Method Article

Eksperymentalna kwantyfikacja interakcji między systemami dostarczania leków a komórkami in vitro: przewodnik po przedklinicznej ocenie nanomedycyny

DOI:

10.3791/64259

⸱

September 28th, 2022

 ,  ,  ,  , 
1Department of Microbiology and Immunology, The University of Melbourne at the Peter Doherty Institute for Infection and Immunity, 2Department of Infectious Diseases, The University of Melbourne at the Peter Doherty Institute for Infection and Immunity, 3Victorian Infectious Diseases Service, Royal Melbourne Hospital at the Peter Doherty Institute for Infection and Immunity, 4Department of Infectious Diseases, Alfred Hospital and Monash University, 5Department of Chemical Engineering, The University of Melbourne, 6Department of Biomedical Engineering, The University of Melbourne

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pokazano przepływ pracy do bezwzględnej kwantyfikacji interakcji nośnik leku z komórką za pomocą cytometrii przepływowej, aby umożliwić lepszą racjonalną ocenę nowych systemów dostarczania leków. Ten przepływ pracy ma zastosowanie do nośników leków dowolnego typu.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Głównym elementem projektowania systemów dostarczania leków jest sposób wzmacniania lub tłumienia interakcji z określonymi typami komórek. Na przykład chemioterapeutyk może być funkcjonalizowany przeciwciałem w celu zwiększenia wiązania z komórkami rakowymi ("celowanie") lub funkcjonalizowany glikolem polietylenowym, aby uniknąć rozpoznania komórek odpornościowych ("podstęp"). Nawet na poziomie komórkowym optymalizacja wiązania i wychwytu nośnika leku jest złożonym problemem projektowania biologicznego. W związku z tym cenne jest oddzielenie tego, jak silnie nowy przewoźnik oddziałuje z komórką, od skuteczności funkcjonalnej ładunku przewoźnika po dostarczeniu do tej komórki.

Kontynuując przykład z chemioterapeutyką, "jak dobrze wiąże się z komórką rakową" jest oddzielnym problemem od "jak dobrze zabija komórkę rakową". Ilościowe testy in vitro dla tych ostatnich są dobrze ugruntowane i zwykle opierają się na pomiarze żywotności. Jednak większość opublikowanych badań nad interakcjami komórka-nośnik ma charakter jakościowy lub półilościowy. Ogólnie rzecz biorąc, pomiary te opierają się na znakowaniu fluorescencyjnym nośnika, a w konsekwencji raportują interakcje z komórkami w jednostkach względnych lub dowolnych. Jednak praca ta może być ustandaryzowana i może być całkowicie ilościowa przy niewielkiej liczbie eksperymentów charakteryzujących. Taka bezwzględna kwantyfikacja jest cenna, ponieważ ułatwia racjonalne, między- i wewnątrzklasowe porównania różnych systemów dostarczania leków – nanocząstek, mikrocząstek, wirusów, koniugatów przeciwciało-lek, zmodyfikowanych komórek terapeutycznych lub pęcherzyków zewnątrzkomórkowych.

Ponadto, kwantyfikacja jest warunkiem wstępnym dla kolejnych metaanaliz lub podejść do modelowania in silico. W tym artykule przedstawiono przewodniki wideo, a także drzewo decyzyjne dotyczące sposobu osiągnięcia kwantyfikacji in vitro dla systemów dostarczania leków na nośniki, które uwzględniają różnice w wielkości nośnika i modalności znakowania. Ponadto omówiono dalsze rozważania dotyczące oceny ilościowej zaawansowanych systemów dostarczania leków. Ma to służyć jako cenne źródło informacji na temat poprawy racjonalnej oceny i projektowania leków nowej generacji.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Projektowanie konstruktów dostarczających leki, które wykazują specyficzne, zaprojektowane zachowanie w zależności od typu komórek, z którymi się zetkną, wzbudziło duże zainteresowanie badawcze. Potencjalne konstrukty lub "nośniki" dostarczania leków obejmują preparaty lipidowe, nanohodowane substancje nieorganiczne, zespoły polimerowe, pęcherzyki zewnątrzkomórkowe, funkcjonalizowane komórki bakteryjne lub zmodyfikowane wirusy. Wszystkie te czynniki mogą wykazywać specyficzność narządów, tkanek lub komórek ze względu na właściwości fizyczne, właściwości powierzchni lub zmodyfikowane funkcjonalne funkcje chemiczne, takie jak przyłączanie przeciwciał1<....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Wybór odpowiedniego strumienia

  1. Postępuj zgodnie z drzewem decyzyjnym opisanym w Rysunek 1, aby określić najlepszy przepływ pracy (strumień) (Rysunek 2) dla użytej konfiguracji eksperymentalnej. Zapoznaj się z dyskusją, aby uzyskać dalsze komentarze na temat tego wyboru strumienia.
  2. Jeśli podążasz za strumieniem cytometru, kontynuuj kroki 2.1.1-2.2.7. Jeśli postępujesz zgodnie ze strumieniem zbiorczym, przejdź do kroków 3.1.1.1-3.1.5.7.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jak omówiono wcześniej, różne typy nośników leków wymagają użycia różnych technik do bezwzględnej kwantyfikacji asocjacji komórka-nosiciel. Na przykład stabilizowane dwusiarczkiem cząstki rdzenia poli(kwasu metakrylowego) (PMA SH) o długości fali 633 nm są wystarczająco duże i gęste, aby można je było wykryć za pomocą czułego cytometru przepływowego. W związku z tym cząstki te zostały oznaczone fluorescencyjnie, a następnie bramkowane i zliczone za pomocą rozpraszania światła pod kątem bocznym (SALS, analogicz.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Scharakteryzowanie interakcji między nośnikami leków a komórkami staje się coraz ważniejsze w opracowywaniu nowych systemów dostarczania leków. W szczególności, aby umożliwić racjonalną ocenę i porównanie różnych konstruktów nośników, kluczowe znaczenie ma bezwzględna kwantyfikacja wydajności wspomnianego nośnika w interakcji z komórkami docelowymi i niedocelowymi. Protokół ten opisuje dwustrumieniową metodologię, która pozwala każdemu badaczowi pracującemu z nośnikiem leku przekształcić względne, półilościowe dane cytom.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez Australijską Narodową Radę Zdrowia i Badań Medycznych (NHMRC; Grant Programowy nr GNT1149990), Australijskie Centrum Badań nad Wirusologią HIV i Wirusowym Zapaleniem Wątroby (ACH2), a także dar od spadkobierców Réjane Louise Langlois. FC przyjmuje do wiadomości przyznanie stypendium National Health and Medical Research Council (NHMRC) Senior Principal Research Fellowship (GNT1135806). Rysunek 1 i rysunek 2 zostały utworzone za pomocą BioRender.com.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Alexa Fluor 647 C2 MaleimideInvitrogenA20347Barwnik stabilny pod względem pH stosowany do znakowania nośników PMA150 nm, 235 nm lub 633 nm PMASH; Przykład dobrego barwnika do stosowania w badaniach asocjacyjnych nośników komórkowych
Apogee A50 MicroflowApogeeCzuły cytometr przepływowy zdolny do wykrywania małych nośników do liczenia
Cytometr przepływowy CytoFLEX SBeckman CoulterCzuły cytometr przepływowy zdolny do wykrywania małych nośników do liczenia i odczytywania do końcowych eksperymentów z barierą komórkową Oprogramowanie
FCS ExpressDe Novo Oprogramowaniesłużące do analizy danych cytometrii przepływowej, tj. wykonywania bramkowania i wyznaczania średnich wartości intensywności fluorescencji wybranych populacji. Alternatywy obejmują FlowJo, OMIQ, Python
Infinite 200 PROTecan LifesciencesStandardowy czytnik mikropłytek używany do masowych pomiarów fluorescencji nośników w roztworze
LSRFortessa Cell AnalyzerBD BiosciencesMniej czuły cytometr przepływowy, ale bardziej ogólnie dostępny dla badaczy. Może być używany do odczytu końcowego eksperymentu z nośnikiem komórkowym
NanoSight NS300Malvern PanalyticalInstrument używany do analizy śledzenia nanocząstek
Prism 8GraphPadOprogramowanie służące do tworzenia wykresów i obliczania krzywych standardowych. Alternatywy obejmują między innymi Microsoft Excel, Origin, Minitab, Python Zestawy
Quantum MESF, Alexa Fluor 647Bangs Laboratories647Absolutne kulki ilościowe do cytometrii przepływowej. Służy do przeliczania intensywności fluorescencji mierzonej masowo na czytniku mikropłytek na intensywności fluorescencji mierzonej na cytometrze przepływowym przy użyciu wzorca MESF
, ,

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Conde, J., et al. Revisiting 30 years of biofunctionalization and surface chemistry of inorganic nanoparticles for nanomedicine. Frontiers in Chemistry. 2, 48(2014).
  2. Cheng, Q., et al.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Drug Delivery SystemsNanoparticle TrackingFlow CytometryCarrier Cell InteractionQuantitative In Vitro AssayFluorescence MeasurementStandard Curve GenerationAntibody Drug ConjugatesCarrier Uptake QuantificationPreclinical Nanomedicine Evaluation

Related Articles