Artykuł metodologiczny

Analiza cytometrii przepływowej mysich komórek macierzystych i progenitorowych szpiku kostnego oraz komórek niszowych zrębu

DOI:

10.3791/64248

⸱

28 września 2022

 ,  ,  ,  , 
1Instituto de Investigação e Inovação em Saúde (i3S), Universidade do Porto, 2Department of Onco-Hematology, Instituto Português de Oncologia (IPO)-Porto, 3Unit of Biochemistry, Department of Biomedicine, Faculdade de Medicina da Universidade do Porto, 4Porto Comprehensive Cancer Center (P.CCC)

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj opisujemy prosty protokół izolacji i barwienia mysich komórek szpiku kostnego do fenotypu hemopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych wraz z wspierającymi je niszowymi komórkami macierzystymi śródbłonka i mezenchymalnymi komórkami macierzystymi. Uwzględniono również metodę wzbogacania komórek zlokalizowanych w obszarach śródkostnych i centralnych szpiku kostnego.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Szpik kostny (BM) to miękka tkanka znajdująca się w kościach, gdzie głównie zachodzi hematopoeza, proces, w którym generowane są nowe krwinki. W związku z tym zawiera hematopoetyczne komórki macierzyste i progenitorowe (HSPC), a także wspierające komórki zrębu, które przyczyniają się do utrzymania i regulacji HSPC. Zaburzenia hematologiczne i inne zaburzenia BM zaburzają hematopoezę, wpływając bezpośrednio na komórki krwiotwórcze i/lub poprzez zmianę niszy BM. W tym miejscu opisujemy metodę badania hematopoezy w zdrowiu i nowotworach złośliwych poprzez analizę fenotypową mysich BM HSPC i niszowych populacji zrębu za pomocą cytometrii przepływowej. Nasza metoda szczegółowo opisuje wymagane kroki w celu wzbogacenia komórek BM we frakcje śródkostne i centralne BM, a także odpowiednie strategie bramkowania w celu zidentyfikowania dwóch kluczowych typów komórek niszowych zaangażowanych w regulację HSPC, komórek śródbłonka i mezenchymalnych komórek macierzystych. Proponowana tutaj analiza fenotypowa może być połączona z mutantami myszy, modelami chorób i testami funkcjonalnymi w celu scharakteryzowania przedziału HSPC i jego niszy.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cytometria przepływowa jest nieocenioną metodą do charakteryzowania i prospektywnego izolowania komórek immunologicznych i krwiotwórczych. Jest również coraz częściej stosowany do analizy populacji zrębu i nabłonka różnych tkanek. Krwiotwórcze komórki macierzyste (HSC) mają unikalne właściwości samoodnawiania i multipotencji. U dorosłych ssaków HSC znajdują się głównie w szpiku kostnym (BM), gdzie odbierają sygnały o spoczynku i przeżyciu z otaczającego mikrośrodowiska lub niszy1. HSC są formalnie definiowane zgodnie z testami funkcjonalnymi2. Niemniej jednak kilka przełomowych prac wykazało przydatność cytometrii przepływowej do identyfikacji HSC. Dzięki zastosowaniu markerów o ograniczonej powierzchni komórek możliwe jest rozróżnienie populacji krwiotwórczych, które są wysoce wzbogacone w HSCs3. Cytometria przepływowa jest zatem centralną metodą w dziedzinie komórek macierzystych. Jest on szeroko stosowany do oceny wpływu przypuszczalnych typów komórek niszowych i czynników niszowych na HSC. Łącząc cytometrię przepływową z obrazowaniem i testami funkcjonalnymi, wykazano, że HSC są krytycznie wspierane przez okołonaczyniowe mezenchymalne komórki macierzyste (MSC) i komórki śródbłonka (EC). MSCs BM są grupą heterogenną i mają różny udział cytokin4, ale dobrze wiadomo, że receptor leptyny (LepR)+ MSCs są kluczowymi komórkami niszowymi1. BM EC są również wysoce heterogeniczne i mogą być częścią sinusoid, tętniczek i naczyń typu H/przejściowych5. Różne badania wykazały zniuansowany wkład tych różnych EC. Na przykład wewnątrzkostne sinusoidalne EC są przestrzennie bliższe spoczynkowi HSCs6, podczas gdy niemigrujące HSC z niższymi poziomami reaktywnych form tlenu znajdują się w pobliżu tętniczych ECs7. Bardzo ważna jest również śródkostna a centralna lokalizacja nisz. Naczynia wewnątrzkostne typu H są związane z komórkami zrębu okołonaczyniowego, które są tracone wraz ze starzeniem się, co prowadzi do utraty HSCs8. W ostrej białaczce szpikowej centralne EC są rozszerzone, podczas gdy naczynia śródkostne i śródkostne HSC są tracone9.

Większość badań w tej dziedzinie skupiała się na samej hematopoezie i na zewnętrznej regulacji HSC przez komórkę. Coraz częściej uznaje się jednak, że istnieje potrzeba lepszego scharakteryzowania nisz, które regulują inne czynniki progenitorowe, a mianowicie multipotencjalnych progenitorów (MPP), szczególnie biorąc pod uwagę, że są one głównymi czynnikami napędzającymi hematopoezę w stanie stacjonarnym10. W przeciwieństwie do ustalonej struktury hierarchicznej, ostatnie badania wykazały, że hematopoeza jest kontinuum, w którym HSC różnicują się w stronnicze MPP na wczesnym etapie11. MPP zostały nazwane według różnych schematów klasyfikacji12, ale niedawny konsensus Międzynarodowego Towarzystwa Hematologii Eksperymentalnej (ISEH) zaproponował, aby MPP były rozróżniane jako wczesne MPP i zgodnie z ich odchyleniem limfatycznym (MPP-Ly), megakariocytarnym i erytroidalnym (MPP-Mk/E) oraz szpikowym (MPP-G/M) class13. Zastosowanie cytometrii przepływowej będzie miało kluczowe znaczenie dla dalszych badań nad znaczeniem nisz BM w regulacji tych populacji. Obecne metody cytometrii przepływowej wykorzystują zmienne strategie bramkowania do różnicowania HSPC i identyfikacji komórek zrębu, a mianowicie EC, przy użyciu niespójnych markerów. Celem obecnej metody jest przedstawienie prostego i powtarzalnego procesu barwienia BM w celu identyfikacji subpopulacji HSPC, heterogenicznych grup EC i MSCs LepR+. Uważamy, że ta technika, choć porównywalna z wcześniej opisanymi metodami (patrz na przykład reference14), zapewnia zaktualizowany i łatwy do wdrożenia protokół analizy fenotypowej komórek krwiotwórczych w dwóch funkcjonalnych obszarach szpiku, endosteal i centralnym BM8,15, a także komórek niszowych zrębu BM.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zwierzęta użyte w tym protokole były trzymane w obiekcie dla zwierząt i3S w określonych warunkach wolnych od patogenów, w 12-godzinnym cyklu światło-ciemność i w środowisku o kontrolowanej temperaturze. Zapewniony był bezpłatny dostęp do standardowej karmy dla gryzoni i wody. Wszystkie zwierzęta otrzymały humanitarną opiekę zgodnie z kryteriami określonymi przez Federację Europejskich Stowarzyszeń Nauk o Zwierzętach Laboratoryjnych w zakresie opieki nad zwierzętami laboratoryjnymi i obchodzenia się ze zwierzętami laboratoryjnymi (Dyrektywa UE 2010/63/UE). Procedura doświadczalna przeprowadzona na zwierzętach (eutanazja) została zatwierdzona przez Komisję Etyki Zwierząt i3S (ref. DD_2019_15) oraz Direção-Geral de Alimentação e Veterinária. Szczegółowe informacje na temat materiałów użytych w niniejszym protokole można znaleźć w Tabeli Materiałów.

1. Przygotowanie roztworów i koktajli barwiących

  1. Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS): Rozpuścić pięć tabletek PBS w 1 litrze wody destylowanej. Przechowywać w temperaturze pokojowej (RT).
  2. PBS 2% płodowa surowica bydlęca (FBS): Dodaj 10 ml FBS do 500 ml PBS. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
  3. Bufor do lizy czerwonych krwinek (RBC) (1x): Dodaj 50 ml 10x buforu do lizy RBC do 450 ml wody dejonizowanej. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
  4. Roztwór kolagenazy IV i dypazy II: Rozpuścić 30 mg kolagenazy IV i 60 mg dypazy II w 30 ml HBSS w celu uzyskania 1 mg/ml kolagenazy IV i 2 mg/ml roztworu dypazy II. Przygotuj świeże przed użyciem.
  5. Roztwór blokujący receptory Fc: Dodać 10 μl oczyszczonego przeciwciała anty-mysiego CD16/32 do 490 μl PBS 2% FBS. Przygotuj świeże lub poprzedniego dnia. Przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu użycia.
  6. Roztwór do barwienia barwnikiem żywotności komórek fluorescencyjnych: Dodać 2 μl barwnika żywotności komórek fluorescencyjnych do 1 ml PBS. Przygotuj świeże przed użyciem.
  7. Koktajl linii biotyny: Wymieszaj 100 μl każdego z następujących przeciwciał: biotyna anty-mysie CD3ε, biotyna anty-mysie CD4, biotyna anty-mysie CD8a, biotyna anty-mysz / ludzka CD11b, biotyna anty-mysz / ludzka CD45R / B220, biotyna anty-mysz Ly-6G / Ly-6C (Gr-1) i biotyna anty-mysie TER-119 / komórki erytroidalne. Przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu użycia.
  8. Podstawowy koktajl barwiący HSC: Dodaj 10 μl koktajlu linii biotyny, 10 μl immunofluorescencyjnie znakowanego 510 anty-mysiego CD150 (SLAM), 10 μl fikoerytryny (PE) anty-mysiego Flk2 (CD135), 10 μl białka perydyninowo-chlorofilowego (PerCP) anty-mysiego Ly-6A/E (Sca-1), 10 μl PE/cyjaniny7 anty-mysiego CD48 i 10 μl allofikocyjaniny (APC)/cyjaniny7 anty-myszy CD117 (c-kit) do 940 μL PBS 2% FBS. Przygotuj świeże lub poprzedniego dnia. Przechowywać w temperaturze 4 °C, chronić przed światłem do czasu użycia.
  9. Pierwotny koktajl barwienia zrębu: Dodaj 5 μl mysiego przeciwciała biotynylowanego leptyny R, 6,7 μl PE przeciwciała anty-mysiego endomucyny, 10 μl PerCP anty-mysiego Ly-6A / E (Sca-1), 4 μl PE / Cyjanina 7 anty-mysiego CD31, 10 μl APC / Cyjanina7 anty-mysiego CD45 i 10 μl APC / Cyjaninina 7 anty-mysie komórki TER-119 / erytroidalne do 954 μL PBS 2% FBS. Przygotuj świeże lub poprzedniego dnia. Przechowywać w temperaturze 4 °C, chronić przed światłem do czasu użycia.
  10. HSCs/wtórny roztwór do barwienia zrębu: Dodać 1 μl streptawidyny APC do 1 ml PBS 2% FBS. Przygotuj świeże lub poprzedniego dnia. Przechowywać w temperaturze 4 °C, chronić przed światłem do czasu użycia.
  11. Koktajl barwiący ECs: Dodaj 10 μl PE przeciwciała anty-mysiego endomucyny, 10 μl PerCP anty-mysiego Ly-6A/E (Sca-1), 10 μl PE/cyjaniny7 anty-mysiego CD31, 10 μl Alexa Fluor 647 anty-mysiego CD54/ICAM-1, 10 μl APC/Cyjanina7 anty-mysiego CD45 i 10 μl anty-mysich komórek TER-119 / erytroidalnych APC/Cyjanina7 do 940 μl PBS 2% FBS. Przygotuj świeże lub poprzedniego dnia. Przechowywać w temperaturze 4 °C, chronić przed światłem do czasu użycia.
  12. Roztwór barwiący DAPI: Dodać 1 kroplę odczynnika DAPI do 500 μl PBS. Przygotuj świeże przed użyciem.

2. Pobieranie próbek

  1. Poddać zwierzę eutanazji przez zwichnięcie szyjki macicy (szczegółowe informacje na temat zwierząt wykorzystanych do uzyskania danych przedstawionych w tym badaniu można znaleźć w tabeli uzupełniającej 1). Umieść zwierzę brzuchem do góry na szalce Petriego i spryskaj 70% etanolem. Wykonaj nacięcie nad brzuchem za pomocą nożyczek i odciągnij skórę aż do kostek.
  2. Chwyć jedną nogę i za pomocą nożyczek przetnij jej dolną część (tam, gdzie znajduje się staw między nogą a biodrem), aby oddzielić ją od zwierzęcia. Ten krok będzie również służył jako drugorzędna metoda potwierdzająca eutanazję. Zdejmij stopę z nogi, przecinając kostkę. Umieść nogę w lodowatym PBS 2% FBS. W razie potrzeby powtórz ten krok z drugą nogą.
  3. Chwyć kość biodrową i za pomocą nożyczek przetnij ją za nią, aby oddzielić ją od zwierzęcia. Umieść kość biodrową w lodowatym PBS 2% FBS. W razie potrzeby powtórz krok z drugą kością biodrową.
  4. Umieścić nogę (nogi) i kość biodrową (kości biodrowe) na szalce Petriego i za pomocą sterylnego skalpela oczyścić kości. Oddziel kość piszczelową i kość udową, przecinając kolano skalpelem. Umieść czyste kości w lodowatym PBS 2% FBS.

3. Przetwarzanie próbek do analizy populacji komórek krwiotwórczych w szpiku kostnym ogółem

  1. Umieść kość udową lub piszczelową w moździerzu z lodowatym PBS 2% FBS i zmiażdż kość, delikatnie dociskając ją do ścianki moździerza za pomocą tłuczka. Komórki BM są uwalniane do roztworu zawartego w zaprawie.
  2. Odpipetować powstałą zawiesinę komórek w górę iw dół za pomocą pipety o pojemności 10 ml w celu homogenizacji i przeniesienia do probówki o pojemności 50 ml przez sitko o pojemności 40 μm umieszczone na górze probówki.
  3. Jeśli zmiażdżone kości nie wyglądają na białe w tym momencie, dodaj więcej PBS 2% FBS do zaprawy i powtórz kruszenie, a następnie pipetuj w górę iw dół i przenieś roztwór do tej samej probówki o pojemności 50 ml przez to samo sitko do komórek 40 μm.
  4. Przepłukać zaprawę większą ilością PBS 2% FBS i przenieść roztwór do tej samej probówki o pojemności 50 ml przez to samo sitko o pojemności 40 μm. Odwirować probówkę o pojemności 50 ml o sile 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
  5. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórek w 5 ml buforu do lizy RBC (1x) w temperaturze pokojowej, kilkakrotnie pipetując w górę i w dół. Po 2-minutowej inkubacji w temperaturze pokojowej dodaj 15 ml PBS 2% FBS.
  6. Odwirować probówkę o pojemności 50 ml o sile 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Jeśli osad komórek nadal wygląda na czerwonawy, wróć do kroku 3.5. W przeciwnym razie należy wyrzucić supernatant, ponownie zawiesić osad w 200 μl PBS i przenieść zawiesinę komórek do studzienki z 96-dołkową płytką z dnem w kształcie litery V w celu barwienia.
  7. Odwirować płytkę o sile 500 x g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant przez odwrócenie płytki na bibułę chłonną i ponownie zawiesić osad w 200 μl roztworu barwiącego barwnik fluorescencyjny. Inkubować płytkę przez 15 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.
  8. Odwirować płytkę o masie 500 x g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C. Wyrzucić supernatant, obracając płytkę na bibułę chłonną i ponownie zawiesić osad w 200 μl PBS 2% FBS w celu przepłukania.
  9. Odwirować płytkę o sile 500 x g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C, odrzucić supernatant przez odwrócenie płytki na bibułę chłonną i ponownie zawiesić osad w 100 μl roztworu blokującego receptory Fc. Inkubować płytkę przez 10 minut w temperaturze 4 °C, chroniąc ją przed światłem.
  10. Dodać 100 μl PBS 2% FBS i kilkakrotnie pipetować w górę i w dół w celu umycia. Odwirować płytkę o sile 500 x g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C, wyrzucić supernatant przez odwrócenie płytki na bibułę chłonną i ponownie zawiesić osad w 100 μl pierwotnego koktajlu barwiącego HSC. Inkubować płytkę przez 15 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.
  11. Dodaj 100 μl PBS 2% FBS i kilkakrotnie pipetuj w górę i w dół, aby umyć. Odwirować płytkę o sile 500 x g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C, wyrzucić supernatant przez odwrócenie płytki na bibułę chłonną i ponownie zawiesić osad w 100 μl wtórnego roztworu barwiącego HSC. Inkubować płytkę przez 15 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.
  12. Dodaj 100 μl PBS 2% FBS i kilkakrotnie pipetuj w górę i w dół, aby umyć. Odwirować płytkę o masie 500 x g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C i odrzucić supernatant poprzez odwrócenie płytki na bibułę chłonną.
  13. Zawiesić osad w 250 μl PBS 2% FBS i przenieść zawiesinę komórek do 5 ml polistyrenowej probówki okrągłodennej przez sitko o pojemności 40 μm. Przechowywać na lodzie chronić przed światłem do czasu analizy metodą cytometrii przepływowej.
    UWAGA: Jeśli jesteś zainteresowany określeniem bezwzględnej liczby populacji komórek krwiotwórczych, dodaj kulki kalibritowe do rurek polistyrenowych przed analizą w cytometrze16.

4. Przetwarzanie próbek do analizy populacji komórek zrębu w szpiku kostnym ogółem

  1. Umieść kość udową lub piszczelową w moździerzu z lodowatym PBS 2% FBS i zmiażdż kość, delikatnie dociskając ją do ścianki moździerza za pomocą tłuczka. Odetnij końcówkę końcówki P1000 za pomocą nożyczek i użyj jej do przeniesienia całej zawartości zaprawy do probówki o pojemności 50 ml (nie przechodź przez sitko do komórek).
  2. Odwirować probówkę o pojemności 50 ml przy 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C, odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 3 ml roztworu kolagenazy IV i dyspazy II. Inkubować probówkę w temperaturze 37 °C przez 40 minut.
  3. Uzupełnij probówkę do 25 ml PBS 2% FBS i wiruj do wymieszania. Przenieść zawartość probówki o pojemności 50 ml do nowej probówki o pojemności 50 ml przez sitko o pojemności 100 μm. Dodać 15 ml PBS 2% FBS do starej probówki o pojemności 50 ml i przenieść roztwór do tej samej nowej probówki o pojemności 50 ml przez to samo sitko do komórek. Wirować przy 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
  4. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórek w 5 ml buforu do lizy RBC (1x) w temperaturze pokojowej, kilkakrotnie pipetując w górę i w dół. Po 2-minutowej inkubacji w temperaturze pokojowej dodaj 15 ml PBS 2% FBS.
  5. Odwirować probówkę o pojemności 50 ml o sile 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Jeśli osad komórkowy nadal wygląda na czerwonawy, wróć do kroku 4.4. Jeśli nie, wyrzucić supernatant, ponownie zawiesić osad w 200 μl PBS 2% FBS i przenieść zawiesinę komórek do dołka z 96-dołkową płytką z dnem w kształcie litery V w celu barwienia. Odwirować płytkę o sile 500 x g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C.
  6. Jeśli wykonujesz barwienie zrębu, przejdź do kroku 4.7. Jeśli wykonujesz barwienie EC, przejdź do kroku 4.12.
  7. Odrzucić supernatant przez odwrócenie płytki na bibułę chłonną i ponownie zawiesić osad w 100 μl zrębu pierwotnego koktajlu barwiącego. Inkubować płytkę przez 15 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.
  8. Dodaj 100 μl PBS 2% FBS i kilkakrotnie pipetuj w górę i w dół, aby umyć. Odwirować płytkę przy 500 x g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C, wyrzucić supernatant przez odwrócenie płytki na bibułę chłonną i ponownie zawiesić osad w 100 μl wtórnego roztworu barwiącego zręb. Inkubować płytkę przez 15 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.
  9. Dodaj 100 μl PBS 2% FBS i kilkakrotnie pipetuj w górę i w dół, aby umyć. Odwirować płytkę o sile 500 x g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C. Odrzucić sklarowany osad, obracając płytkę na bibułę chłonną.
  10. Zawiesić osad w 250 μl PBS 2% FBS i przenieść zawiesinę komórek do 5 ml polistyrenowej probówki okrągłodennej przez sitko o pojemności 40 μm. Przechowywać na lodzie chronić przed światłem.
  11. Tuż przed przejściem do cytometru dodać 35 μl roztworu barwiącego DAPI do probówki zawierającej zawiesinę komórek do analizy metodą cytometrii przepływowej i inkubować probówkę w temperaturze RT przez 5 minut w ciemności. Po tej inkubacji przechowywać na lodzie, chronić przed światłem do czasu analizy cytometrii przepływowej.
  12. Wyrzucić supernatant przez odwrócenie płytki na papier chłonny i ponownie zawiesić granulki w 100 μl koktajlu barwiącego EC. Inkubować płytkę przez 15 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.
  13. Dodaj 100 μl PBS 2% FBS i kilkakrotnie pipetuj w górę i w dół, aby umyć. Odwirować płytkę o sile 500 x g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C.
  14. Odrzucić supernatant, obracając płytkę na bibułę chłonną. Zawiesić osad w 250 μl PBS 2% FBS i przenieść zawiesinę komórek do 5 ml polistyrenowej probówki okrągłodennej przez sitko o pojemności 40 μm. Przechowywać na lodzie chronić przed światłem.
  15. Tuż przed przejściem do cytometru dodać 35 μl roztworu barwiącego DAPI do probówki zawierającej zawiesinę komórek do analizy metodą cytometrii przepływowej i inkubować probówkę w temperaturze RT przez 5 minut w ciemności. Po tej inkubacji przechowywać na lodzie, chronić przed światłem do czasu analizy cytometrii przepływowej.
    UWAGA: Jeśli jesteś zainteresowany określeniem bezwzględnej liczby populacji komórek zrębu i śródbłonka, dodaj kulki kalibritowe do rurek polistyrenowych przed analizą w cytometrze16.

5. Przetwarzanie próbek do analizy populacji komórek krwiotwórczych w rozdrobnionym i przepłukanym BM

  1. Umieść kość udową na szalce Petriego i odetnij końce kości za pomocą sterylnego skalpela.
  2. Przepłukać środkową część kości (trzon), przepuszczając 100 μl PBS 2% FBS przez wnętrze kości raz z każdej strony za pomocą strzykawki insulinowej o pojemności 0,5 ml bez martwej objętości i zbierając roztwór do probówki mikrowirówkowej zawierającej 1 ml PBS 2% FBS. Następnie przenieś zawiesinę komórek do probówki o pojemności 50 ml oznaczonej jako przepłukany BM, zawierającej 4 ml PBS 2% FBS. Trzymaj na lodzie.
  3. Końce kości umieścić w moździerzu z lodowatym PBS 2% FBS i rozdrobnić, delikatnie dociskając ją do ścianki moździerza za pomocą tłuczka. Odpipetować powstałą zawiesinę komórek w górę iw dół za pomocą pipety o pojemności 10 ml w celu homogenizacji i przenieść do probówki o pojemności 50 ml oznaczonej jako rozdrobniony BM przez sitko o pojemności 40 μm.
  4. Jeśli zmiażdżona kość nie wygląda w tym momencie na białą, dodaj więcej PBS 2% FBS do zaprawy i powtórz kruszenie. Następnie pipetować w górę i w dół i przenieść roztwór do tej samej probówki o pojemności 50 ml (rozdrobnionego BM) przez to samo sitko o średnicy 40 μm.
  5. Przepłukać moździerz większą ilością PBS 2% FBS i przenieść roztwór do tej samej probówki o pojemności 50 ml (rozdrobnionego BM) przez to samo sitko o wielkości komórek 40 μm.
  6. Odwirować probówki o pojemności 50 ml odpowiadające przepłukanym i rozdrobnionym próbkom o sile 500 x g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C.
  7. Wykonaj kroki od 3.5 do 3.13 (sekcja 3) z przepłukanymi i rozdrobnionymi próbkami BM.

6. Przygotowanie jednokolorowych kontroli (SCC) do analizy cytometrii przepływowej

  1. Postępować zgodnie z krokami 3.1-3.6 (sekcja 3) z dodatkową kością od jednego ze zwierząt niewykorzystanych do głównej analizy, przenosząc końcową zawiesinę komórek do probówki mikrowirówkowej zawierającej 1 ml PBS 2% FBS zamiast dołka z 96-dołkową płytką z dnem w kształcie litery V.
  2. Przenieś 100 μl zawiesiny komórek do 8 dołków 96-dołkowej płytki z dnem w kształcie litery V, 100 μl do 5 ml polistyrenowej probówki okrągłodennej zawierającej 100 μl PBS 2% FBS oznaczonej jako DAPI SCC, a pozostałą zawiesinę komórek do 5 ml polistyrenowej probówki okrągłodennej zawierającej 100 μl PBS 2% FBS oznaczonej jako niebarwiona. Trzymaj probówki na lodzie, chroniąc je przed światłem.
  3. Odwirować płytkę o sile 500 x g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C i wyrzucić supernatanty, obracając płytkę na bibułę chłonną.
  4. Zawiesić jedną pastylkę w 100 μl roztworu do barwienia barwnikiem fluorescencyjnym, a pozostałe w 100 μl PBS 2% FBS.
  5. Dodać 0,5 μl następujących przeciwciał, oprócz koktajlu linii przeciwciał, dla których dodaje się 2 μl i przeciwciała PECy7 CD31, dla których dodaje się 0,3 μl, do każdej z basenek z zawiesiną komórkową w PBS 2% FBS (jedno przeciwciało na basenik, te same przeciwciała użyte w głównych panelach analitycznych lub te same przeciwciała fluoroforowe o podobnej intensywności fluorescencji i obfitości epitopów): koktajl linii biotyny, immunofluorescencyjnie oznaczony 510 anty-mysi CD150 (SLAM), PE anty-mysi Flk2 (CD135), PerCP anty-mysi Ly-6A / E (Sca-1), immunofluorescencyjnie oznaczony 647 anty-mysz CD54 / ICAM-1, PE / Cyjanina7 anty-mysz CD48 i APC/Cyjanina7 anty-mysz CD117 (c-kit). Inkubować płytkę przez 15 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.
  6. Dodaj 100 μl PBS 2% FBS do każdego dołka i kilkakrotnie pipetuj w górę i w dół, aby umyć. Odwirować płytkę o sile 500 x g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C i wyrzucić supernatanty, obracając płytkę na bibułę chłonną.
  7. Zawiesić wszystkie osady z wyjątkiem tego, który odpowiada komórkom inkubowanym z koktajlem przeciwciał w 180 μl PBS 2% FBS i przenieść zawiesiny komórek do 5 ml polistyrenowych probówek okrągłodennych przez sitka do komórek 40 μm. Przechowywać na lodzie chronić przed światłem do czasu analizy cytometrii przepływowej.
  8. Ponownie zawiesić komórki inkubowane z koktajlem przeciwciał w 100 μl HSC/wtórnego roztworu barwiącego zręb. Inkubować płytkę przez 15 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.
  9. Dodaj 100 μl PBS 2% FBS i kilkakrotnie pipetuj w górę i w dół, aby umyć. Odwirować płytkę o sile 500 x g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C.
  10. Zawiesić osad w 180 μl PBS 2% FBS i przenieść zawiesinę komórek do 5 ml polistyrenowej probówki okrągłodennej przez sitko o pojemności 40 μm. Przechowywać na lodzie chronić przed światłem do czasu analizy cytometrii przepływowej.
  11. Tuż przed udaniem się do cytometru dodaj 35 μl roztworu barwiącego DAPI do probówki DAPI SCC i inkubuj probówkę w temperaturze RT przez 5 minut w ciemności. Po tej inkubacji przechowywać na lodzie, chronić przed światłem do czasu analizy cytometrii przepływowej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Reprezentatywne wykresy analizy metodą cytometrii przepływowej HSC i MPP u zdrowej, młodej dorosłej myszy C57Bl/6 są pokazane w Rysunek 1. Strategia bramkowania jest zgodna z najnowszą nomenklaturą harmonizacyjną zaproponowaną przez ISEH13. Analizując wpływ perturbacji, takiej jak infekcja lub rak, ważne jest, aby używać myszy kontrolnej jako odniesienia dla normalnych bramek. Kontrole fluorescencji minus jeden (FMO) mogą być szczególnie przydatne do wyznaczania granic bramek, ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chociaż opisany protokół jest prosty i łatwy do wykonania, należy zwrócić szczególną uwagę na konkretne kroki. Na przykład, podczas uzyskiwania przepłukanego BM (krok 5.2), nie należy przekraczać objętości lub liczby wskazanych przypadków, w których PBS 2% FBS przechodzi przez wnętrze środkowej części kości, ponieważ może to spowodować znaczne zanieczyszczenie wypłukanej próbki populacjami komórek śródkostnych.

Zmiany w protokole mogą być wprowadzane w celu ułatwienia jego wykonania przez bada...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

LM było wspierane przez grant z Lady Tata Memorial Trust. JR był wspierany przez stypendium doktoranckie z Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT; Stypendium FCT UI/BD/150833/2021). ML było wspierane przez stypendium doktoranckie FCT (FCT fellowship 2021.04773.BD). DD było wspierane przez granty Amerykańskiego Towarzystwa Hematologicznego, Fundacji Pablove, FCT (EXPL/MED-ONC/0522/2021) oraz Portugalskiego Towarzystwa Hematologicznego. Dziękujemy za wsparcie ze strony dr Catariny Meireles i Emilii Cardoso z placówki TRACY w i3s.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Alexa Fluor 647 mysie przeciwciało CD54/ICAM-1BioLegend116114
APC StreptawidynaBioLegend405207
Przeciwciało przeciw myszym CD117 (c-kit) APC/Cyjanina7BioLegend105826
Przeciwciało przeciw myszemu CD45 APC/Cyjanina7Przeciwciało
APC/cyjanina7BioLegend116223
Biotyna anty-mysie przeciwciało CD3 i epsilonuBioLegend100304
Biotyna anty-mysie przeciwciało CD4BioLegend100404
Biotyna przeciwciało anty-mysie CD8aBioLegend100704
Biotyna anty-mysie Ly-6G/Ly-6C (Gr-1)BioLegend108404
Biotyna przeciwciało przeciw mysim TER-119/komórkom erytroidalnymBioLegend116204
Biotyna przeciwciało anty-mysie/ludzkie CD11bBioLegend101204
Biotyna anty-mysie/ludzkie przeciwciało CD45R/B220BioLegend103204
Brilliant Violet 510 anty-mysie CD150 (SLAM)BioLegend115929
Kalibrit 2 kolorowe koralikiBD Biosciences
Kolagenaza IVMerck Life ScienceC1889
Dyspaza IIMerck Life ScienceD4693
Płodowa surowica bydlęca, kwalifikowana, inaktywowana termicznie, zatwierdzona przez UE, pochodzenie z Ameryki PołudniowejThermoFisher Scientific10500064
Zbilansowany roztwór soli Hanksa (HBSS)ThermoFisher Scientific14175095
Mysie przeciwciało biotynylowane Leptyna RR& Systemy DBAF497
NucBlue Odczynnik do stałych komórek (DAPI)ThermoFisher ScientificR37606Odczynnik DAPI
PE przeciwciało przeciw mysiej endomucynieThermoFisher Scientific12-5851-82
PE anty-mysie Flk2 (CD135)ThermoFisher Scientific12-1351-82
PE/Cyjanina7 przeciwciało anty-mysie CD31BioLegend102524
Przeciwciało przeciw mysim CD48 PE/Cyjaniny7BioLegend103424
Przeciwciało anty-mysie Ly-6A/E (Sca-1)PerCP BioLegend108122
Tabletki soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS)Merck Life ScienceP4417
Oczyszczone przeciwciało anty-mysie CD16/32BioLegend101302
Bufor do lizy RBC 10xBioLegend420302
Zombie Violet Fixable Viability DyeBioLegend423114barwnik fluorescencyjny
przeciw mysim komórkom TER-119 103116 349502

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Comazzetto, S., Shen, B., Morrison, S. J. Niches that regulate stem cells and hematopoiesis in adult bone marrow. Developmental Cell. 56 (13), 1848-1860 (2021).
  2. Purton, L. E., Scadden, D. T. Limiting factors in murine hematopoietic stem cell assays. Cell Stem Cell. 1 (3), 263-270 (2007).
  3. Kiel, M. J., et al. SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells. Cell. 121 (7), 1109-1121 (2005).
  4. Asada, N., et al. Differential cytokine contributions of perivascular haematopoietic stem cell niches. Nature Cell Biology. 19 (3), 214-223 (2017).
  5. Mosteo, L., et al. The dynamic interface between the bone marrow vascular niche and hematopoietic stem cells in myeloid malignancy. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 635189(2021).
  6. Christodoulou, C., et al. Live-animal imaging of native haematopoietic stem and progenitor cells. Nature. 578 (7794), 278-283 (2020).
  7. Itkin, T., et al. Distinct bone marrow blood vessels differentially regulate haematopoiesis. Nature. 532 (7599), 323-328 (2016).
  8. Kusumbe, A. P., et al. Age-dependent modulation of vascular niches for haematopoietic stem cells. Nature. 532 (7599), 380-384 (2016).
  9. Duarte, D., et al. Inhibition of endosteal vascular niche remodeling rescues hematopoietic stem cell loss in AML. Cell Stem Cell. 22 (1), 64-77 (2018).
  10. Busch, K., et al. Fundamental properties of unperturbed haematopoiesis from stem cells in vivo. Nature. 518 (7540), 542-546 (2015).
  11. Laurenti, E., Gottgens, B. From haematopoietic stem cells to complex differentiation landscapes. Nature. 553 (7689), 418-426 (2018).
  12. Pietras, E. M., et al. Functionally distinct subsets of lineage-biased multipotent progenitors control blood production in normal and regenerative conditions. Cell Stem Cell. 17 (1), 35-46 (2015).
  13. Challen, G. A., Pietras, E. M., Wallscheid, N. C., Signer, R. A. J. Simplified murine multipotent progenitor isolation scheme: Establishing a consensus approach for multipotent progenitor identification. Experimental Hematology. 104, 55-63 (2021).
  14. Mayle, A., Luo, M., Jeong, M., Goodell, M. A. Flow cytometry analysis of murine hematopoietic stem cells. Cytometry A. 83 (1), 27-37 (2013).
  15. Kusumbe, A. P., Ramasamy, S. K., Adams, R. H. Coupling of angiogenesis and osteogenesis by a specific vessel subtype in bone. Nature. 507 (7492), 323-328 (2014).
  16. Hawkins, E. D., et al. Measuring lymphocyte proliferation, survival and differentiation using CFSE time-series data. Nature Protocols. 2 (9), 2057-2067 (2007).
  17. Akinduro, O., et al. Proliferation dynamics of acute myeloid leukaemia and haematopoietic progenitors competing for bone marrow space. Nature Communications. 9 (1), 519(2018).
  18. Beerman, I., et al. Functionally distinct hematopoietic stem cells modulate hematopoietic lineage potential during aging by a mechanism of clonal expansion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (12), 5465-5470 (2010).
  19. Gomariz, A., et al. Quantitative spatial analysis of haematopoiesis-regulating stromal cells in the bone marrow microenvironment by 3D microscopy. Nature Communications. 9 (1), 2532(2018).
  20. Xu, C., et al. Stem cell factor is selectively secreted by arterial endothelial cells in bone marrow. Nature Communications. 9 (1), 2449(2018).
  21. Amend, S. R., Valkenburg, K. C., Pienta, K. J. Murine hind limb long bone dissection and bone marrow isolation. Journal of Visualized Experiments. (110), e53936(2016).
  22. Wang, Y., et al. Ephrin-B2 controls VEGF-induced angiogenesis and lymphangiogenesis. Nature. 465 (7297), 483-486 (2010).
  23. DeFalco, J., et al. Virus-assisted mapping of neural inputs to a feeding center in the hypothalamus. Science. 291 (5513), 2608-2613 (2001).
  24. Boyer, S. W., Schroeder, A. V., Smith-Berdan, S., Forsberg, E. C. All hematopoietic cells develop from hematopoietic stem cells through Flk2/Flt3-positive progenitor cells. Cell Stem Cell. 9 (1), 64-73 (2011).
  25. Siegemund, S., Shepherd, J., Xiao, C., Sauer, K. hCD2-iCre and Vav-iCre mediated gene recombination patterns in murine hematopoietic cells. PLoS One. 10 (4), 0124661(2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Bone Marrow CellsHematopoietic Stem CellsEndosteal Bone MarrowCentral Bone MarrowMesenchymal Stem CellsEndothelial CellsPhenotypic Analysis

Powiązane artykuły