł osadzonych w błonie. Zatłoczone środowisko generuje wykluczony efekt objętościowy, co prowadzi do wzmocnienia reakcji biomolekularnych 1,2,39,40. W przypadku układu PEG-lipid, w którym polimer zajmuje przede wszystkim objętość n...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy dziękują prof. Benjaminowi Schulerowi za udostępnienie plazmidu ekspresji białka ClyA. Prace te były wspierane przez Human Frontier Science Program (RGP0047-2020).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Strzykawki 2,5 mlHMD HealthcareDispo Van, 2,5 ml TuberkulinaPlastikowa strzykawka
AcetonFinar Chemicals10020LL025
Arkuszgrubości 2 mm
Arkusz akrylowyBigiMall2 mm, przezroczysty
sonikator do kąpieliBransonCPX-1800
Chlorek
ChloroformSigma528730  Cholesterol klasy HPLC
Avanti700100
Słoik z kopinyDuran Wheaton KimbleS60168 przesuwny słoik ze szklaną pokrywą
Szkiełka nakrywkoweVWR631-157424 mm X 50 mm
Nić Cy3-DNA IDTGCTGCTATTGCGTCCGTTTGGTT
GGTGTGGGGGG-Cy3
Barwnik cyjaninowy (Cy3)Cytiva Life SciencesPA23001
DiIInvitrogenD3911Dil Stain (nadchloran 1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetrametyloindokarbocyjaniny ("DiI"; DiIC18(3)))Nici
łącznika DNA 1Sigma AldrichGCTGCTATTGCGTCCGTTTAGCT
GGGGGAGTATTGCGGAGGAAGC
T
Nici konektoryjne DNA 2Sigma AldrichCGGACGCAATAGCAGCTCACAG
TCGGTCACAT
Biomerynici tokoferolu DNAToco-CCCAATGTGACCGACTGTGA
DOPE-PEG2000Avanti8801301,2-dioleoilo-sn-glicero-3-fosfoetanoloamina-N-[metoksy(glikol polietylenowy)-2000] (sól amonowa)
Taśma dwustronnaWiertła 3MLF93010LE
(z powłoką diamentową)0,5 - 1 mm
WiertarkaDremel220Stacja robocza
EMCCDAndorDU-897U-CS0-#BV
Koraliki fluorescencyjneInvitrogenF10720
Szkiełka szklane BlueStarMicro Slides,
szklane fiolkiSigma854190
Nadtlenek wodoruLobachemie0018230% roztwór,
Grade LaboleneThermo-Fischer Scientific  Laser detergentowy
532 nmKoherentnaszafirowa
wycinarka laserowaUniwersalne systemy laseroweILS12.75
Lissamine Rhodamine DOPEAvanti8101501,2-dioleoilo-sn-glicero-3-fosfoetanoloamina-N-(lisamina, rodamina, B, sulfonylo) (sól amonowa)
MetanolFinar Chemicals30932LL025
MikroskopOlympusIX81
Bufor fosforanowy sól fizjologiczna (PBS)1X
Środek do czyszczeniaplazmy Harrick Plasma IncPDC-002
POPCAvanti8504571-palmitoilo-2-oleoilo-glicero-3-fosfocholina
Programowalna pompa strzykawkowaNew EraWysokociśnieniowa pompa strzykawkowaNE1010
Nakrętki PTFESigma27141
Rurka PTFECole-ParmerWW-06417-21Masterflex, 0,022" ID x 0,042" OD
Kwas siarkowySD Chemikaliawysokowartościowe 98%, Obiektyw TIRF klasy AR
OlympusUPLAPO100XOHR
Eksykator próżniowyTarsons
Vortex MixerTarsons
akrylowy o wapnia-1 AR

Bibliografia

  1. Löwe, M., Kalacheva, M., Boersma, A. J., Kedrov, A. The more the merrier: Effects of macromolecular crowding on the structure and dynamics of biological membranes. The FEBS Journal. 287 (23), 5039-5067 (2020).
  2. Kuznetsova, I. M., Turoverov, K. K., Uversky, V. N. What macromolecular crowding can do to a protein. International Journal of Molecular Sciences. 15 (12), 23090-23140 (2014).
  3. Horton, M. R., Höfling, F., Rädler, J. O., Franosch, T. Development of anomalous diffusion among crowding proteins. Soft Matter. 6 (12), 2648-2656 (2010).
  4. Jeon, J. H., Javanainen, M., Martinez-Seara, H., Metzler, R., Vattulainen, I. Protein crowding in lipid bilayers gives rise to non-Gaussian anomalous lateral diffusion of phospholipids and proteins. Physical Review X. 6 (2), 021006(2016).
  5. Zhang, Y., et al. The influence of molecular reach and diffusivity on the efficacy of membrane-confined reactions. Biophysical Journal. 117 (7), 1189-1201 (2019).
  6. Loverdo, C., Bénichou, O., Moreau, M., Voituriez, R. Enhanced reaction kinetics in biological cells. Nature Physics. 4 (2), 134-137 (2008).
  7. Monine, M. I., Haugh, J. M. Reactions on cell membranes: Comparison of continuum theory and Brownian dynamics simulations. Journal of Chemical Physics. 123 (7), 074908(2005).
  8. Berry, H. Anomalous diffusion due to hindering by mobile obstacles undergoing Brownian motion or Orstein-Ulhenbeck processes. Physical Review E. 89 (2), 22708(2014).
  9. Saxton, M. J. Anomalous diffusion due to obstacles: A Monte Carlo study. Biophysical Journal. 66 (2), 394-401 (1994).
  10. Andersson, J., Fuller, M. A., Wood, K., Holt, S. A., Köper, I. A tethered bilayer lipid membrane that mimics microbial membranes. Physical Chemistry Chemical Physics. 20 (18), 12958-12969 (2018).
  11. Kaufmann, S., Papastavrou, G., Kumar, K., Textor, M., Reimhult, E. A detailed investigation of the formation kinetics and layer structure of poly(ethylene glycol) tether supported lipid bilayers. Soft Matter. 5 (14), 2804-2814 (2009).
  12. Marsh, D., Bartucci, R., Sportelli, L. Lipid membranes with grafted polymers: Physicochemical aspects. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1615 (1-2), 33-59 (2003).
  13. Labouta, H. I., et al. Surface-grafted polyethylene glycol conformation impacts the transport of PEG-functionalized liposomes through a tumour extracellular matrix model. RSC Advances. 8 (14), 7697-7708 (2018).
  14. Lee, H., Larson, R. G. Adsorption of plasma proteins onto PEGylated lipid bilayers: The effect of PEG size and grafting density. Biomacromolecules. 17 (5), 1757-1765 (2016).
  15. Richter, R. P., Bérat, R., Brisson, A. R. Formation of solid-supported lipid bilayers: An integrated view. Langmuir. 22 (8), 3497-3505 (2006).
  16. Andersson, J., et al. Solid-supported lipid bilayers - A versatile tool for the structural and functional characterization of membrane proteins. Methods. 180, 56-68 (2020).
  17. Duncan, A. L., et al. Protein crowding and lipid complexity influence the nanoscale dynamic organization of ion channels in cell membranes. Scientific Reports. 7 (1), 1-15 (2017).
  18. Garenne, D., Libchaber, A., Noireaux, V. Membrane molecular crowding enhances MreB polymerization to shape synthetic cells from spheres to rods. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (4), 1902-1909 (2020).
  19. Pollock, N. L., Lee, S. C., Patel, J. H., Gulamhussein, A. A., Rothnie, A. J. Structure and function of membrane proteins encapsulated in a polymer-bound lipid bilayer. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1860 (4), 809-817 (2018).
  20. Coker, H. L. E., et al. Controlling anomalous diffusion in lipid membranes. Biophysical Journal. 116 (6), 1085-1094 (2019).
  21. Rex, S., Zuckermann, M. J., Lafleur, M., Silvius, J. R. Experimental and Monte Carlo simulation studies of the thermodynamics of polyethyleneglycol chains grafted to lipid bilayers. Biophysical Journal. 75 (6), 2900-2914 (1998).
  22. Hallett, F. R., Watton, J., Krygsman, P. Vesicle sizing number distributions by dynamic light scattering. Biophysical Journal. 59 (2), 357-362 (1991).
  23. Jin, A. J., Huster, D., Gawrisch, K., Nossal, R. Light scattering characterization of extruded lipid vesicles. European Biophysics Journal. 28 (3), 187-199 (1999).
  24. Axelrod, D. Chapter 7: Total internal reflection fluorescence microscopy. Methods in Cell Biology. 89, 169-221 (2008).
  25. Fish, K. N. Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. Current Protocols in Cytometry. 50 (1), 1-13 (2009).
  26. Fiolka, R., Belyaev, Y., Ewers, H., Stemmer, A. Even illumination in total internal reflection fluorescence microscopy using laser light. Microscopy Research and Technique. 71 (1), 45-50 (2008).
  27. Roy, R., Hohng, S., Ha, T. A practical guide to single-molecule FRET. Nature Methods. 5 (6), 507-516 (2008).
  28. Jaqaman, K., et al. Robust single-particle tracking in live-cell time-lapse sequences. Nature Methods. 5 (8), 695-702 (2008).
  29. Tinevez, J. Y., et al. TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2017).
  30. Jarmoskaite, I., Alsadhan, I., Vaidyanathan, P. P., Herschlag, D. How to measure and evaluate binding affinities. eLife. 9, 57264(2020).
  31. Sathyanarayana, P., et al. Cholesterol promotes Cytolysin A activity by stabilizing the intermediates during pore formation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (31), 7323-7330 (2018).
  32. Mueller, M., Grauschopf, U., Maier, T., Glockshuber, R., Ban, N. The structure of a cytolytic alpha-helical toxin pore reveals its assembly mechanism. Nature. 459 (7247), 726-730 (2009).
  33. Hubicka, K., Janczura, J. Time-dependent classification of protein diffusion types: A statistical detection of mean-squared-displacement exponent transitions. Physical Review E. 101 (2), 1-13 (2020).
  34. Kepten, E., Weron, A., Sikora, G., Burnecki, K., Garini, Y. Guidelines for the fitting of anomalous diffusion mean square displacement graphs from single particle tracking experiments. PLoS ONE. 10 (2), 0117722(2015).
  35. Persson, F., Lindén, M., Unoson, C., Elf, J. Extracting intracellular diffusive states and transition rates from single-molecule tracking data. Nature Methods. 10 (3), 265-269 (2013).
  36. McGuire, H., Aurousseau, M. R. P., Bowie, D., Blunck, R. Automating single subunit counting of membrane proteins in mammalian cells. The Journal of Biological Chemistry. 287 (43), 35912-35921 (2012).
  37. Hines, K. E. Inferring subunit stoichiometry from single molecule photobleaching. The Journal of General Physiology. 141 (6), 737-746 (2013).
  38. Zhang, H., Guo, P. Single molecule photobleaching (SMPB) technology for counting of RNA, DNA, protein and other molecules in nanoparticles and biological complexes by TIRF instrumentation. Methods. 67 (2), 169-176 (2014).
  39. Phillip, Y., Schreiber, G. Formation of protein complexes in crowded environments-From in vitro to in vivo. FEBS Letters. 587 (8), 1046-1052 (2013).
  40. Mittal, S., Chowhan, R. K., Singh, L. R. Macromolecular crowding: Macromolecules friend or foe. Biochimica et Biophysica Acta - General Subjects. 1850 (9), 1822-1831 (2015).
  41. Mashaghi, S., van Oijen, A. M. A versatile approach to the generation of fluid supported lipid bilayers and its applications. Biotechnology and Bioengineering. 111 (10), 2076-2081 (2014).
  42. Wong, W. C., et al. Characterization of single-protein dynamics in polymer-cushioned lipid bilayers derived from cell plasma membranes. The Journal of Physical Chemistry B. 123 (30), 6492-6504 (2019).
  43. Shashkova, S. S., Leake, M. C. Single-molecule fluorescence microscopy review: Shedding new light on old problems. Bioscience Reports. 37 (4), 20170031(2017).
  44. Ishikawa-Ankerhold, H. C., Ankerhold, R., Drummen, G. P. C. Advanced fluorescence microscopy techniques-FRAP, FLIP, FLAP, FRET and FLIM. Molecules. 17 (4), 4047(2012).
  45. Aitken, C. E., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. An oxygen scavenging system for improvement of dye stability in single-molecule fluorescence experiments. Biophysical Journal. 94 (5), 1826-1835 (2008).
  46. Carter, B. C., Vershinin, M., Gross, S. P. A comparison of step-detection methods: How well can you do. Biophysical Journal. 94 (1), 306-319 (2008).
  47. Otsuka, S., Ellenberg, J. Mechanisms of nuclear pore complex assembly - Two different ways of building one molecular machine. FEBS Letters. 592 (4), 475(2018).
  48. Tsekouras, K., Custer, T. C., Jashnsaz, H., Walter, N. G., Pressé, S. A novel method to accurately locate and count large numbers of steps by photobleaching. Molecular Biology of the Cell. 27 (22), 3601-3615 (2016).
  49. Bryan, J. S., Sgouralis, I., Pressé, S. Enumerating high numbers of fluorophores from photobleaching experiments: A Bayesian nonparametrics approach. bioRxiv. , (2020).
  50. Bryan, J. S., Sgouralis, I., Pressé, S. Diffraction-limited molecular cluster quantification with Bayesian nonparametrics. Nature Computational Science. 2 (2), 102-111 (2022).
  51. Kim, Y., et al. Efficient site-specific labeling of proteins via cysteines. Bioconjugate Chemistry. 19 (3), 786-791 (2008).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Membrany polimerowo zag szczonewspierana dwuwarstwa lipidowalipidy koniugowane z PEGledzenie pojedynczych cz steczekmikroskopia TIRFmonta bia ek b onowychwi zanie cytolizyny Aanaliza ledzenia cz stekanaliza fotowybielania

Powiązane artykuły