Method Article

Dyfuzja i montaż pojedynczych cząsteczek na błonach lipidowych stłoczonych w polimerach

DOI:

10.3791/64243

⸱

July 19th, 2022

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Chemical Engineering, Indian Institute of Science, 2Holonyak Micro & Nanotechnology Lab, University of Illinois, Urbana-Champaign, 3Center for BioSystems Science and Engineering, Indian Institute of Science

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj przedstawiono protokół do wykonywania i analizy wiązania, mobilności i składania pojedynczych cząsteczek na sztucznych zatłoczonych błonach lipidowych za pomocą mikroskopii smTIRF (smTIRF) z wykorzystaniem pojedynczej cząsteczki całkowitego wewnętrznego odbicia.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Błony komórkowe są bardzo zatłoczonymi środowiskami dla reakcji biomolekularnych i sygnalizacji. Jednak większość eksperymentów in vitro badających interakcje białek z lipidami wykorzystuje nagie błony dwuwarstwowe. Takie systemy nie mają złożoności stłoczenia przez białka i glikany osadzone w błonie i wykluczają związane z tym efekty objętości występujące na powierzchniach błon komórkowych. Ponadto ujemnie naładowana szklana powierzchnia, na której tworzą się dwuwarstwy lipidowe, zapobiega swobodnej dyfuzji transbłonowych biomolekuł. W tym miejscu przedstawiamy dobrze scharakteryzowaną błonę polimerowo-lipidową jako naśladownictwo zatłoczonych błon lipidowych. Protokół ten wykorzystuje lipidy sprzężone z glikolem polietylenowym (PEG) jako uogólnione podejście do włączania tłumów do obsługiwanej dwuwarstwy lipidowej (SLB). W pierwszej kolejności przedstawiono procedurę czyszczenia szkiełek mikroskopowych i szkiełek nakrywkowych do przeprowadzania eksperymentów na pojedynczych cząsteczkach. Następnie omówiono metody charakteryzowania PEG-SLB i przeprowadzania jednocząsteczkowych eksperymentów wiązania, dyfuzji i składania biomolekuł za pomocą śledzenia pojedynczych cząsteczek i fotowybielania. Wreszcie, protokół ten pokazuje, jak monitorować gromadzenie się nanoporów bakteryjnej toksyny tworzącej pory cytolizyny A (ClyA) na zatłoczonych błonach lipidowych za pomocą analizy fotowybielania pojedynczej cząsteczki. Kody MATLAB z przykładowymi zestawami danych są również dołączane do wykonywania niektórych typowych analiz, takich jak śledzenie cząstek, wyodrębnianie zachowania dyfuzyjnego i zliczanie podjednostek.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Błony komórkowe to bardzo zatłoczone i złożone systemy1. Stłoczenie molekularne może mieć znaczący wpływ na dyfuzję jednostek związanych z błoną, takich jak białka i lipidy2,3,4. Podobnie, na reakcje dwucząsteczkowe na błonach lipidowych, takie jak dimeryzacja receptorów lub oligomeryzacja kompleksów błonowych, wpływa stłoczenie5,6,7. Natura, konfiguracja i koncentracja tłumów może regulować wiązanie błony, dyfuzyjność i interakcję białko-białko na kilka sposobów8,9. Ponieważ kontrolowanie stłoczenia błon komórkowych i interpretacja ich wpływu na osadzone biomolekuły jest trudne, naukowcy podjęli próbę stworzenia alternatywnych systemów in vitro10.

Popularnym podejściem do sztucznych zatłoczonych membran jest domieszkowanie dwuwarstwowych membran lipidami szczepionymi polimerem (takim jak glikol polietylenowy, PEG)11,12. Podczas wizualizacji dynamiki białek i lipidów na podpartych dwuwarstwach lipidowych (SLB), polimery te dodatkowo osłaniają elementy osadzone w błonie przed leżącym pod spodem ujemnie naładowanym substratem (takim jak szkło), skutecznie odciągając dwuwarstwę od leżącego poniżej nośnika. Zmieniając rozmiar i stężenie polimeru, można kontrolować zakres stłoczenia molekularnego, a także jego oddzielenie od leżącego pod spodem stałego nośnika13,14. Jest to wyraźna przewaga nad dwuwarstwami lipidowymi opartymi na podłożach stałych bez poduszek polimerowych15,16, gdzie transbłonowe biomolekuły mogą stracić swoją aktywność17,18,19. Co ważniejsze, pozwala nam to na odtworzenie zatłoczonego środowiska błony komórkowej in vitro, które ma kluczowe znaczenie dla wielu procesów błonowych.

Polimery szczepione powierzchniowo na membranach również ulegają zmianom w swojej konfiguracji w zależności od gęstości szczepienia12. W niskich stężeniach pozostają w entropicznie zwijanej konfiguracji, znanej jako grzyb, nad powierzchnią błony. Wraz ze wzrostem koncentracji zaczynają one wchodzić w interakcje, mają tendencję do rozwijania się i rozszerzania, ostatecznie tworząc gęstą formację przypominającą szczotkę na membranie21. Ponieważ przejście od reżimu grzybowego do szczotkowego jest wysoce niejednorodne i objawia się słabo scharakteryzowanymi warunkami polimeru, ważne jest, aby stosować dobrze scharakteryzowane warunki do stłoczenia na membranach szczepionych polimerem. W porównaniu z niedawnym badaniem20, identyfikujemy i raportujemy zatłoczone kompozycje błonowe, które utrzymują transport dyfuzyjny i aktywność transbłonowych biomolekuł.

W tym protokole omawiamy, jak generować pegylowane błony lipidowe i podajemy zalecenia dotyczące gęstości PEG, które naśladują stłoczenie w dwóch różnych reżimach konfiguracji polimeru (mianowicie grzyba i szczotki). Protokół opisuje również wiązanie pojedynczych cząsteczek, śledzenie cząstek oraz pozyskiwanie i analizę danych fotowybielania dla cząsteczek osadzonych w tych zatłoczonych błonach. Najpierw opisujemy dokładne etapy czyszczenia, montaż komory obrazowania i generowanie PEG-SLB. Po drugie, podajemy szczegółowe informacje na temat eksperymentów związanych z wiązaniem pojedynczych cząsteczek, śledzeniem cząstek i fotowybielaniem. Po trzecie, omawiamy i) ekstrakcję względnego powinowactwa wiązania, ii) charakteryzowanie dyfuzji molekularnej oraz iii) liczenie podjednostek w zespole białkowym z filmów pojedynczych cząsteczek na błonie.

Chociaż scharakteryzowaliśmy ten system za pomocą obrazowania pojedynczych cząsteczek, protokół jest przydatny dla wszystkich biofizyków błon zainteresowanych zrozumieniem wpływu stłoczenia na reakcje biomolekularne na błonach lipidowych. Ogólnie rzecz biorąc, prezentujemy solidną linię produkcyjną do tworzenia zatłoczonych i podpartych dwuwarstw lipidowych, wraz z różnymi testami jednocząsteczkowymi przeprowadzanymi na nich i odpowiednimi procedurami analizy.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Czyszczenie szkiełka i szkiełka nakrywkowego do eksperymentów z pojedynczymi cząsteczkami

  1. Przed montażem komory obrazowania należy oczyścić i przygotować zarówno szkiełka nakrywkowe, jak i szkiełka podstawowe. Wywierć wiele par otworów w szkiełkach za pomocą wiertarki z wiertłami z powłoką diamentową (średnica 0,5-1 mm). Jeśli używane są arkusze akrylowe, użyj wycinarki laserowej, aby wykonać precyzyjne otwory (0,5 mm), jak pokazano w Rysunek 1.
    UWAGA: Każda para otworów będzie działać jako wlot i wylot do wymiany przepływu dla indywidualnej komory mikroprzepływowej. Reprezentatywny plik CAD dla otworów w prowadnicy akrylowej jest dostępny w Uzupełniającym pliku kodowania 1. Otwory wiercone w szkiełkach zwykle są 1,5x-2x większe niż rozmiar wiertła.
  2. Wyczyść szkiełka podstawowe i szkiełka nakrywkowe detergentem. Dokładnie spłucz je wodą dejonizowaną. Umieścić szkiełka podstawowe i szkiełka nakrywkowe w osobnym słoiku do barwienia szkiełek (Coplin) z wodą i sonikować w sonikatorze do kąpieli przez 30 minut. Dla wszystkich etapów sonikacji użyj ustawienia mocy 70 W.
  3. Usuń wodę i napełnij słoik Coplin zawierający szkiełka podstawowe i szkiełka nakrywkowe acetonem po brzegi (50-100 ml w zależności od objętości słoika). W przypadku arkuszy akrylowych należy użyć tej samej objętości wstępnie zmieszanego 50% (v/v) roztworu acetonu, w przeciwnym razie szkiełka staną się oszronione. Wstrząśnij słoikiem Coplin, aby upewnić się, że wszystkie szkiełka i szkiełka nakrywkowe są całkowicie zanurzone w roztworze i poddaj sonikacji w kąpieli przez 30 minut.
  4. Usuń aceton i wyrzuć go do pojemnika na odpady, wlej metanol do słoików Coplin (50%, v/v dla szkiełek akrylowych) i sonikuj przez 30 minut. Zarówno aceton, jak i metanol służą do usuwania cząstek organicznych ze szkiełek.
  5. Opłucz szkiełka podstawowe i szkiełka nakrywkowe dużą ilością wody typu 1 i umieść je w szklanym słoiku Coplin. Wlej 1 M roztwór KOH do słoika i sonikuj przez 1 godzinę. Do prowadnic akrylowych należy użyć 0,5 m KOH.
  6. Wyrzuć KOH do pojemnika na odpady nieorganiczne. Opłucz słoik dużą ilością wody i umieść słoiki Coplin w dygestoriach w celu leczenia piranii. Nie wykonuj zabiegu piranii na szkiełkach akrylowych; Bezpośrednio przejdź do kroku 1.9.
    UWAGA: Leczenie piranii powinno odbywać się w dygestoriach w odpowiednich rękawicach, okularach ochronnych i fartuchu do obchodzenia się z kwasami. Roztwór piranii jest silnym utleniaczem i usuwa wszelkie resztki cząstek organicznych ze szkiełek i szkiełek nakrywkowych.
  7. Aby przygotować roztwór piranii, delikatnie wlej 2/3 objętości kwasu siarkowego (98%, v/v) do szklanej zlewki, a resztę napełnij nadtlenkiem wodoru (30%, v/v). Roztwór dokładnie wymieszać szklaną pałeczką, wlać do słoika Coplin i pozostawić słoik Coplin w dygestorium na co najmniej 1 godzinę.
  8. Zdekantować roztwór piranii ze słoika Coplin do pojemnika na odpady kwasowe przechowywane w dygestorium. Opłucz słoik Coplin dużą ilością wody typu 1.
  9. Wysuszyć szkiełka podstawowe i nakrywkowe w delikatnym strumieniu azotu i umieścić je w czystym słoiku z koplinu. Wysuszone szkiełka podstawowe i nakrywkowe są teraz gotowe do obróbki plazmowej. Weź parę szkiełek podstawowych i nakrywek i umieść je w maszynie plazmowej.
  10. Stwórz próżnię w komorze. Przekręć pokrętło na częstotliwość radiową 8-12 MHz do generowania plazmy w komorze. Fioletowa poświata wewnątrz komory będzie wskazywać na formowanie się plazmy w komorze.
  11. Zabieg plazmowy należy wykonywać przez 8-10 minut. Po wyłączeniu plazmy delikatnie zwolnić podciśnienie i przejść do kroku 2 montażu komory obrazowania mikroprzepływowego.

2. Montaż komory mikroprzepływowej

UWAGA: Komora obrazowania jest tworzona przez umieszczenie dwustronnej taśmy pomiędzy wstępnie oczyszczonym szkiełkiem nakrywkowym a szkiełkiem podstawowym z poprzedniego kroku, jak opisano poniżej.

  1. Zmontuj szkiełka podstawowe i szkiełko nakrywkowe po obróbce plazmowej, jak pokazano na Rysunek 1. Umieść szkiełko podstawowe na czystej bibułce. Pokrój taśmę dwustronną na paski o szerokości ~2-3 mm i umieść je po każdej stronie pary otworów w szklanym szkiełku. Użyj końcówki pipety, aby spłaszczyć taśmę, w przeciwnym razie spowoduje to wyciek z jednego kanału do drugiego.
    UWAGA: Alternatywnie, przeciąć taśmę na całym slajdzie za pomocą lasera lub automatycznego plotera tnącego (Rysunek 1).
  2. Umieść szkiełko nakrywkowe poddane plazmie na zaklejonym szkiełkiem, aby zamknąć komorę. Użyj końcówki pipety, aby delikatnie docisnąć szkiełko nakrywkowe do przyklejonych obszarów, aby kanał był wodoszczelny.
  3. Jeśli używasz szkiełek, uszczelnij krawędzie za pomocą żywicy epoksydowej. Wreszcie każda komora obrazowania wykonana z szkiełka podstawowego i szkiełka nakrywkowego ma wymiary 10 mm x 2 mm x 0,1 mm (długość x szerokość x głębokość). Przygotowane komory do obrazowania mikroprzepływowego przechowywać przez 1-2 tygodnie w stanie wysuszonym (najlepiej w temperaturze 10-25 °C).
    UWAGA: W przypadku taśm wycinanych laserowo stosowanych ze zjeżdżalniami akrylowymi nie jest konieczne stosowanie żywicy epoksydowej, ponieważ krawędzie taśmy tworzą szczelne, szczelne uszczelnienie.

3. Tworzenie dwuwarstw na podłożu szklanym metodą fuzji pęcherzykowej

UWAGA: Na ściankach komory obrazowania powstają stłoczone dwuwarstwy lipidowe w wyniku fuzji pęcherzyków lipidowych przygotowanych z domieszkowanymi PEG-lipidami.

  1. Weź czystą szklaną fiolkę, najlepiej wstępnie oczyszczoną roztworem piranii. Dodać roztwór chloroformu 1-palmitoilo-2-oleoilo-glicero-3-fosfocholiny (POPC) i 1,2-dioleoilo-sn-glicero-3-fosfoetanoloaminy-N-[amino(glikolu polietylenowego)-2000] (DOPE-PEG2000) przy pożądanej frakcji molowej PEG2000 lipidów, tak aby końcowe stężenie po dodaniu buforu wynosiło 3 mM lipidów w kroku 3.4. W podobny sposób przygotuj inne kompozycje błonowe lipidów.
  2. Wysuszyć chloroform z fiolki za pomocą delikatnego strumienia azotu z małym zawirowaniem, tak aby wysuszone lipidy były równomiernie pokryte na powierzchni fiolki. Umieścić fiolkę w eksykatorze próżniowym na 1 godzinę. Spowoduje to usunięcie wszelkich pozostałości chloroformu ze szklanej fiolki. Dodać 1 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C.
  3. Przygotuj małe pęcherzyki jednowarstwowe (SUV), jak opisano poniżej.
    1. Delikatnie wiruj przez 1-2 minuty po całonocnej inkubacji, aż roztwór stanie się mętny i mleczny.
    2. Weź 100 μl tego roztworu do małej probówki wirówkowej o pojemności 500 μl i sonikuj przez około 1 godzinę w sonikatorze kąpielowym (ustawionym na moc 70 W). Rozwiązanie stanie się jasne; Jeśli nie, to sonikuj przez dodatkowe 30 minut. Ten krok pozwoli wygenerować SUV-y o średnicy 50-100 nm.
      UWAGA: Jeśli przygotowujesz się po raz pierwszy, scharakteryzuj SUV-y za pomocą dynamicznego rozpraszania światła22,23 (DLS) lub równoważnej metody.
  4. Dodać chlorek wapnia (CaCl2, 3 M zapas) do sonikowanych pęcherzyków tak, aby jego końcowe stężenie wynosiło 30 mM w roztworze lipidowym.
  5. Wyciąć końcówkę mikropipety do wstrzykiwania roztworu próbki w taki sposób, aby ściśle przylegała do otworu. Wymieszać roztwór lipidów i wstrzyknąć przez jeden z otworów w komorze obrazowania wykonanych w kroku 2. Wytrzyj nadmiar roztworu, który wydostaje się z komory z wylotu, czystą chusteczką, aby zapobiec zanieczyszczeniu sąsiednich kanałów.
  6. Pozostaw ten zestaw w wilgotnej komorze na 90 minut. Przygotuj komorę nawilżającą, umieszczając mokrą chusteczkę na końcu probówki wirówkowej o pojemności 50 ml. Umieść szkiełko bokiem do wnętrza rurki z zamkniętymi zaślepkami rurki. Pęcherzyki łączą się i tworzą jednolitą dwuwarstwę na powierzchni szkła.
  7. Dokładnie umyć komorę dużą ilością buforu PBS (około 5 razy większą niż objętość komory obrazowania). Zapobiegaj przedostawaniu się pęcherzyków powietrza do komory podczas mycia, ponieważ może to spowodować uszkodzenia membrany.

4. Ustawienie mikroskopu i pomiary obrazowania pojedynczych cząstek

UWAGA: Eksperymenty z pojedynczymi cząsteczkami są przeprowadzane na obiektywnej fluorescencji całkowitego wewnętrznego odbicia24,25,26 (TIRF) ustawienia mikroskopu (Rysunek 2). Obrazowanie TIRF zapewnia lepszy stosunek sygnału do szumu dla obrazowania pojedynczych cząsteczek, chociaż mikroskopy epi-fluorescencyjne mogą być również używane w pewnych warunkach (zwłaszcza gdy biomolekuły fluorescencyjne można usunąć z roztworu masowego przez mycie). Można użyć TIRF typu pryzmatu, ale typ obiektywu jest preferowany ze względu na łatwość konfiguracji mikrofluidyki27. W przypadku obiektywów typu TIRF zalecany jest obiektyw o dużej aperturze numerycznej (powiększenie 100x, zwykle dostępny na rynku jako obiektyw TIRF).

  1. Przed przeprowadzeniem jakiegokolwiek eksperymentu dotyczącego mobilności i montażu, należy ustawić mikroskop TIRF tak, aby zapewnić optymalny stosunek sygnału do szumu dzięki oświetleniu przez ulotne pole. Podczas ustawiania utrzymuj moc lasera na niskim poziomie, od 100 μW do 1 mW.
    UWAGA: Podczas ustawiania wiązki laserowej należy używać okularów ochronnych do lasera.
    1. Aby ustawić mikroskop, należy przygotować próbkę kulek fluorescencyjnych, dodając je do kanału mikroprzepływowego w niskich stężeniach (przy ~100 pM) tak, aby plamki fluorescencyjne z pojedynczych kulek nie nakładały się na obrazy.
    2. Najpierw wizualizuj koraliki w trybie epifluorescencji. Gdy oświetlenie jest w trybie epifluorescencji, przesuń stopień translacji lustra M5 (zwierciadło, które odbija laser do dichroiku) tak, aby wiązka wychodząca z obiektywu zakrzywiała się, aż w końcu znajdzie się w konfiguracji całkowitego wewnętrznego odbicia.
    3. Sprawdź, czy osiągnięto oświetlenie TIR. Gdy ulotne pole TIR oświetla próbkę kulki, sprawdź, czy widoczne są tylko kulki na powierzchni i czy nie obserwuje się swobodnie unoszących się kulek z dala od powierzchni.
  2. Na początku eksperymentu ustaw moc lasera na tylnej płaszczyźnie ogniskowej obiektywu na 5-10 mW, aby zapobiec fotozniszczeniu (fotowybielaniu) fluoroforów.
  3. Trzymaj szkiełko na stoliku mikroskopu i najpierw skup się na nieosłoniętej membranie (bez fluoroforów). Zwykle wystarczą do tego niewielkie ślady zanieczyszczeń w błonach lipidowych. Opcjonalnie: Na etapie 3.1 należy wprowadzić niewielką liczbę koralików fluorescencyjnych lub kropek kwantowych (zakres sub picomolar), tak aby w polu widzenia znajdowało się tylko od dwóch do pięciu cząstek fluorescencyjnych, co ułatwi identyfikację właściwej ostrości.
  4. Wstrzyknąć próbkę (białka błonowe itp.) za pomocą mikropipety do komory obrazowania pokrytej PEG-SLB, wykonanej w kroku 3.7.
  5. Do pomiaru kinetyki wiązania pojedynczych cząsteczek użyj pompy strzykawkowej, aby przepuścić znakowane biomolekuły przez otwory wlotowe do komory mikroprzepływowej (Rysunek 3). Stosować natężenie przepływu 50-500 μl/min.
    1. Rozpocznij akwizycję filmu przed dodaniem roztworu do komory obrazowania. Rejestruj >5 000 klatek z szybkością 25-50 klatek/s przy ciągłym przepływie, aż do momentu, gdy nie nastąpi dalszy wzrost pojawiania się nowych plam na powierzchni membrany (Wideo 1). W celu analizy kinetyki wiązania należy postępować zgodnie z krokami opisanymi w ppkt 6.1.
  6. W celu śledzenia pojedynczych cząstek, dodaj znakowane biomolekuły w niskich stężeniach (w porównaniu ze stałą wiązania) do kanału za pomocą mikropipety. Zoptymalizuj stężenie do gęstości <0,1 cząstki/μm2, aby poszczególne cząstki rzadko przecinały swoje ścieżki (Wideo 2). Zapewnia to wysoką wierność ścieżek odzyskanych ze zbiorów danych. W razie potrzeby inkubować (w przypadku słabego wiązania błony przez biomolekuły, ~10 min) w wilgotnym środowisku i umyć komorę buforem.
    UWAGA: Mycie jest konieczne w przypadku, gdy wiązanie na membranie jest słabe, a większość cząsteczek fluorescencyjnych pozostaje w roztworze. W przeciwnym razie może to zakłócić obrazowanie i spowodować słaby stosunek sygnału do szumu.
  7. W przypadku analizy trajektorii pojedynczej cząstki należy uzyskać 200-500 klatek przy 10-100 klatkach / s. Utrzymuj soczewkę obiektywu skupioną na płaszczyźnie dwuwarstwowej z minimalnym dryftem stopnia w okresie akwizycji.

5. Akwizycja obrazu do zliczania podjednostek w zespole białkowym

UWAGA: Akwizycja obrazu w celu oszacowania stechiometrii wymaga ciągłego wybielania fluoroforów i wykrywania liczby kroków, aż do momentu, gdy więcej fluoroforów nie emituje fluorescencji.

  1. W przypadku podjednostek pomiarowych należy dodać odpowiednie stężenie znakowanych biomolekuł (przykład: patrz wyniki; ClyA dodano w stężeniu 25 nM) do komory obrazowania mikroprzepływowego i inkubować (w razie potrzeby przemyć). Inkubować szkiełko w komorze nawilżającej w żądanej temperaturze przez wymagany czas (przykład: 37 °C i 60 minut w przypadku montażu ClyA).
  2. Wykonaj akwizycję obrazu w celu fotowybielania pojedynczych cząsteczek, jak opisano poniżej.
    1. Przed obrazowaniem należy umyć komorę obrazowania buforem (jeśli to konieczne). Umieść szkiełko na mikroskopie i dostosuj ostrość, aby uwidocznić znakowane cząsteczki.
    2. Ustaw moc lasera na poziom, przy którym bielenie fluoroforu następuje stopniowo (~1-5 min). Idealnie, dla każdej złożonej biomolekuły, utrzymuj tempo kroku fotowybielania >10-20 klatek obrazowania od siebie. Uzyskuj obrazy, aż wszystkie cząsteczki zostaną całkowicie wybielone (Wideo 3).
      UWAGA: Aby określić całkowity czas trwania wymaganej trajektorii fotowybielania, należy wykreślić średnią intensywność poszczególnych punktów z liczbą klatek obrazowania i wyznaczyć stałą czasową, dopasowując funkcję rozpadu wykładniczego. Całkowity czas trwania akwizycji można ustawić na 5-10-krotność stałej czasowej.
  3. Wykonać zależny od czasu pomiar montażu, rozpoczynając akwizycję filmu zaraz po wprowadzeniu próbki do komory i uzyskując nowe filmy fotowybielające w ustalonych odstępach czasu po związaniu membrany z różnych segmentów PEG-SLB.

6. Analiza obrazu i danych

  1. Wykonaj wiązanie i śledzenie pojedynczych cząstek, jak opisano poniżej.
    1. Wyodrębnij trajektorie pojedynczych cząstek z filmów uzyskanych powyżej, jak pokazano na Rysunek 4. Do wykrywania pojedynczych cząstek i śledzenia ich użyj pakietu MATLAB, u-track28 lub Trackmate29, wtyczki w ImageJ, która zapewnia również solidny algorytm śledzenia pojedynczych cząstek. Postępuj zgodnie z instrukcjami konfiguracji analizy u-track, jak pokazano w pliku uzupełniającym 1.
      UWAGA: Krytycznymi parametrami śledzenia pojedynczych cząstek są odchylenie standardowe rozmiaru cząstki (w pikselach) i długość zamknięcia szczeliny. Użyj odpowiednio 1 i 0 dla tych parametrów jako najbardziej rygorystycznych kryteriów śledzenia.
    2. Aby obliczyć stałe szybkości wiązania, najpierw oszacuj liczbę cząstek wiążących się z powierzchnią membrany w czasie. Użyj pliku MATLAB binding_SPT (Supplementary Coding File 2) z folderem wyjściowym u-track, aby zidentyfikować i wykreślić liczbę cząstek pojawiających się na membranie uzyskaną z kroku 6.1. Dopasuj obserwowaną kinetykę do odpowiednich modeli kinetycznych (przykład: pojedyncze dopasowanie wykładnicze w celu wyznaczenia stałej czasowej, której odwrotność można przypisać do pozornej stałej szybkości)30, aby wyodrębnić stałe szybkości (patrz wyniki, Rysunek 5).
    3. Przemieszczenie średniokwadratowe (MSD) cząstek dyfuzyjnych (takich jak znacznik DNA w PEG-SLB, Rysunek 6) wskazuje na naturę dyfuzji. Użyj pakietu MATLAB MSD_ISD (Supplementary Coding File 2) z folderem wyjściowym u-track, aby uzyskać wykres MSD w funkcji czasu opóźnienia (Rysunek 6B).
    4. Aby zidentyfikować niejednorodne gatunki dyfuzyjne, oblicz chwilowy rozkład kwadratu przemieszczenia (ISD), jak pokazano na rysunku Rysunek 6C. ISD2, zdefiniowany jako (Xt+τ - Xt)2 + (Yt+τ− Yt)2, gdzie czas opóźnienia, τ = 2, jest preferowany, ponieważ zmniejsza szum. Odfiltruj krótkie trajektorie z mniej niż trzema klatkami, aby zredukować szum.
    5. Użyj ISD_analyzer (Supplementary Coding File 2) w MATLAB z wyjściem u-track, aby wykreślić ISD śledzonych cząstek (Rysunek 6C).
  2. Wykonaj analizę fotowybielania pojedynczych cząsteczek zgodnie z poniższym opisem.
    1. Aby oszacować stechiometrię kompleksów błonowych, należy przeprowadzić analizę fotowybielania na zależnych od czasu intensywnościach kompleksów fluorescencyjnych (Wideo 3). W tym celu należy zastosować algorytm korekcji dryfu (drift_correct_images, Supplementary Coding File 2) oparty na autokorelacji klatek filmu, aby wyodrębnić dryf translacji. Zakłada się, że zmontowane struktury są w dużej mierze nieruchome podczas akwizycji obrazu. Uruchom pakiet MATLAB Extract_traces_1C (Supplementary Coding File 2), aby wykryć ślady intensywności cząstek w czasie z filmów.
    2. Użyj kodu MATLAB Stepcount_immobile (Supplementary Coding File 2), aby przeprowadzić wykrywanie kroku dla śladów intensywności w czasie. W przypadku, gdy cząstki nie są nieruchome, użyj pakietu u-track, aby wyodrębnić lokalizację poruszających się cząstek. Ten zestaw współrzędnych xy można odwzorować na surowych filmach, aby wyodrębnić wartości intensywności poruszającej się cząstki, która dyfunduje bocznie na membranie. Dla tej opcji należy użyć pakietu MATLAB utrack_Int (Supplementary Coding File 2) z danymi wyjściowymi z analizy u-track.
    3. Wykonaj korektę niepełnego znakowania biomolekuł za pomocą znaczników fluoroforowych, aby oszacować prawidłową stechiometrię kompleksu białkowego. Określ skuteczność etykietowania za pomocą spektrofotometru UV-VIS, mierząc absorpcję barwnika i białka w celu oszacowania stężenia. Obliczyć skuteczność znakowania jako stosunek molowy barwnika do białka.
      UWAGA: Niektóre barwniki absorbują również przy długościach fal bliskich 280 nm, a zatem ten udział barwnika w absorpcji powinien być uwzględniony podczas obliczania stężenia.
    4. Wykonaj poprawkę dwumianową, aby uwzględnić niepełną skuteczność znakowania fluoroforu w następujący sposób, używając kodu MATLAB Step_correction (Uzupełniający plik kodowania 2) z danymi uzyskanymi z liczenia krokowego w kroku 6.2.2. Na przykład w przypadku toksyny tworzącej pory, takiej jak cytolizyna A, która tworzy strukturę przypominającą pierścień dodekameryczny, zastosuj poprawkę dwumianową, stosując następujący wzór:
      nk figure-protocol-1
      gdzie figure-protocol-2 = wydajność etykietowania, n = liczba etapów fotowybielania, a s = rzeczywiste liczby. Użyj rutynowej Stepcount_immobile MATLAB, aby odzyskać skorygowane gatunki oligomeryczne. Przelicz częstość oligomerów (si) na ułamki masowe (Rysunek 7C; Uzupełniający plik kodowania 2).
      UWAGA: Zestaw plików analizowanych przez użytkownika znajduje się w dodatkowym pliku kodowania 3. Kody MATLAB w dodatkowym pliku kodowania 2 mogą być uruchamiane z tymi zestawami danych.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Monitorowanie wiązania białka ClyA na błonach pegylowanych
Po kroku 4.5 kinetykę wiązania szacuje się, wykreślając liczbę cząstek wiążących się z powierzchnią membrany w czasie (Wideo 1). Gdy białko ClyA wiąże się z błoną o stężeniu 5% molowych lipidów PEG2000, gęstość cząstek wzrasta i osiąga nasycenie (Rysunek 5). Dopasowanie rozpadu wykładniczego do związanych cząstek (cyjanowe okręgi) daje stałą czasową (τb) dla wiązania błony (w szczególności począ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym miejscu demonstrujemy eksperymenty z pojedynczymi cząsteczkami na podpartych dwuwarstwach lipidowych (SLB), które manifestują zatłoczone środowisko dla biomolekuł osadzonych w błonie. Zatłoczone środowisko generuje wykluczony efekt objętościowy, co prowadzi do wzmocnienia reakcji biomolekularnych 1,2,39,40. W przypadku układu PEG-lipid, w którym polimer zajmuje przede wszystkim objętość n...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują prof. Benjaminowi Schulerowi za udostępnienie plazmidu ekspresji białka ClyA. Prace te były wspierane przez Human Frontier Science Program (RGP0047-2020).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Strzykawki 2,5 mlHMD HealthcareDispo Van, 2,5 ml TuberkulinaPlastikowa strzykawka
AcetonFinar Chemicals10020LL025
Arkuszgrubości 2 mm
Arkusz akrylowyBigiMall2 mm, przezroczysty
sonikator do kąpieliBransonCPX-1800
Chlorek
ChloroformSigma528730  Cholesterol klasy HPLC
Avanti700100
Słoik z kopinyDuran Wheaton KimbleS60168 przesuwny słoik ze szklaną pokrywą
Szkiełka nakrywkoweVWR631-157424 mm X 50 mm
Nić Cy3-DNA IDTGCTGCTATTGCGTCCGTTTGGTT
GGTGTGGGGGG-Cy3
Barwnik cyjaninowy (Cy3)Cytiva Life SciencesPA23001
DiIInvitrogenD3911Dil Stain (nadchloran 1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetrametyloindokarbocyjaniny ("DiI"; DiIC18(3)))Nici
łącznika DNA 1Sigma AldrichGCTGCTATTGCGTCCGTTTAGCT
GGGGGAGTATTGCGGAGGAAGC
T
Nici konektoryjne DNA 2Sigma AldrichCGGACGCAATAGCAGCTCACAG
TCGGTCACAT
Biomerynici tokoferolu DNAToco-CCCAATGTGACCGACTGTGA
DOPE-PEG2000Avanti8801301,2-dioleoilo-sn-glicero-3-fosfoetanoloamina-N-[metoksy(glikol polietylenowy)-2000] (sól amonowa)
Taśma dwustronnaWiertła 3MLF93010LE
(z powłoką diamentową)0,5 - 1 mm
WiertarkaDremel220Stacja robocza
EMCCDAndorDU-897U-CS0-#BV
Koraliki fluorescencyjneInvitrogenF10720
Szkiełka szklane BlueStarMicro Slides,
szklane fiolkiSigma854190
Nadtlenek wodoruLobachemie0018230% roztwór,
Grade LaboleneThermo-Fischer Scientific  Laser detergentowy
532 nmKoherentnaszafirowa
wycinarka laserowaUniwersalne systemy laseroweILS12.75
Lissamine Rhodamine DOPEAvanti8101501,2-dioleoilo-sn-glicero-3-fosfoetanoloamina-N-(lisamina, rodamina, B, sulfonylo) (sól amonowa)
MetanolFinar Chemicals30932LL025
MikroskopOlympusIX81
Bufor fosforanowy sól fizjologiczna (PBS)1X
Środek do czyszczeniaplazmy Harrick Plasma IncPDC-002
POPCAvanti8504571-palmitoilo-2-oleoilo-glicero-3-fosfocholina
Programowalna pompa strzykawkowaNew EraWysokociśnieniowa pompa strzykawkowaNE1010
Nakrętki PTFESigma27141
Rurka PTFECole-ParmerWW-06417-21Masterflex, 0,022" ID x 0,042" OD
Kwas siarkowySD Chemikaliawysokowartościowe 98%, Obiektyw TIRF klasy AR
OlympusUPLAPO100XOHR
Eksykator próżniowyTarsons
Vortex MixerTarsons
akrylowy o wapnia-1 AR

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Löwe, M., Kalacheva, M., Boersma, A. J., Kedrov, A. The more the merrier: Effects of macromolecular crowding on the structure and dynamics of biological membranes. The FEBS Journal. 287 (23), 5039-5067 (2020).
  2. Kuznetsova, I. M., Turoverov, K. K., Uversky, V. N. What macromolecular crowding can do to a protein. International Journal of Molecular Sciences. 15 (12), 23090-23140 (2014).
  3. Horton, M. R., Höfling, F., Rädler, J. O., Franosch, T. Development of anomalous diffusion among crowding proteins. Soft Matter. 6 (12), 2648-2656 (2010).
  4. Jeon, J. H., Javanainen, M., Martinez-Seara, H., Metzler, R., Vattulainen, I. Protein crowding in lipid bilayers gives rise to non-Gaussian anomalous lateral diffusion of phospholipids and proteins. Physical Review X. 6 (2), 021006(2016).
  5. Zhang, Y., et al. The influence of molecular reach and diffusivity on the efficacy of membrane-confined reactions. Biophysical Journal. 117 (7), 1189-1201 (2019).
  6. Loverdo, C., Bénichou, O., Moreau, M., Voituriez, R. Enhanced reaction kinetics in biological cells. Nature Physics. 4 (2), 134-137 (2008).
  7. Monine, M. I., Haugh, J. M. Reactions on cell membranes: Comparison of continuum theory and Brownian dynamics simulations. Journal of Chemical Physics. 123 (7), 074908(2005).
  8. Berry, H. Anomalous diffusion due to hindering by mobile obstacles undergoing Brownian motion or Orstein-Ulhenbeck processes. Physical Review E. 89 (2), 22708(2014).
  9. Saxton, M. J. Anomalous diffusion due to obstacles: A Monte Carlo study. Biophysical Journal. 66 (2), 394-401 (1994).
  10. Andersson, J., Fuller, M. A., Wood, K., Holt, S. A., Köper, I. A tethered bilayer lipid membrane that mimics microbial membranes. Physical Chemistry Chemical Physics. 20 (18), 12958-12969 (2018).
  11. Kaufmann, S., Papastavrou, G., Kumar, K., Textor, M., Reimhult, E. A detailed investigation of the formation kinetics and layer structure of poly(ethylene glycol) tether supported lipid bilayers. Soft Matter. 5 (14), 2804-2814 (2009).
  12. Marsh, D., Bartucci, R., Sportelli, L. Lipid membranes with grafted polymers: Physicochemical aspects. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1615 (1-2), 33-59 (2003).
  13. Labouta, H. I., et al. Surface-grafted polyethylene glycol conformation impacts the transport of PEG-functionalized liposomes through a tumour extracellular matrix model. RSC Advances. 8 (14), 7697-7708 (2018).
  14. Lee, H., Larson, R. G. Adsorption of plasma proteins onto PEGylated lipid bilayers: The effect of PEG size and grafting density. Biomacromolecules. 17 (5), 1757-1765 (2016).
  15. Richter, R. P., Bérat, R., Brisson, A. R. Formation of solid-supported lipid bilayers: An integrated view. Langmuir. 22 (8), 3497-3505 (2006).
  16. Andersson, J., et al. Solid-supported lipid bilayers - A versatile tool for the structural and functional characterization of membrane proteins. Methods. 180, 56-68 (2020).
  17. Duncan, A. L., et al. Protein crowding and lipid complexity influence the nanoscale dynamic organization of ion channels in cell membranes. Scientific Reports. 7 (1), 1-15 (2017).
  18. Garenne, D., Libchaber, A., Noireaux, V. Membrane molecular crowding enhances MreB polymerization to shape synthetic cells from spheres to rods. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (4), 1902-1909 (2020).
  19. Pollock, N. L., Lee, S. C., Patel, J. H., Gulamhussein, A. A., Rothnie, A. J. Structure and function of membrane proteins encapsulated in a polymer-bound lipid bilayer. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1860 (4), 809-817 (2018).
  20. Coker, H. L. E., et al. Controlling anomalous diffusion in lipid membranes. Biophysical Journal. 116 (6), 1085-1094 (2019).
  21. Rex, S., Zuckermann, M. J., Lafleur, M., Silvius, J. R. Experimental and Monte Carlo simulation studies of the thermodynamics of polyethyleneglycol chains grafted to lipid bilayers. Biophysical Journal. 75 (6), 2900-2914 (1998).
  22. Hallett, F. R., Watton, J., Krygsman, P. Vesicle sizing number distributions by dynamic light scattering. Biophysical Journal. 59 (2), 357-362 (1991).
  23. Jin, A. J., Huster, D., Gawrisch, K., Nossal, R. Light scattering characterization of extruded lipid vesicles. European Biophysics Journal. 28 (3), 187-199 (1999).
  24. Axelrod, D. Chapter 7: Total internal reflection fluorescence microscopy. Methods in Cell Biology. 89, 169-221 (2008).
  25. Fish, K. N. Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. Current Protocols in Cytometry. 50 (1), 1-13 (2009).
  26. Fiolka, R., Belyaev, Y., Ewers, H., Stemmer, A. Even illumination in total internal reflection fluorescence microscopy using laser light. Microscopy Research and Technique. 71 (1), 45-50 (2008).
  27. Roy, R., Hohng, S., Ha, T. A practical guide to single-molecule FRET. Nature Methods. 5 (6), 507-516 (2008).
  28. Jaqaman, K., et al. Robust single-particle tracking in live-cell time-lapse sequences. Nature Methods. 5 (8), 695-702 (2008).
  29. Tinevez, J. Y., et al. TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2017).
  30. Jarmoskaite, I., Alsadhan, I., Vaidyanathan, P. P., Herschlag, D. How to measure and evaluate binding affinities. eLife. 9, 57264(2020).
  31. Sathyanarayana, P., et al. Cholesterol promotes Cytolysin A activity by stabilizing the intermediates during pore formation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (31), 7323-7330 (2018).
  32. Mueller, M., Grauschopf, U., Maier, T., Glockshuber, R., Ban, N. The structure of a cytolytic alpha-helical toxin pore reveals its assembly mechanism. Nature. 459 (7247), 726-730 (2009).
  33. Hubicka, K., Janczura, J. Time-dependent classification of protein diffusion types: A statistical detection of mean-squared-displacement exponent transitions. Physical Review E. 101 (2), 1-13 (2020).
  34. Kepten, E., Weron, A., Sikora, G., Burnecki, K., Garini, Y. Guidelines for the fitting of anomalous diffusion mean square displacement graphs from single particle tracking experiments. PLoS ONE. 10 (2), 0117722(2015).
  35. Persson, F., Lindén, M., Unoson, C., Elf, J. Extracting intracellular diffusive states and transition rates from single-molecule tracking data. Nature Methods. 10 (3), 265-269 (2013).
  36. McGuire, H., Aurousseau, M. R. P., Bowie, D., Blunck, R. Automating single subunit counting of membrane proteins in mammalian cells. The Journal of Biological Chemistry. 287 (43), 35912-35921 (2012).
  37. Hines, K. E. Inferring subunit stoichiometry from single molecule photobleaching. The Journal of General Physiology. 141 (6), 737-746 (2013).
  38. Zhang, H., Guo, P. Single molecule photobleaching (SMPB) technology for counting of RNA, DNA, protein and other molecules in nanoparticles and biological complexes by TIRF instrumentation. Methods. 67 (2), 169-176 (2014).
  39. Phillip, Y., Schreiber, G. Formation of protein complexes in crowded environments-From in vitro to in vivo. FEBS Letters. 587 (8), 1046-1052 (2013).
  40. Mittal, S., Chowhan, R. K., Singh, L. R. Macromolecular crowding: Macromolecules friend or foe. Biochimica et Biophysica Acta - General Subjects. 1850 (9), 1822-1831 (2015).
  41. Mashaghi, S., van Oijen, A. M. A versatile approach to the generation of fluid supported lipid bilayers and its applications. Biotechnology and Bioengineering. 111 (10), 2076-2081 (2014).
  42. Wong, W. C., et al. Characterization of single-protein dynamics in polymer-cushioned lipid bilayers derived from cell plasma membranes. The Journal of Physical Chemistry B. 123 (30), 6492-6504 (2019).
  43. Shashkova, S. S., Leake, M. C. Single-molecule fluorescence microscopy review: Shedding new light on old problems. Bioscience Reports. 37 (4), 20170031(2017).
  44. Ishikawa-Ankerhold, H. C., Ankerhold, R., Drummen, G. P. C. Advanced fluorescence microscopy techniques-FRAP, FLIP, FLAP, FRET and FLIM. Molecules. 17 (4), 4047(2012).
  45. Aitken, C. E., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. An oxygen scavenging system for improvement of dye stability in single-molecule fluorescence experiments. Biophysical Journal. 94 (5), 1826-1835 (2008).
  46. Carter, B. C., Vershinin, M., Gross, S. P. A comparison of step-detection methods: How well can you do. Biophysical Journal. 94 (1), 306-319 (2008).
  47. Otsuka, S., Ellenberg, J. Mechanisms of nuclear pore complex assembly - Two different ways of building one molecular machine. FEBS Letters. 592 (4), 475(2018).
  48. Tsekouras, K., Custer, T. C., Jashnsaz, H., Walter, N. G., Pressé, S. A novel method to accurately locate and count large numbers of steps by photobleaching. Molecular Biology of the Cell. 27 (22), 3601-3615 (2016).
  49. Bryan, J. S., Sgouralis, I., Pressé, S. Enumerating high numbers of fluorophores from photobleaching experiments: A Bayesian nonparametrics approach. bioRxiv. , (2020).
  50. Bryan, J. S., Sgouralis, I., Pressé, S. Diffraction-limited molecular cluster quantification with Bayesian nonparametrics. Nature Computational Science. 2 (2), 102-111 (2022).
  51. Kim, Y., et al. Efficient site-specific labeling of proteins via cysteines. Bioconjugate Chemistry. 19 (3), 786-791 (2008).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Single Molecule DiffusionPolymer Crowded MembranesSupported Lipid BilayerPEG Conjugated LipidsSingle Molecule TrackingTIRF MicroscopyMembrane Protein AssemblyCytolysin A BindingParticle Tracking AnalysisPhotobleaching Analysis

Related Articles