Zastosowanie obrazowania in vivo do badań przesiewowych fenotypów morfogenezy u zmutowanych szczepów Candida albicans podczas aktywnej infekcji u ssaka gospodarza

Podsumowanie

Ten manuskrypt opisuje metodę badania przesiewowego bibliotek mutantów Candida albicans średniej wielkości pod kątem fenotypów morfogenezy podczas aktywnej infekcji u ssaków za pomocą nieinwazyjnej mikroskopii konfokalnej.

Streszczenie

Candida albicans jest ważnym ludzkim patogenem. Jego zdolność do przełączania się między formami morfologicznymi ma kluczowe znaczenie dla jego patogenezy; Te zmiany morfologiczne są regulowane przez złożoną sieć sygnalizacyjną kontrolowaną w odpowiedzi na bodźce środowiskowe. Te składniki regulacyjne zostały dokładnie przebadane, ale prawie wszystkie badania wykorzystują różne bodźce in vitro do wywołania filamentacji. Aby określić, w jaki sposób morfogeneza jest regulowana podczas procesu patogenezy, opracowaliśmy system mikroskopii in vivo, aby uzyskać obrazy o wysokiej rozdzielczości przestrzennej organizmów przechodzących tworzenie strzępek w organizmie ssaka. Przedstawiony tutaj protokół opisuje zastosowanie tego systemu do badań przesiewowych małych zbiorów zmutowanych szczepów C. albicans, co pozwala nam zidentyfikować kluczowe regulatory morfogenezy zachodzącej w miejscu infekcji. Przedstawiono reprezentatywne wyniki, które pokazują, że niektóre regulatory morfogenezy, takie jak regulator transkrypcji Efg1, mają spójne fenotypy in vitro i in vivo, podczas gdy inne regulatory, takie jak cyklaza adenylowa (Cyr1), mają znacząco różne fenotypy in vivo w porównaniu z in vitro.

Wprowadzenie

Candida albicans jest powszechnym ludzkim patogenem grzybiczym, powodującym choroby śluzówkowo-skórne, choroby rozsiane i miejscowe infekcje tkanek¹. Kluczową cechą fizjologii C. albicans jest jej złożony polimorficzny wzrost, co jest związana z jej rolą zarówno jako komensala, jak i patogenu^2,3,4. W warunkach bogatych w składniki odżywcze in vitro w temperaturze 30 °C zwykle rośnie jako jajowate, pączkujące drożdże. Różnorodne czynniki środowiskowe, w tym niedobór składników odżywczych, zmiany pH, wzrost w temperaturze 37 °C, ekspozycja na surowicę i wzrost po zatopieniu w agarze powodują przejście do spolaryzowanego wzorca wzrostu, co skutkuje powstawaniem prawdziwych strzępek i/lub pseudostrzępek⁵. Inicjacja spolaryzowanego wzrostu i wynikający z niego wzrost organizmów nitkowatych jest określana jako morfogeneza.

Ze względu na znaczenie morfogenezy w zjadliwości organizmu, regulacja tworzenia strzępek była szeroko badana^6,7. Istnieje złożona sieć szlaków sygnałowych i regulacji transkrypcji, która wyzwala morfogenezę. Pomimo związku morfogenezy C. albicans z patogenezą, większość badań dotyczących morfogenezy wykorzystywała bodźce in vitro do wywoływania tworzenia strzępek. Staje się coraz bardziej oczywiste, że różne modele filamentacji in vitro nie są identyczne pod względem stymulowanych indywidualnych szlaków regulacyjnych. Co więcej, żadne warunki wzrostu in vitro nie odpowiadają ściśle złożonemu środowisku gospodarza. Biorąc pod uwagę znaczenie C. albicans jako ludzkiego patogenu, celem tego protokołu jest zbadanie jego morfogenezy podczas aktywnej infekcji u ssaka gospodarza przy użyciu systemu o umiarkowanej przepustowości, co pozwoli badaczowi na badanie przesiewowe bibliotek mutantów C. albicans.

Aby ułatwić te badania, opracowano system obrazowania in vivo, który pozwala nam uzyskać obrazy o wysokiej rozdzielczości przestrzennej komórek C. albicans podczas infekcji małżowiny usznej znieczulonej myszy za pomocą odwróconego mikroskopu konfokalnego^8,9,10. Ponieważ skóra małżowiny usznej jest dość cienka, obrazy te można uzyskać bez konieczności preparowania tkanek. W ten sposób ilościowe dane fenotypowe można zmierzyć w miejscu aktywnych infekcji w tkance gospodarza. Opisany tutaj protokół obejmuje transformację szczepu referencyjnego i jednego lub więcej zmutowanych szczepów z różnymi kasetami ekspresji białek fluorescencyjnych^11,12. Szczepy wykazujące ekspresję białek fluorescencyjnych są następnie mieszane i wstrzykiwane śródskórnie. Po ustaleniu infekcji stosuje się obrazowanie konfokalne w celu ilościowego określenia zarówno częstotliwości filamentacji, jak i długości utworzonych włókien. Dane uzyskane ze zmutowanych szczepów są znormalizowane do danych uzyskanych ze szczepu referencyjnego, który jest obecny w tym samym regionie tkanki, zapewniając w ten sposób kontrolę wewnętrzną. Ten system pozwolił nam z powodzeniem przebadać kilka serii zmutowanych szczepów C. albicans, z których wiele ma defekty morfogenezy in vitro^9,10. Wiele z tych szczepów łatwo rozwija się in vivo, co podkreśla znaczenie modeli in vivo dla badań nad morfogenezą.

Protokół

Badania w tym protokole zostały zatwierdzone przez University of Iowa Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). Zapoznaj się z wytycznymi CDC dotyczącymi sprzętu i procedur do pracy z organizmami BSL2¹³.

1. Przygotowanie szczepów Candida albicans

1. Określić odpowiedni szczep referencyjny do wykorzystania jako kontrola dodatnia. Upewnij się, że ten szczep ściśle pasuje do szczepów eksperymentalnych pod względem linii i manipulacji genetycznych.
   UWAGA: W prezentowanych tutaj reprezentatywnych eksperymentach mutanty zostały stworzone ze szczepów opisanych w Homann, et al.¹⁴, które zostały skonstruowane z SN152. Te mutanty to Arg^-. W związku z tym wybranym szczepem referencyjnym był SN250, który również został utworzony z SN152 i jest również Arg^-. Stresory żywieniowe mają kluczowe znaczenie w regulacji spolaryzowanego wzrostu drożdży Saccharomyces cerevisiae¹⁵; są one również zaangażowane w filamentację u C. albicans i innych grzybów^16,17,18. W związku z tym, gdy tylko jest to możliwe, szczep referencyjny powinien być dopasowany pod kątem auksotrofii do szczepów doświadczalnych, aby uniknąć potencjalnych zakłóceń spowodowanych stresem żywieniowym.
2. Wybierz fluorescencyjne konstrukty ekspresji białek. Podczas badań przesiewowych różnych szczepów eksperymentalnych należy utworzyć szczep referencyjny, który wyraża jedno białko fluorescencyjne i użyć innych białek fluorescencyjnych do oznaczenia zmutowanych szczepów.
   UWAGA: Przedstawione tutaj reprezentatywne dane wykorzystują NEON dla szczepu referencyjnego i iRFP dla zmutowanych szczepów. Każde białko fluorescencyjne może być użyte, jeśli jest wysoce eksprymowane, stosunkowo jasne i może być wzbudzone/wykryte przez używany mikroskop. Eksperymenty kontrolne porównujące szczepy referencyjne wykazujące ekspresję różnych białek fluorescencyjnych nie wykazały żadnego wpływu ekspresji białek fluorescencyjnych na morfogenezę.
3. Przekształć szczepy za pomocą fluorescencyjnych konstruktów ekspresji białek.
   UWAGA: Wiele instytucji wymaga stosowania środków ostrożności na poziomie bezpieczeństwa biologicznego 2 do pracy z C. albicans. Wszystkie prace powinny być zgodne z lokalnymi przepisami bezpieczeństwa. Niezależnie od lokalnych przepisów, badacze pracujący z C. albicans muszą zostać przeszkoleni w zakresie bezpiecznego obchodzenia się z organizmem.
   1. Przekształć szczepy referencyjne i eksperymentalne przy użyciu standardowych protokołów octanu litu¹⁹.
      UWAGA: Opisane tutaj eksperymenty wykorzystują plazmidy pENO1-NEON-NAT^R i pENO1-iRFP-NAT^R, hojnie dostarczone przez Dr. Roberta Wheelera^11,12. Plazmidy zostały zlinearyzowane za pomocą NotI⁹.
   2. Wybrać transformatory na podstawie wzrostu na nourseotrycynie lub innym odpowiednim pożywce selekcyjnej.
   3. Zidentyfikuj udane transformanty. Za pomocą wykałaczki wybierz niewielką ilość komórek z każdej kolonii, a następnie wymieszaj je z kroplą wody o objętości 2,5 μl na szkiełku mikroskopowym. Nałóż szkiełko nakrywkowe i zbadaj w powiększeniu 10x-40x. Zbadaj za pomocą systemu obrazowania konfokalnego (używanego do końca protokołu) lub dowolnego standardowego mikroskopu fluorescencyjnego o szerokim polu. Odpowiednie transformatory będą miały jasny sygnał o odpowiednich długościach fal wzbudzenia i emisji.
      UWAGA: Aby uzyskać reprezentatywne wyniki, szczepy eksprymujące NEON zostały zwizualizowane za pomocą pionowego mikroskopu fluorescencyjnego z zestawem filtrów długoprzepustowych z filtrem wzbudzenia pasmowo-przepustowym 472/30 nm, filtrem emisyjnym pasmowo-przepustowym 520/35 nm i jednokrawędziowym rozdzielaczem wiązki dichroicznej 495 nm. Ponieważ iRFP nie jest widoczny gołym okiem, szczepy wyrażające iRFP zostały zobrazowane za pomocą systemu mikroskopii konfokalnej używanego do obrazowania in vivo, przy użyciu lasera 638 nm do wzbudzenia i wykrywania światła emisyjnego w zakresie 655-755 nm.
      1. Alternatywnie, oceń makroskopową fluorescencję kolonii za pomocą stereoskopii fluorescencyjnej, ręcznych systemów wzbudzania fluorescencji lub systemów wykrywania fluorescencji zwykle stosowanych w żelach i plamach zachodnich.
      2. Twórz zapasy zamrażarek z wybranymi transformantami.
4. Zaszczepić stałe podłoże YPD (dekstroza peptonowa z ekstraktu drożdżowego) wzorcowymi i eksperymentalnymi szczepami eksprymującymi białko fluorescencyjne z wywaru zamrażalniczego na 3 dni przed wstrzyknięciem, używając wykałaczki do przeniesienia odrobiny organizmów z wywaru zamrażarki do pożywki stałej YPD. Inkubować w temperaturze 30 °C przez 2 dni.
5. Dla każdego szczepu należy zaszczepić kolbę zawierającą 25 ml YPD komórkami C. albicans pobranymi z kilku kolonii na 1 dzień przed wstrzyknięciem. Zrób to, używając wykałaczki, aby przenieść odrobinę organizmów z jednej kolonii do YPD; Powtórz kilka razy, aby uzyskać komórki z kilku różnych kolonii. Inkubować przez noc w temperaturze 30 °C w inkubatorze z wytrząsarką orbitalną z prędkością 175 obr./min.
   UWAGA: Ważne jest, aby używać wielu kolonii jako źródła inokulum, ponieważ C. albicans ma wysoką częstotliwość spontanicznych zmian genetycznych. Użycie wielu kolonii podczas rozpoczynania hodowli inokulum minimalizuje ryzyko, że wszystkie organizmy w inokulum pochodzą od rodzica ze znacznymi spontanicznymi zmianami.
6. W dniu wstrzyknięcia:
   1. Odwirować 1 ml kultury przez 2 minuty przy 500 x g.
   2. Przemyć kulturę trzykrotnie 1 ml sterylnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (dPBS) firmy Dulbecco. Po ostatnim przemyciu ponownie zawiesić osad w 1 ml jałowego dPBS.
   3. Rozcieńczyć próbkę przemytej kultury w stosunku 1:100 i policzyć za pomocą hemocytometru.
   4. Dostosuj gęstość przemytej kultury do 1 x 10⁸ organizmów na ml za pomocą dPBS.
   5. Dla każdego zestawu szczepów, które mają być wstrzyknięte, należy utworzyć inokulum, mieszając równe objętości szczepu referencyjnego i szczepu doświadczalnego(-ych). Pozwala to utrzymać gęstość inokulum na poziomie 1 x 10⁸ organizmów na ml.
      UWAGA: Liczba szczepów, które można ocenić na ucho, jest ograniczona zdolnością systemu mikroskopowego używanego do wyraźnego rozróżniania sygnału z każdego białka fluorescencyjnego.
   6. Po przygotowaniu inokulum należy przejść bezpośrednio do wstrzyknięć dla zwierząt. Nie przechowywać inokulum przed użyciem.

2. Przygotowanie zwierząt

1. Uzyskaj zgodę lokalnego Komitetu ds. Opieki nad Zwierzętami i Wykorzystania Zwierząt lub odpowiedniego lokalnego organu zarządzającego.
2. Zdobądź 6-12-tygodniowe myszy od dostawcy lub programu hodowlanego. Myszy domowe w obiekcie, w którym będą mieszkać przez cały czas trwania eksperymentu, przez co najmniej 1 tydzień przed szczepieniem.
   UWAGA: Aby uzyskać reprezentatywne wyniki, użyto 6-tygodniowych samic myszy DBA2/N.
3. Karm zwierzęta karmą wolną od chlorofilu przez co najmniej 7 dni przed szczepieniem.

3. Depilacja i inokulacja

1. Wywołaj chirurgiczną płaszczyznę znieczulenia (Rysunek 1).
   UWAGA: Wziewne środki znieczulające są materiałami niebezpiecznymi i mogą powodować podrażnienie oczu lub skóry, a także toksyczność układu nerwowego. Należy przestrzegać wszystkich polityk i procedur instytucjonalnych oraz ogólnych praktyk bezpieczeństwa laboratoryjnego dotyczących stosowania wziewnych środków znieczulających. Tylko osoby przeszkolone w stosowaniu wziewnych środków znieczulających mogą wykonywać te czynności. Standardowe praktyki obejmują noszenie rękawiczek, fartucha laboratoryjnego, ochronę oczu, korzystanie z systemu znieczulenia i staranne prowadzenie dokumentacji zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi.
   1. Umieść mysz we wstępnie podgrzanej komorze indukcyjnej znieczulenia. Trzymaj zwierzę w ciepłym środowisku przez cały czas znieczulenia ogólnego. Osiągnij to za pomocą przeznaczonych do tego celu poduszek rozgrzewających i podgrzewanego stolika mikroskopowego. Nie używaj poduszki grzewczej dostępnej bez recepty, ponieważ może się przegrzać i spowodować oparzenia.
   2. Dostarcz 2%-3% izofluranu do komory indukcyjnej, aż mysz straci odruch prostowania, a oddechy będą powolne i stabilne. Oczyść komorę indukcyjną ze znieczulenia i przenieś zwierzę do stożka nosowego bez aparatu oddechowego, dostarczającego 1%-2% izofluranu.
   3. Zweryfikuj płaszczyznę znieczulenia za pomocą odruchu szczypania palców u nóg lub innych mechanizmów weryfikacyjnych. Przez cały czas trwania eksperymentu monitoruj wzorzec oddechowy zwierzęcia i płaszczyznę znieczulenia oraz dostosuj stężenie środka znieczulającego w razie potrzeby.
   4. Zastosuj lubrykant do oczu, aby zapobiec wysuszeniu rogówki.
2. Depilacja (Rysunek 1C,D)
   1. Nałóż dostępny bez recepty krem do depilacji na wewnętrzną i zewnętrzną powierzchnię obu uszu za pomocą wacika z bawełnianą końcówką.
   2. Po 2-3 minutach (lub zgodnie ze wskazówkami producenta) delikatnie przetrzyj ucho suchym gazikiem, aby usunąć cały krem i włosy. Przetrzyj jeszcze dwa razy gazikami nasączonymi sterylną wodą, aby całkowicie usunąć pozostałości kremu do depilacji. Nieusunięcie całego kremu do depilacji spowoduje podrażnienie/stan zapalny skóry.
3. Wtrysk (Rysunek 1E, F)
   1. Przetrzyj powierzchnię ucha, do którego należy wstrzyknąć, gazikiem nasączonym 70% etanolem i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu.
   2. Dobrze wymieszaj inokulum, odwracając je wiele razy lub wirując.
   3. Pobrać 20-30 μl inokulum do strzykawki insulinowej. Trzymając igłę skierowaną do góry, delikatnie postukać w strzykawkę, aby upewnić się, że powietrze w cylindrze znajduje się na górze. Ostrożnie wyrzucić powietrze i nadmiar inokulum z powrotem do probówki z inokulum lub probówki z odpadem, tak aby tłok znalazł się na znaku 10 μl.
   4. Nosząc naparstek na palcu lub kciuku ręki niedominującej, ustabilizuj ucho, owijając je w poprzek naparstka. Alternatywnie, nałóż dostępną bez recepty dwustronną taśmę do skóry (modną taśmę) na małą stożkową lub okrągłodenną plastikową rurkę i ułóż ucho w poprzek taśmy. Uważaj, aby podczas tej czynności nie przesunąć stożka nosowego znieczulenia. Pomocne może być przyklejenie stożka do powierzchni roboczej.
      UWAGA: Wewnętrzna lub zewnętrzna strona ucha może być wstrzykiwana w zależności od fizycznego komfortu badacza. W przypadku mikroskopii należy umieścić mysz tak, aby strona ucha, w którą wstrzyknięto implant, była skierowana w stronę soczewki obiektywu.
   5. Trzymając igłę strzykawki prawie całkowicie równolegle do skóry i unikając dużych żył, włóż końcówkę igły w najbardziej zewnętrzną warstwę skóry, aż skos zostanie zakryty.
   6. Powoli wstrzykiwać inokulum śródskórnie. Dobre wstrzyknięcie śródskórne spowoduje powstanie małego pęcherzyka w skórze. Trzymaj igłę na miejscu przez 15-20 s przed wyjęciem jej z ucha, aby zminimalizować wyciek.
      1. Jeśli dolna część ucha zwierzęcia stanie się wilgotna, oznacza to, że igła była zbyt głęboka i całkowicie przeszła przez ucho. W takim przypadku należy powtórzyć wstrzyknięcie w inne miejsce ucha.
   7. Powtórz proces, używając drugiego ucha zwierzęcia. Można to zrobić z tymi samymi szczepami C. albicans dla repliki lub z innym zestawem szczepów C. albicans.
   8. Jeśli obrazowanie nie zostanie wykonane natychmiast, umieść zwierzę w ogrzewanej komorze rekonwalescencyjnej. Obserwuj zwierzę, dopóki nie dojdzie do siebie po znieczuleniu, a następnie umieść je z powrotem w klatce.
   9. Postępując zgodnie z protokołami instytucjonalnymi, wyraźnie oznacz klatkę etykietami zagrożenia biologicznego i wskaż, że zwierzęta w klatce są zarażone Candida albicans.
   10. Wypełnij wszystkie wymagane dokumenty związane ze znieczuleniem zwierząt i wszelkimi innymi wymaganymi praktykami instytucjonalnymi.
   11. Trzymaj zwierzę w warunkach obiektowych z zachowaniem środków ostrożności na poziomie bezpieczeństwa biologicznego zwierząt 2
   .

4. Ilościowe określenie morfogenezy in vitro dla porównania z wynikami in vivo

1. Używając tych samych umytych kultur, które zostały użyte do przygotowania inokulum, należy utworzyć rozcieńczenie organizmów w RPMI1640 + 10% inaktywowanej termicznie płodowej surowicy bydlęcej i inkubować w temperaturze 37 °C z bębnowaniem przez 4 godziny. Alternatywnie można użyć innych pożywek, które stymulują morfogenezę in vitro.
2. Odwirować próbkę przez 5 minut przy 500 x g i ponownie zawiesić w 0,5 ml dPBS.
3. Rozcieńczyć próbkę w stosunku 1:10, umieścić 2,5 μl rozcieńczonej próbki na szkiełku mikroskopowym i przykryć szkiełkiem nakrywkowym.
4. Zbadaj próbkę za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego. Policz co najmniej 100 komórek, zapisując liczbę drożdży i komórek nitkowatych dla każdego szczepu. W przedstawionych tutaj reprezentatywnych wynikach komórka nitkowata jest definiowana jako dowolna komórka o długości ponad dwukrotnie większej niż długość komórki macierzystej.
   UWAGA: Kwantyfikacja morfogenezy in vitro może być przeprowadzona w tym samym dniu, w którym przeprowadzono inokulację zwierząt. Możliwe jest rozpoczęcie testu morfogenezy in vitro podczas przygotowywania inokulum do wstrzyknięcia i przeprowadzenie inokulacji zwierząt podczas 4 godzinnego okresu inkubacji. Jeżeli wszystkie procedury na zwierzętach zostaną zakończone przed końcem 4-godzinnego okresu inkubacji, należy przystąpić bezpośrednio do badania komórek stymulowanych in vitro. Alternatywnie, komórki można ponownie zawiesić w 3,7% formaldehydzie w dPBS (w kroku 4.2) i przechowywać w temperaturze 4 °C przez kilka dni. Utrwalone organizmy można następnie określić ilościowo, jeśli czas na to pozwoli. Nie wolno opóźniać inokulacji zwierząt w celu przeprowadzenia testu ilościowego in vitro.

5. Przygotowanie do obrazowania in vivo

1. Przygotuj mikroskop (Rysunek 2A).
   1. Włącz cały sprzęt mikroskopowy i uruchom oprogramowanie do obrazowania.
      1. Jeśli to możliwe, załaduj wszystkie wstępnie ustalone ustawienia obrazowania.
      2. Aktywuj lasery i detektory potrzebne do wykrycia używanych białek fluorescencyjnych.
   2. Włączyć podgrzewany stolik mikroskopu i pozwolić mu ogrzać się do 37 °C.
      UWAGA: Możliwe jest użycie mikroskopu z całkowicie zamkniętą komorą środowiskową zamiast podgrzewanej sceny.
   3. Ustaw punkt odniesienia osi Z tak, aby płaszczyzna ostrości znajdowała się na górnej powierzchni szkiełka nakrywkowego. Można to zrobić, przyklejając szkiełko nakrywkowe taśmą nad otworem stolika i umieszczając kroplę wody na szkiełku nakrywkowym. Użyj "suchego" obiektywu o mniejszym powiększeniu (10x), aby ustawić ostrość na krawędzi kropli wody, a następnie ustaw punkt odniesienia osi z. Użyj kawałka ręcznika w celu wchłonięcia wody ze szkiełka nakrywkowego przed usunięciem go ze sceny.
   4. Obróć obiektyw o bardzo dużej odległości roboczej na miejsce i umieść kroplę płynu zanurzeniowego na soczewce. Obniż soczewkę, aby uniknąć ewentualnych uszkodzeń podczas zakładania szkiełka nakrywkowego.
   5. Umieść szkiełko nakrywkowe #1.5 na otworze sceny i przyklej je taśmą. Upewnij się, że taśma całkowicie zakrywa wszystkie krawędzie szkiełka nakrywkowego, aby zapobiec przedostawaniu się płynu poniżej szkiełka nakrywkowego do mikroskopu. Podnieś obiektyw do punktu odniesienia osi z tak, aby płyn zanurzeniowy stykał się zarówno z soczewką obiektywu, jak i szkiełkiem nakrywkowym.
   6. Przygotuj wiele kawałków taśmy samoprzylepnej, aby były gotowe do użycia podczas ustawiania stożka i myszy.
2. Wywołaj znieczulenie ogólne u myszy, aby zobrazować jak powyżej (krok 3.1).
3. Ustaw kursor myszy (Rysunek 2B-D).
   1. Zamocuj stożek nosowy do znieczulenia na stoliku mikroskopu z stożkiem nosowym ustawionym tak, aby całkowicie zakrywał nos zwierzęcia, gdy zwierzę jest w pozycji do obrazowania. Można to łatwiej osiągnąć dzięki dwóm badaczom. Poproś pierwszego badacza, aby umieścił nos znieczulonej myszy w stożku i przesunął mysz do pozycji obrazowania, kontynuując trzymanie stożka nad nosem zwierzęcia. Poproś drugiego badacza, aby przykleił nos i rurkę na miejsce, tak aby stabilnie przylegały do nosa myszy. Po przyklejeniu stożka do nosa pozostaw go tam na pozostałą część sesji obrazowania.
   2. Po ustaleniu najlepszego miejsca do umieszczenia nosa, zanotuj jego położenie. W przypadku kolejnych sesji obrazowania nos można przymocować do stolika przed przyniesieniem zwierzęcia do mikroskopu.
   3. Umieść kroplę sterylnej wody na szkiełku nakrywkowym nad soczewką obiektywu.
   4. Umieść mysz na stoliku mikroskopu. Upewnij się, że ucho znajduje się na kropli wody i płasko przylega do szkiełka nakrywkowego.
   5. Użyj drugiego (górnego) szkiełka nakrywkowego, aby spłaszczyć ucho.
      1. Umieść krawędź szkiełka nakrywkowego równolegle do ciała myszy, tak aby krawędź dotykała myszy w miejscu, w którym ucho styka się z głową.
      2. Opuść wolną krawędź szkiełka nakrywkowego do stolika mikroskopu ruchem zawiasowym. Gdy szkiełko nakrywkowe zbliży się do stolika mikroskopu, spłaszczy ucho. Uważaj, aby nie tworzyć fałd ani wypukłości w uchu.
      3. Przyklej górne szkiełko nakrywkowe taśmą na miejscu, tak aby utrzymywało wystarczający nacisk, aby ucho było płaskie. Uważaj, aby nie zahaczyć o sierść lub wąsy myszy w taśmę.
   6. O ile nie używany jest mikroskop z komorą środowiskową, luźno przykryj ciało myszy sterylną serwetą, aby utrzymać normotermiczne środowisko.
4. Zidentyfikuj pole zainteresowania.
   1. Upewnij się, że obiektyw znajduje się w punkcie odniesienia osi z.
   2. Korzystając z obrazowania w świetle białym/szerokokątnym, dostosuj płaszczyznę ostrości do tkanki ucha. Dobrą strategią jest skupienie się na naczyniach krwionośnych - jeśli można zobaczyć czerwone krwinki poruszające się w naczyniach krwionośnych, płaszczyzna ostrości znajduje się w tkance.
   3. Jeśli mikroskop jest wyposażony w funkcję fluorescencji szerokokątnej, użyj jej do zidentyfikowania pola zainteresowania. Jeśli nie, użyj obrazowania konfokalnego. Ogólnie rzecz biorąc, użycie mikroskopii szerokokątnej do identyfikacji obszarów zainteresowania jest szybsze i wymaga mniejszego napromieniowania tkanki ucha.
      1. Używając kostki filtrującej do wykrywania białka fluorescencyjnego wyrażonego w szczepie referencyjnym, zidentyfikuj pole widzenia, w którym emitowany jest sygnał fluorescencyjny ze szczepu odniesienia. Należy pamiętać, że nieostre światło prawdopodobnie uniemożliwi skupienie się na poszczególnych organizmach. Celem tego etapu jest zidentyfikowanie obszaru zainteresowania dla obrazowania konfokalnego.
      2. Zmienić na kostkę filtrującą, która wykryje białko fluorescencyjne wyrażone przez eksperymentalny szczep(-y) i zweryfikuje ich obecność w wybranym polu widzenia.

6. Obrazowanie

1. Określ ustawienia.
   1. Gdy oprogramowanie do obrazowania jest w trybie konfokalnym na żywo, zbadaj pole zainteresowania, gdy płaszczyzna ogniskowej jest przesuwana przez oś z. Wybierz płaszczyznę osi Z z silnym sygnałem ze wszystkich używanych białek fluorescencyjnych.
   2. Dostosuj moc lasera i/lub prędkość obrazowania, aby uzyskać wystarczająco silny sygnał, aby można było określić morfologię dla wszystkich komórek w polu widzenia. Aby uniknąć uszkodzenia tkanek, należy używać najmniejszej możliwej mocy lasera.
      UWAGA: Podobnie jak w przypadku wszystkich rodzajów obrazowania, istnieje równowaga między mocą lasera, szybkością akwizycji i rozdzielczością. Zidentyfikuj ustawienia, które wyraźnie identyfikują morfologię organizmu, jednocześnie równoważąc prędkość i moc lasera, aby zminimalizować napromienianie tkanki ucha. Ponieważ obrazowanie odbywa się przez zewnętrzną skórę właściwą, do wzbudzenia wymagana jest wyższa moc lasera niż jest to zwykle konieczne do obrazowania konfokalnego tradycyjnych próbek zamontowanych na szkiełkach. Na szczęście poziom rozdzielczości przestrzennej wymagany do analizy morfologii nie jest ekstremalny. W ten sposób uzyskanie obrazów z wystarczającym sygnałem do określenia morfologii organizmu bez powodowania uszkodzenia tkanek jest łatwo osiągalne.
   3. Po ustaleniu tych parametrów należy ich używać przez cały czas trwania sesji obrazowania, aby służyły jako punkt wyjścia do kolejnych sesji obrazowania. Dlatego pomocne jest zapisanie ustawień obrazowania.
      UWAGA: Poszczególne obszary infekcji mogą być płytsze lub głębsze w tkance. Głębsze obszary mogą wymagać zwiększenia mocy lasera. Ponieważ test ten opiera się na przestrzennym rozkładzie sygnału, a nie na jego intensywności, dopuszczalna jest zmiana ustawień obrazu między polami w razie potrzeby.
2. Uzyskaj obrazy.
   1. Wybierz pole widzenia, w którym w szczepie referencyjnym wyraźnie tworzą się włókna i gdzie większość organizmów jest na tyle rozproszona, że można określić ich morfologię.
   2. Ustaw górną i dolną płaszczyznę ostrości dla stosu z. Nie jest konieczne pokrycie całej głębokości zainfekowanego obszaru, ale należy pamiętać, że organizmy znajdujące się na górze lub na dole obrazowanej objętości są zwykle wykluczane z analizy.
   3. Uzyskaj obrazy stosu z, pokoloruj pseudo każdy kanał, aby odróżnić każdy szczep i nałóż kanały. Zapisz obrazy.
   4. Powtórz te czynności dla innych pól widzenia. Morfogeneza może się różnić w zależności od lokalizacji; Dlatego ważne jest pozyskanie i przeanalizowanie co najmniej trzech pól z każdego ucha.

7. Ręczna analiza dwuwymiarowa: Częstotliwość filamentacji

1. Użyj oprogramowania do obrazowania, aby wykonać maksymalną projekcję stosu z na obraz dwuwymiarowy. Podane tutaj instrukcje dotyczą FIDŻI/Obraz J.
   1. Otwórz obrazy mikroskopowe za pomocą oprogramowania ImageJ.
   2. W razie potrzeby nałóż pseudo-kolor na każdy kanał, aby umożliwić prostą identyfikację każdego szczepu C. albicans. W tym celu kliknij Obraz > Tabela przeglądowa > Kolor LUT i wybierz wybrany pseudokolor.
   3. Przekonwertuj plik stosu na dwuwymiarowy obraz projekcji o maksymalnej intensywności:
      1. Wybierz plik z-stack. Kliknij Obraz > stosy > projekcji Z.
      2. Wybierz górną i dolną płaszczyznę, a następnie wybierz typ projekcji Maksymalna intensywność.
2. Policz każdy organizm widziany na obrazach maksymalnej projekcji według typu szczepu (z rozróżnieniem na podstawie koloru kanału) i morfologii.
   1. Organizmy, które w znacznym stopniu nakładają się na siebie lub obszary o bardzo dużym zagęszczeniu organizmów, będą trudne do dokładnego policzenia. Wyklucz je z liczenia, ale uważaj, aby nie wprowadzać uprzedzeń w stosunku do form nitkowatych, które z większym prawdopodobieństwem będą się nakładać.
   2. Nitkowate formy wystające prosto do lub z stosu z będą wyglądać jak małe okrągłe obiekty w maksymalnej projekcji. Podobnie organizmy, które są odcięte przez granicę obrazu, mogą wydawać się drożdżami, ponieważ żarnik znajduje się poza polem widzenia. W związku z tym analiza dwuwymiarowa zawsze będzie przeszacowywać procent form drożdżowych. Ponieważ nastąpi to w równym stopniu dla szczepu referencyjnego i doświadczalnego(-ych), należy zawsze porównywać wyniki doświadczalne ze szczepem referencyjnym.
3. Wykonaj statystyczne porównania wyników zgodnie z projektem eksperymentalnym.

8. Ręczna analiza dwuwymiarowa: Długość filamentu

1. W przypadku C. albicans nieprawidłowe tworzenie włókien może wystąpić, ponieważ: a) mniej "matek" komórek drożdży ulega morfogenezie, b) włókna rosną w wolniejszym tempie lub c) nitkowaty wzrost jest inicjowany, ale nie utrzymywany. Aby ocenić te możliwości, określ ilościowo długość ścieżki krzywej każdego włókna na obrazie projekcji maksymalnej jako substytut prawdziwej długości trójwymiarowej (omówionej poniżej).
   1. Kiedy pączek rozwija się na komórce macierzystej, nie można stwierdzić, czy stanie się włóknem, czy drożdżami. Aby upewnić się, że w tej analizie uwzględnione są tylko komórki nitkowate, należy mierzyć tylko organizmy, w których komórka potomna jest co najmniej dwa razy dłuższa od komórki macierzystej.
2. Otwórz obraz projekcji maksymalnej utworzony w kroku 7.
3. W zestawie narzędzi ImageJ kliknij prawym przyciskiem myszy narzędzie Linia prosta/segmentowa i wybierz opcję Linia podzielona na segmenty. Opcja linii segmentowej pozwala użytkownikowi mierzyć długość filamentu wzdłuż zakrzywionej ścieżki, co jest koniecznością, biorąc pod uwagę plastyczność filamentów C. albicans.
4. Zmierz długość filamentu od szyjki pąka do rosnącego końca filamentu. Kliknij lewym przyciskiem myszy szyjkę pąka; Wskaźnik zmieni się w mały kwadrat. Śledź filament wzdłuż jego długości, klikając środek filamentu za każdym razem, gdy następuje zakrzywienie, skręt lub zmiana długiej osi filamentu. Kliknij dwukrotnie na rosnącą końcówkę filamentu.
5. Naciśnij Control + M. Spowoduje to otwarcie wyskakującego okienka, w którym znajdują się tabelaryczne pomiary powierzchni, średniej, minimalnej, maksymalnej i długości. Po zmierzeniu każdego filamentu ponownie naciśnij Control + M, aby dodać bieżący pomiar do tabeli pomiarów.
6. Po zmierzeniu wszystkich filamentów skopiuj i wklej pomiary długości do pliku analizy danych.
7. Wykonaj analizę statystyczną, aby ocenić rozkład długości włókien w odkształcie odniesienia i odkształceniu zmutowanym.

9. Ręczna analiza trójwymiarowa

1. Aby uzyskać bardziej precyzyjny pomiar morfogenezy, który pozwala uniknąć przeszacowania form drożdży i może umożliwić rozróżnienie między pseudostrzępkami a strzępkami, ręcznie przewijaj w górę iw dół przez stos z, oceniając morfologię każdego organizmu w trzech wymiarach.
2. Alternatywnie, utwórz trójwymiarowy obraz każdego stosu z i przeanalizuj kształt każdego organizmu podczas obracania obrazu.

10. Zautomatyzowana analiza

1. Korzystając z oprogramowania do obrazowania, zautomatyzuj liczenie organizmów i ich morfologię w dwóch lub trzech wymiarach.
   UWAGA: Niektóre algorytmy dyskryminacji typów morfologii mogą wprowadzać błąd systematyczny. W związku z tym strategie automatyzacji muszą być starannie zweryfikowane w odniesieniu do projektu eksperymentalnego. Dobrze zaprojektowana i zweryfikowana zautomatyzowana analiza obrazu może zwiększyć przepustowość etapu analizy.

Wyniki

Przedstawione tutaj wyniki opierają się na wcześniej opublikowanych raportach^9,10. Celem niniejszej analizy jest ilościowa ocena zdolności mutantów szczepów C. albicans do przechodzenia morfogenezy podczas aktywnych infekcji. Typowe parametry odróżniające pseudohif od hif mogą być trudne do oceny w organizmach rosnących trójwymiarowo w złożonym środowisku in vivo. Jest to szczególnie widoczne w przypadku dwuwymiarowych przekrojów uzyskanych za pomocą obrazowania konfokalnego. Dlatego też niniejsza analiza przesiewowa koncentruje się na identyfikacji organizmów rosnących w formie włóknistej w przeciwieństwie do formy drożdżowej. W badaniach następczych, z wykorzystaniem bardziej szczegółowej analizy, w tym rekonstrukcji trójwymiarowych, metodę tę można by dostosować do rozróżniania drożdżaków, hif i pseudohif.

Ekspresja białka fluorescencyjnego w szczepie referencyjnym lub mutantycznym C. albicans umożliwia bezpośrednią detekcję morfologii szczepu in vivo (Rycina 3 oraz Rycina 4). Generalnie ilościowa analiza za pomocą mikroskopii świetlnej jest najskuteczniejsza, gdy niewiele lub żadne z pikseli na obrazie nie jest nasycone. W przypadku niniejszego protokołu nasycenie obrazu często jednak upraszcza analizę. Lokalizacja białka fluorescencyjnego nie jest jednolita w całej komórce i często jest wyższa w komórce macierzystej drożdży niż w filamentach. Na szczęście w badaniach nad morfogenezą to przestrzenny rozkład sygnału, a nie jego intensywność, definiuje wynik. Zatem uzyskanie obrazów, w których wiele pikseli jest nasyconych, poprawia możliwość ilościowego określenia morfogenezy w tym teście.

Aby zilustrować znaczenie oceny morfogenezy in vivo, przedstawiono reprezentatywne wyniki dla szczepu referencyjnego (SN250) oraz dwóch mutantów: jednego pozbawionego czynnika transkrypcyjnego Efg1 i drugiego pozbawionego cyklazy adenylowej Cyr1. In vitro żaden z tych szczepów nie rośnie w formie filamentów^20,21. Podczas hodowli in vitro w podłożu RPMI uzupełnionym o 10% surowicy, szczep referencyjny szybko tworzy filamenty, podczas gdy szczepy efg1ΔΔ i cyr1ΔΔ tego nie robią (Rysunek 3 i Rysunek 4). W tych warunkach mutant efg1ΔΔ wykazuje w pewnym stopniu polaryzację wzrostu, przy czym komórki potomne są lekko wydłużone w porównaniu z komórkami macierzystymi. Podkreśla to znaczenie stosowania jasnej definicji filamentacji. Każda taka definicja jest z założenia arbitralna, ale jest ona niezbędna do spójnej oceny fenotypu. W tych badaniach filamentowy wzór wzrostu zdefiniowano jako organizm, w którym największy wymiar komórki potomnej jest więcej niż dwukrotnie większy od wymiaru komórki macierzystej. Stosując tę definicję, wydłużone komórki efg1ΔΔ nie są uznawane za filamentowe.

Zgodnie z fenotypem in vitro, szczep efg1ΔΔ wykazuje istotny defekt filamentacji in vivo: około 9% komórek efg1ΔΔ rosło w formie filamentów in vivo (Rycina 3). W przeciwieństwie do tego, 53% komórek mutanta cyr1ΔΔ rosło jako filamenty in vivo (Rycina 4). Chociaż liczba komórek mutanta cyr1ΔΔ ulegających filamentacji in vivo była znacznie niższa niż w szczepie referencyjnym, zdolność mutanta cyr1ΔΔ do tworzenia filamentów in vivo stanowi istotną zmianę w stosunku do całkowitego braku morfogenezy in vitro. Wizualnie filamenty tworzone przez mutant cyr1ΔΔ wydawały się krótsze niż w szczepie referencyjnym. Aby ocenić to ilościowo, zmierzono długość ścieżki krzywej komórek filamentacyjnych przy użyciu dwuwymiarowej projekcji obrazów in vivo (Rycina 4E). Mediana długości filamentów cyr1ΔΔ była o 29% krótsza niż długość filamentów szczepu referencyjnego.

Rysunek 1: Znieczulenie i inokulacja. (A) Indukcja znieczulenia przy użyciu komory indukcyjnej. (B) Utrzymywanie znieczulenia za pomocą maski nosowej, co pozwala na zmianę pozycji myszy w razie potrzeby. (C) Aplikacja kremu do depilacji za pomocą aplikatora z watką. W celu ochrony oczu podczas znieczulenia zastosowano żel nawilżający do oczu. (D) Skuteczna depilacja prawego ucha. Porównanie z niepoddanym zabiegowi lewym uchem. (E) Iniekcja śródskórna C. albicans do ucha myszy. Ucho jest stabilizowane za pomocą końcówki probówki stożkowej owiniętej dwustronną taśmą skórną (taśmą krawiecką). (F) Zbliżenie iniekcji śródskórnej. W skórze tworzy się blady pęcherzyk, co jest oznaką prawidłowego podania śródskórnego. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Przygotowanie do obrazowania. (A) Stolik mikroskopu przygotowany do obrazowania. Stożek anestezjologiczny jest zamocowany na miejscu. Do stolika przyklejono taśmą szkiełko nakrywkowe, zasłaniające otwór obiektywu. Dostępne są dodatkowe kawałki taśmy. Podgrzewany stolik jest wstępnie rozgrzany do 37 °C (nie pokazano). (B) Umieszczenie znieczulonej myszy w stożku anestezjologicznym. (C) Mysz jest lekko obracana tak, aby strona ucha, w którą podano inokulum, była skierowana w stronę dolnego szkiełka nakrywkiego/obiektywu. Ucho jest następnie dociśnięte do dolnego szkiełka nakrywkiego i unieruchomione poprzez nałożenie drugiego szkiełka nakrywkiego na wierzch ucha. (D) Górne szkiełko nakrywkowe jest przyklejone taśmą do stolika, aby unieruchomić ucho względem stolika mikroskopu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Rycina 3: In vitro i in vivo morfologia efg1szczep mutant $\Delta\Delta$. (A) Obraz szerokopolowy WT i efg1szczepy mutanty ΔΔ po in vitro indukcja filamentacji poprzez hodowlę komórek w pożywce RPMI + 10% surowicy w temperaturze 37 °C przez 4 h. Paski skali oznaczają 10 µmKontrast obrazu został dostosowany przy użyciu oprogramowania do edycji zdjęć w celu ułatwienia oglądania.B) Procent filamentacji in vitro obserwowano w WT oraz efg1szczepy mutanty ΔΔ. Und = niewykrywalne (nie wykryto filamentów). Wysokość słupka reprezentuje medianę procentowego udziału komórek filamentowatych z trzech niezależnych eksperymentów, w których poddano analizie co najmniej 100 komórek. Słupki błędu wskazują odchylenie standardowe (wyniki porównano testem t studenta) t-test, p < 0.001). (C) Mikrografia konfokalna typu WT (zielony) i efg1mutant ΔΔ (czerwony) w fazie wzrostu in vivo 24 h po inokulacji. Strzałki wskazują przykłady efg1Komórki mutanty ΔΔ, które spełniają naszą definicję „nitkowatych”. Pasek skali oznacza 50 µm. (D) Procent filamentacji in vivo obserwowane w WT oraz efg1Szczepy mutanty ΔΔ. Wysokość słupków reprezentuje medianowy procent komórek nitkowatych z dwóch niezależnych eksperymentów. Słupki błędu wskazują odchylenie standardowe (wyniki porównano za pomocą testu t studenta) t-test, p < 0.001). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rycina 4: In vitro i in vivo morfologia cyr1szczep mutant $\Delta\Delta$. (A) Obraz szerokopolowy (widefield) cyr1szczep mutant ΔΔ po in vitro indukcja filamentacji poprzez hodowlę komórek w pożywce RPMI + 10% surowicy w 37 °C przez 4 h. Pasek skali oznacza 10 µmKontrast obrazu został dostosowany przy użyciu oprogramowania do edycji zdjęć w celu ułatwienia oglądania.B) Procent nitek (filamentacji) in vitro obserwowano w WT i cyr1Szczepy mutanty ΔΔ. Und = niewykrywalne (nie wykryto filamentów). Wysokość słupka reprezentuje medianowy procent komórek filamentacyjnych z trzech niezależnych eksperymentów, w których poddano analizie co najmniej 100 komórek. Słupki błędu wskazują odchylenie standardowe (wyniki porównano testem t studenta) t-test, p < 0.001). (C) Mikrograf konfokalny WT (zielony) i the cyr1mutant ΔΔ (czerwony) w fazie wzrostu in vivo 24 h po inokulacji. Pasek skali oznacza 50 µm. (D) Procent filamentacji in vivo obserwowano w grupie WT i cyr1szczepy mutanty ΔΔ. Wysokość słupków reprezentuje medianę procentowego udziału komórek nitkowatych z dwóch niezależnych eksperymentów. Słupki błędów oznaczają odchylenie standardowe (wyniki porównano testem t studenta) t-test, p < 0.001). (E) Rozkład długości filamentów in vivo, mierzona jako długość ścieżki krzywej w dwuwymiarowej projekcji stosu z (z-stack). Każda kropka reprezentuje długość jednego filamentu. W analizie nie uwzględniono komórek rosnących w formie drożdżowej. Słupek oznacza medianę długości filamentów. Rozkład długości jest istotnie różny w analizie z wykorzystaniem testu U Manna-Whitneya (p < 0.001). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dyskusja

Model ten wykorzystuje mikroskopię konfokalną do uzyskania obrazów organizmów C. albicans rosnących w tkance ssaka gospodarza, co pozwala nam ocenić fenotypy morfogenezy podczas aktywnej infekcji. Proces morfogenezy ma kluczowe znaczenie dla patogenezy C. albicans i był szeroko badany przy użyciu różnych testów in vitro ^2,3,4. Jednak żaden test in vitro nie jest w stanie w pełni odwzorować złożonego środowiska biochemicznego i strukturalnego gospodarza.

Opisany tutaj protokół koncentruje się na wykorzystaniu tego systemu obrazowania in vivo do badania przesiewowego serii/biblioteki mutantów C. albicans w celu identyfikacji genów zaangażowanych w morfogenezę podczas infekcji. Zastosowanie szczepów C. albicans wykazujących ekspresję różnych białek fluorescencyjnych pozwala nam na ilościowe określenie morfogenezy in vivo zmutowanych szczepów C. albicans w porównaniu ze szczepem referencyjnym. Porównanie morfogenezy mutanta ze szczepem referencyjnym w obrębie tego samego obszaru infekcji zapewnia, że organizmy są narażone na identyczne środowisko. Pozwala to na ilościowy pomiar procentu komórek poddawanych filamentacji, a także zakresu filamentacji. Normalizacja pomiarów zmutowanego szczepu (szczepów) do pomiarów szczepu referencyjnego pozwala nam lepiej porównać wydajność jednego mutanta z drugim.

Przedstawione tutaj reprezentatywne wyniki wskazują na możliwość wystąpienia znacznej rozbieżności między fenotypami in vitro i in vivo . Zmutowany szczep C. albicans efg1ΔΔ jest często stosowany jako kontrola ujemna w testach morfogenezy, ponieważ nie udaje się go w filament w prawie wszystkich warunkach in vitro ²⁰. Chociaż wyniki in vivo były bardzo podobne do wyników in vitro , nawet ten poważnie utrudniony szczep czasami tworzył włókna w środowisku tkanki gospodarza (ryc. 3). Podkreśla to siłę środowiska gospodarza w wyzwalaniu morfogenezy.

W przeciwieństwie do tego, zmutowany szczep cyr1ΔΔ wykazuje znaczną dysonans między wzrostem in vitro i in vivo; chociaż żadna ze zmutowanych komórek nie ulega filamentacji in vitro, około połowa komórek rośnie jako włókna in vivo (ryc. 4)^10,21. Co ciekawe, włókna te były znacznie krótsze niż te utworzone przez szczep referencyjny, co sugeruje, że CYR1 przyczynia się do tempa wzrostu włókien lub zdolności do utrzymania nitkowatego fenotypu. Aby ułatwić analizę długości włókien, zmierzono długość ścieżki krzywej włókien za pomocą dwuwymiarowej projekcji obrazów. W dwuwymiarowych rzutach włókien rosnących w trzech wymiarach, każde włókno rosnące na osi, która nie jest równoległa do płaszczyzny xy, będzie rzutować jako krótsze niż jego rzeczywista długość. Ponieważ to skrót perspektywiczny występuje również w przypadku szczepu referencyjnego, ocena rozkładu długości włókien w projekcji dwuwymiarowej nadal pozwala na ilościowe porównanie między szczepami referencyjnymi i zmutowanymi. Analiza długości filamentu w dwóch, a nie trzech wymiarach wymaga mniej intensywnej analizy obrazu; Dzięki temu można go wykonać stosunkowo szybko na typowym komputerze stacjonarnym. Korzystanie z tej prostszej analizy pozwala na włączenie rozkładu długości włókien jako części protokołu badań przesiewowych, dając bardziej zniuansowane zrozumienie zdolności każdego mutanta do przechodzenia morfogenezy bez powodowania znacznych opóźnień w przepustowości.

Przedstawione tu reprezentatywne badania przeprowadzono na myszach DBA2/N, które mają defekt w układzie dopełniacza powodujący niepowodzenie rekrutacji neutrofili do miejsca zakażenia C. albicans ²². Celem tych badań było zbadanie mechanizmów regulacji filamentacji C. albicans w tkance gospodarza. Dlatego wykorzystano myszy DBA2/N, aby uniknąć mylenia wyników ze względu na podatność lub oporność poszczególnych szczepów na neutrofile. Ponieważ odpowiedź neutrofili anty-C. albicans może wpływać na filamentację²³, rekrutacja neutrofili do miejsca infekcji może mieć wpływ na wyniki testu morfogenezy. Jeśli szczep jest zdolny do filamentacji in vivo , ale jest silnie hamowany przed filamentacją, gdy obecne są neutrofile, filamentacja zostanie wykryta u myszy DBA2 / N, ale jest mało prawdopodobne, aby została zaobserwowana w przypadku użycia myszy z nienaruszoną chemotaksją neutrofili. Tak więc obciążenie myszy używanej jako gospodarz jest ważnym czynnikiem podczas korzystania z tego protokołu.

Obserwacja, że zmutowany szczep efg1ΔΔ nie jest w stanie filamentować in vivo , jest mało prawdopodobna, aby była związana z odpowiedziami neutrofili gospodarza, ponieważ szczep ten również nie jest w stanie filamentować in vitro. Filamentacja obserwowana in vivo ze szczepem cyr1ΔΔ jest niezgodna z jego brakiem filamentacji in vitro. Dane z modelu zakażenia C. albicans u danio pręgowanego wskazują, że reagujące neutrofile są ważne w zapobieganiu morfogenezie²⁴. Dlatego jest mało prawdopodobne, aby użycie myszy DBA2 / N, które nie mają odpowiedzi neutrofili, odpowiadało za wzrost filamentacji cyr1ΔΔ in vivo w porównaniu z in vitro. Niemniej jednak środowisko in vivo ma wyraźny wpływ na morfogenezę szczepu cyr1ΔΔ; w związku z tym dalsze badania tego szczepu mogą dostarczyć ważnych informacji na temat regulacji morfogenezy C. albicans podczas aktywnych infekcji. Opisany tutaj protokół został zaprojektowany jako test przesiewowy w celu identyfikacji szczepów, takich jak szczep cyr1ΔΔ, które mają być wykorzystane w przyszłych badaniach.

Zastosowanie systemu znieczulenia gazowego o niskim przepływie jest bardzo pomocne w tym protokole (ryc. 1A,B). Podczas początkowego opracowywania tego protokołu myszy znieczulono za pomocą wstrzykiwanego koktajlu znieczulającego ketaminy zmieszanego z ksylazyną. Chociaż możliwe było wykonanie ograniczonego obrazowania za pomocą tej metody znieczulającej, czas trwania znieczulenia był nieprzewidywalny, co wymagało szybkiego zakończenia sesji obrazowania, aby uniknąć powrotu myszy do zdrowia po znieczuleniu podczas obrazowania. Tradycyjne wziewne systemy znieczulające są nieporęczne i wymagają dużych szybkości przepływu gazów znieczulających, co często wymaga stosowania ich w dygestorium. W związku z tym tradycyjne wziewne systemy znieczulające byłyby bardzo trudne w użyciu przy ograniczeniach przestrzennych mikroskopu konfokalnego bez nieumyślnego narażenia badaczy na działanie środków znieczulających. Zastosowanie systemu znieczulenia wziewnego o niskim przepływie pozwala na konsekwentne znieczulenie zwierzęcia przy jednoczesnym zachowaniu bezpiecznego środowiska dla badacza. Nos o niskim przepływie umożliwia łatwe pozycjonowanie zwierzęcia zarówno do inokulacji, jak i mikroskopii. Rurka doprowadzająca o małym kalibrze i małej objętości pozwala na użycie stosunkowo długich rurek, co umożliwia umieszczenie aparatu anestezjologicznego w wystarczającej odległości, aby nie zakłócać mikroskopii.

Chlorofil obecny w typowej karmie myszy prowadzi do znacznej autofluorescencji tkanek²⁵. Powoduje to znaczne szumy na obrazach, co utrudnia uzyskanie obrazów o wysokiej jakości i wysokiej rozdzielczości przestrzennej. Kiedy zwierzęta były karmione karmą bez chlorofilu przez 7 dni przed obrazowaniem, tło z autofluorescencji było znacznie zmniejszone w tkance, ale chlorofil odkładający się we włosach nadal był problematyczny. Usuwanie włosów na małżowinach usznych za pomocą dostępnego bez recepty chemicznego kremu do depilacji skutecznie minimalizuje autofluorescencję we włosach (ryc. 1C, D). W ten sposób połączenie karmy bez chlorofilu i odpowiedniego usuwania owłosienia znacznie zmniejszyło autofluorescencję i znacznie poprawiło jakość obrazu. Ponieważ włosy są usuwane z ucha przed obrazowaniem, kolor sierści zwierzęcia nie ma wpływu na ten układ. Protokół ten został z powodzeniem wykorzystany do badania zakażeń C. albicans u myszy BALB/c (biały), C57BL/6 () i DBA2/N (brązowy). Protokół może być również stosowany u myszy z nokautem C57BL/6, które mają niedobór różnych genów gospodarza; Umożliwi to w przyszłości badania nad tym, w jaki sposób układ odpornościowy gospodarza ssaków wpływa na filamentację. Jedną z cech tego modelu, która nie została omówiona w tym protokole, jest to, że ponieważ ten system obrazowania jest nieinwazyjny, to samo zwierzę może być obrazowane wielokrotnie przez kilka dni, co pozwala śledzić postęp poszczególnych infekcji w czasie. Ta cecha prawdopodobnie odegra kluczową rolę w przyszłych badaniach nad interakcją gospodarz-patogen.

Podsumowując, protokół ten skutkuje uzyskaniem obrazów o wysokiej rozdzielczości przestrzennej C. albicans rosnących w tkance żywego ssaka gospodarza, co pozwala na dokładną ocenę morfogenezy w zmutowanych szczepach ^8,9,10. Zaprezentowane tutaj wyniki pokazują, w jaki sposób protokół ten może być wykorzystany do badania przesiewowego biblioteki mutantów C. albicans. Spośród przebadanych do tej pory mutantów C. albicans duża część mutantów ze znanymi defektami morfogenezy in vitro łatwo ulega filamentacji in vivo ^9,10. Podkreśla to znaczenie włączenia systemu in vivo, takiego jak ten, do eksperymentów mających na celu wyjaśnienie mechanizmów patogenezy C. albicans.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
#1.5 szkiełka nakrywkowe	Thermo-Fisher	20811	wystarczająco duże, aby zakryć uniwersalny otwór sceniczny
0,1 mL Strzykawki insulinowe	EXELint	26018	Może używać strzykawek o średnicy 5/16"– 1/2" długości i 29– 32 G
3,7% formaldehyd w dPBS	Sigma-Aldrich	SHBJ5734
70% etanolu/30% wody	Decon Laboratories	A05061001A
Wkładki do przygotowywania alkoholu	Covidien	5110	Alternatywa: gaziki nasączone 70% alkoholem izopropylowym
C.albicans szczep referencyjny i szczepy eksperymentalne	SN250	FGSC Katalog	onlineSpecyficzny szczep C. albicans różni się w zależności od eksperymentu i celów badaczy. Użyliśmy szczepów pochodzących z SC5314, a także innych izolatów klinicznych.
Mysz bez chlorofilu	Komputer Envigo	2920x
Dell		Optiplex 7050	Komputer, na którym można uruchomić oprogramowanie do obrazowania w celu akwizycji i analizy obrazów. Dostępnych jest różne programy do obrazowania, które różnią się w zależności od konkretnego mikroskopu i systemu użytkownika.
aplikator z bawełnianą końcówką	Pro Advantage	76200
DBA2/N (myszy 6-12 tygodniowe)			Myszy BALB/c i C57/BL6 mogą być również używane. Te ostatnie pozwalają na wykorzystanie powszechnie dostępnych modeli myszy z nokautem, a także modeli mysich, w których poszczególne typy komórek, takie jak fagocyty, są identyfikowane na podstawie ekspresji białek fluorescencyjnych.
Dwustronna taśma przeznaczona do przytrzymywania tkaniny przy skórze (taśma modowa)	w lokalnej aptece lub sklepie		Dwustronna taśma klejąca przeznaczona do utrzymywania odzieży na miejscu na ludzkiej skórze. Jest to zazwyczaj dostępne bez recepty w aptekach i sklepach z różnorodnymi rozmaitościami. Ważne jest, aby używać tego rodzaju taśmy, ponieważ jest ona przeznaczona do delikatnego przylegania do skóry. Przykłady:  https://www.amazon.com/Womens-Fashion-Clothing-Transparent-Suitable/dp/B08S3TWR3H/ref=sr_1_40?crid=2UWFL8FMFAKGM&keywords =moda+taśma& qid=1649174406& sprefix= moda+taśma%2Caps%2C70& sr=8-40 https://www.amazon.com/Fearless-Tape-Sensitive-Clothing-Transparent/dp/B07QY8V5XT/ref=sr_1_26?crid=2UWFL8FMFAKGM&keywords =moda+taśma& qid=1649174320& sprefix= moda+taśma%2Caps%2C70& sr=8-26 https://www.amazon.com/Hollywood-Fashion-Secrets-Tape-Floral/dp/B009RX77MK/ref=sr_1_29?crid=2UWFL8FMFAKGM&keywords =moda+taśma& qid=1649174406& sprefix= moda+taśma%2Caps%2C70& sr=8-29
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami Dulbecco	Gibco / Thermo-Fisher	14190-144	Musi być sterylny; otwierać nowy pojemnik dla każdego eksperymentu
Surowica bydlęca	płodu Gibco / Thermo-Fisher	26140-079
Gazik	Pro Advantage	P157112
Żel do oczu lurbicant	lokalna apteka lub sklep
ImageJ lub FIJI oprogramowanie analityczne	NIH	ImageJ (FIJI)
Isoflurane	Akorn	J119005
Leica DMi8 (platforma SP8) z obiektywem Leica 11506375	Leica	DMi8 (SP8)	Obiektyw  (Leica 11506375) używane tutaj  to soczewka zanurzająca w wodzie 25x, która pozwala nam uzyskać wysokie NA (0,95) przy jednoczesnym przybliżeniu współczynnika załamania światła tkanki ucha. Mikroskop (Leica DMi8 (platforma SP8) ma linie lasera diodowego 488 nm i 638 nm i jest wyposażony w bezfiltrową detekcję spektralną ze sterowaną komputerowo regulowaną szerokością pasma do wykrywania światła emisyjnego. Stolik musi mieć wystarczający prześwit, aby obiektyw mógł Dotrzyj do dolnego szkiełka nakrywkowego bez uderzania w scenę.
System anestezjologiczny o niskim przepływie lub tradycyjny waporyzator anestezjologiczny	Kent Scientific International	SomnoSuite
Nair balsam do depilacji	lokalna apteka lub sklep		Dostępny bez recepty krem do depilacji
Nourseothricin	Jena Bioscience	AB-101L
pENO1-NEON-NATR plazmidy			pENO1-iRFP-NATRKonstrukty transformacji ekspresji białek fluorescencyjnych  hojnie podarowany nam przez dr Roberta Wheelera (Seman, et al., 2018, Infection and Immunity; Bergeron, et al., 2017, Infekcja i odporność)
Taśma laboratoryjna wrażliwa na nacisk	Taśma & Label Graphic Systems Inc	1007910
RPMI1640 pożywki do hodowli komórkowych	Gibco / Thermo-Fisher	11875-093
Naparstek, plastikowa rurka stożkowa 15 ml lub probówki polistyrenowe Falcon 5 ml z okrągłym dnem	Falcon	352196	Aby bezpiecznie trzymać ucho zwierząt podczas wstrzykiwań

Można również stosować spożywczym spożywczy spożywczy