Artykuł metodologiczny

Eksperymentalna kwantyfikacja interakcji między systemami dostarczania leków a komórkami in vitro: przewodnik po przedklinicznej ocenie nanomedycyny

2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/64259

⸱

28 września 2022

 ,  ,  ,  , 
1Department of Microbiology and Immunology, The University of Melbourne at the Peter Doherty Institute for Infection and Immunity, 2Department of Infectious Diseases, The University of Melbourne at the Peter Doherty Institute for Infection and Immunity, 3Victorian Infectious Diseases Service, Royal Melbourne Hospital at the Peter Doherty Institute for Infection and Immunity, 4Department of Infectious Diseases, Alfred Hospital and Monash University, 5Department of Chemical Engineering, The University of Melbourne, 6Department of Biomedical Engineering, The University of Melbourne

W tym artykule

Podsumowanie

Pokazano przepływ pracy do bezwzględnej kwantyfikacji interakcji nośnik leku z komórką za pomocą cytometrii przepływowej, aby umożliwić lepszą racjonalną ocenę nowych systemów dostarczania leków. Ten przepływ pracy ma zastosowanie do nośników leków dowolnego typu.

Streszczenie

Głównym elementem projektowania systemów dostarczania leków jest sposób wzmacniania lub tłumienia interakcji z określonymi typami komórek. Na przykład chemioterapeutyk może być funkcjonalizowany przeciwciałem w celu zwiększenia wiązania z komórkami rakowymi ("celowanie") lub funkcjonalizowany glikolem polietylenowym, aby uniknąć rozpoznania komórek odpornościowych ("podstęp"). Nawet na poziomie komórkowym optymalizacja wiązania i wychwytu nośnika leku jest złożonym problemem projektowania biologicznego. W związku z tym cenne jest oddzielenie tego, jak silnie nowy przewoźnik oddziałuje z komórką, od skuteczności funkcjonalnej ładunku przewoźnika po dostarczeniu do tej komórki.

Kontynuując przykład z chemioterapeutyką, "jak dobrze wiąże się z komórką rakową" jest oddzielnym problemem od "jak dobrze zabija komórkę rakową". Ilościowe testy in vitro dla tych ostatnich są dobrze ugruntowane i zwykle opierają się na pomiarze żywotności. Jednak większość opublikowanych badań nad interakcjami komórka-nośnik ma charakter jakościowy lub półilościowy. Ogólnie rzecz biorąc, pomiary te opierają się na znakowaniu fluorescencyjnym nośnika, a w konsekwencji raportują interakcje z komórkami w jednostkach względnych lub dowolnych. Jednak praca ta może być ustandaryzowana i może być całkowicie ilościowa przy niewielkiej liczbie eksperymentów charakteryzujących. Taka bezwzględna kwantyfikacja jest cenna, ponieważ ułatwia racjonalne, między- i wewnątrzklasowe porównania różnych systemów dostarczania leków – nanocząstek, mikrocząstek, wirusów, koniugatów przeciwciało-lek, zmodyfikowanych komórek terapeutycznych lub pęcherzyków zewnątrzkomórkowych.

Ponadto, kwantyfikacja jest warunkiem wstępnym dla kolejnych metaanaliz lub podejść do modelowania in silico. W tym artykule przedstawiono przewodniki wideo, a także drzewo decyzyjne dotyczące sposobu osiągnięcia kwantyfikacji in vitro dla systemów dostarczania leków na nośniki, które uwzględniają różnice w wielkości nośnika i modalności znakowania. Ponadto omówiono dalsze rozważania dotyczące oceny ilościowej zaawansowanych systemów dostarczania leków. Ma to służyć jako cenne źródło informacji na temat poprawy racjonalnej oceny i projektowania leków nowej generacji.

Wprowadzenie

Projektowanie konstruktów dostarczających leki, które wykazują specyficzne, zaprojektowane zachowanie w zależności od typu komórek, z którymi się zetkną, wzbudziło duże zainteresowanie badawcze. Potencjalne konstrukty lub "nośniki" dostarczania leków obejmują preparaty lipidowe, nanohodowane substancje nieorganiczne, zespoły polimerowe, pęcherzyki zewnątrzkomórkowe, funkcjonalizowane komórki bakteryjne lub zmodyfikowane wirusy. Wszystkie te czynniki mogą wykazywać specyficzność narządów, tkanek lub komórek ze względu na właściwości fizyczne, właściwości powierzchni lub zmodyfikowane funkcjonalne funkcje chemiczne, takie jak przyłączanie przeciwciał1,2.

Prawie powszechnym krokiem w ocenie nośnika in vitro jest inkubacja komórek z zawiesiną zawierającą wspomniany nośnik naładowany lekiem. Po inkubacji wydajność nośnika mierzy się za pomocą funkcjonalnego odczytu wydajności ładunku leku, na przykład skuteczności transfekcji lub toksyczności. Odczyty funkcjonalne są przydatne, ponieważ są dalszą miarą efektywności nośnika. Jednak w przypadku bardziej złożonych konstruktów dostarczania leków coraz ważniejsze staje się wyjście poza odczyty funkcjonalne i oddzielne określenie ilościowe stopnia interakcji nośnika z komórką będącą przedmiotem zainteresowania. Jest ku temu kilka powodów.

Po pierwsze, rośnie zainteresowanie odkrywaniem (i iteracyjnym ulepszaniem) technologii przewoźników "platformowych", które mogą przewozić różne ładunki. Na przykład nanocząstki lipidowe (LNP) zaprojektowane do enkapsulacji RNA mogą wymieniać jedną sekwencję RNA na inną z kilkoma zastrzeżeniami3. W związku z tym, aby iteracyjnie ulepszać technologię nośnika, kluczowe znaczenie ma ilościowe określenie jej wydajności niezależnie od funkcjonalności ładunku. Po drugie, odczyty funkcjonalne mogą nie być proste dla ładunku będącego przedmiotem zainteresowania, co ogranicza zdolność do szybkiej iteracji i oceny receptur nośników. Podczas gdy można przeprowadzić optymalizację in vitro przy użyciu modelowego ładunku z prostym odczytem funkcjonalnym (na przykład fluorescencją), zmiana ładunku może zmienić odpowiedź biologiczną na carrier4, a zatem może nie dać reprezentatywnych wyników. Po trzecie, wiele nośników jest zaprojektowanych do interakcji z określonym typem komórek i bycia przez nie wchłanianymi. Taka zdolność przewoźnika do namierzania może i powinna być odróżniana od skuteczności jego terapeutycznego namierzania słupków ładunkowych. Kontynuując przykład LNP, ładunek RNA może być niezwykle silny, ale jeśli LNP nie jest w stanie związać się z komórką, zostać zinternalizowanym i uwolnić RNA, nie zaobserwuje się żadnego dalszego efektu funkcjonalnego. Może to stanowić problem szczególnie dla nośników przeznaczonych do celowania w trudne do transfekcji typy komórek, takie jak limfocyty T5. I odwrotnie, LNP może celować niezwykle skutecznie, ale ładunek RNA może nie działać. Test na dalszym etapie, który mierzy tylko funkcjonalność ładunku, nie będzie w stanie rozróżnić tych dwóch sytuacji, komplikując w ten sposób rozwój i optymalizację systemów dostarczania leków na nośniki.

W tej pracy omawiane jest bezwzględne ilościowe określenie powiązania przewoźnika. Asocjacja to termin odnoszący się do eksperymentalnie zmierzonego stopnia interakcji między nośnikiem a komórką. Asocjacja nie rozróżnia między wiązaniem błony a internalizacją - nośnik może być powiązany, ponieważ jest związany z powierzchnią komórki lub dlatego, że komórka go zinternalizowała. Asocjacja jest zwykle mierzona w ramach eksperymentów inkubacji nośnika komórkowego. Historycznie rzecz biorąc, asocjacja była zgłaszana albo w dowolnych jednostkach fluorescencyjnych (zazwyczaj "mediana intensywności fluorescencji" lub MFI) lub jako "procentowe powiązanie", metryki, których ograniczenia zostały wcześniej omówione6. Krótko mówiąc, pomiary te nie są porównywalne między eksperymentami, laboratoriami i nośnikami leków ze względu na różnice w protokołach eksperymentalnych, ustawieniach cytometru przepływowego i intensywności znakowania różnych nośników. Podjęto wysiłki, aby przezwyciężyć ten pierwszy problem poprzez kalibrację cytometru, przekształcając w ten sposób względną miarę MFI w absolutnie ilościową miarę fluorescencji7. Jednak metoda ta nie uwzględnia zmienności intensywności etykietowania różnych nośników, a zatem nie pozwala na racjonalne porównanie różnych parametrów nośników w wybranej komórce docelowej8.

Tutaj, jak praktycznie przekształcić względne, arbitralne jednostki fluorescencyjne na bezwzględną ilościową metrykę "liczba nośników na komórkę" demonstruje się poprzez przeprowadzenie niewielkiej liczby dodatkowych eksperymentów charakteryzujących. Jeśli pożądana jest inna miara stężenia nośnika (np. masa nośnika na komórkę lub objętość nośnika na komórkę), łatwo jest przeliczyć z nośników na komórkę, pod warunkiem, że przeprowadzono charakterystykę nośnika. Dla zwięzłości i uniknięcia żargonu, słowo "przewoźnik" jest używane w tej pracy w odniesieniu do szerokiego asortymentu konstruktów dostarczania leków. Te techniki kwantyfikacji mają równie duże zastosowanie, niezależnie od tego, czy stosuje się je do nanoinżynieryjnej cząsteczki złota, czy do bakterii poddanych bioinżynierii.

Kilka faktów umożliwia konwersję z dowolnych jednostek fluorescencyjnych na nośniki na komórkę. Po pierwsze, zmierzona intensywność fluorescencji jest proporcjonalna do stężenia fluoroforu9 (lub nośnika znakowanego fluorescencyjnie), zakładając, że fluorescencja mieści się w granicach wykrywalności przyrządu, a ustawienia oprzyrządowania są takie same. Tak więc, jeśli znana jest fluorescencja nośnika i fluorescencja próbki, można określić, ile nośników jest obecnych w tej próbce, jeśli wszystkie pomiary zostały wykonane w tych samych ustawieniach i warunkach. Jednak, szczególnie w przypadku mniejszych nośników, pomiar fluorescencji nośnika, autofluorescencji komórek i fluorescencji komórek związanych z nosicielami na tym samym urządzeniu przy tych samych ustawieniach może nie być możliwy. W tym przypadku istnieje drugi wymóg, aby umożliwić konwersję między fluorescencją zmierzoną na jednym urządzeniu a zmierzoną fluorescencją na innym. W tym celu można ustalić standardową krzywą stężenia fluoroforu w celu pomiaru intensywności fluorescencji na obu instrumentach, korzystając z normy Molekuły równoważnego rozpuszczalnego fluorochromu (MESF)9. Pozwala to na pomiar fluorescencji nośnika luzem na urządzeniu innym niż cytometr, pomiar, który można wykonać na nośnikach o dowolnej wielkości lub charakterystyce. Gdy takie zbiorcze oznaczanie ilościowe przeprowadza się na zawiesinie nośnika o znanym stężeniu, można ponownie obliczyć liczbę nośników na komórkę próbki.

Podczas gdy ta praca demonstruje proces pomiaru asocjacji nośników (określanej przez zmierzoną intensywność fluorescencji), analogiczny protokół mógłby być przeprowadzony dla innych pomiarów interakcji komórka-nośnik (np. eksperymentalny protokół, który odróżnia nośniki zinternalizowane i związane z błoną). Ponadto protokół ten byłby w dużej mierze taki sam, gdyby asocjacja była mierzona za pomocą testu niefluorescencyjnego (na przykład za pomocą cytometrii masowej).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Wybór odpowiedniego strumienia

  1. Postępuj zgodnie z drzewem decyzyjnym przedstawionym na Rysunku 1, aby określić optymalny schemat postępowania (strumień) (Rysunek 2) dla zastosowanego układu eksperymentalnego. Szczegółowe uwagi dotyczące wyboru strumienia znajdują się w sekcji dyskusji.
  2. W przypadku wyboru strumienia cytometrycznego należy przejść do kroków 2.1.1-2.2.7. W przypadku wyboru strumienia masowego należy przejść do kroków 3.1.1.1-3.1.5.7.

figure-protocol-1
Rysunek 1: Drzewo decyzyjne wyboru ścieżki analizy. Decyzja o wyborze odpowiedniej ścieżki (Stream) zależy przede wszystkim od rodzaju analizowanego nośnika. Większe nośniki oraz nośniki o wysokich właściwościach rozpraszania mogą być łatwiej wykrywane pojedynczo za pomocą cytometrów, co czyni je odpowiednimi do kwantyfikacji w ramach ścieżki Cytometer Stream. Ścieżka Bulk Stream jest odpowiednia dla wszystkich pozostałych typów nośników. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

figure-protocol-2
Rysunek 2: Przegląd ścieżek badawczych. Niniejszy protokół jest podzielony na dwie różne ścieżki. Ścieżka cytometryczna wykorzystuje czuły cytometr do zliczania nośników w zawiesinie, pomiaru ich indywidualnej fluorescencji, a następnie wyznaczenia fluorescencji komórek inkubowanych z nośnikami. Ścieżka masowa wykorzystuje techniki niezwiązane z cytometrią, takie jak analiza śledzenia nanocząstek (Nanoparticle Tracking Analysis), do zliczania nośników w zawiesinie. Indywidualna fluorescencja nośników jest następnie ilościowo określana przy użyciu czytnika mikropłytek lub spektrofluorometru. Zastosowanie cytometru przepływowego ogranicza się zatem do pomiaru końcowej fluorescencji komórek inkubowanych z nośnikami, co jest pomiarem możliwym do wykonania na szerszym zakresie cytometrów i jest niezależny od rodzaju użytego nośnika. Skróty: MESF = cząsteczki równoważnego rozpuszczalnego fluorochromu; MFI = mediana intensywności fluorescencji. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

2. Strumień cytometru

  1. Liczenie nośników
    UWAGA: Do tego pomiaru można użyć dowolnego cytometru przepływowego, pod warunkiem, że znana jest szybkość przepływu (µL/s). Jeśli szybkość przepływu jest nieznana i nie można jej ustalić, nie należy wykonywać tego kroku. Zamiast tego należy przejść do kroku 3.1. Liczenie nośników w zawiesinie pozwala na dokładne i powtarzalne określenie liczby nośników inkubowanych w każdym eksperymencie komórkowym.
    1. Skonfigurować cytometr tak, aby wykrywał nośniki zarówno w kanale rozpraszania światła (zazwyczaj rozpraszanie boczne [SSC]), jak i w kanale fluorescencji. Należy upewnić się, że próg detekcji został dostosowany w celu umożliwienia wykrywania nośników.
      UWAGA: Jeśli SSC nie daje wyraźnego sygnału, może być konieczne przetestowanie różnych kanałów rozpraszania światła (np. rozpraszanie przednie [FSC]).
    2. Przeprowadzić pomiar próbki zawierającej tylko rozcieńczalnik, aby określić liczbę zdarzeń tła w kanałach SSC i fluorescencji.
      UWAGA: Idealna liczba zdarzeń tła wynosi <10 zdarzeń/s.
    3. Przygotować nośniki do cytometrii przepływowej.
      1. Upewnić się, że nośniki są dobrze zawieszone, stosując mieszanie w vortexie lub sonikację, w zależności od zastosowanego systemu nośników.
      2. Jeśli to możliwe, zapewnić, aby stężenie nośników wynosiło od 1 0 nośników/µL do 10 00 nośników/µL. Dobrym punktem wyjścia jest liczba zdarzeń o jeden lub dwa rzędy wielkości wyższa od tła. Jeśli rząd wielkości stężenia nośników jest nieznany, warto przygotować rozcieńczenie 1:1 0 z roztworu zapasowego. Początkowe wyniki należy wykorzystać jako informację zwrotną do przyszłych rozcieńczeń próbek.
        UWAGA: Mętna zawiesina jest zazwyczaj zbyt skoncentrowana.
    4. Wprowadzić pierwszą próbkę nośników do cytometru i rozpocząć rejestrację.
    5. Porównać liczbę zdarzeń uzyskane w kanałach SSC i fluorescencji; powinny być one w przybliżeniu równe (różnica <10%). W przeciwnym razie należy sprawdzić ustawienia cytometru, np. ustawienia fotopowielacza (PMT) i intensywność lasera dla kanału fluorescencji. Alternatywnie można zastosować inne metody, takie jak mikroskopia konfokalna, aby potwierdzić obecność i jednorodność znakowania fluorescencyjnego nośników.
    6. Powtórzyć kroki 2.1.3–2.1.5 co najmniej dwa razy, stosując różne rozcieńczenia z roztworu zapasowego. Upewnić się, że liczba zdarzeń w każdej próbce jest co najmniej o jeden rząd wielkości wyższa od liczby zdarzeń tła.
    7. Zweryfikować, czy trzy lub więcej próbek wykazuje trend liniowy, co oznacza, że dwukrotne rozcieńczenie próbki powinno skutkować odpowiadającym mu dwukrotnym spadkiem zmierzonego stężenia nośników.
    8. Wykorzystać próbki z zakresu liniowego, odpowiadające czynniki rozcieńczenia oraz znaną szybkość przepływu cytometru, aby obliczyć stężenie zapasowe nośników zgodnie z równaniem (1):
      figure-protocol-3     (1)
      gdzie C to stężenie zapasowe nośników w nośnikach/mL. Zaleca się stosowanie liczby zdarzeń uzyskanej z detekcji rozpraszania światła zamiast fluorescencji.
  2. Odczyt cytometryczny eksperymentu z nośnikami i komórkami, w tym wyznaczanie intensywności fluorescencji na jeden nośnik
    UWAGA: W idealnym przypadku intensywność fluorescencji na jeden nośnik powinna zostać określona jak najbliżej czasowo eksperymentu z nośnikami i komórkami. Ma to na celu zapewnienie, że uzyskane wartości MFI dla poszczególnych nośników będą mogły być bezpośrednio porównane z MFI komórek powiązanych z nośnikami. W praktyce cytometr zazwyczaj generuje podobne wyniki w kolejne dni przy zastosowaniu tych samych napięć PMT, ale nie można tego zagwarantować.
    1. Zaprojektować eksperyment z nośnikami i komórkami. Użyć stężenia nośników wyznaczonego w kroku 2.1, aby podać pożądaną dawkę nośników.
    2. Skonfigurować cytometr przepływowy do końcowego eksperymentu z nośnikami i komórkami, określając optymalne ustawienia napięcia PMT w odpowiednich kanałach. Ustawić progi detekcji tak, aby umożliwić wykrywanie nośników.
    3. Przeprowadzić pomiar nośników w zawiesinie, aby określić intensywność fluorescencji na jeden nośnik przy aktualnych ustawieniach PMT.
    4. W razie potrzeby zmienić progi cytometru, aby wykrywać komórki, a nie nośniki.
    5. Przeprowadzić pomiar próbki kontrolnej negatywnej – komórek nieinkubowanych z nośnikami – aby określić fluorescencję tła (autofluorescencję) komórek.
    6. Przeprowadzić pomiar próbek z nośnikami i komórkami, aby określić intensywność fluorescencji na jedną komórkę. Fluorescencja ta jest liniową kombinacją autofluorescencji komórkowej i obecności fluorescencyjnych nośników.
    7. Obliczyć liczbę nośników na komórkę, korzystając z poniższego równania (2):
      figure-protocol-4     (2)
      gdzie Passoc to liczba nośników powiązanych z jedną komórką, FIcell to MFI komórek inkubowanych z nośnikami, FIbackground to MFI komórek nieinkubowanych z nośnikami, a FIcarrier to MFI nośników w zawiesinie.

3. Strumień masowy

  1. Liczenie nośników: analiza śledzenia nanocząstek
    UWAGA: W przypadku przepływu masowego (Bulk Stream) liczenie nośników jest niezbędnym etapem w celu ilościowego określenia absolutnej intensywności fluorescencji na nośnik (patrz krok 3.1.4). Ponadto liczenie nośników w zawiesinie umożliwia dokładne i powtarzalne ustalenie liczby nośników inkubowanych w każdym eksperymencie komórkowym.
    1. Przygotowanie
      1. Zamocuj ogniwo przepływową na module laserowym i zablokuj cały moduł laserowy wewnątrz urządzenia.
      2. Powoli (z prędkością nieprzekraczającą 0,1 ml/s) przepłucz celę przepływową ok. 1 ml wody destylowanej. Jeśli wewnątrz celi przepływowej utworzą się pęcherzyki powietrza, częściowo wycofaj zawiesinę, aby połączyć pęcherzyk z granicą fazy powietrze-ciecz przed kontynuowaniem procedury.
      3. Uruchom kamerę mniej więcej w połowie procesu płukania; upewnij się, że zanieczyszczenia z nośnika zostały wypłukane. Wybierz Wychwytywanie aby otworzyć Ustawienia rejestracji zakładka i kliknięcie Uruchom kamerę.
      4. Osusz system, przepuszczając 1 ml powietrza. Jeśli na ekranie widoczne są jakiekolwiek statyczne nośniki, wyczyść komorkę przepływową zgodnie z instrukcjami producenta.
      5. Przygotować nośniki do analizy śledzenia nanocząstek (NTA), upewniając się, że nośniki są dobrze zawieszone. poprzez mieszanie na wirówce typu vortex lub sonikacja, w zależności od zastosowanego systemu nośnika. Jeśli rząd wielkości stężenia roztworu zapasu jest nieznany, należy przygotować rozcieńczenie 1:10 z roztworu zapasu i wykorzystać wstępne wyniki jako informację zwrotną przy planowaniu przyszłych rozcieńczeń próbek. Rozcieńczać nośniki w wodzie, a nie w soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS), aby przygotować co najmniej ok. 0,6–1 ml każdej próbki o stężeniu nośnika pomiędzy 1 × 107 nośników/ml oraz 1 × 109 nośników/ml.
        UWAGA: Mętna zawiesina jest zazwyczaj zbyt skoncentrowana. Bufor i sole mogą generować wysoki szum tła.
    2. Pomiar
      1. Wyjmij moduł laserowy i ustaw go w pozycji pionowej.
      2. Nabrać pierwszą próbkę nośnika do strzykawki o objętości 1 ml. Podłączyć strzykawkę do wlotu rurki i ostrożnie wprowadzić próbkę do celi przepływowej. W przypadku powstania pęcherzyków powietrza wewnątrz celi przepływowej, częściowo wycofać zawiesinę, aby połączyć pęcherzyk z granicą fazy powietrze-ciecz, a następnie kontynuować procedurę. Upewnić się, że cała cela przepływowa jest wypełniona cieczą, a następnie przerwać działanie.
      3. W razie potrzeby dostosuj ostrość kamery, aby umożliwić wizualizację poszczególnych nośników. Regulację wstępną ostrości wykonaj za pomocą pokrętła obrotowego znajdującego się po prawej stronie urządzenia. Bardziej precyzyjną regulację wykonaj, wybierając Sprzęt zakładka | Pompy/StółZmień ostrość, regulując Ogniskowanie suwak
      4. Dostosuj poziom kamery, aby upewnić się, że nie występuje przesycenie. W obrębie Przechwytywanie zakładka, wybierz optymalne Poziom kamery poprzez przesuwanie suwaka.
      5. Jeśli instrument jest wyposażony w to akcesorium, należy włożyć strzykawkę zawierającą próbkę nośnika do Pompa strzykawkowa aby zapewnić ciągły przepływ próbek podczas pomiarów.
      6. Pod Standardowa Procedura Operacyjna (SOP) karta, wybierz Standardowy pomiar należy wykonać pięć ujęć po 30 s każde. Zatwierdź. Nazwa pliku bazowego i, w razie potrzeby, dodać dodatkowe informacje o próbce, klikając Zaawansowany przycisk (który otwiera okno dialogowe z wieloma opcjami do wyboru).
        UWAGA: Jeśli wprowadzony zostanie czynnik rozcieńczenia, końcowy pomiar stężenia nośnika zostanie automatycznie skorygowany przez oprogramowanie. Odradza się wprowadzanie tego czynnika. Zamiast tego należy przeprowadzić korektę ręcznie, co ułatwia analizę i pozwala ocenić, czy każde rozcieńczenie mieści się w zakresie dynamicznym urządzenia (krok 3.1.3.4).
      7. Prasa Utwórz i Uruchom skrypt i poczekaj na pojawienie się okna wyskakującego z prośbą o Proszę przesunąć próbkę..
      8. Jeśli używasz pompa strzykawkowa, wybierz Sprzęt zakładka | Pompa strzykawkowa zakładka | ustawić Szybkość infuzji w 30-80 i naciśnij Wprowadzić dożylnieJeśli nie używamy Pompa strzykawkowaprzesuń próbkę ręcznie.
      9. W oknie wyskakującym wybrać Proszę o dostarczenie tekstu źródłowego do tłumaczenia. aby rozpocząć rejestrację. Po każdym z pięciu ujęć, gdy Proszę przesunąć próbkę dalej po ponownym pojawieniu się okna wyskakującego należy sprawdzić, czy próbka nadal przepływa przez komórkę przepływową, albo ręcznie, albo poprzez ten Pompa strzykawkowaNastępnie należy wybrać Proszę podać tekst źródłowy do przetłumaczenia. aby przejść do kolejnego obrazowania.
        UWAGA: Po wykonaniu pięciu przechwyceń oprogramowanie automatycznie otwiera kartę Process i wyświetla okno pop-up z prośbą o dostosowanie ustawień procesu.
    3. Analiza
      1. W Proces zakładka, dostosuj Próg detekcji suwak (pomiędzy 4 i 8) aby prawidłowo zidentyfikować poszczególne nośniki widoczne na ekranie. Dostosuj Wzmocnienie ekranu aby ułatwić wizualizację; nie wpłynie to na analizę końcową. Należy użyć suwaka pod ekranem przechwytywania, aby przejrzeć wiele klatek filmu w celu ułatwienia ustawienia progu detekcji.
        UWAGA: Próg detekcji należy ustawić raz, a następnie nie powinien on być zmieniany pomiędzy pomiarami lub próbkami.
      2. W oknie wyskakującym (uwaga po kroku 3.1.2.9) naciśnij Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia. w celu rozpoczęcia analizy śledzenia. Monitoruj postępy analizy, klikając w Analiza zakładka Pojedyncza analiza tab.
      3. Po zakończeniu analizy należy poszukać Ustawienia eksportu pojawi się monit, w którym Dołącz PDF oraz zawiera Podsumowanie eksperymentu powinny być wybrane domyślnie. Wybierz dowolne inne formaty eksportu zgodnie z potrzebami.
      4. W Wyniki część z Eksport danych do pliku PDFaby zapewnić wiarygodność zmierzonego stężenia, należy zweryfikować, czy zmierzone stężenie nośnika mieści się w zakresie od 1 × 107 nośników/ml i 1 × 109 nośników/ml – zakres dynamiczny urządzenia – oraz sprawdź, czy pod wynikiem pomiaru stężenia nie wyświetlają się komunikaty o błędach lub ostrzeżenia.
      5. Powtórz kroki 3.1.2.1–3.1.3.4 dwa lub więcej razy, stosując różne rozcieńczenia roztworu zapasu. Upewnij się, że stężenie każdej próbki mieści się w zakresie liniowym urządzenia.
      6. Wybierz co najmniej trzy próbki wykazujące trend liniowy, co oznacza, że dwukrotne rozcieńczenie próbki powinno skutkować odpowiadającym mu dwukrotnym spadkiem zmierzonego stężenia nośnika. Wykorzystaj wybrane próbki i odpowiadające im czynniki rozcieńczenia do obliczenia stężenia roztworu zapasu nośnika.
    4. Oznaczanie absolutnej intensywności fluorescencji na nośnik
      UWAGA: Ponieważ fluorescencji poszczególnych nośników w tym strumieniu nie można określić bezpośrednio, intensywność fluorescencji jest mierzona masowo. Metoda ta opiera się na fakcie, że intensywność fluorescencji jest liniowo powiązana z koncentracją fluorochromu zgodnie z prawem Lamberta-Beera. Gdy taka masowa kwantyfikacja nośników w zawiesinie jest przeprowadzana na zawiesinie o znanej koncentracji nośników (patrz krok 3.1), można obliczyć fluorescencję przypadającą na pojedynczy nośnik. Ten etap można zrealizować przy użyciu czytnika płytek fluorescencyjnych lub spektrofluorometru. Intensywność fluorescencji jest porównywana z krzywą wzorcową próbek o znanej absolutnej fluorescencji, wyrażonej w liczbie MESF.
      1. Użyj roztworu wolnego fluorochromu do znakowania nośnika: resuspenduj barwnik w odpowiednim buforze (np. DMSO) i wykonaj dalsze rozcieńczenia w tym samym buforze, który służy jako rozcieńczalnik nośnika. Alternatywnie użyj roztworu przeciwciała sprzężonego z fluorochromem. Oblicz stężenie roztworu zapasowego (MESF/ml) na podstawie stężenia w mg/ml, masy cząsteczkowej w mg/mol oraz liczby Avogadro, korzystając z równania (3). Wykonać rozcieńczenie seryjne w rozcieńczalniku nośnym w celu przygotowania próbek do krzywej wzorcowej.
        figure-protocol-5     (3)
        UWAGA: Przeciwciała koniugowane z fluorochromem należy stosować wyłącznie w przypadku, gdy znany jest stopień znakowania, tzn. stosunek molowy fluorochromu do przeciwciała w roztworze. W pierwszej kolejności należy sporządzić krzywą wzorcową o szerokim zakresie, ponieważ intensywność fluorescencji próbki nośnika jest jeszcze nieznana. Następnie należy zawęzić ten zakres, aby objął on przedział niezbędny do analizy.
      2. Przygotuj próbki nośnikowe.
        UWAGA: Najlepszą praktyką jest przetestowanie dwóch lub więcej rozcieńczeń nośnika w celu potwierdzenia, że pomiary są liniowe i mieszczą się w zakresie krzywej wzorcowej.
      3. Pomiar fluorescencji należy przeprowadzić dla równych objętości każdej próbki, tj. zarówno dla krzywych nośnikowych, jak i wzorcowych.
      4. Wygeneruj krzywą wzorcową i oblicz całkowitą bezwzględną intensywność fluorescencji w MESF/ml dla zmierzonych próbek nośnika.
      5. Oblicz absolutną intensywność fluorescencji na nośnik (MESF/nośnik), dzieląc całkowitą fluorescencję (MESF/ml) przez stężenie nośników (nośniki/ml), zgodnie z równaniem (4):
        figure-protocol-6     (4)
    5. Eksperyment komórkowy (w tym oznaczenie równoważnej intensywności fluorescencji na nośnik)
      UWAGA: Na tym etapie wykorzystuje się koraliki do kwantyfikacji w cytometrii przepływowej w celu wygenerowania krzywej wzorcowej określającej zależność między MESF a MFI. Koraliki te składają się z wielu populacji koralików o znanej liczbie MESF na koralik, a poszczególne koraliki mogą być wykrywane przez każdy cytometr. W idealnych warunkach krzywa wzorcowa MESF jest wyznaczana w tym samym czasie, co odczyt z eksperymentów z komórkami nośnikowymi. Ma to na celu zapewnienie, że wartości MFI obliczone dla poszczególnych nośników mogą być bezpośrednio porównane z MFI komórek związanych z nośnikami. W praktyce cytometr zazwyczaj generuje podobne wyniki podczas pomiarów wykonywanych w kolejne dni przy zastosowaniu tych samych napięć PMT, jednak nie można tego zagwarantować.
      1. Zaprojektuj eksperyment z wykorzystaniem komórek nośnikowych. Użyj stężenia nośnika określonego w sekcji 3.1.3, aby podać pożądaną dawkę nośników.
      2. Skonfiguruj cytometr przepływowy do końcowego eksperymentu z komórkami nośnikowymi, określając optymalne ustawienia napięcia PMT w odpowiednich kanałach.
      3. Przeprowadź analizę próbki kontrolnej ujemnej, czyli komórek nieinkubowanych z nośnikami, aby określić poziom fluorescencji tła.
      4. Przygotować i resuspender kuleczki do kwantyfikacji w cytometrii przepływowej. Należy użyć tego samego buforu, który był stosowany dla próbek komórek (np. PBS). Jeśli populacje kuleczek dostarczono oddzielnie, należy je połączyć.
      5. Przeprowadź analizę próbki z kuleczkami do kwantyfikacji w cytometrii przepływowej.
      6. Przeanalizuj próbki komórek nośnych w celu oznaczenia intensywności fluorescencji na pojedynczą komórkę.
      7. Użyj próbki kulek do kwantyfikacji, aby wygenerować krzywą wzorcową przeliczającą bezwzględną intensywność fluorescencji (MESF) na MFI. Wykorzystaj tę krzywą wzorcową oraz wyniki z kroku 3.1.4, aby obliczyć teoretyczne MFI nośników. Oblicz liczbę nośników na komórkę, korzystając z równania (5):
        figure-protocol-7     (5)
        Gdzie Ppowiązania czy liczba przenośników związanych z komórką, FIkomórka jest MFI komórek inkubowanych z nośnikami, FIWstęp jest to średnia intensywność fluorescencji (MFI) komórek nieinkubowanych z nośnikami, a FInośnik jest obliczona wartość MFI nośników w zawiesinie (krok 3.1.4).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Jak omówiono wcześniej, różne rodzaje nośników leków wymagają zastosowania różnych technik do absolutnego ilościowego oznaczenia asocjacji komórka-nośnik. Na przykład cząstki rdzeń-powłoka z poli(kwasu metakrylowego) stabilizowanego wiązaniami disiarczkowymi (PMASH) o długości fali 63 nm są wystarczająco duże i gęste, aby można było je wykryć za pomocą czułego cytometru przepływowego. W związku z tym cząstki te zostały znakowane fluorescencyjnie, a następnie poddane bramkowaniu i zliczone z wykorzystaniem bocz...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Scharakteryzowanie interakcji między nośnikami leków a komórkami staje się coraz ważniejsze w opracowywaniu nowych systemów dostarczania leków. W szczególności, aby umożliwić racjonalną ocenę i porównanie różnych konstruktów nośników, kluczowe znaczenie ma bezwzględna kwantyfikacja wydajności wspomnianego nośnika w interakcji z komórkami docelowymi i niedocelowymi. Protokół ten opisuje dwustrumieniową metodologię, która pozwala każdemu badaczowi pracującemu z nośnikiem leku przekształcić względne, półilościowe dane cytom...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Australijską Narodową Radę Zdrowia i Badań Medycznych (NHMRC; Grant Programowy nr GNT1149990), Australijskie Centrum Badań nad Wirusologią HIV i Wirusowym Zapaleniem Wątroby (ACH2), a także dar od spadkobierców Réjane Louise Langlois. FC przyjmuje do wiadomości przyznanie stypendium National Health and Medical Research Council (NHMRC) Senior Principal Research Fellowship (GNT1135806). Rysunek 1 i rysunek 2 zostały utworzone za pomocą BioRender.com.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Alexa Fluor 647 C2 MaleimideInvitrogenA20347Barwnik stabilny pod względem pH stosowany do znakowania nośników PMA150 nm, 235 nm lub 633 nm PMASH; Przykład dobrego barwnika do stosowania w badaniach asocjacyjnych nośników komórkowych
Apogee A50 MicroflowApogeeCzuły cytometr przepływowy zdolny do wykrywania małych nośników do liczenia
Cytometr przepływowy CytoFLEX SBeckman CoulterCzuły cytometr przepływowy zdolny do wykrywania małych nośników do liczenia i odczytywania do końcowych eksperymentów z barierą komórkową Oprogramowanie
FCS ExpressDe Novo Oprogramowaniesłużące do analizy danych cytometrii przepływowej, tj. wykonywania bramkowania i wyznaczania średnich wartości intensywności fluorescencji wybranych populacji. Alternatywy obejmują FlowJo, OMIQ, Python
Infinite 200 PROTecan LifesciencesStandardowy czytnik mikropłytek używany do masowych pomiarów fluorescencji nośników w roztworze
LSRFortessa Cell AnalyzerBD BiosciencesMniej czuły cytometr przepływowy, ale bardziej ogólnie dostępny dla badaczy. Może być używany do odczytu końcowego eksperymentu z nośnikiem komórkowym
NanoSight NS300Malvern PanalyticalInstrument używany do analizy śledzenia nanocząstek
Prism 8GraphPadOprogramowanie służące do tworzenia wykresów i obliczania krzywych standardowych. Alternatywy obejmują między innymi Microsoft Excel, Origin, Minitab, Python Zestawy
Quantum MESF, Alexa Fluor 647Bangs Laboratories647Absolutne kulki ilościowe do cytometrii przepływowej. Służy do przeliczania intensywności fluorescencji mierzonej masowo na czytniku mikropłytek na intensywności fluorescencji mierzonej na cytometrze przepływowym przy użyciu wzorca MESF
, ,

Bibliografia

  1. Conde, J., et al. Revisiting 30 years of biofunctionalization and surface chemistry of inorganic nanoparticles for nanomedicine. Frontiers in Chemistry. 2, 48(2014).
  2. Cheng, Q., et al. Selective ORgan Targeting (SORT) nanoparticles for tissue specific mRNA delivery and CRISPR/Cas gene editing. Nature Nanotechnology. 15 (4), 313-320 (2020).
  3. Jackson, N. A. C., Kester, K. E., Casimiro, D., Gurunathan, S., DeRosa, F. The promise of mRNA vaccines: A biotech and industrial perspective. npj Vaccines. 5 (1), 1-6 (2020).
  4. Press, A. T., et al. Cargo-carrier interactions significantly contribute to micellar conformation and biodistribution. NPG Asia Materials. 9 (10), 444(2017).
  5. Cevaal, P. M., et al. In vivo T cell-targeting nanoparticle drug delivery systems: Considerations for rational design. ACS Nano. 15 (3), 3736-3753 (2021).
  6. Faria, M., Johnston, S. T., Mitchell, A. J., Crampin, E., Caruso, F. Bio-nano science: Better metrics would accelerate progress. Chemistry of Materials. 33 (19), 7613-7619 (2021).
  7. Shin, H., Kwak, M., Geol Lee, T., Youn Lee, J. Quantifying the level of nanoparticle uptake in mammalian cells using flow cytometry. Nanoscale. 12 (29), 15743-15751 (2020).
  8. Lozano-Andrés, E., et al. Considerations for MESF-bead based assignment of absolute fluorescence values to nanoparticles and extracellular vesicles by flow cytometry. bioRxiv. , (2021).
  9. Schwartz, A., et al. Formalization of the MESF unit of fluorescence intensity. Cytometry. Part B, Clinical Cytometry. 57 (1), 1-6 (2004).
  10. Faria, M., et al. Revisiting cell-particle association in vitro: A quantitative method to compare particle performance. Journal of Controlled Release. 307, 355-367 (2019).
  11. Chen, A. K., Cheng, Z., Behlke, M. A., Tsourkas, A. Assessing the sensitivity of commercially available fluorophores to the intracellular environment. Analytical Chemistry. 80 (19), 7437-7444 (2008).
  12. Comfort, N., et al. Nanoparticle tracking analysis for the quantification and size determination of extracellular vesicles. Journal of Visualized Experiments. (169), e62447(2021).
  13. Cui, J., et al. Immobilized particle imaging for quantification of nano- and microparticles. Langmuir. 32 (14), 3532-3540 (2016).
  14. Shang, J., Gao, X. Nanoparticle counting: Towards accurate determination of the molar concentration. Chemical Society Reviews. 43 (21), 7267-7278 (2014).
  15. Thomas, D. G., et al. ISD3: A particokinetic model for predicting the combined effects of particle sedimentation, diffusion and dissolution on cellular dosimetry for in vitro systems. Particle and Fibre Toxicology. 15 (1), 6(2018).
  16. Johnston, S. T., Faria, M., Crampin, E. J. Isolating the sources of heterogeneity in nano-engineered particle-cell interactions. The Journal of the Royal Society Interface. 17 (166), 20200221(2020).
  17. Ahmed-Cox, A., et al. Spatio-temporal analysis of nanoparticles in live tumor spheroids impacted by cell origin and density. Journal of Controlled Release. 341, 661-675 (2022).
  18. Faria, M., et al. Minimum information reporting in bio-nano experimental literature. Nature Nanotechnology. 13 (9), 777-785 (2018).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

ledzenie nanocz steczekcytometria przep ywowaoddzia ywanie z kom rkami no nikowymiilo ciowy test in vitropomiar fluorescencjitworzenie krzywej wzorcowejkoniugaty przeciwcia o lekilo ciowe oznaczanie pobierania przez no nik

Powiązane artykuły