Eksperymentalna kwantyfikacja interakcji między systemami dostarczania leków a komórkami in vitro: przewodnik po przedklinicznej ocenie nanomedycyny

Summary

Pokazano przepływ pracy do bezwzględnej kwantyfikacji interakcji nośnik leku z komórką za pomocą cytometrii przepływowej, aby umożliwić lepszą racjonalną ocenę nowych systemów dostarczania leków. Ten przepływ pracy ma zastosowanie do nośników leków dowolnego typu.

Abstract

Głównym elementem projektowania systemów dostarczania leków jest sposób wzmacniania lub tłumienia interakcji z określonymi typami komórek. Na przykład chemioterapeutyk może być funkcjonalizowany przeciwciałem w celu zwiększenia wiązania z komórkami rakowymi ("celowanie") lub funkcjonalizowany glikolem polietylenowym, aby uniknąć rozpoznania komórek odpornościowych ("podstęp"). Nawet na poziomie komórkowym optymalizacja wiązania i wychwytu nośnika leku jest złożonym problemem projektowania biologicznego. W związku z tym cenne jest oddzielenie tego, jak silnie nowy przewoźnik oddziałuje z komórką, od skuteczności funkcjonalnej ładunku przewoźnika po dostarczeniu do tej komórki.

Kontynuując przykład z chemioterapeutyką, "jak dobrze wiąże się z komórką rakową" jest oddzielnym problemem od "jak dobrze zabija komórkę rakową". Ilościowe testy in vitro dla tych ostatnich są dobrze ugruntowane i zwykle opierają się na pomiarze żywotności. Jednak większość opublikowanych badań nad interakcjami komórka-nośnik ma charakter jakościowy lub półilościowy. Ogólnie rzecz biorąc, pomiary te opierają się na znakowaniu fluorescencyjnym nośnika, a w konsekwencji raportują interakcje z komórkami w jednostkach względnych lub dowolnych. Jednak praca ta może być ustandaryzowana i może być całkowicie ilościowa przy niewielkiej liczbie eksperymentów charakteryzujących. Taka bezwzględna kwantyfikacja jest cenna, ponieważ ułatwia racjonalne, między- i wewnątrzklasowe porównania różnych systemów dostarczania leków – nanocząstek, mikrocząstek, wirusów, koniugatów przeciwciało-lek, zmodyfikowanych komórek terapeutycznych lub pęcherzyków zewnątrzkomórkowych.

Ponadto, kwantyfikacja jest warunkiem wstępnym dla kolejnych metaanaliz lub podejść do modelowania in silico. W tym artykule przedstawiono przewodniki wideo, a także drzewo decyzyjne dotyczące sposobu osiągnięcia kwantyfikacji in vitro dla systemów dostarczania leków na nośniki, które uwzględniają różnice w wielkości nośnika i modalności znakowania. Ponadto omówiono dalsze rozważania dotyczące oceny ilościowej zaawansowanych systemów dostarczania leków. Ma to służyć jako cenne źródło informacji na temat poprawy racjonalnej oceny i projektowania leków nowej generacji.

Introduction

Projektowanie konstruktów dostarczających leki, które wykazują specyficzne, zaprojektowane zachowanie w zależności od typu komórek, z którymi się zetkną, wzbudziło duże zainteresowanie badawcze. Potencjalne konstrukty lub "nośniki" dostarczania leków obejmują preparaty lipidowe, nanohodowane substancje nieorganiczne, zespoły polimerowe, pęcherzyki zewnątrzkomórkowe, funkcjonalizowane komórki bakteryjne lub zmodyfikowane wirusy. Wszystkie te czynniki mogą wykazywać specyficzność narządów, tkanek lub komórek ze względu na właściwości fizyczne, właściwości powierzchni lub zmodyfikowane funkcjonalne funkcje chemiczne, takie jak przyłączanie przeciwciał^1,2.

Prawie powszechnym krokiem w ocenie nośnika in vitro jest inkubacja komórek z zawiesiną zawierającą wspomniany nośnik naładowany lekiem. Po inkubacji wydajność nośnika mierzy się za pomocą funkcjonalnego odczytu wydajności ładunku leku, na przykład skuteczności transfekcji lub toksyczności. Odczyty funkcjonalne są przydatne, ponieważ są dalszą miarą efektywności nośnika. Jednak w przypadku bardziej złożonych konstruktów dostarczania leków coraz ważniejsze staje się wyjście poza odczyty funkcjonalne i oddzielne określenie ilościowe stopnia interakcji nośnika z komórką będącą przedmiotem zainteresowania. Jest ku temu kilka powodów.

Po pierwsze, rośnie zainteresowanie odkrywaniem (i iteracyjnym ulepszaniem) technologii przewoźników "platformowych", które mogą przewozić różne ładunki. Na przykład nanocząstki lipidowe (LNP) zaprojektowane do enkapsulacji RNA mogą wymieniać jedną sekwencję RNA na inną z kilkoma zastrzeżeniami³. W związku z tym, aby iteracyjnie ulepszać technologię nośnika, kluczowe znaczenie ma ilościowe określenie jej wydajności niezależnie od funkcjonalności ładunku. Po drugie, odczyty funkcjonalne mogą nie być proste dla ładunku będącego przedmiotem zainteresowania, co ogranicza zdolność do szybkiej iteracji i oceny receptur nośników. Podczas gdy można przeprowadzić optymalizację in vitro przy użyciu modelowego ładunku z prostym odczytem funkcjonalnym (na przykład fluorescencją), zmiana ładunku może zmienić odpowiedź biologiczną na carrier⁴, a zatem może nie dać reprezentatywnych wyników. Po trzecie, wiele nośników jest zaprojektowanych do interakcji z określonym typem komórek i bycia przez nie wchłanianymi. Taka zdolność przewoźnika do namierzania może i powinna być odróżniana od skuteczności jego terapeutycznego namierzania słupków ładunkowych. Kontynuując przykład LNP, ładunek RNA może być niezwykle silny, ale jeśli LNP nie jest w stanie związać się z komórką, zostać zinternalizowanym i uwolnić RNA, nie zaobserwuje się żadnego dalszego efektu funkcjonalnego. Może to stanowić problem szczególnie dla nośników przeznaczonych do celowania w trudne do transfekcji typy komórek, takie jak limfocyty T⁵. I odwrotnie, LNP może celować niezwykle skutecznie, ale ładunek RNA może nie działać. Test na dalszym etapie, który mierzy tylko funkcjonalność ładunku, nie będzie w stanie rozróżnić tych dwóch sytuacji, komplikując w ten sposób rozwój i optymalizację systemów dostarczania leków na nośniki.

W tej pracy omawiane jest bezwzględne ilościowe określenie powiązania przewoźnika. Asocjacja to termin odnoszący się do eksperymentalnie zmierzonego stopnia interakcji między nośnikiem a komórką. Asocjacja nie rozróżnia między wiązaniem błony a internalizacją - nośnik może być powiązany, ponieważ jest związany z powierzchnią komórki lub dlatego, że komórka go zinternalizowała. Asocjacja jest zwykle mierzona w ramach eksperymentów inkubacji nośnika komórkowego. Historycznie rzecz biorąc, asocjacja była zgłaszana albo w dowolnych jednostkach fluorescencyjnych (zazwyczaj "mediana intensywności fluorescencji" lub MFI) lub jako "procentowe powiązanie", metryki, których ograniczenia zostały wcześniej omówione⁶. Krótko mówiąc, pomiary te nie są porównywalne między eksperymentami, laboratoriami i nośnikami leków ze względu na różnice w protokołach eksperymentalnych, ustawieniach cytometru przepływowego i intensywności znakowania różnych nośników. Podjęto wysiłki, aby przezwyciężyć ten pierwszy problem poprzez kalibrację cytometru, przekształcając w ten sposób względną miarę MFI w absolutnie ilościową miarę fluorescencji⁷. Jednak metoda ta nie uwzględnia zmienności intensywności etykietowania różnych nośników, a zatem nie pozwala na racjonalne porównanie różnych parametrów nośników w wybranej komórce docelowej⁸.

Tutaj, jak praktycznie przekształcić względne, arbitralne jednostki fluorescencyjne na bezwzględną ilościową metrykę "liczba nośników na komórkę" demonstruje się poprzez przeprowadzenie niewielkiej liczby dodatkowych eksperymentów charakteryzujących. Jeśli pożądana jest inna miara stężenia nośnika (np. masa nośnika na komórkę lub objętość nośnika na komórkę), łatwo jest przeliczyć z nośników na komórkę, pod warunkiem, że przeprowadzono charakterystykę nośnika. Dla zwięzłości i uniknięcia żargonu, słowo "przewoźnik" jest używane w tej pracy w odniesieniu do szerokiego asortymentu konstruktów dostarczania leków. Te techniki kwantyfikacji mają równie duże zastosowanie, niezależnie od tego, czy stosuje się je do nanoinżynieryjnej cząsteczki złota, czy do bakterii poddanych bioinżynierii.

Kilka faktów umożliwia konwersję z dowolnych jednostek fluorescencyjnych na nośniki na komórkę. Po pierwsze, zmierzona intensywność fluorescencji jest proporcjonalna do stężenia fluoroforu⁹ (lub nośnika znakowanego fluorescencyjnie), zakładając, że fluorescencja mieści się w granicach wykrywalności przyrządu, a ustawienia oprzyrządowania są takie same. Tak więc, jeśli znana jest fluorescencja nośnika i fluorescencja próbki, można określić, ile nośników jest obecnych w tej próbce, jeśli wszystkie pomiary zostały wykonane w tych samych ustawieniach i warunkach. Jednak, szczególnie w przypadku mniejszych nośników, pomiar fluorescencji nośnika, autofluorescencji komórek i fluorescencji komórek związanych z nosicielami na tym samym urządzeniu przy tych samych ustawieniach może nie być możliwy. W tym przypadku istnieje drugi wymóg, aby umożliwić konwersję między fluorescencją zmierzoną na jednym urządzeniu a zmierzoną fluorescencją na innym. W tym celu można ustalić standardową krzywą stężenia fluoroforu w celu pomiaru intensywności fluorescencji na obu instrumentach, korzystając z normy Molekuły równoważnego rozpuszczalnego fluorochromu (MESF)⁹. Pozwala to na pomiar fluorescencji nośnika luzem na urządzeniu innym niż cytometr, pomiar, który można wykonać na nośnikach o dowolnej wielkości lub charakterystyce. Gdy takie zbiorcze oznaczanie ilościowe przeprowadza się na zawiesinie nośnika o znanym stężeniu, można ponownie obliczyć liczbę nośników na komórkę próbki.

Podczas gdy ta praca demonstruje proces pomiaru asocjacji nośników (określanej przez zmierzoną intensywność fluorescencji), analogiczny protokół mógłby być przeprowadzony dla innych pomiarów interakcji komórka-nośnik (np. eksperymentalny protokół, który odróżnia nośniki zinternalizowane i związane z błoną). Ponadto protokół ten byłby w dużej mierze taki sam, gdyby asocjacja była mierzona za pomocą testu niefluorescencyjnego (na przykład za pomocą cytometrii masowej).

Protocol

1. Wybór odpowiedniego strumienia

1. Postępuj zgodnie z drzewem decyzyjnym opisanym w Rysunek 1, aby określić najlepszy przepływ pracy (strumień) (Rysunek 2) dla użytej konfiguracji eksperymentalnej. Zapoznaj się z dyskusją, aby uzyskać dalsze komentarze na temat tego wyboru strumienia.
2. Jeśli podążasz za strumieniem cytometru, kontynuuj kroki 2.1.1-2.2.7. Jeśli postępujesz zgodnie ze strumieniem zbiorczym, przejdź do kroków 3.1.1.1-3.1.5.7.

Rysunek 1: Drzewo decyzyjne strumienia pracy. Decyzja o tym, z którego strumienia skorzystać, zależy przede wszystkim od rodzaju zainteresowania. Większe nośniki i nośniki o wysokich właściwościach rozpraszania można łatwiej wykryć pojedynczo na cytometrach, dzięki czemu nadają się do oznaczania ilościowego za pomocą strumienia cytometru. Bulk Stream jest odpowiedni dla wszystkich innych typów przewoźników. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Przegląd strumieni pracy. Ten protokół jest podzielony na dwa różne strumienie. Strumień cytometru wykorzystuje czuły cytometr do liczenia nośników w zawiesinie, mierzenia ich indywidualnej fluorescencji, a następnie określania fluorescencji komórek inkubowanych z nośnikami. Strumień masowy wykorzystuje techniki nieoparte na cytometrii, takie jak analiza śledzenia nanocząstek, do liczenia nośników w zawiesinie. Indywidualna fluorescencja nośnika jest następnie oznaczana ilościowo za pomocą czytnika mikropłytek lub spektrofluorometru. Stosowanie cytometru przepływowego jest zatem ograniczone do pomiaru końcowej fluorescencji komórek inkubowanych z nośnikami, pomiaru, który można wykonać na szerszym zakresie cytometrów i który jest niezależny od zastosowanego typu nośnika. Skróty: MESF = cząsteczki równoważnego rozpuszczalnego fluorochromu; MFI = mediana intensywności fluorescencji. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

2. Strumień cytometru

1. Liczenie przewoźników
   UWAGA: Do tego pomiaru można użyć dowolnego cytometru przepływowego, pod warunkiem, że znane jest natężenie przepływu (μL/s). Jeśli natężenie przepływu jest nieznane i nie można go określić, nie wykonuj tego kroku. Zamiast tego przejdź do kroku 3.1. Liczenie nośników w zawiesinie pozwala na dokładne i powtarzalne określenie liczby nośników inkubowanych w każdym eksperymencie komórkowym.
   1. Ustaw cytometr do wykrywania nośników, zarówno za pomocą kanału rozpraszania optycznego (zwykle rozpraszania bocznego [SSC]), jak i fluorescencji. Upewnij się, że ustawiłeś próg, aby umożliwić wykrywanie carriers.
      UWAGA: Iteracja przez różne kanały rozpraszania optycznego może być wymagana, jeśli SSC nie zapewnia wyraźnego sygnału (np. rozproszenie do przodu [FSC]).
   2. Uruchom próbkę zawierającą tylko rozcieńczalnik, aby określić ilościowo liczbę zdarzeń tła zarówno w kanale SSC, jak i fluorescencyjnym.
      UWAGA: Idealna liczba zdarzeń w tle to <100 zdarzeń/s.
   3. Przygotować nośniki do cytometrii przepływowej.
      1. Upewnij się, że nośniki są dobrze zawieszone przez wirowanie lub sonikację, w zależności od zaangażowanego systemu nośnego.
      2. Jeśli to możliwe, upewnij się, że stężenie nośnika mieści się w przedziale od 1 000 nośników/μl do 10 000 nośników/μl. Liczba zdarzeń o jeden lub dwa rzędy wielkości większa niż tło to dobry początek. Jeśli rząd wielkości stężenia nośnika nie jest znany, dobrym początkiem jest przygotowanie rozcieńczenia 1:1 000 z wywaru. Wykorzystaj wstępne wyniki jako informacje zwrotne do informacji o przyszłych rozcieńczeniach próbek.
         UWAGA: Mętna zawiesina jest na ogół zbyt skoncentrowana.
   4. Załaduj pierwszą próbkę nośnika do cytometru i rozpocznij nagrywanie.
   5. Porównaj liczbę zdarzeń wynikającą zarówno z kanału SSC, jak i kanału fluorescencji; powinny one być w przybliżeniu równe (różnica <10%). Jeśli nie, sprawdź ustawienia cytometru, np. ustawienia lampy fotopowielacza (PMT) i natężenie lasera dla kanału fluorescencyjnego. Alternatywnie można użyć innych metod, takich jak mikroskopia konfokalna, aby sprawdzić, czy fluorescencyjne znakowanie nośników jest obecne i jednolite.
   6. Powtórzyć kroki 2.1.3-2.1.5 dodatkowe dwa lub więcej razy, stosując różne rozcieńczenia z podstawy. Upewnij się, że liczba zdarzeń w każdej próbce jest co najmniej o jeden rząd wielkości wyższa niż liczba zdarzeń w tle.
   7. Sprawdzić, czy trzy lub więcej próbek wykazuje tendencję liniową, to znaczy, że dwukrotne rozcieńczenie próbki powinno skutkować odpowiednim dwukrotnym zmniejszeniem zmierzonego stężenia nośnika.
   8. Użyć próbek w zakresie liniowym, odpowiadających im współczynników rozcieńczenia i znanego natężenia przepływu cytometru, aby obliczyć stężenie nośnika podstawowego zgodnie z równaniem (1):
      (1)
      gdzie C jest stężeniem nośnika w nośnikach/ml. Zaleca się stosowanie liczby zdarzeń pochodzącej z detekcji rozpraszania optycznego, a nie fluorescencji.
2. Odczyt cytometrii przepływowej z eksperymentu z komórką nośną, w tym określenie intensywności fluorescencji na nośnik
   UWAGA: Idealnie byłoby, gdyby intensywność fluorescencji na nośnik została określona jak najbliżej eksperymentu z komórką nośną. Ma to na celu zapewnienie, aby MIF uzyskane dla poszczególnych przewoźników mogły być bezpośrednio porównane z MIF komórek powiązanych z tymi przewoźnikami. W praktyce cytometr zwykle generuje podobne wyniki, gdy jest używany w kolejnych dniach przy użyciu tych samych napięć PMT, ale nie można tego zagwarantować.
   1. Zaprojektuj eksperyment z komórką nośną. Należy użyć stężenia nośnika określonego w kroku 2.1, aby podać żądaną dawkę nośników.
   2. Skonfiguruj cytometr przepływowy do końcowego eksperymentu z komórką nośną, określając optymalne ustawienia napięcia PMT w odpowiednich kanałach. Ustaw progi, aby umożliwić wykrywanie przewoźnika.
   3. Uruchom nośniki w zawieszeniu, aby określić intensywność fluorescencji na nośnik przy bieżących ustawieniach PMT.
   4. W razie potrzeby zmień progi cytometru, aby wykryć komórki, a nie nośniki.
   5. Uruchom próbkę kontroli ujemnej - komórki nie inkubowane z nośnikami - w celu określenia fluorescencji tła (autofluorescencji) komórek.
   6. Uruchom próbki komórek nośnych, aby określić intensywność fluorescencji na komórkę. Ta fluorescencja jest liniowym połączeniem autofluorescencji komórkowej i obecności nośników fluorescencyjnych.
   7. Oblicz liczbę nośników w komórce, korzystając z następującego równania (2):
      (2)
      gdzie P_assoc jest liczbą nośników związanych na komórkę, _komórka FI jest MIF komórek inkubowanych z nośnikami, _tło FI jest MIF komórek nieinkubowanych z nośnikami, a _{FI nosiciel} jest MIF nośników w zawieszeniu.

3. Strumień masowy

1. Zliczanie nośników: analiza śledzenia nanocząstek
   UWAGA: W strumieniu masowym liczenie nośników jest niezbędnym krokiem do ilościowego określenia bezwzględnej intensywności fluorescencji na nośnik (patrz krok 3.1.4). Ponadto liczenie nośników w zawiesinie pozwala na dokładne i powtarzalne określenie liczby nośników inkubowanych w każdym eksperymencie komórkowym.
   1. preparat
      1. Zamontuj celę przepływową na module laserowym i zablokuj cały moduł laserowy na miejscu wewnątrz przyrządu.
      2. Powoli (nie szybciej niż 0,1 ml/s) przepłukać komorę przepływową ~1 ml wody destylowanej. Jeśli w komorze przepływowej tworzą się pęcherzyki, przed kontynuowaniem należy częściowo wycofać zawiesinę, aby połączyć pęcherzyk z interfejsem powietrze-ciecz.
      3. Uruchom aparat mniej więcej w połowie spłukiwania; upewnij się, że resztki nośnika są wypłukane. Wybierz opcję Przechwyć, aby otworzyć kartę Ustawienia przechwytywania, a następnie kliknij przycisk Uruchom kamerę.
      4. Osuszyć system 1 ml powietrza. Jeśli na ekranie widoczne są jakiekolwiek nośniki statyczne, wyczyść komorę przepływową zgodnie z instrukcjami producenta.
      5. Przygotuj nośniki do analizy śledzenia nanocząstek, upewniając się, że nośniki są dobrze zawieszone poprzez wirowanie lub sonikację, w zależności od zaangażowanego systemu nośnego. Jeśli rząd wielkości stężenia podstawowego jest nieznany, należy przygotować rozcieńczenie 1:100 z podstawowego roztworu i wykorzystać początkowe wyniki jako informacje zwrotne do przyszłych rozcieńczeń próbki. Rozcieńczyć nośniki w wodzie, a nie w soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS), aby przygotować co najmniej ~0,6-1 ml każdej próbki o stężeniu nośnika między 1 × 10⁷ nośników/ml i 1 × 10⁹ nośników/ml.
         UWAGA: Mętna zawiesina jest na ogół zbyt skoncentrowana. i sole mogą generować wysoki poziom szumu tła.
   2. pomiar
      1. Wyjmij moduł laserowy i ustaw go pionowo.
      2. Pobrać pierwszą próbkę nośnika do strzykawki o pojemności 1 ml. Podłączyć strzykawkę do wlotu rurki i ostrożnie załadować próbkę do komory przepływowej. Jeśli w komorze przepływowej tworzą się pęcherzyki, przed kontynuowaniem należy częściowo wycofać zawiesinę, aby połączyć pęcherzyk z interfejsem powietrze-ciecz. Upewnij się, że cała komórka przepływowa jest wypełniona cieczą, a następnie wstrzymaj się.
      3. W razie potrzeby dostosuj ostrość kamery, aby zobrazować poszczególnych przewoźników. Dokonaj zgrubnej regulacji ostrości za pomocą pokrętła po prawej stronie instrumentu. Dokonaj dokładniejszych korekt, wybierając kartę Sprzęt | Pompy/Etap. Zmień fokus, dostosowując suwak Fokus.
      4. Dostosuj poziom kamery, aby upewnić się, że nie ma przesycenia. Na karcie Przechwytywanie wybierz optymalny poziom kamery, dostosowując suwak.
      5. Jeśli przyrząd jest wyposażony w to akcesorium, załaduj strzykawkę zawierającą próbkę nośną do pompy strzykawkowej, aby zapewnić ciągły przepływ próbki podczas pomiarów.
      6. Na karcie SOP wybierz opcję Pomiar standardowy, aby wykonać pięć ujęć po 30 s każde. Wprowadź podstawową nazwę pliku i, jeśli to konieczne, dodaj dodatkowe informacje o próbce, klikając przycisk Zaawansowane (który otwiera modalne okno dialogowe z różnymi opcjami).
         UWAGA: Jeśli wprowadzony zostanie współczynnik rozcieńczenia, końcowy pomiar stężenia nośnika zostanie automatycznie dostosowany przez oprogramowanie. Wprowadzanie tego czynnika jest odradzane. Zamiast tego należy przeprowadzić regulację ręcznie, co ułatwia analizę i pozwala ocenić, czy każde rozcieńczenie mieści się w zakresie dynamicznym przyrządu (krok 3.1.3.4).
      7. Naciśnij Utwórz i uruchom skrypt i poczekaj, aż pojawi się wyskakujące okienko z prośbą o przekazanie próbki.
      8. Jeśli używasz pompy strzykawkowej, wybierz kartę Sprzęt | Zakładka Pompa strzykawkowa | ustawić szybkość infuzji na 30-80 i nacisnąć przycisk Zaparzanie. Jeśli nie używasz pompy strzykawkowej, ręcznie przesuń próbkę.
      9. W wyskakującym okienku wybierz przycisk OK, aby rozpocząć przechwytywanie. Po każdym z pięciu przechwyceń, gdy ponownie pojawi się wyskakujące okienko Proszę przesunąć próbkę, sprawdź, czy próbka nadal przepływa przez komórkę przepływową, ręcznie lub za pomocą pompy strzykawkowej. Następnie wybierz przycisk OK, aby kontynuować następne przechwytywanie.
         UWAGA: Po pięciu przechwyceniach oprogramowanie automatycznie otwiera kartę Proces i otwiera wyskakujące okienko z prośbą o dostosowanie ustawień procesu.
   3. analiza
      1. Na karcie Proces dostosuj suwak Próg wykrywania (od 4 do 8), aby poprawnie zidentyfikować odrębne nośniki widoczne na ekranie. Dostosuj również wzmocnienie ekranu, aby ułatwić wizualizację; Nie będzie to miało wpływu na dalszą analizę. Użyj suwaka pod ekranem przechwytywania, aby przewijać wiele klatek wideo, aby ułatwić ustawienie progu wykrywania.
         UWAGA: Próg wykrywalności należy ustawić jeden raz, a następnie nie należy go zmieniać między pomiarami lub próbkami.
      2. W wyskakującym okienku (uwaga po kroku 3.1.2.9) naciśnij OK, aby rozpocząć analizę śledzenia. Monitoruj postęp analizy, klikając w zakładkę Analiza | Pojedyncza karta Analiza.
      3. Po zakończeniu analizy poszukaj monitu Ustawienia eksportu, w którym domyślnie powinny być zaznaczone opcje Dołącz PDF i Dołącz podsumowanie eksperymentu. Wybierz dowolne inne formaty eksportu zgodnie z potrzebami.
      4. W sekcji Wyniki eksportu danych PDF, aby upewnić się, że zmierzone stężenie jest wiarygodne, sprawdź, czy zmierzone stężenie nośnika mieści się w zakresie od 1 × 10⁷ nośników/ml do 1 ×^{10 9} nośników/ml - zakresu dynamicznego przyrządu - i sprawdź, czy pod wynikiem pomiaru stężenia nie ma żadnych komunikatów o błędach lub komunikatów ostrzegawczych.
      5. Powtórzyć kroki 3.1.2.1-3.1.3.4 dwa lub więcej razy, rozcieńczając je różnymi roztworami z podstawy. Upewnij się, że stężenie każdej próbki mieści się w zakresie liniowym przyrządu.
      6. Należy wybrać trzy lub więcej próbek, które wykazują tendencję liniową, to znaczy dwukrotne rozcieńczenie próbki powinno skutkować odpowiednim dwukrotnym zmniejszeniem mierzonego stężenia nośnika. Użyć wybranych próbek i odpowiadających im współczynników rozcieńczenia, aby obliczyć stężenie nośnika podstawowego.
   4. Oznaczanie bezwzględnej intensywności fluorescencji na nośnik
      UWAGA: Ponieważ fluorescencji poszczególnych nośników w tym strumieniu nie można bezpośrednio scharakteryzować, intensywność fluorescencji jest określana ilościowo zbiorczo. Metoda ta opiera się na fakcie, że intensywność fluorescencji jest liniowo związana ze stężeniem fluorochromu zgodnie z prawem Lamberta-Beera. Gdy taka masowa kwantyfikacja nośników w zawiesinie jest przeprowadzana na zawiesinie o znanym stężeniu nośnika (patrz krok 3.1), można uzyskać fluorescencję na nośnik. Ten krok można wykonać na czytniku płytek fluorescencyjnych lub spektrofluorometrze. Intensywność fluorescencji porównuje się z krzywą wzorcową próbek o znanej fluorescencji bezwzględnej, wyrażoną w liczbie MESF.
      1. Do oznaczenia nośnika należy użyć roztworu wolnego fluorochromu: ponownie zawiesić barwnik w odpowiednim buforze (np. DMSO) i przeprowadzić dalsze rozcieńczenia w tym samym buforze, co rozcieńczalnik nośnika. Alternatywnie można użyć roztworu przeciwciała sprzężonego z fluorochromem. Obliczyć stężenie roztworu podstawowego (MESF/ml) na podstawie stężenia w mg/ml, masy cząsteczkowej w mg/mol i liczby Avogadro za pomocą równania (3). Wykonać seryjne rozcieńczanie w rozcieńczalniku nośnikowym, aby wygenerować próbki o krzywej wzorcowej.
         (3)
         UWAGA: Przeciwciało sprzężone z fluorochromem należy stosować tylko wtedy, gdy znany jest stopień znakowania, tj. stosunek molowy między fluorochromem a przeciwciałem w roztworze. Początkowo należy wygenerować krzywą wzorcową o szerokim zakresie, ponieważ intensywność fluorescencji próbki nośnika jest nadal nieznana. W tym miejscu zawęź go, aby uwzględnić wymagany zakres.
      2. Przygotuj próbki nośników.
         UWAGA: Najlepszą praktyką jest przetestowanie dwóch lub więcej rozcieńczeń nośnika w celu sprawdzenia, czy pomiary są liniowe i mieszczą się w zakresie krzywej standardowej.
      3. Zmierzyć fluorescencję równych objętości każdej próbki, tj. zarówno krzywej nośnej, jak i wzorcowej.
      4. Wygeneruj krzywą wzorcową i odejmij bezwzględną intensywność fluorescencji objętości w MESF/ml dla mierzonych próbek nośników.
      5. Obliczyć bezwzględną intensywność fluorescencji na nośnik (MESF/nośnik), dzieląc fluorescencję objętościową (MESF/ml) przez stężenie nośnika (nośniki/ml), jak w równaniu (4):
         (4)
   5. Doświadczenie z komórkami (łącznie z określeniem równoważnej intensywności fluorescencji na nośnik)
      UWAGA: Na tym etapie kulki kwantymetryczne cytometrii przepływowej są używane do generowania standardowej krzywej zależności między MESF i MFI. Te kulki ilościowe składają się z wielu populacji kulek o znanej liczbie MESF na koralik, a te pojedyncze kulki można wykryć za pomocą dowolnego cytometru. Idealnie byłoby, gdyby krzywa wzorcowa MESF była określana w tym samym czasie, co odczyt eksperymentów z komórkami nośnymi. Ma to na celu zapewnienie, aby wartości MIF obliczone dla poszczególnych przewoźników mogły być bezpośrednio porównane z MIF komórek powiązanych z przewoźnikami. W praktyce cytometr zwykle generuje podobne wyniki, gdy jest używany w kolejnych dniach przy użyciu tych samych napięć PMT, ale nie można tego zagwarantować.
      1. Zaprojektuj eksperyment z komórką nośną. Użyć stężenia nośnika określonego w punkcie 3.1.3 w celu podania żądanej dawki nośników.
      2. Skonfiguruj cytometr przepływowy do końcowego eksperymentu z komórką nośną, określając optymalne ustawienia napięcia PMT w odpowiednich kanałach.
      3. Uruchom ujemną próbkę kontrolną, to znaczy komórki nieinkubowane z nośnikami, aby określić fluorescencję tła.
      4. Przygotować i ponownie zawiesić kulki do oznaczania ilościowego cytometrii przepływowej. Należy użyć tego samego buforu, który jest używany do próbek komórek (np. PBS). Jeśli populacje ściegów są podane osobno, połącz je ze sobą.
      5. Uruchomić próbkę kulkową cytometrii przepływowej.
      6. Uruchom próbki komórek nośnych, aby określić intensywność fluorescencji na komórkę.
      7. Użyj próbki kulki ilościowej, aby wygenerować krzywą standardową przeliczającą bezwzględną intensywność fluorescencji (MESF) na MFI. Tę krzywą standardową oraz wyniki z kroku 3.1.4 należy wykorzystać do obliczenia teoretycznej MIF przewoźników. Oblicz liczbę nośników w komórce, korzystając z równania (5):
         (5)
         Gdzie P_assoc jest liczbą nośników związanych z komórką, _komórka FI jest MIF komórek inkubowanych z nośnikami, _tło FI jest MIF komórek nieinkubowanych z nosicielami, a _{FI nosicielstwo} jest obliczoną MIF nosicieli w zawieszeniu (etap 3.1.4).

Results

Jak omówiono wcześniej, różne typy nośników leków wymagają użycia różnych technik do bezwzględnej kwantyfikacji asocjacji komórka-nosiciel. Na przykład stabilizowane dwusiarczkiem cząstki rdzenia poli(kwasu metakrylowego) (_{PMA SH)} o długości fali 633 nm są wystarczająco duże i gęste, aby można je było wykryć za pomocą czułego cytometru przepływowego. W związku z tym cząstki te zostały oznaczone fluorescencyjnie, a następnie bramkowane i zliczone za pomocą rozpraszania światła pod kątem bocznym (SALS, analogicz...

Discussion

Scharakteryzowanie interakcji między nośnikami leków a komórkami staje się coraz ważniejsze w opracowywaniu nowych systemów dostarczania leków. W szczególności, aby umożliwić racjonalną ocenę i porównanie różnych konstruktów nośników, kluczowe znaczenie ma bezwzględna kwantyfikacja wydajności wspomnianego nośnika w interakcji z komórkami docelowymi i niedocelowymi. Protokół ten opisuje dwustrumieniową metodologię, która pozwala każdemu badaczowi pracującemu z nośnikiem leku przekształcić względne, półilościowe dane cytom...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 647 C2 Maleimide	Invitrogen	A20347	Barwnik stabilny pod względem pH stosowany do znakowania nośników PMA150 nm, 235 nm lub 633 nm PMASH; Przykład dobrego barwnika do stosowania w badaniach asocjacyjnych nośników komórkowych
Apogee A50 Microflow	Apogee		Czuły cytometr przepływowy zdolny do wykrywania małych nośników do liczenia
Cytometr przepływowy CytoFLEX S	Beckman Coulter		Czuły cytometr przepływowy zdolny do wykrywania małych nośników do liczenia i odczytywania do końcowych eksperymentów z barierą komórkową Oprogramowanie
FCS Express	De Novo Oprogramowanie		służące do analizy danych cytometrii przepływowej, tj. wykonywania bramkowania i wyznaczania średnich wartości intensywności fluorescencji wybranych populacji. Alternatywy obejmują FlowJo, OMIQ, Python
Infinite 200 PRO	Tecan Lifesciences		Standardowy czytnik mikropłytek używany do masowych pomiarów fluorescencji nośników w roztworze
LSRFortessa Cell Analyzer	BD Biosciences		Mniej czuły cytometr przepływowy, ale bardziej ogólnie dostępny dla badaczy. Może być używany do odczytu końcowego eksperymentu z nośnikiem komórkowym
NanoSight NS300	Malvern Panalytical		Instrument używany do analizy śledzenia nanocząstek
Prism 8	GraphPad		Oprogramowanie służące do tworzenia wykresów i obliczania krzywych standardowych. Alternatywy obejmują między innymi Microsoft Excel, Origin, Minitab, Python Zestawy
Quantum MESF, Alexa Fluor 647	Bangs Laboratories	647	Absolutne kulki ilościowe do cytometrii przepływowej. Służy do przeliczania intensywności fluorescencji mierzonej masowo na czytniku mikropłytek na intensywności fluorescencji mierzonej na cytometrze przepływowym przy użyciu wzorca MESF