Artykuł metodologiczny

Określanie asocjacji termodynamicznej i kinetycznej aptameru DNA i tetracykliny za pomocą izotermicznej kalorymetrii miareczkowej

DOI:

10.3791/64247

⸱

23 sierpnia 2022

 ,  , 
1Aptagen LLC

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obecny protokół opisuje użycie izotermicznej kalorymetrii miareczkowej (ITC) do analizy kinetyki asocjacji i dysocjacji wiązania między aptamerem DNA a tetracykliną, w tym przygotowania próbek, uruchamiania wzorców i próbek oraz interpretacji uzyskanych danych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Określenie powinowactwa wiązania i zachowania między aptamerem a jego celem jest najważniejszym krokiem w wyborze i użyciu aptameru do aplikacji. Ze względu na drastyczne różnice między aptamerem a małymi cząsteczkami, naukowcy muszą włożyć wiele wysiłku w scharakteryzowanie ich właściwości wiążących. Kalorymetria miareczkowa izotermiczna (ITC) jest skutecznym podejściem do tego celu. ITC wykracza poza wyznaczanie stałych dysocjacji (Kd) i może zapewnić zmiany entalpii i stechiometrię wiązania interakcji między dwiema cząsteczkami w fazie roztworu. Podejście to polega na ciągłym miareczkowaniu przy użyciu cząsteczek bezznacznikowych i rejestruje ciepło uwalniane w czasie po zdarzeniach wiązania wytwarzanych przez każde miareczkowanie, dzięki czemu proces może z dużą czułością mierzyć wiązanie między makrocząsteczkami a ich małymi celami. W artykule przedstawiono krok po kroku procedurę pomiaru ITC wybranego aptameru z małym celem, jakim jest tetracyklina. Przykład ten dowodzi wszechstronności tej techniki i jej potencjału w innych zastosowaniach.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aptamery to fragmenty ssDNA lub RNA wybrane w procesie ewolucji o wysokim powinowactwie wiązania i specyficzności do pożądanych celów1,2, które mogą działać jako zaawansowane elementy rozpoznające lub chemiczne przeciwciała3,4,5. W związku z tym powinowactwo wiązania i swoistość aptamerów z ich celami odgrywają kluczową rolę w doborze i zastosowaniu aptameru, a kalorymetria miareczkowa izotermiczna (ITC) jest szeroko stosowana do celów charakterystyki. Do określenia powinowactwa aptamerów zastosowano wiele podejść, w tym ITC, powierzchniowy rezonans plazmonowy (SPR), miareczkowanie kolorymetryczne, termoforezę w mikroskali (MST) i interferometrię biowarstwową (BLI). Wśród nich ITC jest jedną z najnowszych technik określania asocjacji termodynamicznej i kinetycznej dwóch cząsteczek w fazie roztworu. Podejście to polega na ciągłym miareczkowaniu przy użyciu cząsteczek bezznacznikowych i rejestrowaniu ciepła uwalnianego w czasie podczas zdarzeń wiązania wytwarzanych przez każde miareczkowanie6,7. W przeciwieństwie do innych metod, ITC może oferować powinowactwo wiązania, kilka miejsc wiązania oraz asocjację termodynamiczną i kinetyczną (Rysunek 1A). Na podstawie tych parametrów początkowych zmiany energii swobodnej Gibbsa i zmiany entropii są określane za pomocą następującej zależności:

ΔG = ΔH-TΔS

Oznacza to, że ITC oferuje kompletny profil termodynamiczny oddziaływania molekularnego, aby wyjaśnić mechanizmy wiązania (Rysunek 1B). Określenie powinowactwa wiązania małych cząsteczek z aptamerem jest trudne ze względu na drastycznie różne rozmiary między aptamerem a celem. Tymczasem ITC może zapewnić czuły pomiar bez znakowania i unieruchamiania cząsteczek, co zapewnia sposób na utrzymanie naturalnej struktury aptameru i celu podczas pomiaru. Dzięki wymienionym atrybutom, ITC może być stosowany jako standardowa metoda charakterystyki wiązania między aptamerem a małymi celami.

Po wyborze przez grupę Gu, ten aptamer został zintegrowany z różnymi platformami, w tym z elektrochemicznymi biosensorami opartymi na aptamerach, konkurencyjnym testem aptamerowym połączonym z enzymem oraz płytką mikromiareczkową, która może osiągnąć wysoką przepustowość wykrywania tetracykliny8,9,10. Jednak jego charakterystyka wiązania nie została wyjaśniona na tyle dobrze, aby wybrać odpowiednią platformę8; warto scharakteryzować wiązanie aptameru z tetracykliną za pomocą ITC.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Rysunek 2 pokazuje główne etapy eksperymentu ITC w celu określenia termodynamicznego i kinetycznego związku aptameru DNA i tetracykliny.

1. Przygotowanie próbek

UWAGA: Próbki do ITC muszą być przygotowane w tym samym buforze zarówno dla aptameru, jak i liganda, aby uniknąć wydzielania ciepła spowodowanego mieszaniem różnych z celi próbki i strzykawki. Zazwyczaj osiąga się to poprzez dializę wszystkich materiałów do tego samego buforu. Bufor jest wymieniany przy użyciu protokołu zaadaptowanego z protokołu koncentratora o masie cząsteczkowej 3 kDa (MWC) z pewnymi modyfikacjami, jak poniżej:

  1. Aktywować membranę kolumny dializacyjnej (3 kDa MWC) 1x PBS o pH 7,4, zakupionym od producenta, wykonując następujące czynności: napełnić 1x buforem (PBS), zrównoważyć przez 10 minut w temperaturze pokojowej i odwirować przy 5 000 x g przez 15 min.
  2. Usunąć bufor i załadować 500 μl próbek aptamerów do kolumny, odwirować przy 5 000 x g i powtórzyć to 4 razy, aby wymienić oryginalny bufor na 1 x PBS. Gdy bufor przejdzie przez membranę, wszystkie cząsteczki o masie mniejszej niż 3 kDa przejdą przez membranę, a aptamer pozostanie na górnej stronie membrany.
  3. Pobrać dializowany aptamer DNA za pomocą pipety i przenieść go do nowej probówki (probówek) o pojemności 1,5 ml.
  4. Zebrać ostatni bufor przepływowy, aby rozpuścić tetracyklinę. Tetracyklina w proszku jest czysta i mała, więc dializa nie jest potrzebna. Należy jednak użyć poprzedniego dializowanego buforu DNA jako celu, aby upewnić się, że bufor do eksperymentu w strzykawce pasuje do buforu w komórce referencyjnej.
  5. Ponownie oznaczyć stężenie aptamerów za pomocą spektrometru widzialnego w promieniowaniu UV. Użyć ostatniego buforu wymiennego, aby dostosować stężenie do 40 μM tetracykliny i 2 μM aptameru.
  6. Złożyć aptamer DNA, ogrzewając w temperaturze 90 °C przez 10 minut, schładzając w temperaturze 4 °C przez 10 minut, a następnie wracając do temperatury pokojowej przez 20 minut.
  7. Odgazowuje złożony aptamer i dializowaną tetracyklinę za pomocą stacji odgazowującej lub pompy próżniowej ustawionej na 600 mmHg w temperaturze 25 °C przez 25 minut w celu wyeliminowania rozpuszczonych gazów.

2. Mycie instrumentu i uruchamianie zestawu testowego

  1. Wyczyść porty rozpuszczalnika, aby upewnić się, że cała ścieżka próbki jest czysta. Oczyścić, wyrzucając roztwór odpadowy i ładując je czystym metanolem, wodą i buforem. Każdy port zawiera ponad 250 ml, aby zapewnić wystarczającą ilość roztworu do czyszczenia.
    UWAGA: Proces czyszczenia jest automatycznie kończony przez programowalne przez użytkownika oprogramowanie sterujące ITC.
  2. Przetestuj czystość maszyny, uruchamiając ITC za pomocą bufora do bufora (tj. 1x PBS do 1x PBS).
    UWAGA: Normalna linia bazowa szumu jest widoczna między małym buforem a pikami wtrysku buforu. Gdy strzykawka do miareczkowania i kaniule zostaną odpowiednio oczyszczone i całkowicie suche, linia podstawowa będzie stabilna; Wzrost lub spadek linii podstawowej odzwierciedla brudne oprzyrządowanie lub pęcherzyki wewnątrz urządzenia, które należy skorygować przed uruchomieniem rzeczywistych próbek.
  3. Przetestuj dokładność maszyny za pomocą standardowego zestawu, który zawiera EDTA i CaCl2 (Rysunek 3), używając domyślnego programu i postępując zgodnie z instrukcjami producenta.

3. Badanie próbki w celu określenia wiązania między aptamerem a tetracykliną

  1. Ustaw parametry pracy: szybkość mieszania 200 obr./min, praca w temperaturze 25 °C, 2 μM aptamer i 40 μM tetracyklina, 30 wstrzyknięć po 2,0 μl każde, czas opóźnienia 180 s.
  2. Sprawdź wymagane woluminy za pomocą uruchomionego kalkulatora programów. Przy tym parametrze pracy należy wykonać pomiar ITC za pomocą 230 μl 40 μM tetracykliny w strzykawce ITC i 485 μl aptameru 2 μM w celi próbki ITC za pomocą ITC.
  3. Załadować dializowane płytki strzykawki z tetracykliną i złożony aptamer do celi próbki, unikając pęcherzyków, za pomocą pipety.
  4. Uruchom instrument ITC, klikając przycisk Start w oprogramowaniu.
    UWAGA: Proces uruchamiania przyrządu ITC jest w pełni zautomatyzowany po ręcznym napełnieniu celi referencyjnej i płytek z próbkami titranta.

4. Analiza danych za pomocą oprogramowania

  1. Otwórz oprogramowanie do analizy danych, klikając dwukrotnie, aby rozpocząć analizę danych.
  2. Otwórz ścieżkę zapisanych nieprzetworzonych danych, aby poznać tendencję wiązania.
  3. Otwórz kartę modelowania i użyj różnych modeli powiązań, aby znaleźć najlepsze dopasowanie do krzywej danych. Następnie oprogramowanie automatycznie oblicza termogram ITC i różne parametry termodynamiczne, w tym entalpię (ΔH), entropię (ΔS), energię swobodną (ΔG), stałą wiązania równowagi (Ka) i stechiometrię.
  4. Zbierz parametry termodynamiczne wyznaczone na podstawie danych i informacji o modelu dopasowania.
  5. Utwórz raport, zawierający zdjęcia termogramu ITC i różnych parametrów termodynamicznych, jak pokazano na Rysunek 4 i Tabela 1.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ITC dostarcza dokładnej stałej dysocjacji (Kd), stechiometrii wiązania oraz parametrów termodynamicznych oddziaływań dwucząsteczkowych6. W tym przykładzie aptamer wybrany przez Kima i wsp.9,11 wiąże się z tetracykliną z powinowactwem do wiązania Kd 1 = 13 μM, Kd 2 = 53 nM. Co ciekawe, wiązanie to zostało określone za pomocą metody filtracji równowagowej i zgłoszonego Kd

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiona tutaj metoda została zmodyfikowana zgodnie z instrukcją TA Instruments i jest wystarczająca do określenia powinowactwa wiązania i termodynamiki wielu wybranych aptamerów i tarcz w naszym centrum. Kluczowe kroki tej procedury obejmują wymianę buforu w celu dopasowania celu do liganda, uruchomienie próbek z odpowiednimi parametrami i znalezienie odpowiedniego modelu dopasowania wiązania do analizy danych. Ciągłe rejestrowanie wydzielania ciepła wymaga wyeliminowania wszelkich zakłóceń cieplnych, takich jak ni...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie było wspierane przez Fundusze na Rozwój i Rozwój od Aptagen LLC.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
5'-CGTACGGAATTCG CTAGCCCCCCGGCAGGCCACGG
C TTGGGTTGGTCCCACTGCGCGGG
TGGATCCGAGCTCCAC GTG-3'Integrated		DNA Technologies, IncSekwencja została zaczerpnięta z badań Gu, które nie zidentyfikowały Kd za pomocą ITC (patrz referencje 8 i 9)
Affinity ITC Auto Low Volume (190 µ L) System kompletny– Gold CellsTA Instruments61000.901System kalorymetrii miareczkowej
CasCl2Avantor (VWR)E506-100MLChlorek wapnia 1 M w roztworze wodnym, klasa biotechnologiczna, sterylna
wirówkaEppendorf5417REppendorf 5417R jest niezrównany pod względem bezpieczeństwa, niezawodności i łatwości obsługi. Bardzo łatwy w utrzymaniu dzięki bezszczotkowemu silnikowi, który obraca się do 16 400 obr./min z maksymalnym RCF do 25 000 x g.
Kompletna stacja odgazowująca (110/230V)TA Instruments6326Ten odgazowywacz zapewnia niezależną platformę mieszającą, komorę próżniową, port próżniowy, kontrolę temperatury i elektroniczny zegar do prawidłowego przygotowania próbki.
EDTATekNovaE0375EDTA 500 mM, pH 7,5
NanoDrop One Spektrofotometr UV-VIS o mikroobjętościThermoFisherSpektrofotometr ND-ONE-W UV-VIS
Nanosep, Nanosep MF i NAB Urządzenia odśrodkowePall LaboratoryOD030C343 kDa koncentrator odcięcia masy cząsteczkowej
PBS pH 7,4IBI ScientificIB70165Bufor zawierający fosforan sodu, chlorek sodu, fosforan potasu i chlorek potasu Ultra-Pure Grade Sterylne przefiltrowane przy użyciu 0,2 &mikro; m filtr. Autoklawizowane w temperaturze 121 & deg; C przez ponad 20 min.
Posi-Click 1,7 ml probówki wirówkowe z dużą nasadkąlabForce (marka Thomas Scientific)1149K01
Tetracyklina, hydrochorideEMD Millipore CorperationCAS64-75-5

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ellington, A. D., Szostak, J. W. In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands. Nature. 346 (6287), 818-822 (1990).
  2. Tuerk, C., Gold, L. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase. Science. 249 (4968), 505-510 (1990).
  3. Kim, S. H., Thoa, T. T. T., Gu, M. B. Aptasensors for environmental monitoring of contaminants in water and soil. Current Opinion in Environmental Science & Health. 10, 9-21 (2019).
  4. Dunn, M. R., Jimenez, R. M., Chaput, J. C. Analysis of aptamer discovery and technology. Nature Reviews Chemistry. 1, 0076(2017).
  5. Stoltenburg, R., Reinemann, C., Strehlitz, B. SELEX--A (r)evolutionary method to generate high-affinity nucleic acid ligands. Biomolecular Engineering. 24 (4), 381-403 (2007).
  6. Wang, Y., Wang, G., Moitessier, N., Mittermaier, A. K. Enzyme kinetics by isothermal titration calorimetry: Allostery, inhibition, and dynamics. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 583826(2020).
  7. Velazquez-Campoy, A., Freire, E. Isothermal titration calorimetry to determine association constants for high-affinity ligands. Nature Protocols. 1 (1), 186-191 (2006).
  8. Niazi, J. H., Lee, S. J., Gu, M. B. Single-stranded DNA aptamers specific for antibiotics tetracyclines. Bioorganic and Medicinal Chemistry. 16 (15), 7245-7253 (2008).
  9. Kim, Y. J., Kim, Y. S., Niazi, J. H., Gu, M. B. Electrochemical aptasensor for tetracycline detection. Bioprocess and Biosystems Engineering. 33 (1), 31-37 (2010).
  10. Wang, S., et al. Development of an indirect competitive assay-based aptasensor for highly sensitive detection of tetracycline residue in honey. Biosensors & Bioelectronics. 57, 192-198 (2014).
  11. Kim, Y. S., et al. A novel colorimetric aptasensor using gold nanoparticle for a highly sensitive and specific detection of oxytetracycline. Biosensors & Bioelectronics. 26 (4), 1644-1649 (2010).
  12. Thoa, T. T., Minagawa, N., Aigaki, T., Ito, Y., Uzawa, T. Regulation of photosensitisation processes by an RNA aptamer. Scientific Reports. 7, 43272(2017).
  13. Horowitz, E. D., Lilavivat, S., Holladay, B. W., Germann, M. W., Hud, N. V. Solution structure and thermodynamics of 2',5' RNA intercalation. Journal of the American Chemical Society. 131 (16), 5831-5838 (2009).
  14. Sigurskjold, B. W. Exact analysis of competition ligand binding by displacement isothermal titration calorimetry. Analytical Biochemistry. 277 (2), 260-266 (2000).
  15. Neves, M. A. D., Slavkovic, S., Churcher, Z. R., Johnson, P. E. Salt-mediated two-site ligand binding by the cocaine-binding aptamer. Nucleic Acids Research. 45 (3), 1041-1048 (2017).
  16. Turnbull, W. B., Daranas, A. H. On the value of c: Can low affinity systems be studied by isothermal titration calorimetry. Journal of the American Chemical Society. 125 (48), 14859-14866 (2003).
  17. Van Ness, J., Van Ness, L. K., Galas, D. J. Isothermal reactions for the amplification of oligonucleotides. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (8), 4504-4509 (2003).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Wi zanie aptamer w DNAinterakcja z tetracyklinpowinowactwo wi zaniaparametry termodynamicznefa dowanie aptameruwymiana buforusekwencyjny model wi zaniatermoforeza mikroskalowa

Powiązane artykuły